• Aucun résultat trouvé

Altération de la réponse au stress par des agrégats cytoplasmiques de la protéine prion

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Partager "Altération de la réponse au stress par des agrégats cytoplasmiques de la protéine prion"

Copied!
138
0
0

Texte intégral

(1)

Alteration de la reponse au stress par des agregats cytoplasmiques de la proteine prion

Par Kevin Goggin Departement de biochimie

Memoire presente a la Faculte de medecine et des sciences de la sante en vue de l'obtention du grade

Maitre es sciences (M.Sc.) en biochimie

Membres du jury evaluateur:

Dr Xavier Roucou (Directeur de recherche)

Departement de biochimie, Faculte de medecine et des sciences de la sante Dr Martin Bisaillon

Departement de biochimie, Faculte de medecine et des sciences de la sante Dr Benoit Leblanc

Departement de biologie, Faculte des sciences

7 Janvier 2008 © 2008, Kevin Goggin

(2)

Published Heritage Branch 395 Wellington Street Ottawa ON K1A0N4 Canada Direction du Patrimoine de I'edition 395, rue Wellington Ottawa ON K1A0N4 Canada

Your file Votre reference ISBN: 978-0-494-37874-8 Our file Notre reference ISBN: 978-0-494-37874-8

NOTICE:

The author has granted a non-exclusive license allowing Library and Archives Canada to reproduce, publish, archive, preserve, conserve, communicate to the public by

telecommunication or on the Internet, loan, distribute and sell theses

worldwide, for commercial or non-commercial purposes, in microform, paper, electronic and/or any other formats.

AVIS:

L'auteur a accorde une licence non exclusive permettant a la Bibliotheque et Archives Canada de reproduire, publier, archiver,

sauvegarder, conserver, transmettre au public par telecommunication ou par Plntemet, prefer, distribuer et vendre des theses partout dans le monde, a des fins commerciales ou autres, sur support microforme, papier, electronique et/ou autres formats.

The author retains copyright ownership and moral rights in this thesis. Neither the thesis nor substantial extracts from it may be printed or otherwise reproduced without the author's permission.

L'auteur conserve la propriete du droit d'auteur et des droits moraux qui protege cette these. Ni la these ni des extraits substantiels de celle-ci ne doivent etre imprimes ou autrement reproduits sans son autorisation.

In compliance with the Canadian Privacy Act some supporting forms may have been removed from this thesis.

Conformement a la loi canadienne sur la protection de la vie privee, quelques formulaires secondaires ont ete enleves de cette these. While these forms may be included

in the document page count, their removal does not represent any loss of content from the thesis.

Canada

Bien que ces formulaires

aient inclus dans la pagination, il n'y aura aucun contenu manquant.

(3)

Alteration de la reponse au stress par des agregats cytoplasmiques de la proteine prion

Kevin Goggin

Departement de biochimie, Universite de Sherbrooke

Memoire presente a la Faculte de medecine et des sciences de la sante en vue de l'obtention du grade

Maitre es sciences (M.Sc.) en biochimie 7 Janvier 2008

Les encephalopathies spongiformes transmissibles (EST) sont des maladies neurodegeneratives infectieuses qui resultent de l'agregation de formes anormales de la proteine prion cellulaire (PrPc). La maladie de Creutzfeldt-Jakob est la plus

repandue chez les humains alors que chez les animaux, la maladie de la vache folle est celle qui a 1'impact economique le plus important et est la seule EST animate clairement transmissible a l'homme. Des etudes suggerent que des agregats cytoplasmiques de la proteine prion (CyPrP) pourraient etre responsables de la neurodegenerescence observee lors des EST, toutefois, le mecanisme de toxicite de ces agregats est encore inconnu. Nous avons emis l'hypothese que la production d'agregats cytoplasmiques de la proteine prion entraine un stress considerable et possiblement letal pour les cellules neuronales. Nous avons analyse la capacite de ces agregats d'activer ou d'inhiber certaines composantes de la reponse au stress integree. Cette reponse a pour but de limiter les dommages cellulaires en conditions de stress et consiste en 1'arret de la synthese proteique, l'assemblage de granules de stress et l'induction de chaperonnes moleculaires. Nos resultats demontrent que les agregats cytoplasmiques de la proteine prion induisent un stress pour la cellule qui resulte en l'activation de la kinase du stress PKR, la phosphorylation du facteur d'initiation de la traduction eIF2a et une diminution d'environ 80 % de la synthese proteique. De facon surprenante, la formation des granules de stress est inhibee dans les cellules qui produisent des agregats cytoplasmiques de PrP. L'hybridation in situ et la chromatographic d'affmite sur resine de cellulose-oligo(dT) nous ont permis de demontrer que les ARNm etaient sequestres en grande partie au sein des agregats de CyPrP. Nous avons aussi demontre que l'induction de Hsp70 etait inhibee suite a un stress dans les cellules qui produisent des agregats et que ces cellules sont beaucoup plus sensibles a un stress oxydatif. Nous proposons que l'activation d'une reponse au stress inadequate par les agregats cytoplasmiques de la proteine prion altere considerablement la capacite des neurones de resister a de nombreux stress physiologiques. Nous suggerons que ces evenements pourraient contribuer a la toxicite et a la neurodegenerescence observee au cours des maladies a prions.

(4)

TABLE DES MATIERES

Liste des figures VI

Liste des abreviations VII

Resume

1. INTRODUCTION 1

1.1. Structure etfonction de la proteine prion 1

1.1.1. LegemPRNP 1

1.1.2. Structure de la proteine prion cellulaire 1

1.1.3. Role physiologique de PrPc 2

1.2. Les encephalopathies spongiformes transmissibles et les formes

pathologiques de la proteine prion 4

1.2.1. Les encephalopathies spongiformes transmissibles (EST) 4 1.2.2. La forme PrPSc et la conversion de PrPc en PrPSc 6

1.2.3. L'accumulation de PrP dans le cytoplasme et son implication

dans les EST 7

1.3. Les agregats cytoplasmiques de la proteine prion 9 1.3.1. Production et maturation des agregats cytoplasmiques de la

proteine prion 9

1.3.2. Caracteristiques morphologiques et biochimiques des agregats

deCyPrP 10

1.4. L 'agresome: un site de stockage pour les proteines anormalement

structurees 11

1.4.1. Structure, role et formation des agresomes 12 1.4.2. Diverses proteines anormalement structurees forment des

(5)

sein des agresomes 16

1.4.5. Effets toxiques des agresomes 18

1.5. La reponse au stress integree 19

1.5.1. Les divers types de stress physiologiques 19 1.5.2. Activation des kinases de eIF2a en reponse au stress 20 1.5.3. Phosphorylation de eIF2a et inhibition de la traduction 21 1.5.4. Traduction selective en conditions de stress 22 1.5.5. Formation des granules de stress et stockage des ARNm lors

d'un stress 24

1.5.6. La reponse auxproteines mal repliees (UPR) 26 1.5.7. Activation des facteurs de transcription heat shock et synthese

des proteines heat shock 28

1.5.8. L'apoptose et la survie cellulaire en conditions de stress 29 1.6. Regulation de la proteine prion par divers types de stress 30

1.6.1. Regulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle du

gene PRNP par divers types de stress 30

1.7. Problematique et hypotheses de recherche 31

1.7.1. Enonce de la problematique 31

1.7.2. Hypotheses et buts 33

RESULTATS 33

2.1. Article : Prion protein aggresomes are poly(Af -ribonucleoprotein

complexes that induce a PKR-mediated deficient cell stress response ..33

(6)

2.2.1. Plasmides, culture cellulaire, transfections et traitements 83

2.2.2. Marquage metabolique 83

2.3. Resultats supplementaires 84

2.3.1. L'inhibition de la traduction induite par CyPrP est specifique

et reversible 84

3. DISCUSSION 87

3.1. Activation de PKR et agregation des ARNmpar CyPrP 87 3.2. L 'inhibition de la traduction et de la formation des granules de stress

sont specifiques a CyPrP 91

3.3. Implication de ces mecanismespotentiellement toxiques dans les

encephalopathies spongiformes transmissibles 95

3.4. Conclusion et perspectives 97

4. REMERCIEMENTS 100

5. REFERENCES 100

6. ANNEXE 119

6.1. Nouvelle: La proteine prion ne se fait pas prier pour fair e des

(7)

