Recherche d'un rôle physiologique essentiel pour la bétalactamase et caractérisation d'une activité beta-lactamase dans les cellules de foie de rat

(1)

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FACULTE DE MEDECINE

ms

THESE PRESENTEE

A L'ECOLE DES GRADUES

DE L 'UNIVERSITE LAVAL

POUR L 'OBTENTION

DU GRADE DE PHILOSOPHIAE DOCTOR (Ph.D.)

PAR

MICHEL COUILLARD

MAITRE ES SCIENCES

DE L'UNIVERSITE LAVAL

RECHERCHE D'UNI ROLE PHYSIOLOGIQUE ESSENTIEL POUR LA BETA-

LACTAHASE ET CARACTERISATION D'UNE ACTIVITE BETA-LACTAHASE

DANS LES CELLULES DE FOIE DE RAT

(2)

AVANT- PROPOS

A l'automne 19 8 0, Robert De 1 age, alors étudiant gra dué à la maîtrise en microbiologie médicale, soulignait la

ressemblance entre la structure de base des céphalosporines et

la molécule de nicotinamide adénine dinucléotide. Il s'inter

rogeait sur la possibilité que cette dernière puisse être un

substrat des 6-1actamases. Claude Asselin pour sa part complé

tait sa thèse de maîtrise qui portait sur l'influence de fac

teurs physico-chimiques sur la synthèse de deux g-lactamases

dans une souche d'Enterobacter. A cette époque, Claude Morin

et moi-même étions en quête d'un sujet de thèse qui puisse combler nos aspirations et compétences en matière de recherche.

Les discussions que nous avons eues à l'époque avec Robert Del age et Claude Asselin allaient nous motiver à proposer un

projet de recherche. Celui-ci visait à déterminer le rôle physiologique essentiel des g-lactamases. Les hypothèses de

départ étaient tributaires de sept années de travaux qui eurent lieu dans ce laboratoire sous la direction des professeurs

Roger Guay, Robert Letarte et Jean-Claude Pechère.

La présente thèse de doctorat comporte une revue de la littérature ainsi que quatre chapitres de résultats expéri

mentaux. Les deux premiers constituent l'aboutissement de travaux exécutés conjointement avec mon collègue et ami Claude

Morin. Au début de 1982, il fut décidé que mon travail se

concentrerait sur la mise en évidence et la caractérisation d'une B-lactamase eucaryote. Les deux derniers chapitres abor

dent ces sujets.

La réalisation du projet de recherche et la prépara tion de cette thèse n'auraient pas été possibles sans la colla

(3)

Ill

De veux d'abord souligner la contribution de mon

directeur de thèse, le docteur Dean-Claude Pechère, de mon co

directeur, le docteur Roger G u a y, ainsi que des professeurs

Gilles Richer et Robert Letarte. De désire les remercier pour

m'avoir fourni un encadrement scientifique et des facilités

matériel les. Leurs conseils et leurs encouragements à des

moments parfois difficiles m'ont été précieux. De leur exprime

toute ma gratitude.

D'autres professeurs du Département de microbiologie

ont contribué à ma formation et m'ont fourni une aide à l'une ou l'autre des étapes expérimentales de cette thèse. De veux

remercier les professeurs Hans W. Ackermann, Michel G. Berge

ron, Dean R. Do1 y et Roger Lévesque.

Des professeurs d'autres départements de l'Université

Laval ont également joué un rôle dans la réalisation de ce

projet de recherche en me fournissant une aide technique et

matériel le, ou en me prodiguant des conseils. C'est le cas de Luc Bélanger, Claude Gagnon, Seymour Heisler, Dacques Huot,

Marcel Lalanne, Denis Mayrand, M.R.V. Murthy, Michel P a g é,

Robert Tanguay et Doan Willemot.

De suis également redevable aux nombreux collègues

étudiants et assistants de recherche qui m'ont fourni une aide

indispensable à certaines étapes expérimentales. De désire

souligner plus particulièrement la collaboration de Dean Berge

ron, Maurice Boissinot, Corinne Marlot, Marc Martin, Mario

Martin, Claude Morin, Darnel Rafrafi, Daniel le Ramsay, Docelyne

Tardif et Nancy Watt.

Enfin, je veux adresser mes remerciements au person

nel de la Faculté de médecine, dont Betty Boulet, Docelyne

Gagnon, Francine Garneau, Louiselle Garon, Dean-Marc Dacques,

Brigitte Roy et Amédée Tremblay du Département de microbiolo gie, Françoise Boisvert du Laboratoire de virologie et Pierre

(4)

IV

3'adresse mes remerciements à Gilles Mongrain qui a

préparé les photographies ainsi qu'à Nicole Cauchon et Maurice

Poulin qui ont réalisé les graphiques. 3 e veux souligner le

travail remarquable de Diane Huot Blais qui a collaboré à la

réalisation de ce document et qui a eu la patience de dactylo graphier le manuscrit.