LISTE DES FIGURES Introduction

Figure 1 (p.3) Structure de la proteine prion cellulaire et mutations

Figure 2 (p.13) Figure 3 (p.23)

pathogeniques de PrP Formation de l'agresome La reponse au stress cellulaire

Article Figure 1 Figure 2 Figure 3 Figure 4 Figure 5 Figure 6 Figure 7 Figure 8 (p.71) (p.72) (p.73) (p.74-76) (p.77) (p.78-80) (p.81) (p.82)

Translational inhibition in cells producing PrP aggresomes Phosphorylation of eIF2a in cells with PrP aggresomes PKR mediates the phosphorylation of eIF2a in

cells producing cytoplasmic PrP aggregates PrP aggresomes inhibit the assembly of SGs

A phosphomimetic mutant of eIF2a is unable to induce the formation of SGs in cells with PrP aggresomes

Co-aggregation of poly(A)+RNA with PrP aggresomes

PrP aggresomes prevent the induction of Hsp70

Cells with PrP aggresomes are more sensitive to arsenite

Figure supplementaire

Figure supplementaire 1 (p.86) L'inhibition de la traduction par CyPrP est specifique et reversible

Annexe

(8)

AIF Facteur inducteur de l'apoptose

APP Proteine precurseur de l'amyloide beta (Ap) AR Recepteur de l'androgene

ATA Atmosphere absolu

ATF Facteur de transcription activateur

BSE/ESB Encephalopathie spongiforme bovine (bovine spongiform

encephalopathy)

bZIP Domaine leucine-zipper basique

CFTR Regulateur transmembranaire associe a la fibrose kystique CJD Maladie de Creutzfeldt-Jakob

cnRNA ARN centrosomal cpm Comptes par minutes

CREP Represseur constitutif de la phosphorylation de eIF2a CWD Maladie debilitante chronique des cervides (chronic wasting

disease)

CyPrP Proteine prion cytoplasmique DMSO Dimethylsulfoxyde (Me2SO)

dsRBD Domaine de liaison a l'ARN double-brin

ERAD Degradation associee au reticulum endoplasmique

ESR Reponse au stress du reticulum endoplasmique ( ER stress response) EST/TSE Encephalopathie spongiforme transmissible

FFI Insomnie familiale fatale

FMRP Proteine du retard mental du X fragile G3BP Ribonuclease liant Ras-GAP

GADD34 Proteine d'arret de la croissance et de dommages de l'ADN 34 GCN2 Proteines de controle du glucose non derepressible 2

GPI Glycosylphosphatidylinositol GSH Gluthathione reduite (non oxydee)

GSS Syndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker HBO Oxygene hyperbare

HD Maladie de Huntington

HRI Kinase inhibitrice regule par l'heme HS Choc thermique (heat shock)

HSBP1 Proteine liant les facteurs du choc thermique 1 HSE Element promoteur du choc thermique

HSF1 Facteur de transcription du choc thermique 1 Hsp Proteines de choc thermique

(9)

ISR Reponse au stress integree {integrated stress response) LB Corps de Lewy

MTOC Centre d'organisation des microtubules ORF Cadre de lecture ouvert

PABP-1 Proteine liant les polyadenyl 1

PACT Activateur proteique de la proteine kinase dependante des ARNs double-brin PBP PD PERK PK PKR PMP22 poly(I:C) polyA polyQ PP1 PrP PrPc PrPRes PrPSc prpSen PSN-1 RE ROS RRM Sch SG/GS shRNA SMN SOD TIA-1 TIAR TTP UPR UTR vCJD

Proteine liant la preseniline Maladie de Parkinson

Proteine kinase du reticulum endoplasmique apparentee a PKR Proteinase K

Proteine kinase activee par les ARNs double-brin Proteine de myeline peripherique 22

Acide polyinosinique - polycytidylique Polyalanine

Polyglutamine

Proteine phosphatase 1 Proteine prion

Proteine prion cellulaire

Forme de la proteine prion resistante a la proteinase K Forme infectieuse de la proteine prion (PrP scrapie)

Forme native de la proteine prion sensible a la proteinase K Preseniline 1

Reticulum endoplasmique Especes d'oxygene reactives Motif de reconnaissance de l'ARN Schwannomine

Granule de stress

Court ARN en tige-boucle (small hairpin RNA) Proteine de survie des neurones moteurs

Cu-Zn Superoxyde dismulase

Antigene intracellulaire des cellules T 1

Proteine apparentee a TIA-1 (TIA-1 related protein) Tristetraproline

Reponse aux proteines mal repliees Region non traduite

(10)

1. INTRODUCTION

1.1. Structure etfonction de la proteine prion

1.1.1. Le gene PRNP

C

La proteine prion cellulaire (PrP ) est exprimee chez tous les mammiferes et est encodee par le gene PRNP qui se situe sur le chromosome 20 (20pl3) chez l'humain (LIAO et al, 1986; SPARKES et al, 1986). Le promoteur du gene PRNP humain ne contient pas de boite TATA classique, mais une boite CCAAT (MAHAL et al, 2001). De plus, on y retrouve un contenu GC tres riche et un seul site principal d'initiation de la transcription (PUCKETT et al, 1991). La region promotrice contient deux elements heat shock (HSE) situes a -1653 pb et -680 pb du site d'initiation de la transcription (SHYU et al, 2002). Les genes PRNP bovin, murin et ovin sont constitues de trois exons. Toutefois, le gene PRNP humain est constitue de deux exons de 134 pb et 2355 pb, nommes respectivement exon 1 et 3 (par analogie avec les autres genes PRNP de mammiferes), separes par un seul intron d'environ 13 kb. La sequence codant pour la proteine prion est entierement contenue dans le deuxieme exon (exon 3) (LEE, IY et al, 1998; PUCKETT et al, 1991).

1.1.2. Structure de la proteine prion cellulaire

La proteine prion cellulaire est une glycoprotein membranaire d'environ 27 KDa synthetisee sous la forme d'un precurseur de 253 acides amines. Les residus 1-23 encodent un peptide signal qui dicte la translocation au reticulum endoplasmique

(11)

(BASLER et al, 1986; ROBAKIS et al, 1986). La region N-terminale de PrPL est

peu structured et contient 5 repetitions de l'octapeptide PHGGGWGQ reconnues pour lier les ions divalents (JACKSON et al, 2001). L'extremite C-terminale de PrPc est

composee de trois helices alpha et de deux courts feuillets beta. Un pont disulfure entre les residus cysteine 179 et 214 et deux sites de glycosylation aux positions Asn 181 et 197 permettent a la proteine de se replier adequatement. Les residus 231-253 en C-terminal du precurseur proteique sont clives, puis une ancre glycosylphosphatidylinositol (GPI) est ajoutee dans le reticulum endoplasmique (RE). La structure tridimensionnelle de PrPc, determined par RMN, est en general tres bien

conservee entre les differentes especes de mammiferes. Toutefois, de nombreux variants peuvent etre produits selon les glycosylations ajoutees, qui affectent plus ou moins la structure tertiaire de PrPc. Ces variations dans les patrons de glycosylation

de PrP creent une mosai'que de molecules dont certaines sont prones a adopter une conformation pathogenique (revues dans ERMONVAL et al, 2003).

1.1.3. Role physiologique de PrPc

Le role precis de PrPc demeure incertain et des deletions chez des souris

transgeniques demontrent que ce gene n'est pas essentiel (PRUSINER et al, 1993). PrPc semble favoriser le renouvellement des cellules souches hematopo'fetiques

(ZHANG et al, 2006). De plus, il a ete demontre que PrPc est exprimee dans des

precurseurs neuronaux multipotents et que son expression accelere la differenciation de ces precurseurs en neurones matures de facon dose-dependante in vitro, et

(12)
(13)

(PI3-kinase) qui promeut la survie cellulaire et que cette induction est dependante de la liaison du cuivre dans les repetitions octapeptide (VASSALLO et al, 2005). PrP semble aussi avoir des fonctions immunologiques et participe au processus de proliferation des lymphocytes T en augmentant les proprietes stimulatrices des cellules presentatrices d'antigenes (BALLERINI et al, 2006). Certaines etudes demontrent que PrPc interagit avec la laminine et que cette interaction stimule la

proliferation des neurites via la voie des MAPK (GRANER et al, 2000; LOPES et

al, 2005) en plus de stimuler le developpement de la memoire chez le rat

(COITINHO et al, 2006). D'autres etudes associent a PrPc un role protecteur dans la

reponse a divers types de stress dont l'ischemie hypoxique cerebrale et le stress oxydatif par des radicaux libres (KREBS et al, 2007; SHYU et al, 2005; WATT et

al, 2005; WEISE et al., 2006).

1.2. Les encephalopathies spongiformes transmissibles et les formes pathologiques de la proteine prion

1.2.1. Les encephalopathies spongiformes transmissibles (EST)

Les encephalopathies spongiformes transmissibles (EST) sont des maladies neurodegeneratives infectieuses qui sont enclenchees par la deposition d'agregats de formes anormalement structurees de la proteine prion cellulaire appeles prions. Ces pathologies affectent certains mammiferes et les plus repandues sont la tremblante du mouton {scrapie), la maladie debilitante chronique des cervides (chronic wasting

(14)

encephalopathy, BSE). Cette derniere a des impacts economiques potentiellement

desastreux et est la seule EST animale reconnue comme transmissible a l'homme. Chez l'humain, les EST incluent la maladie de Creutzfeldt-Jakob (CJD), l'insomnie familiale fatale (FFI), le syndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS), le kuru et la maladie variante de Creutzfeldt-Jakob (vCJD). Comme beaucoup d'autres maladies neurodegeneratives, les maladies a prions ont une longue periode de latence et leurs symptomes apparaissent generalement entre l'age de 30 a 70 ans (Collinge, 2001). Une particularite unique des maladies a prions est leur mode de transmission qui peut etre hereditaire (10%) (comme dans le cas du CJD, du GSS et du FFI), sporadique (85%) (CJD), ou acquises par transmission entre individus, especes ou interventions chirurgicales (5%) (EST animales, CJD, kuru et vCJD). Les formes hereditaires sont en general associees a l'une ou l'autre des 30 mutations les plus frequentes dans le gene PRNP. Les formes sporadiques surviennent suite a un evenement inconnu, mais qui est probablement initie par des changements physico-chimiques dans l'environnement cellulaire. Les formes transmissibles peuvent dans certains cas franchir la barriere des especes. Des epidemies de tremblante du mouton et de vache folle en Angleterre, et l'epidemie de kuru qui a presque aneanti le peuple Fore (prononce Fore) en Papouasie-Nouvelle-Guinee dans les annees 1950, chez qui la maladie etait transmise lors de rituels cannibales, temoignent de l'impact epidemiologique potentiel des EST. La decouverte que l'encephalopathie spongiforme bovine etait transmissible a l'homme (que Ton a appele maladie variante de Creutzfeldt-Jakob) il y a une dizaine d'annees, a souleve de grandes inquietudes face a une eventuelle epidemie de maladies a prions chez l'humain.

(15)

Les EST resultent en des symptomes plus ou moins similaires soit une degenerescence de differentes regions du systeme nerveux central qui se traduit en general par la perte de coordination des mouvements, l'hysterie et la perte des fonctions cognitives. D'un point de vue clinique, on distingue la presence d'agregats de la proteine prion sous formes de plaques ou de fibres amyloi'des et une vacuolisation du cortex cerebral dans certaines formes d'EST. Les differentes EST et leurs symptomes sont attribuables a l'atteinte de differentes regions du cerveau, du cervelet, de la moelle epiniere ou du thalamus par des souches distinctes de prions (revues dans WADS WORTH et al, 2003).

1.2.2. La forme PrPSc et la conversion de PrPc en PrPSc

Les prions, ou formes infectieuses de la proteine prion, sont appelees de facon generate PrP scrapie (PrPSc). La formation de PrPSc se caracterise par un changement

conformationnel de PrP qui passe d'un contenu majoritairement en helices alpha vers un contenu principalement constitue de feuillets beta (PAN et al, 1993). Cette conversion s'effectue suite a un contact physique entre des agregats de PrPSc exogenes

et le PrP membranaire et implique possiblement une proteine toujours inconnue appelee temporairement proteine X (TELLING et al, 1995). L'apparition de la forme infectieuse dans les EST sporadiques ou hereditaires est probablement due a une conversion spontanee de PrPc en PrPSc dictee par des mutations ou des conditions

physico-chimiques particulieres. Les feuillets P de PrPSc rendent cette molecule tres

(16)

infectieuses sont constitutes de 14 a 28 molecules de PrP1 c (SILVEIRA et al, 2005).

Les agregats de PrPSc sont fortement resistants a la degradation par la proteinase K

(PK) et cette particularity est utilisee dans le diagnostic des EST. De ce fait, la forme PrPk c est aussi appelee PrP es par opposition a PrPL en qui designe le PrP natif

sensible a la PK. Bien que la forme PrPSc soit associee a la transmission des EST

depuis plus de 20 ans, de recentes etudes demontrent que cette molecule n'est pas neurotoxique en soi. De faibles quantites de PrP c sont detectees dans le cerveau de

souris chez qui l'insomnie fatale familiale a ete transmise experimentalement et qui demontrent des signes cliniques pathologiques (COLLINGE et al, 1995). Chez des souris transgeniques, la deletion du gene de PrPc inhibe le phenomene de spongiose

associe a des titres eleves de PrPSc (MALLUCCI et al, 2003). Ces resultats

demontrent que la propagation de PrPk c peut etre dissociee des phenomenes toxiques

qui provoquent la mort neuronale au cours des EST.

1.2.3. L'accumulation de PrP dans le cytoplasme et son implication dans les EST

Un nombre croissant d'etudes suggerent que 1'accumulation de la proteine prion dans des agregats cytoplasmiques pourrait etre responsable de la neurotoxicite observee au cours des EST. L'accumulation de PrP dans le cytoplasme peut etre declenchee par differents mecanismes. II a ete demontre que la proteine prion sauvage et des mutants pathologiques peuvent etre transloques de facon retrograde du reticulum endoplasmique vers le cytoplasme par une voie appelee degradation associee au

(17)

reticulum endoplasmique {endoplasmic reticulum-associated degradation, ERAD). Les polypeptides anormalement structures sont retro-transloques par le translocon Sec61, un composant implique dans l'import des proteines dans le RE (PILON et al, 1997; WIERTZ et al, 1996). Une fois exposees dans le cytoplasme, les molecules de PrP sont ciblees pour la degradation par le proteasome 26S par l'ajout d'ubiquitine (MA et LINDQUIST, 2001; YEDIDIA et al, 2001). D'autres equipes ont demontre que la translocation de PrPc dans le RE est en partie inefficace et qu'une proportion

considerable de molecules de PrP demeurent confinees dans le cytoplasme sous une forme non-glycosylee et dont le peptide signal n'a pas ete clive (DRISALDI et al, 2003; RANE et al, 2004). De plus, il a ete demontre recemment que des conditions de stress dans le RE induites par des agents chimiques favorisent 1'accumulation de PrP immature dans le cytoplasme (ORSI et al, 2006).

Bien que 1'accumulation de PrP dans le cytoplasme puisse survenir de differentes facons, on observe rapidement la formation d'agregats cytosoliques de PrP lorsque l'activite du proteasome est compromise (MA et LINDQUIST, 2001; YEDIDIA et

al, 2001). Des etudes plus approfondies ont demontre que l'accumulation

cytoplasmique de PrP etait hautement toxique dans des cellules de neuroblastomes murins (N2a) et dans des souris transgeniques. Des souris transgeniques exprimant une proteine prion modiflee appelee CyPrP (residus 23-230 de PrP ) qui ne contient pas de peptides signaux developpent differents patrons de neurodegenerescence qui correlent avec le niveau d'expression de CyPrP (MA, J et al, 2002). Quelques etudes contestent la toxicite des agregats de CyPrP (CROZET et al, 2006; FIORITI et al,

(18)

2005; KRISTIANSEN et al, 2005; ROUCOU et al, 2003), toutefois, un nombre croissant d'etudes confirment le potentiel neurotoxique de CyPrP (GRENIER et al, 2006; MA, J et al, 2002; NORSTROM et al, 2007; RANE et al, 2004). Ces resultats contradictoires pourraient etre attribuables au fait que CyPrP puisse induire la mort cellulaire seulement dans certaines lignees cellulaires ou encore dans un contexte particulier. Puisque ce champ d'etudes est tres recent, peu d'etudes proposent un mecanisme de toxicite des agregats de CyPrP. Wang et ses collegues ont propose que 1'interaction de CyPrP avec des lipides hydrophobiques membranaires du RE ou de la membrane plasmique menerait a la disruption de la bicouche lipidique et une alteration de la permeabilite membranaire (WANG et al, 2006). Une autre etude suggere que 1' interaction de CyPrP avec la proteine Bcl-2 activerait la voie apoptotique en inactivant la fonction anti-apoptotique de Bcl-2 en la sequestrant au sein des agregats cytoplasmiques (RAMBOLD et al, 2006). De plus, l'interaction de CyPrP avec la proteine pro-apoptotique NRAGE pourrait affecter le potentiel membranaire mitochondrial et suggere l'activation des mecanismes apoptotiques (BRAGASON et PALSDOTTIR, 2005).