Ces études de doctorat n'auraient pas été réalisées

sans la contribution financière du Fonds de la recherche en

santé du Québec qui m'a attribué une bourse de stagiaire de

recherche pendant la période 1980-1983, de même que du Fonds de

soutien du revenu des étudiants au doctorat de l'Université

Laval. Par 1 'intermédiaire de ces programmes, ce sont les contribuables du Québec qui m'ont accordé ce support et je leur

(5)

RESUME

Cette étude a eu pour but d'élucider le rôle physio logique de l'enzyme 6-lactamase. Nous avons postulé que la 8 -

lactamase n'est pas exclusivement de nature bactérienne, qu'elle est reliée à une fonction physiologique importante et

que cette fonction peut se retrouver chez les mammifères.

Nous avons d'abord entrepris de vérifier le concept

d'universalité des g-lactamases. Des méthodes sensibles de

détection ont été appliquées afin de mesurer la capacité de

souches bactériennes, dites g-1actamases-négatives, de synthé tiser cette enzyme. La présence de 8-1actamase a semblé être

une caractéristique commune aux bactéries grain-négatives. Une

souche de Mycoplasma pneumoniae n'a montré aucune activité de

ce type. Chez les micro-organismes à Gram positif, les actino mycètes Bifidobacterium et Propionibacterium ont montré une

faible activité 6-lactamase. Deux Peptococcus anaerobius et un

Peptostreptococcus productus n'ont pas révélé d'activité 8- lactamase décelable. Ces deux espèces sont des bactéries anaé

robies strictes. Cette observation suggère que la 6-1actamase

peut jouer un rôle dans le métabolisme aérobie des cellules

productrices.

Nous avons ensuite réalisé des expériences métaboli

ques avec des souches d'entérobactéries afin de vérifier si la synthèse de B-lactamase est accrue en aérobiose. Nous avons

mesuré l'effet de l'oxygène sur la synthèse de B-lactamases

inductibles et constitutives, en présence ou non de cyanure de

potassium. De plus, l'influence de la pénicilline, de la

source d'énergie et de la composition du milieu de culture sur

le taux de synthèse de B-lactamase fut évaluée en présence et

en absence d'oxygène. L'aérobiose ainsi que le milieu minimal

(6)

VI

ont augmenté les niveaux des B-lactamases d'Enterobacter et de

Citrobacter. Le cyanure de potassium a freiné l'effet induc

teur de 1'oxygène en aérobiose. Ce résultat semble suggérer

que la synthèse de g-lactamase dépend davantage du fonctionne

ment normal de la chaîne des transporteurs d'électrons que de

l'influence directe de l'oxygène à d'autres niveaux métaboli

ques. Nous avons justifié la nécessité de réaliser ce type

d'expériences avec des souches microbiennes génétiquement défi nies.

A la suite de ces observations, nous avons dirigé nos efforts vers la mise en évidence et la caractérisation d'une

activité g-lactamase dans des cellules de mammifères. Les

méthodes d'études ont été basées sur 1 'interaction des pro

téines de rat avec une gamme d'antibiotiques appartenant aux

principaux groupes de 6-1actamines. Les résultats ont indiqué

que le surnageant 100,000 g d'un homogénat de foie de rat peut

dégrader les g-1actamines. L'activité a été jugée complexe.

L'inactivation de deux céphalosporines chromogéniques, le PADAC (pyridinium-2-azo-p-diméthy 1-ani 1ine chromophore) et la nitro-

céfine, a semblé reposer sur deux mécanismes différents. Les

caractéristiques spectrophotométriques de ces deux substrats et

de leurs produits de dégradation ont rappelé une activité de

type g-lactamase. Nous avons déterminé l'absence de relation

avec d'autres protéines capables de réagir sur les g-lactamines

comme la peptidase rénale, l'albumine et l'acylase.

La présence d'une g-lactamase dans les cellules de

foie de rat pourrait contribuer à élucider son rôle physiologi

que essentiel. Dans cette perspective, nous avons entrepris de

purifier l'activité g-lactamase des cellules de foie de rat. Les tentatives entreprises afin d'isoler la protéine

responsable de l'hydrolyse du PADAC ont échoué. Chaque étape de purification a été caractérisée par une faible récupération

de l'activité enzymatique et, par conséquent, une perte d'acti vité spécifique. Nous avons d'abord attribué ce résultat à

(7)

condi-VII

tions optimales pour stabiliser cette protéine a permis de

déterminer qu'elle nécessite la présence d'un cofacteur, le NADPH. Elle possède un poids moléculaire voisin de 25,000 et

un point isoélectrique d'environ 7.7. Elle a réagi aussi avec

quelques pénames et céphèmes. La protéine qui a dégradé la

nitrocéfine possède un poids moléculaire inférieur à celle qui

a hydro lysé le PADAC et un point isoélectrique près de 5.4. Elle a réagi avec un pénème et un monobactame. Ces propriétés

n'écartent pas la possibilité qu'il s'agit de g-lactamases.