1.3. Les agregats cytoplasmiques de la proteine prion

1.3.1. Production et maturation des agregats cytoplasmiques de la proteine prion

Les agregats de CyPrP peuvent etre produits par surexpression de la proteine prion sauvage et traitement avec des inhibiteurs du proteasome ou encore par surexpression

(19)

des residus 23-230 a l'aide d'un promoteur viral (ROUCOU et al, 2003). Les agregats cytoplasmiques de PrP se forment initialement pres de la membrane plasmique sous la forme de micro-agregats. Ces petits agregats sont ensuite transporters le long des microtubules par la proteine de transport dyneine et coalescent pour former de larges agregats peri-nucleaires appeles agresomes, un processus qui dure environ 24 heures. Ces agresomes se localisent au centrosome et perturbent la localisation de certaines composantes cellulaires dont les mitochondries qui sont relocalisees autour des agresomes de CyPrP (GRENIER et al, 2006).

1.3.2. Caracteristiques morphologiques et biochimiques des agregats de CyPrP

Les agregats de CyPrP sont facilement observables par microscopie a fluorescence et peuvent, dans certains cas, etre observes directement en contraste de phase. Dans les cellules neuronales murines (N2a) et humaines (BE(2)M17), de meme que dans certains types de cellules non neuronales (HEK 293), CyPrP forme de larges agresomes qui peuvent parfois atteindre une taille equivalente au quart du noyau. Ces agregats colocalisent avec la gamma-tubuline et le proteasome 26S suggerant qu'un certain niveau de degradation de CyPrP a lieu au sein des agresomes (GRENIER et

al., 2006). Un domaine determinant pour l'agregation de CyPrP a ete localise par

analyse mutationnelle et se situe entre les residus 124 et 157. Toutefois, le fait que ce domaine seul n'induise pas l'agregation d'une fusion avec la proteine fluorescente EGFP indique que des interactions avec d'autres regions de la proteine sont

(20)

necessaires pour permettre l'agregation de CyPrP (GRENIER et al, 2006). Ces agregats proteiques sont insolubles dans des detergents ioniques et peuvent etre isoles par centrifugation. Une caracteristique importante des agregats de CyPrP est leur resistance a la degradation par la proteinase K, qui rappelle la forme pathologique PrPSc. II a aussi ete etabli que les agregats de CyPrP deroutent les molecules de PrPc

natives de la voie de secretion et les sequestrent au sein des agresomes (GRENIER et

al, 2006). La fonction de PrP , bien qu'inconnue, pourrait etre abolie par cette

relocalisation de la proteine sauvage dans des agregats cytoplasmiques.

1.4. L 'agresome: un site de stockage pour les proteines anormalement structurees

Plusieurs proteines mal repliees forment des corps d'inclusion cytoplasmiques lorsque l'activite de degradation par le proteasome n'est pas adequate. Ces proteines souvent membranaires sont impliquees dans le developpement de pathologies neurodegeneratives ou neuromusculaires. Dans la plupart des cas, ces inclusions se forment pres du centrosome et possedent des caracteristiques morphologiques similaires. Le terme agresome a ete propose par Kopito et ses collegues en 1998 pour designer ces larges structures qui representent un centre de depot et de proteolyse des proteines anormalement repliees.

(21)

1.4.1. Structure, role et formation des agresomes

Les agresomes sont des corps d'inclusion qui se forment suite au transport de proteines anormalement structurees par les microtubules. Les proteines anormal.es sont ciblees pour la degradation par le proteasome 26S, par ubiquitination. Si la synthese de proteines anormalement structurees est soutenue, une proportion considerable de ces proteines s'agrege pour former de petits agregats a la peripheric du cytoplasme. Ces petits agregats sont lies par l'histone desacetylase associee aux microtubules HDAC6 (KAWAGUCHI et al, 2003). Cette enzyme s'associe ensuite au complexe dyneine/dynactine qui assure le transport retrograde jusqu'au centre d'organisation des microtubules (MTOC) ou ces petits agregats coalescent pour former un agresome (JOHNSTON et al, 2002; KAWAGUCHI et al, 2003). Certains types d'agresomes ne contiennent pas de proteines polyubiquitinylees et HDAC6 (GARCIA-MATA et al, 1999; JOHNSTON et al, 2000; KAWAGUCHI et al, 2003). Le mecanisme de liaison de ces agregats proteiques aux proteines motrices n'est pas elucide, mais il fait probablement intervenir d'autres proteines adaptatrices.

Les agresomes sont depourvus de membranes et peuvent adopter differentes morphologies selon la proteine agregee et le type cellulaire dans lequel elle est exprimee. De maniere generale, les agresomes ont une forme quasi-spherique d'une taille de 1 a 3 urn, mais des agresomes sous forme de rubans ou de larges agregats irreguliers peuvent etre observes. L'agresome se forme au niveau du MTOC, dans une concavite de la membrane nucleaire. Une caracteristique tres robuste des agresomes

(22)
(23)

site de proteolyse des polypeptides anormaux. L'agresome est done une sorte d'usine de traitement des dechets de la cellule. Certaines etudes ont suggere un lien fonctionnel entre la formation d'agresomes et l'induction des mecanismes de macro-autophagie (GARCIA-MATA et al, 2002; KOPITO, 2000; RAVIKUMAR et al, 2004). L'autophagie est un processus par lequel la cellule elimine des composants cellulaires dans le but de recycler certains de leurs constituants ou de presenter des antigenes. Bien qu'il ait ete demontre que l'autophagie est impliquee dans la degradation d'agregats proteiques de proteines ayant des expansions polyQ ou polyA (IWATA et al, 2005; RAVIKUMAR et al, 2002) et de la proteine de myeline peripherique 22, PMP22, (FORTUN et al, 2003; FORTUN el al, 2007), aucun lien causal ne peut etre trace entre la formation d'agresomes et l'activation des processus d'autophagic

1.4.2. Diverses proteines anormalement structurees forment des agresomes

Le terme agresome a ete propose suite a 1'observation de larges agregats de la proteine CFTR {cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) un canal ionique qui, lorsque deficient, cause certaines formes de fibrose kystique (JOHNSTON et al, 1998). Garcia-Mata et ses collegues ont demontre qu'une chimere entre la proteine GFP et un fragment de 250 acides amines de la proteine cytoplasmique pi 15 pouvait aussi s'accumuler sous forme d'agresome (GARCIA-MATA et al, 1999). Depuis, il est etabli que la formation d'agresomes est un processus declenche lors de l'expression de nombreuses proteines, particulierement de

(24)

mutants structurels ou fonctionnels. Plusieurs proteines qui forment des agresomes sont impliquees dans des maladies neurodegeneratives dont la maladie d'Alzheimer (PSN-1, PBP), la maladie de Parkinson (parkine, a-synucleine, synphilin-1,) et la maladie de Huntington (HD exon 1 polyQ) (JOHNSTON et al, 1998; JUNN et al, 2002; NAMEKATAef al, 2002; TANAKA et al, 2004; WAELTER et al., 2001). D'autres modeles de formation d'agresomes incluent la proteine precurseur de l'amyloi'de p (APP) (FRATTA et al., 2005), la proteine de myeline peripherique 22 (PMP22) (FORTUN et al., 2005; FORTUN et al., 2007) et la proteine associee aux microtubules EB1 (RIESS et al., 2005).

1.4.3. Les agresomes de la proteine prion

La proteine prion sauvage peut s'accumuler dans le cytoplasme et former des agresomes lorsque l'activite du proteasome est inhibee (MA et LINDQUIST, 2001). De plus, differentes formes pathologiques de PrP sont aussi associees a la formation d'agresomes. Le mutant D177N chez la souris (D178N chez l'humain), associe a certaines formes transmises d'EST, forme des agresomes dans des cellules de neuroblastome N2a, meme en l'absence d'inhibiteurs du proteasome (MA et LINDQUIST, 2001). Les mutants V203I et E211Q associes au CJD et le mutant Q212P associe au GSS forment aussi de larges inclusions peri-nucleaires caracteristiques des agresomes suite a un traitement avec des inhibiteurs du proteasome (MISHRA et al., 2003). Une forme de PrP ayant des caracteristiques semblables a PrPSc s'accumule dans des agresomes apres un traitement a la

(25)

cyclosporine A, un immunosuppressant (COHEN et TARABOULOS, 2003). De plus, la forme pathologique PrP c se retrouve dans des agresomes lorsque l'activite du

proteasome est inhibee dans des cellules infectees par des prions (KRISTIANSEN et

al, 2005). Recemment, des agresomes de PrP cytoplasmique ont ete caracterises de

facon plus approfondie, car on les suspecte d'intervenir dans le processus de neurodegenerescence des maladies a prions (GRENIER et al, 2006). Puisque l'expression de CyPrP entraine une neurodegenerescence chez la souris, il pourrait etre logique de presumer que 1'accumulation de PrP dans le cytoplasme soit suffisante pour declencher le phenomene de mort cellulaire observe au cours des maladies a prions. Toutefois, aucun lien direct n'a ete etabli entre la production d'agresomes de PrP et l'apparition des EST.

1.4.4. Implication des chaperonnes moleculaires et proteolyse au sein des agresomes

Les agresomes etant constitues de grandes quantites de proteines anormalement repliees, un nombre considerable de chaperonnes moleculaires y sont associes. Plusieurs membres de la famille des proteines heat shock (Hsp) sont presents au sein des agresomes dont Hdjl, Hdj2, Hsc70 et Hsp27 (GARCIA-MATA et al, 1999; ITO

et al, 2002). D'autres chaperonnes telles que l'a-B crystalline, l'a-synucleine et les

proteines 14-3-3, de meme que la chaperonne du reticulum endoplasmique Grp78/BiP sont aussi retrouvees associees aux agresomes (ITO et al, 2002; JUNN et al, 2002; WAELTER et al, 2001). Puisque des agresomes peuvent etre produits suite a la

(26)

surexpression de nombreux substrats et que leur temps de formation varie de 24 h a 72 h, il est logique de presumer que le profil de chaperonnes preserves au sein des agresomes variera en fonction des proteines agregees. La surexpression de Hsp70 empeche la formation d'agresomes d'une chaine legere d'immunoglobuline mutee amyloi'dogenique appelee SMA (DUL et al, 2001) et la formation d'inclusions de huntingtine (htt) polyglutaminee (MUCHOWSKI et al, 2000). On pourrait done presumer que la formation d'agresomes s'initie suite a un deficit en chaperonnes cytoplasmiques et non pas seulement en reponse a l'inhibition du proteasome. Le proteasome s'associe aux agregats proteiques principalement apres leur convergence en une masse peri-nucleaire localisee au MTOC. Contrairement au proteasome, la presence d'ubiquitine au sein des agresomes n'est pas intrinseque et varie selon les modeles d'agresomes utilises. Les agresomes des proteines CFTR-AF508 (JOHNSTON et al, 1998), PMP22 (FORTUN et al, 2005), SchAFl 18 (GAUTREAU

et al, 2003), et du recepteur de l'androgene (AR) polyglutamine (TAYLOR et al,

2003) sont ubiquitinyles. De plus, la parkine (JUNN et al, 2002), l'a-synucleine (SPILLANTINI et al, 1997; TANAKA et al, 2004) et la synphiline-1 (ENGELENDER et al, 1999) sont des composantes des corps de Lewy (LB) qui sont des inclusions cytoplasmiques polyubiquitinylees (KUZUHARA et al, 1988) associees a la maladie de Parkinson (PD). Par contre, quelques proteines qui forment des agresomes ne sont pas ubiquitinylees telles que GFP-250 (GARCIA-MATA et al, 1999), un mutant de la proteine ATP7B impliquee dans la maladie de Wilson (HARADA et al, 2001) et la Cu-Zn-superoxide-dismutase mutante (SOD) (JOHNSTON et al, 2000). La presence du proteasome dans tous les types

(27)

d'agresomes suggere que des mecanismes de degradation ubiquitine-independante ont lieu au sein de ces structures.

1.4.5. Effets toxiques des agresomes

La litterature concernant la toxicite des agresomes est controversee et semble dependre des polypeptides agreges. Taylor et ses collegues ont propose que la production d'agresomes protege la cellule des effets cytotoxiques de monomeres ou de micro-agregats de certaines proteines (TAYLOR et al, 2003). Cette etude a demontre que l'inhibition de la formation d'agresomes du recepteur de l'androgene (AR) polyglutamine ainsi que de la chimere GFP-250 a l'aide d'une drogue destabilisant les microtubules augmentait la duree de vie de ces proteines, demontrant que ces structures facilitent la degradation des proteines prones a s'agreger (TAYLOR

et al, 2003). Un nombre eleve d'etudes suggerent que les agresomes pourraient etre

impliques dans de nombreuses maladies neurodegeneratives ou neuromusculaires (FRENCH, 2001; JOHNSTON et al, 2000; KOPITO et SITIA, 2000; MCNAUGHT

et al, 2002; NOTTERPEK et al, 1999). Des mecanismes de toxicite varies sont

envisages et incluent la diminution de la disponibilite de chaperonnes moleculaires ou une diminution de l'activite proteosomale, la sequestration de proteines essentielles ou encore l'inhibition du trafic microtubulaire ou du transport axonal dans les neurones (GARCIA-MATA et al, 2002; KOPITO, 2000). II a ete demontre que differentes formes de la proteine prion produisent des agresomes qui entrainent la mort cellulaire programmed par apoptose (GRENIER et al, 2006; KRISTIANSEN et al, 2005).

(28)

Toutefois, on ne sait pas si le phenomene de cytotoxicite observe est attribuable directement a la presence de l'agresome, ou s'il est declenche parce que la capacite de stockage de celui-ci est excedee.

1.5. La reponse au stress integree

1.5.1. Les divers types de stress physiologiques

Au cours de leur evolution, les cellules eucaryotes ont conserve un systeme de reponses universel a differents types de stress appele reponse au stress integree

(integrated stress response, ISR) (revue dans (ANDERSON et KEDERSHA, 2002b;

WEK et al., 2006)). Cette reponse physiologique fait appel a de nombreux processus biochimiques et de signalisation cellulaire dans le but de limiter les dommages cellulaires en conditions de stress. Cette voie accomplit trois fonctions essentielles en conditions de stress: 1) inhiber la traduction pour limiter les anomalies dans la synthese proteique 2) declencher la formation de granules de stress servant a stacker et stabiliser les ARNm non traduits et 3) induire la synthese de chaperonnes moleculaires dont Hsp70 (ANDERSON et KEDERSHA, 2002a; LINDQUIST, 1986). Plusieurs conditions de stress activent une meme proteine par un mecanisme semblable ou different. Le stress oxydatif, le choc thermique, l'infection virale, la production de proteines anormalement repliees, la privation de nutriments et de serum et les rayons UV ne sont que quelques exemples de conditions non physiologiques potentiellement letales. En regroupant divers stimuli potentiellement toxiques dans une meme reponse, la cellule peut mieux gerer l'apport energetique implique dans sa

(29)

survie. La plupart des conditions de stress menent a la mort cellulaire par apoptose lorsque soutenues (BUTTKE et SANDSTROM, 1994; EDWARDS et al, 1998; GODAR, 1996; JACKLE et al, 2001; MIGLIORATI et al, 1992; RATAN et al, 1994; WERNIG et XU, 2002), indiquant que la reponse au stress est efficace a des seuils de toxicite relativement restreints et qu'elle ne peut etre prolongee sur une longue periode. De fa9on surprenante, certains types cellulaires deviennent tolerants ou supportent davantage un stress lorsque d'abord traites avec un type de stress different. Ceci demontre bel et bien que les voies de la reponse au stress sont entrecroisees.