Cependant, l'appartenance définitive de ces protéines à la

famille des 6-lactamases devra attendre leur purification com plète.

(8)

TABLE DES MATIERES

PAGE

AVANT-PROPOS ...

II

RESUME ...

V

TABLE DES MATIERES ...

VIII

LISTE DES TABLEAUX ...

XV

LISTE DES FIGURES ...

XVII

CHAPITRE I - REVUE DE LA LITTERATURE

1

1. INTRODUCTION ... 2

2. LES BETA-LACTAMINES ... 4

2.1. Diversité ... 4 2.2. Structure et classification ... 7 2.2.1. Les pénicillines ... 7 2.2.2. Les céphalosporines ... 11 2.2.3. L'acide clavulanique ... 11

2.2.4. Les carbapé nèmes ... 12

2.2.5. Les g-lactamines monocycliques ... 12

2.3. Mode d'action ... 13

3. LA RESISTANCE BACTERIENNE AUX BETA-LACTAMINES .

16

3.1. Structure de la paroi ... 16

3.1.1. Bactéries gram-né gatives ... 16

3.1.2. Bactéries gram-positives ... 18

3.2.

Aspects génétiques ... 18 3.3. Mécanismes de résistance ... 20 3.3.1. Barrière de perméabilité ... 20

3.3.2.

Modification de la cible ... 20 3.3.3. Tolérance ... 21 3.3.4. Résistance enzymatique ... 21 3.3.4.1. Les 6-lactamases ... 21 3.3.4.2. Les estérases ... 23

VIII

(9)

IX

3.3.4.3. Les acylases ... 24 3.3.5. Conclusion ... 25

4. LES BETA-LACTAMASES

... 26 4.1. Définition ... 26 4.2. Mécanisme d'action ... 26 4.3. Propriétés générales ... 27

4.4. Rôle dans la résistance ... 28

4.5. Classification ... 30

5. LE ROLE PHYSIOLOGIQUE DES BETA-LACTAMASES

... 37

5.1. Introduction ... 37

5.2. Les B-lactamases jouent un rôle comme agents détoxiquants ... 38

5.3. Les g-lactamases jouent un rôle dans le métabo lisme de la paroi ... 40

5.4. Evidences suggérant un rôle des B-lactamases dans d'autres fonctions métaboliques ... 44

5.5. Origine des B-lactamases ... 46

5.5.1. Ressemblance avec les PB P ... 46

5.5.2. Ressemblance avec les protéases ... 49

5.5.3. Modèle évolutif des B-lactamases ... 50

6. LES CELLULES DE MAMMIFERES POSSEDENT-ELLES UNE

BETA-LACTAMASE?

... 53

6.1. Dégradation non-enzymatique ... 54

6.1.1. Réactions nucléophiles ... 54

6.1.2. Réactions électrophiles ... 55

6.1.3. Conséquences biologiques ... 55

6.2. Liaison avec des protéines ... 56

6.2.1. Albumine ... 56

6.2.2. Ligandine ... 56

6.2.3. Autres protéines ... 57

6.3. Biotransformation des B-lactamines ... 58

6.3.1. Dans le sérum ... 58

6.3.2. Dans le foie ... 59

6.3.3. Dans d'autres sites de biotransformation ... 60

6.4. Dégradation enzymatique ... 60

6.4.1. Les B-lactamases ... 61

(10)

X

6.4.3. Les estérases ... 64

6.4.4. La peptidase rénale

... 64

7. MOTIFS ET OBJECTIFS DE

CE TRAVAIL ... 67

CHAPITRE II - UNIVERSALITE DES BETA-LACTAMASES

69

1. INTRODUCTION ... 70

2. MATERIEL ET METHODES ... 72

2.1. Souches bactériennes ... 72

2.2. Détermination de la concentration minimale in hibitrice 72

2.3. Culture des bactéries et préparation de 1 1 ex trait brut 72

2.3.1. Entérobactéries ... 72

2.3.2. Autres bactéries ... 73

2.4. Détermination de 11 activité enzymatique ... 74

2.4.1. Hydrolyse de la nitrocé fine ... 74

2.4.2. Méthode microbiologique de diffusion simple ... 74

2.4.3. Méthode microbiologique d'hydrolyse périphéri que 75

3. RESULTATS ... 76

3.1. Les entérobactéries ... 76

3.2. Les cocci gram-positifs ... 79

3.3. Les actinomycètes ... 79 3.4. Le mycoplasme ... 79

4. DISCUSSION ... 81

4.1. Méthodes d'études ... 81 4.2. Souches bactériennes ... 83 4.3. Universalité ... 86

CHAPITRE III - ROLE DE L'OXYGENE SUR LA SYNTHESE

DES

BETA-LACTAMASES

88

1. INTRODUCTION ... 89

(11)