1.5.2. Activation des kinases de eIF2a en reponse au stress

L'exposition de cellules a un type de stress declenche generalement l'activation de l'une ou l'autre des quatre kinases du facteur d'initiation de la traduction eIF2a. Ces kinases sont: la kinase inhibitrice regulee par l'heme HRI (heme-regulated inhibitor

kinase), activee par une deficience en heme, le stress oxydatif et le choc thermique; la

proteine kinase dependante de EARN double-brin PKR {RNA-dependent protein

kinase), activee par la presence d'ARN double-brin d'origine virale dans le

cytoplasme ou par PACT, un activateur cellulaire; la proteine apparente a la proteine de controle du glucose GCN2 (glucose control non-derepressible-2-like kinase), activee par une carence en acides amines et par les UV; et la kinase apparentee a PKR residente du RE PERK (PKR-like ER kinase), activee par un stress dans le RE. Ces quatres kinases ont des domaines N-terminaux regulateurs varies qui detectent

(30)

diverses conditions defavorables, alors que leur domaine catalytique carboxy-terminal est relativement bien conserve. Ces kinases se dimerisent et s'activent par autophosphorylation sur serine et/ou threonine (FAGARD et LONDON, 1981; GALABRU et HOVANESSIAN, 1987; WU et KAUFMAN, 1997). Les kinases de cette famille phosphorylent la serine 51 du facteur eIF2a (KUDLICKI et al, 1987; PRICE et PROUD, 1990). Chez la levure, GCN2 est la seule kinase de eIF2a et assure sa phosphorylation en reponse a la plupart des stress (DEVER et al, 1992; WEK et al., 1989). La presence de quatre kinases chez les eucaryotes superieurs est probablement due a des divergences evolutives qui permettent une regulation plus efficace des divers stimuli. Parmi ces kinases, PKR est la plus abondamment etudiee puisqu'elle est un regulateur crucial de la proliferation cellulaire et de la reponse antivirale (GARCIA et al., 2006). Recemment, il a ete demontre que PKR etait activee dans certaines maladies neurodegeneratives dont la maladie de Huntington et la maladie d'Alzheimer (Bando et al, 2005; ONUKI et al, 2004; PACCALIN et al, 2006; PEEL, 2004; PEEL et BREDESEN, 2003; Peel et al, 2001). Toutefois, les mecanismes qui menent a 1'activation de PKR dans ces pathologies ne sont pas elucides.

1.5.3. Phosphorylation de eIF2a et inhibition de la traduction

En conditions normales, le facteur d'echange de la guanine (GEF) eIF2B lie le facteur d'initiation de la traduction eIF2a de facon transitoire et facilite l'echange du GDP pour le GTP, sur eIF2a (KIMBALL et al, 1996). eIF2a couple au GTP se lie avec

(31)

l'ARNt initiateur charge de la methionine pour former le complexe ternaire (GTP-eIF2a-Met-tRNA). La sous-unite ribosomale 40S s'associe au complexe ternaire pour former le complexe de pre-initiation 43 S qui se lie au complexe de liaison de la coiffe

{cap binding complex) eIF4F pre-assemble au niveau de la coiffe des ARNm (GRAY

et WICKENS, 1998). Lorsque le complexe est immobilise au niveau du premier codon, la sous-unite 60S joint le complexe d'intitiation de la traduction. La GTPase eIF5B participe avec d'autres facteurs a la mise en place de l'ARNt-Met sur le codon d'initiation. Cette reaction necessite l'hydrolyse du GTP lie a eIF2a par eIF5B. Le facteur eIF2a dissocie du GTP ainsi que d'autres facteurs d'initiation se detachent du complexe d'initiation et la traduction de l'ARNm s'amorce. La phosphorylation de la serine 51 du facteur eIF2a le rend tres prone a s'associer avec le facteur eIF2B, ce qui sequestre tout le eIF2B disponible dans le cytoplasme et limite la quantite de eIF2a pouvant etre couplee au GTP et pouvant former des complexes ternaires fonctionnels (KRISHNAMOORTHY et al, 2001). Le eIF2a phosphoryle agit done comme un inhibiteur competitif de eIF2a -GTP et en empechant sa liaison a l'ARNt initiateur, inhibe rapidement l'initiation de la traduction des ARNm dans les cellules stressees.

1.5.4. Traduction selective en conditions de stress

En conditions de stress, alors que la traduction de la majorite des ARNm est inhibee pour prevenir 1'expression de proteines aberrantes, la traduction de certains ARNm est rapidement stimulee. La presence de sites internes d'entree des ribosomes {internal

(32)
(33)

5' de l'ARNm n'y est pas necessaire. De plus, certains ARNm contiennent des ORF en amont de leur sequence codante appeles upstream ORF (uORF). Ces petits cadres de lectures ouverts sont traduits preferentiellement en conditions normales et chevauchent la sequence codante de l'ARNm empechant ainsi 1'initiation de la traduction au niveau du codon d'initiation situe en aval. Lors d'un stress, la disponibilite limitante de eIF2cc permet un assemblage plus lent des ribosomes sur l'ARNm et certains complexes de pre-initiation 43S parviennent a se Her au niveau de la sequence codante pour initier la traduction de l'ORF (VATTEM et WEK, 2004).

1.5.5. Formation des granules de stress et stockage des ARNm lors d'un stress

Dans les cellules stressees, 1'inhibition de la synthese proteique mene a 1'accumulation cytoplasmique d'ARNm non traduits. Ces ARNm sont rapidement sequestres (15-30 min) dans des granules ribonucleoproteiques appeles granules de stress (stress granules, SG/GS). Ces granules sont composes d'ARNm non traduits, de la sous-unite ribosomale 40S, de la proteine PABP-1 et des facteurs generaux d'initiation de la traduction eIF3, eIF4E, eIF4G, et represented des centres de stockage et de triage des complexes d'initiation de la traduction deficients ou immobilises (KEDERSHA, N. et ai, 2002; KEDERSHA, N. et ai, 1999; KIMBALL

et al, 2003). Les granules de stress sont des structures hautement dynamiques dont

1'assemblage est initie par l'auto-agregation des proteines TIA-1 et TIAR (GILKS et

(34)

et al, 2003). TIA-1 et la proteine apparentee TIAR possedent trois motifs de

reconnaissance de l'ARN (RRM) pres de leur extremite amino-terminale et un domaine riche en glutamine structurellement relie au prion a leur extremite carboxy-terminale (KAWAKAMI et al, 1992; TIAN et al, 1991). Le mecanisme d'agregation des granules de stress implique l'activite de liaison de l'ARNm par TIA-1 et TIAR d'une part et la capacite de ces proteines de s'auto-agreger grace a leur domaine prion-related, piegeant ainsi de nombreux ARNm et les complexes d'initiation de la traduction qui y sont associes (GILKS et al, 2004). De facon similaire, G3BP regule l'assemblage des granules de stress en liant les ARNm a une extremite via un RRM et en s'oligomerisant a l'aide d'un domaine d'interaction proteique amino-terminal (TOURRIERE et al, 2003). Bien que la formation de granules de stress soit initiee suite a la phosphorylation de eIF2a, ce mecanisme peut aussi etre eIF2a-independant (DANG et al, 2006; MAZROUI et al, 2006). II est done probable que 1'initiation de la formation des GS par TIA-1 /R fasse intervenir une ou plusieurs proteines de signalisation entre les composantes que sont eIF2a phosphoryle et TIA-1/R. La proteine SMN (survival motor neuron) est aussi impliquee dans les etapes precoces d'assemblage des GS (HUA et ZHOU, 2004). De plus, une etude demontre que l'integrite des microtubules est necessaire a l'assemblage des GS (IVANOV et al, 2003). D'autres proteines impliquees dans la stabilisation ou la degradation d'ARNm sont recrutees plus tardivement aux GS dont HuR (GALLOUZI et al, 2000), CPEB1, l'helicase rck/p54 (WILCZYNSKA et al, 2005), Staufen (THOMAS et al, 2005), l'exonuclease XRN1 (KEDERSHA, N. et al, 2005) et la proteine du retard mental du X fragile (FMRP) (KIM et al, 2006). De

(35)

plus, bien qu'elle soit exclue des GS, la proteine AIF (apoptosis inducing factor) inhibe leur assemblage en modulant le niveau de glutathione reduite (GSH) et par consequent le potentiel oxydo-reducteur de la cellule (CANDE et ah, 2004). Puisque la surexpression de plusieurs proteines (TIA-1, G3BP, SMN et TTP) et des conditions environnementales variees induisent la formation de granules de stress, il est normal de presumer que la formation de ces granules est un processus impliquant de nombreux effecteurs en aval de eIF2a.

Lorsque les conditions de stress sont abolies, la dissociation des granules de stress s'initie suite a la dephosphorylation de eIF2a par la proteine phosphatase 1 (PPlc) et le pool d'ARNm stockes dans les GS est relache dans le cytoplasme. Ceci evite a la cellule d'avoir a synthetiser a nouveau l'ensemble de ses ARNm, un processus qui necessiterait un apport energetique important pour la cellule. Toutefois, aucune etude approfondie n'a ete effectuee sur la dissociation des GS suite a un retour a des conditions physiologiques favorables. Un mecanisme envisage est l'inactivation de certains effecteurs de 1'assemblage des GS qui menerait a la dissociation rapide de ces structures.