XI

2. MATERIEL ET METHODES

... 91

2.1. Souches bactériennes ... 91

2.2. Caractéristiques morphologiques et biochimiques des souches étudiées ... 91

2.3. Composition des milieux de culture ... 91

2.4. Culture des bactéries ... 92

2.5. Préparation des extraits bruts ... 92

2.6. Détermination de l'activité enzymatique ... 92

2.7. Essais avec malate et fumarate ... 93

3. RESULTATS ... 94

3.1. Expériences préliminaires ... 94

3.2. Influence des paramètres physico-chimiques sur la synthèse de B-lactamase ... 94

3.3. Essai de 1'activité fumarase ... 95

4. DISCUSSION ... 98

4.1. Expériences préliminaires ... 98

4.2. Influence des paramètres physico-chimiques .... 4.3. Activité fumarase ... 100

4.4. Conclusions ... 101

CHAPITRE IV - INTERACTION DE PROTEINES SOLUBLES DU FOIE

DE RAT AVEC LES BETA-LACTAMINES

104 1 2

1.

INTRODUCTION

... 105

2. MATERIEL ET METHODES

... 107

2.1. Antibiotiques et autres produits chimiques .... 107

2.2. Animaux ... 107

2.3. Préparation des organes ... 108

2.4. Préparation du foie de rat ... 108

2.5. Localisation de la fraction la plus active de 1 1 homogénat ... 109

2.6. Préparation des extraits enzymatiques ... 109

2.7. Chromatographie ... 109

2.8. Détection de l'activité enzymatique ... 111

2.9. Essais de 1 ' activité enzymatique ... 111

(12)

XII

2.11. Méthode iodomé trique ... 113

2.12. Essais immunologiques ... 113

3. RESULTATS ... 114

3.1. Détection d'une activité hydrolytique dans différents organes du rat ... 114

3.2. Localisation de la fraction la plus active du foie de rat ... 114

3.3. Modification de céphalosporines chromogéniques 117 3.4. Essais biologiques ... 117

3.5. Recherche d'une B-lactamase par la méthode iodométrique ... 120

3.6. Essais de compétition ... 120

3.7. Mesure de 1'inhibition par la céfotaxime ... 126

3.8. Détection de la peptidase rénale ... 126

3.9. Effet de 1 ' albumine ... 128

4. DISCUSSION ... 133

CHAPITRE V - CARACTERISATION DE L'ACTIVITE

BETA-LACTAMA-SE DES CELLULES DE

FOIE DE RAT

140 1 2

1. INTRODUCTION ... 141

2. MATERIEL ET METHODES ... 142

2.1. Produits chimiques et antibiotiques ... 142

2.2. Préparation de 1'extrait enzymatique de foie .. 143

2.3. Purification de 1'activité de type B -lactamase 143 2.3.1. Précipitation avec le sulfate d'ammonium ... 143

2.3.2. Chromatographie d'affinité ... 143

2.3.2.1. Préparation de la colonne ... 143

2.3.2.2. Déroulement de la chromatographie ... 144

2.3.3. Chromatographie échangeuse d'ions ... 145

2.3.4. Filtration sur gel ... 145

2.3.5. Ultrafiltration ... 146

2.4. Essai de 1'activité de type B-lactamase ... 146

2.5. Essai des protéases dans l'extrait brut ... 147

2.6. Electrofocalisation ... 147

(13)

XIII

2.6.2. Electrofocalisation en gradient de sucrose .... 148

2.6.2.1. Bande large de pH ... 148

2.6.2.2. Bande étroite de pH ... 149

2.7. Electrophorèse en gel de polyacrylamide ... 149

2.8. Estimation du poids moléculaire ... 149

2.9. Détermination des protéines ... 150

3. RESULTATS ... 151

3.1. Purification de l'activité de type 6-lactamase 151 3.1.1. Précipitation avec le sulfate d'ammonium ... 151

3.1.2. Chromatographie d'affinité ... 151

3.1.3. Chromatographie échangeuse d'ions ... 153

3.1.4. filtration sur gel ... 153

3.2. Détermination des conditions de stabilisation enzymatique ... 156

3.2.1. Effet du tampon et de la force ionique ... 158

3.2.1.1. Influence de la nature et de la composition des tampons ... 158

3.2.1.2. Influence des ions sodique et potassique dans la composition du tampon phosphate ... 158

3.2.1.3. Influence du NaCl ... 161

3.2.2. Effet du pH ... 161

3.2.2.1. Gamme large ... 161

3.2.2.2. Gamme étroite ... 165

3.2.3. Effet de la température ... 165

3.2.3.1. Effet de la température sur la cinétique de la réaction ... 165

3.2.3.2. Effet de la température sur la stabilité enzy matique ... 165

3.2.4. Effet du sucrose et du glycérol ... 168

3.2.4.1. Effet du sucrose ... 168

3.2.4.2. Effet du glycérol ... 170

3.2.5. Effets d'agents oxydants et réducteurs ... 170

3.2.5.1. Effet de l'oxygène ... 170

3.2.5.2. Effet du pCMB ... 170

3.2.5.3. Effet d'agents réducteurs ...

173

(14)

XIV

3.2.6.1. Détermination de 11 activité protéolytique de

1 1 extrait de foie ... 173

3.2.6.2. Influence des inhibiteurs de protéases ... 173

3.2.7. Effet des ions et de 1 1 ED T A ... 177

3.2.7.1. Influence des ions ... 177

3.2.7.2. Influence de 1 'EDTA ... 177

3.2.8. Effet de molécules organiques ... 177

3.2.8.1. Influence de 1 1 ATR et de 5 coenzymes ... 177

3.2.8.2. Dé termination des concentrations optimales de NAD et de

NADP

... 190

3.2.8.3. Influence comparative du NAD, NADH, NADP et N ADP H ... 193

3.3. Dé termination des caractéristiques.physico-chi miques . 193 3.3.1. Poids moléculaires ... 193

3.3.2. Electrofocalisation ... 197

3.3.2.1. Electrofocalisation en gel de polyacrylamide .. 197

3.3.2.2. Electrofocalisation en gradient de sucrose .... 197

4. DISCUSSION

... 200

CHAPITRE

VI

-

CONCLUSION

205

BIBLIOGRAPHIE ... 211

(15)

LISTE DES TABLEAUX

CHAPITRE 1

Tableau 1. Les g-lactamases des bactéries à Gram posi

tif (actinomycètes exceptés) ... 31

Tableau 2. Les g-lactamases des actinomycètes ... 33

Tableau 3. Les g - lactamases des bactéries à Gram néga

tif ... 34

Tableau 4. La classification d1 Ambler ... 36

Tableau 5. Substrats et inhibiteurs de B-lactamases

qui ne possèdent pas l'anneau 6-lactame ... 45

Tableau 6. Activité g-lactamase de PBP ... 47

Tableau 7. Dégradation de pénicillines par une

activi-de type g-lactamase ... 62

Tableau 8. Principales propriétés des peptidases réna

les ... 66

CHAPITRE II

Tableau 9. Activité g-lactamase des anaérobies, des

actinomycètes, du mycoplasme et des entéro

bactéries étudiées ... 77

Tableau 10. Détermination des concentrations minimales

inhibitrices ... 78

Tableau 11. Activité g-lactamase de Bifidobacterium et de Propionibacterium détectée par la mé

thode biologique ... 80

(16)

XVI

CHAPITRE III

Tableau 12. Effet de 11 oxygène, de 1 1 induction et de la

composition du milieu de culture sur la

synthèse de B-lactamase ... 96

Tableau 13. Effet du KCN sur la synthèse de 6-lactamase en milieu minimal ... 97

CHAPITRE IV

Tableau 14. Détermination d'une activité hydrolytique envers les céphalosporines chromogéniques (PADAC et nitrocéfine) dans différents organes du rat ... 115

Tableau 15. Activité d'échantillons de surnageants de foie et d'acylase commerciale envers les céphalosporines chromogéniques PADAC et nitrocéfine ... 118

Tableau 16. Activité du surnageant de foie envers 9 (3- 1actamines évaluée par deux méthodes micro biologiques ... 121

Tableau 17. Résultats de la méthode iodomé trique ... 122

Tableau 18A. Résultats des essais de compétition ... 124

Tableau 18 B. Résultats des essais de compétition ... 125

Tableau 19. Activité de 1'extrait brut et du sérum de rat envers les céphalosporines chromogéni ques ... 129

CHAPITRE X

Tableau 20. Purification de 1'activité de type B-lac tamase par filtration sur gel de Séphacryl 5-200 ... 154

(17)