1.5.6. La reponse aux proteines mal repliees (UPR)

L'accumulation de polypeptides anormalement structures dans le RE entraine l'activation d'une sous-branche de la reponse au stress integree appelee reponse aux proteines mal repliees {unfolded protein response, UPR) ou reponse au stress du RE

(36)

(ER stress response, ESR). Lorsque des proteines anormalement repliees sont

produites dans le RE, dies sequestrent la chaperonne BiP et la dissocie des trois regulateurs proteiques ATF-6, IRE1 et PERK, ce qui les active. La dissociation de BiP et ATF-6 permet la translocation de ATF-6 au Golgi ou les proteases S1P et S2P le clivent et liberent son domaine bZIP amino-terminal (HAZE et al, 1999; SHEN et

al, 2002; YE et al, 2000). Le domaine clive peut ainsi transloquer au noyau et activer

la transcription de l'ARNm de la X-box-bindingprotein-\ (XBP-1) et d'autres genes cibles de la reponse au stress dans le RE dont les facteurs de transcription ATF3 et CHOP (YOSHIDA et al, 2000). IRE1 se dimerise lorsqu'activee et effectue l'epissage de l'ARNm de XBP-1 (CALFON et al, 2002; YOSHIDA et al, 2001). L'ARNm de XBP-1 mature peut alors etre traduit et la proteine active la transcription de nombreux genes impliques dans les fonctions du RE et dans les voies de secretion en general (LEE, AH et al, 2003). La dissociation de BiP du domaine luminal du RE de PERK l'amene a se dimeriser et a s'activer par autophosphorylation (BERTOLOTTI et al, 2000; MA, K et al, 2002). PERK transmet le signal a travers son domaine transmembranaire vers la face cytoplasmique du RE ou se situe le domaine catalytique qui phosphoryle eIF2a. La phosphorylation de eIF2a entraine une diminution de la traduction globale, mais une augmentation de la traduction de certains messagers inductibles par le stress qui contiennent des uORF dans leur sequence 5'UTR. Parmi ces transcrits, les facteurs de transcription ATF4, ATF3 et CHOP sont rapidement induits (JIANG et al, 2004). En conjonction avec d'autres facteurs de transcription, XBP1, ATF6, ATF4, ATF3 et CHOP induisent la transcription de nombreux genes dont la chaperonne BiP et la proteine GADD34

(37)

(SCHRODER et KAUFMAN, 2005). La proteine GADD34 forme un complexe avec la sous-unite catalytique de la proteine phosphatase 1 (PPlc) qui agit comme un inhibiteur retro-actif de la voie en dephosphorylant la serine 51 de eIF2a lorsque les conditions normales sont retablies (NOVOA et al, 2001).

1.5.7. Activation des facteurs de transcription heat shock et synthese des proteines heat shock

L'exposition des cellules a des conditions de stress declenche l'activation d'un facteur de transcription appele heat shock factor 1 (HSF1). En conditions normales, ce facteur est maintenu sous une forme monomerique inactive par une interaction intramoleculaire et des chaperonnes moleculaires (ABRAVAYA et al, 1992; RABINDRAN et al, 1994). L'activation de HSF1 en conditions de stress survient suite a l'homo-trimerisation des molecules de HSF1 (ZUO et al, 1994). De plus, la fonction de transactivation des facteurs de transcription du choc thermique necessite la translocation au noyau mediee par des signaux de localisation nucleaire situes dans les HSF (NAKAI et ISHIKAWA, 2000; SHELDON et KINGSTON, 1993; ZANDI et

al, 1997). L'hyperphosphorylation sur serines de HSF1 active sa fonction de

transactivation et induit l'expression des genes de proteines heat shock (Hsp), des chaperonnes moleculaires. Ces genes possedent des elements heat shock (HSE) dans leur region promotrice qui sont lies specifiquement par le domaine helice-tour-helice du facteur HSF1 active (PELHAM, 1982). Lors d'un stress, les membres de la famille Hsp70 sont induits davantage que les autres Hsp, particulierement Hsp72, qui

(38)

constitue la majeure chaperonne induite lors d'un stress proteotoxique et Grp78/BiP, qui lie les proteines anormalement repliees dans le RE lors de la reponse UPR (SANTORO, 2000). Les membres de la famille Hsp40 (Hdj) sont en general des cofacteurs des Hsp70 et ils s'y associent pour stimuler leur activite ATPase. De nombreuses petites proteines heat shock (sHsp) sont induites en conditions de stress dont Hsp27 et l'a-B-cristalline (HEAD et al, 1994). L'inhibition de la reponse transcriptionnelle initiee par HSF1 s'effectue rapidement par la dissociation des trimeres de HSF1 et la perte de son activite de liaison a l'ADN. Le facteur HSBP1

{heat shock binding protein 1) lie le HSF1 trimerique par le biais de repetitions

hydrophobes et recrute Hsp70, un mecanisme que Ton presume responsable de la dissociation des trimeres de HSF1 (SATYAL et al, 1998).

1.5.8. L'apoptose et la survie cellulaire en conditions de stress

Generalement, la reponse au stress integree permet aux cellules de survivre un certain temps dans des conditions defavorables. Lorsque le stress est aboli, la dephosphorylation rapide du facteur eIF2a et l'inactivation de HSF1 entrainent une inhibition rapide de la reponse au stress et promeuvent le retour au metabolisme normal de la cellule. Toutefois, un stress prolonge ou 1'exposition a des concentrations elevees d'agents toxiques entrainent l'activation de la voie apoptotique intrinseque des caspases. Cette activation est vraisemblablement initiee par la caspase-2 qui, une fois activee, entraine la relache du cytochrome C, de la proteine pro-apoptotique Smac/DIABLO et du facteur inducteur d'apoptose AIF (apoptosis

(39)

inducing factor) de la mitochondrie (CHEUNG et al, 2006; LASSUS et al, 2002). La

relache de ces facteurs dans le cytoplasme initie la formation de l'apoptosome cyt c-Apaf-1 qui active la caspase-9, qui a son tour active les caspases effectrices caspase-3 et caspase-7 (KROEMER et al, 1998).

1.6. Regulation de la proteine prion par divers types de stress

1.6.1. Regulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle du gene PRNP par divers types de stress

Shyu et ses collegues ont demontre que l'expression de la proteine prion cellulaire etait stimulee lors d'un choc thermique (SHYU et al, 2002; SHYU et al, 2000). La transcription de PrPc induite lors de ce type de stress est attribuable a la presence de

deux elements heat shock (HSE) situes dans le promoteur du gene de la proteine prion (SHYU et al, 2002). En conditions oxydatives, l'accumulation d'especes d'oxygene reactives (ROS) entraine le clivage de l'extremite amino-terminale de PrPc qui

contient la region des repetitions octapeptide, un processus appele clivage (3 (MCMAHON et al, 2001; WATT et al, 2005). Cette reaction de clivage s'effectue a un pH optimal de 7.0, necessite la presence d'ions Cu et est partiellement inhibee par d'autres ions divalents dont Zn2+, Mn2+ et Ca2+ (MCMAHON et al, 2001). Des

cellules qui expriment un mutant dans lequel les repetitions octapeptide ont ete supprimees (PrPAOct), un mutant ayant 9 copies supplementaires des repetitions octapeptide associe aux formes familiales d'encephalopathies (PG14) ou un mutant associe au GSS (Al 16V) ne subissent pas de clivage p de la proteine prion. De plus,

(40)

ces cellules ont un niveau de radicaux libres superieur et une activite glutathione peroxydase reduite par rapport aux cellules controles (WATT et al, 2005). Des variantes de cellules de rat PC 12 selectionnees pour leur forte tolerance a la toxicite du cuivre, expriment des niveaux de PrPc environ deux a trois fois superieurs aux

cellules PC12 controles (BROWN et al, 1997a). Un autre modele d'induction de dommages oxydatifs bien documente est la therapie par l'oxygene hyperbare (HBO) (SPEIT et al, 1998; SPEIT et al, 2002). Des cellules de neuroblastomes murins N18 incubees en presence de 100 % oxygene a une pression de 3 atmospheres absolus (ATA) produisent de 2 a 2,5 fois plus d'ARNm de PrPc et 2 fois plus de la proteine

PrPc que des cellules controles non traitees (SHYU et al, 2004). Depuis, de

nombreuses etudes ont demontre une implication de la proteine prion dans les mecanismes de survie en reponse au stress oxydatif (BROWN et al, 1997b; CHOI et

al, 2007; ZENG et al, 2003). En plus du stress oxydatif et du choc thermique,

l'hypoglycemie stimule l'expression de la proteine prion. Des cellules neuronales N18 incubees dans un milieu reduit en glucose revelent des quantites accrues de l'ARNm et de la proteine PrPc de meme qu'une activite accrue d'un systeme rapporteur a la

luciferase fusionne au promoteur de PrP (SHYU et al, 2005).