LISTE DES FIGURES

CHAPITRE 1

Figure 1. L1 évolution des g-lactamines ... 6

Figure 2. g-lactamines dont le cycle azétidinone est

accolé à un pentacycle ... 8

Figure 3. g-lactamines dont le cycle azétidinone est

accolé à un hexacycle insaturé ... .. 9

Figure 4. g-lactamines monocycliques ... 10

Figure 3. Structure de la paroi bactérienne ... 17

Figure 6. Les enzymes hydrolytiques des g-lactamines 22

Figure 7. Modèles évolutifs des g-lactamases ... 51

CHAPITRE IV

Figure 8. Procédure expérimentale utilisée pour frac

tionner l'homogénat de foie ... 110

Figure 9. Localisation de l'activité hydrolytique de

l'homogénat de foie envers le PADAC ... 116

Figure 10. Analyse spectrophotométrique des céphalos

porines chromogéniques et de leur produit

d ' hydrolyse ... 119

Figure 11. Droites de Lineweaver-Burk représentant

1'inhibition de l'extrait de foie par la

céfotaxime ... 127 Figure 12. Détermination spectrophotométrique de 1 ' ac

tivité avec un sérum de chèvre normal et un

sérum de chèvre anti-albumine de rat sur

1'activité enzymatique de l'extrait de foie

de rat ... 130

Figure 13. Immunodiffusion sur lame ... 132

(18)

XVIII

CHAPITRE V.

Figure 14. Pourcentage cumulatif de protéines totales

précipitées et d'unités de 8-lactamases

précipitées en fonction du pourcentage de

saturation en sulfate d1 ammonium ... 152

Figure 15. Modèle d'élution de 11 extrait brut de foie

sur colonne de Séphacryl 5-200 ... 155

Figure 16. Electrophorèse analytique de la filtration

sur Séphacryl 5-200 ... 157 Figure 17. Influence de la nature et de la composition

des tampons en fonction du temps et de la

concentration en Na Cl ... 159

Figure 18. Influence du phosphate monosodique et mono

potassique en fonction du temps et de la

concentration en N a C 1 ... .. 160

Figure 19. Influence de la concentration en N a C1 en

fonction du temps ... 162

Figure 20. Influence du pH sur l'activité enzymatique

restante après différents temps d'incuba

tion à 5 0 C... 163

Figure 21. Activité enzymatique en fonction du p H

(gamme large) ... 164

Figure 22. Activité enzymatique en fonction du p H

(gamme étroite) ... 166

Figure 23. Effet de la température sur l'activité de

l'enzyme hépatique ... 167

Figure 24. Effet de la température sur la stabilité de

1'activité enzymatique du foie en fonction

du temps ... 169

Figure 25. Influence du glycérol sur la stabilité de

l'enzyme hépatique ... .. 171

Figure 26. Effet comparatif de l'azote et de l'oxygène sur la stabilité de l'activité enzymatique

(19)

XIX

Figure 27. Influence du 2-mercaptoéthanol, du dithio-

thréitol et du pCMB sur 1 ' activité de 1 1

en-Figure CM CO

zyme du foie en fonction du temps ... Détermination de l'activité protéolytique

174

Figure 29 .

de l'extrait de foie ...

Influence de 1'aprotinine et de la

leupep-175

Figure 30.

tine sur l'activité de l'enzyme de foie en

fonction du temps ...

Influence de l'ion magnésium sur 1'activité

176

Figure 31 .

de 1'enzyme de foie en fonction du temps ..

Influence de l'ion manganèse sur 1'activité

178

Figure 32.

de l'enzyme de foie en fonction du temps ..

Influence de l'ion potassium sur l'activité

179

Figure 33.

Influence de l'ion calcium sur 1'activité

180

Figure 34 .

Influence de l'ion molybdène sur 1’activité

181

Figure 33.

Influence de l'ion cobalt sur l'activité de

182

Figure 36 .

l'enzyme de foie en fonction du temps ...

Influence de l'ion zinc sur 1'activité de

183

Figure 37.

1'enzyme de foie en fonction du temps ...

Influence de l'ion fer sur l'activité de

184

Figure 38.

Influence de l'ion cuivre sur l'activité de

185

Figure 39.

Influence de 1 ' EDTA sur 1'activité de

l'en-186

Figure 40 .

zyme de foie en fonction du temps ...

Influence des cofacteurs cocarboxylase et

187

Figure 41 .

codécarboxylase ainsi que de l'ATP sur

1'activité de l'enzyme de foie ...

Influence des cofacteurs NAD, NADP et F AD

188

Figure 42 .

sur l'activité de l'enzyme de foie en fonc

tion du temps ...

Détermination de la concentration optimale

189

(20)

Figure 43. Dé termination de la concentration optimale

de NAD pour stabiliser 11 enzyme de foie ... 192

Figure 44. Influence des cofacteurs N AD et NADP, N ADH

et NADR H sur 11 activité de l'enzyme de foie

en fonction du temps ... 194

Figure 45. Estimation du poids moléculaire de l'enzyme

hépatique qui dégrade le PADAC en HPLC sur

gel T S K G3000SW ... 195

Figure 46. Filtration de l'extrait brut de foie sur

gel de Séphacryl 5 -20 0 ... 196

Figure 47. Electrofocalisation de l'extrait brut de

foie en gel de polyacrylamide ... 198

Figure 48. Electrofocalisation en gradient de sucrose

d'un extrait de foie filtré sur Séphacryl

(21)

CHAPITRE I

(22)

2

1. INTRODUCTION

Parmi les développements les plus remarquables en science contemporaine, l'application clinique des antibiotiques

du groupe des B-lactamines apparaît comme un événement mar quant. La découverte de la pénicilline par Fleming (112), puis

les travaux menés à Oxford par Florey, Chain, Abraham et leurs collaborateurs ( 4., 6 8), ont conduit à l'utilisation de ce

composé à des fins thérapeutiques au cours de la seconde guerre

mondiale. L'effort de développement sans précédent qui a été

entrepris à cette époque a permis une production sur grande

échelle de la pénicilline. Les résultats encourageants obtenus c1 iniquement avec la pénicilline ont stimulé la recherche d'au

tres antibiotiques.

Quelques décennies plus tard, on peut évaluer l'im

pact de cette découverte en réalisant ce qu'elle représente

pour la société d'aujourd'hui. D'un point de vue économique,

l'industrie pharmaceutique emploie des dizaines de milliers de

personnes et réalise un chiffre d'affaire dépassant le milliard de dollars (192). D'ailleurs, les agents antimicrobiens cons

tituent un des groupes de médicaments le plus utilisé en méde

cine aujourd'hui.

Au niveau scientifique, l'étude des antibiotiques a permis d'acquérir des connaissances considérables en chimie (363) et en physiologie bactérienne (314). L'étude des mécanis

mes de résistance des bactéries aux antibiotiques a contribué à

paver la voie à des techniques nouvelles en génétique molécu

laire en plus d'intensifier les recherches quant au développe

ment de nouveaux antibiotiques mieux conçus pour contrer les

moyens de défense des micro-organismes.

Cette découverte a eu un impact incommensurable pour

la société lorsque l'on considère les millions d'individus dont

la vie a été sauvée, ou qui se sont vus épargnés de longues

(23)

l'infection. Les antibiotiques ont également permis de raccour cir ou d'éliminer le séjour à l'hôpital. En somme, l'avènement

de l'antib,iothérapie a contribué à l'amélioration des condi

tions de vie ainsi qu'à l'augmentation de l'espérance de vie (314) .

(24)

4

2. LES BETA-LACTAMINES

2.1. Diversité

Les 3-lactamines constituent une des plus anciennes,

la plus importante et la mieux étudiée des classes d'antibioti ques (1_7_). Elles sont uniques parmi les agents antimicrobiens

pour leur activité hautement sélective contre les cellules bactériennes, leur spectre d'activité et leur faible toxicité pour l'homme et l'animal (3_3, 288).

Les (3-lactamines sont des molécules qui réagissent avec deux catégories principales d'enzymes bactériennes (59).

Les premières, certaines des enzymes de la paroi cellulaire,

sont inactivées par les 3-lactamines et représentent les cibles

létales de ces composés. Au contraire les secondes, appelées

3-lactamases, inactivent les 3-lactamines et jouent un rôle

dans la protection de la cellule contre l'attaque des 3-lacta

mines. Nous étudierons ces deux types d'enzymes un peu plus loin .

Le dépistage de micro-organismes producteurs d'anti

biotiques a été la pierre angulaire des programmes de recherche de l'industrie pharmaceutique (405). La grande majorité de ces

études a porté sur des champignons et des actinomycètes capa

bles de produire des substances naturelles avec des structures

chimiques parfois très divergentes. Ces travaux ont permis d'acquérir une bonne connaissance des processus métaboliques menant à leur synthèse biologique (149, 387 ). Par ailleurs,

depuis les premières recherches sur la pénicilline, on a cons

tamment tenté d'accroître la productivité des fermentations d'antibiotiques (218) en utilisant le plus souvent des appro

ches génétiques pour améliorer les souches productrices (15).

Ousqu'à 1970, seulement deux groupes de 3-lactamines

étaient connus: les pénicillines et les céphalosporines. Pen

(25)

5

et céphalosporines, une variété de composés produits par des actinomycètes ont été découverts dont les cépham yci nés, l'acide

c1 avu1 aniqbe et la thiénamycine. Toutes ces substances portent un cycle g-lactame et des analogues ont été développés pour

donner une variété de substances antibactériennes avec des propriétés thérapeutiques intéressantes (109). Plus récemment,

on a isolé des molécules possédant un anneau g-lactame chez des bactéries (154, 271, 365, 405).