1.7. Problematique et hypotheses de recherche

1.7.1. Enonce de la problematique

II est bien etabli que la surexpression d'une forme cytosolique de PrP (CyPrP) entraine la production d'agregats cytoplasmiques et la mort cellulaire (GRENIER et

(41)

al, 2006; MA, J et al, 2002; RANE et al, 2004). Toutefois, nos connaissances sur les

mecanismes qui entrainent la mort cellulaire en reponse a la production d'agresomes de PrP demeurent obscures et comptent quelques theories, telles que la liaison de proteines anti-apoptotique (Bcl-2) ou pro-apoptotiques (NRAGE) par CyPrP et une alteration des bicouches phopholipidiques par l'interaction de CyPrP (BRAGASON et PALSDOTTIR, 2005; RAMBOLD et al, 2006; WANG et al, 2006). On peut presumer que l'apoptose peut etre declenchee lorsque la taille de l'agresome (i.e. la quantite de proteines agregees dans la cellule) devient trop importante et compromet l'integrite cellulaire. De facon alternative, la mort cellulaire associee a certains agresomes pourrait etre due a la toxicite inherente de certaines proteines dont la proteine prion (puisque des micro-agregats de CyPrP entrainent aussi l'apoptose) (GRENIER et al, 2006). Une particularite des maladies a prions et de plusieurs maladies neurodegeneratives est leur longue periode de latence. La degradation d'agregats toxiques serait done efficace jusqu'a un evenement cellulaire (attribuable a une diminution de l'activite proteasomale, a un stress cellulaire intense, au vieillissement ou a une autre maladie) apres lequel le PrPc produit en trop grande

quantite s'accumulerait dans des inclusions cytoplasmiques et declencherait possiblement l'apoptose. Bien que la reponse aux proteines mal repliees (UPR) soit bien caracterisee pour les proteines anormalement repliees dans le RE, peu de details sont connus sur les mecanismes de reponse cellulaire a un stress analogue localise au cytoplasme.

(42)

1.7.2. Hypotheses et buts

Nous avons voulu determiner s'ilexistait un lien entre la production d'agregats cytoplasmiques de PrP (CyPrP) et la reponse au stress integree. Nous avons emis l'hypothese que la presence d'agregats de CyPrP entraine un stress pour les cellules neuronales qui se traduirait par l'activation d'une reponse au stress cellulaire. De facon alternative, la production d'agregats cytoplasmique pourrait sequestrer ou inhiber certaines composantes de cette reponse et incapaciter la cellule a survivre a differents types de stress. Nos buts sont de determiner si 1) la production d'agregats cytoplasmiques de la proteine prion entraine l'activation ou 1'inhibition de composantes cles de la reponse au stress, 2) la production de CyPrP affecte le metabolisme cellulaire de la synthese proteique, 3) la production de CyPrP entraine une tolerance / sensibilisation a des stress environnementaux.

2. RESULTATS

2.1. Article : Prion protein aggresomes are poly(A)+-ribonucleoprotein

(43)

AVANT-PROPOS

Kevin Goggin, Simon Beaudoin, Catherine Grenier, Andree-Anne Brown et Xavier Roucou

Departement de biochimie, Faculte de medecine et des sciences de la sante, Universite de Sherbrooke, 3001, 12e Avenue Nord, Sherbrooke, QC, J1H 5N4,

Canada

Prion protein aggresomes are poly(A)+ ribonucleoprotein complexes that induce a PKR-mediated deficient cell stress response, Biochim. Biophys. Acta (2007), doi:10.1016/j.bbamcr.2007.10.008

L'article a ete soumis dans sa forme revisee et accepte le 16 octobre 2007 dans

Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research

Cet article est sous presse au moment du depot de ce memoire. Une version publiee en ligne est disponible au www.sciencedirect.com

(44)

LETTRE D'APPROBATION DES CO-AUTEURS

Sherbrooke, le 7 Janvier 2008

A qui de droit,

Par la presente, nous autorisons M. Kevin Goggin a inclure dans son memoire de maitrise Particle intitule: Prion protein aggresomes are poly(A)+-ribonucleoprotein

complexes that induce a PKR-mediated deficient cell stress response. L'article a ete accepte dans Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research et sera publie en version imprimee sous peu.

Simon Beaudoin Catherine Grenier

Andree-Anne Brown Xavier Roucou

(45)

RESUME DE L'ARTICLE

Les agregats proteiques cytoplasmiques coalescent generalement pour former de larges particules appelees agresomes. De recentes etudes ont demontre que la proteine prion (PrP) forme des agresomes dans des cellules infectees de prions et suggerent la presence de ces agregats dans le cerveau d'animaux infectes. La fonction moleculaire des agresomes de PrP est pour 1'instant inconnue. Nos resultats demontrent que les agresomes de PrP initient une reponse au stress cellulaire en activant la kinase dependante de TARN double-brin (PKR). PKR activee phosphoryle le facteur d'initiation de la traduction eIF2a, ce qui resulte en un arret global de la synthese proteique. Toutefois, certaines composantes de la reponse au stress dont l'assemblage de granules de stress et la synthese de la proteine heat shock protein 70 sont reprimees. Nos resultats demontrent que les agresomes de PrP sont des complexes ribonucleoproteiques qui lient les ARN poly(A)+. Les agresomes de PrP pourraient

compromettre certaines fonctions cellulaires des neurones en modifiant leur reponse au stress cellulaire et en induisant l'agregation des ARN poly(A)4.

Ma contribution a cet article a ete significative. J'ai effectue les experiences preliminaires et j'ai contribue aux figures 1 (100%), 2 (50 %), 4 (50 %) et 6 (33 %). J'ai participe a la redaction des sections suivantes du manuscrit: Materiel et methodes, Resultats, Discussion et References. J'ai propose certaines idees enoncees dans la discussion et j'ai participe au processus de correction du manuscrit. Ma contribution aux travaux de recherche presentes dans cet article est d'environ 40 %.

(46)

Prion protein aggresomes are poly(A)+ ribonucleoprotein complexes

that induce a PKR-mediated déficient cell stress response

Kevin Goggin', Simon Beaudoin', Catherine Grenier, Andrée-Anne Brown, Xavier

Roucou*

Department of Biochemistry, Faculty of Medicine, University of Sherbrooke, 3001, 12ème Avenue Nord, Sherbrooke, Québec, Canada JIH 5N4

'

These authors have contributed equally to this work.

* Address correspondence to Dr Xavier Roucou, Department of Biochemistry, Faculty of Medicine, University of Sherbrooke, 3001 12ème Avenue Nord,

Sherbrooke, Québec, Canada JIH 5N4

Tel.:+1 819 346 1110x12248; Fax:+1 819 564 5340.

E-mail: xavier.roucou@usherbrooke.ca

Running Title: PrP aggresomes modify the cell stress response

Keywords: Prion protein; Aggresome; Stress response; PKR; Stress granule

Abbreviations: CyPrP^^'''', cytoplasmic prion protein genetically fused to

EGFP; EGFP, enhanced green fluorescent protein; ER, endoplasmic retieulum; Hsp, beat shock protein; poly(l:C), polyinosinic-polycytidylic acid; PKR,

Références

Documents relatifs

Aunque casi inútiles por poco fiables desde el punto de vista histórico, las menciones que el Fénix dedicó a la Jornada de Inglaterra resultan interesantes

Les résultats des mesures physiologiques sont présentés dans le tableau S.. Les résultats présentés au tableau 5 confirment le faible niveau de la contrainte thermique à ce poste.

Après avoir rappelé les principales études sur le sujet et soulevé les apparentes contradictions des classifications (pin), portant à la fois sur l'œuvre et sur son

Our models are able to express the probability of the ranking between two algorithms to ip in presence of a given estimated uncertainty on the ground truth and in the absence of

Publiées dans le Web de données Linked Data Stockées dans un entrepôt INRA et avec un partage restreint Entrepôt libre : dépôt dans un entrepôt Inra Signaler le jeu de

Cette indépendance envers les ONG, à la fois voulue et subie car elles ne sont que très peu présentes dans la zone, permet aussi de valoriser les personnes qui ressentent souvent

The capability of setting up analytical models for the inflation of a tube allows us to validate finite element simulations, to analyse the influence of processing and

تاجاتنتسلاا : م ملع إاسب لما جمد هأب لوقلا نكيم ابس ا نم ،ةيرربلا دراولما رادإ ةيةيتاتسا نمض إارضرا اسرام .ديعص نم رلكأ ملع كلذو ،إارضرا ةمظسملل ةمادتسلما