La synthèse de nouvelles (3-lactamines a soulevé un intérêt considérable, particulièrement ces dernières années, et

plusieurs méthodes synthétiques ont été employées afin d'obte

nir des molécules qui n' auraient pu être isolées par fermenta tion (151, 340, 418). D'autre part, les découvertes de g-

1actamines non-classiques comme la thiénamycine et la nocardicine ont constitué autant de stimuli auprès des chimistes pour

qu'ils synthétisent de nouveaux analogues de composés à cycle g-lactame que l'on n'a pas retrouvés en nature ( 2_4, 6_1, 324,

420). L'importance croissante et la distribution des bactéries

résistantes ont accéléré les recherches afin de découvrir des antibiotiques plus efficaces (279, 297, 329). Ainsi la struc

ture des nouvelles g-1actamines n'a plus, dans certains cas,

beaucoup de ressemblance avec la molécule de Florey et Chain. Alors que les premières pénicillines étaient utilisées pour

leur pouvoir bactéricide, les molécules brevetées récemment ont

la même capacité, mais ont d'abord été conçues afin d'être insensibles à l'action des g-lactamases (88, 109). D'autres

molécules, appelées "inhibiteurs" ont pour rôle premier de

bloquer l'activité de ces enzymes (7)9, 8_0, 413); l'inhibiteur,

utilisé en conjonction avec une g-laetamine pourtant sensible à

l'action de la g-lactamase, permet de réaliser un traitement adéquat (47 , 269 , 292) .

Le résultat de tous ces efforts constitue un vaste

ensemble d'antibiotiques dont chaque branche se distingue par

sa pharmacodynamie, par son spectre d'activité, ainsi que par sa résistance aux g-lactamases (figure 1).

(26)

1985 1980 1975 1970 1965 1960 1955 1950 1945 y-TALWPI CILLI NE ■BACAMP1C1LLINE CARIIBACILLINE •SULBÉNICILLINE SÇT1CARC1LLINE-' FLUCLOXACILLINE ■CYCLOCILLINE rPIVAMPlCILLINE AZI DOC ILLINE _{r AM0XYC1LLINE}

CLOXACILLIIt V. —OXAC1LL1NE V\ -NAFCILLIIC \ NtMÉTVIICILLINE PHÉNÉTHICILLINE PÉNICILLINE V PÉNICILLINE 6 Penifii 11 h un chryvoqenum CEFTRIAXONE - CÉFOPÉRAZONE -CÉFOTAX1ME - CÉFADROXIL- CÉFACLOR- CÉFAMANDOLE- CÉPHAPIRINE - CÉFAZOLINE--ŒFFÉTAZOLE -CÉFODIZIME - CEFTAZIDIME -CEFSULODINE - CÉFOTI AM - CÉFUROXIME -CÉPERADINE - CÉPHACÉTRILE CÉPHALEXINE CÉPHALORIDINE-•CÉPHALOTHINE 7-ACA CÉPHALOSPORINE C Cepha lor.porium CHLOROCARD1CINE NOCARD1CINE Bactéries

Figure 1. L'évolution des (3-1 actamines (figure

adaptée de G.N. R0LINS0N, référence 305).

(27)

7

2.2. Structure et classification

Les B-lactamines ont toutes en commun un hétérocycle

azétidinone qui comprend une fonction lac tame (amide intra-

cyclique). Ce cycle peut être accolé à d'autres cycles et

porter une variété de radicaux. Des nomenclatures ont été

proposées afin de classer les B-lactamines utilisées c1 inique ment ou présentement à l'étude ( 4^9, 3_S_). Les figures 2,3 et 4

illustrent les molécules caractéristiques de cette famille

d'antibiotiques. Les paragraphes suivants ont pour but de

mettre en évidence les principaux groupes de B-lactamines et

quelques membres représentatifs. Le lecteur peut consulter des volumes spécialisés (9_7, 2 3 6 , 237 , 238 , 320) s'il désire des

informations plus complètes sur le sujet.

2

.

2

.

1

. keiL n.iç.i 1.1 i.n e.s_

Le groupe des pénicillines a été étudié intensivement (336, 339). La molécule de pénicilline est un produit de

condensation de la L-cystéine, de la D-valine et d'une chaîne

latérale acyle. Les résidus des deux acides aminés constituent

le noyau de toutes les pénicillines, l'acide 6-aminopénicilla- nique (6-A PA). Sa structure de base est constituée d'un double

anneau azétidinone-thiazo1idine (figure 2-A). Le 6-APA est le

point de départ pour la synthèse de la plupart des pénicillines (305). Les différences dans les propriétés biologiques et

pharmacologiques des diverses pénicillines sont principalement

tributaires de la chaîne latérale en position 6. Celle-ci peut par exemple rendre la pénicilline résistante à la dégradation

par une B-lactamase, tolérante à l'acidité gastrique ou capable

de pénétrer l'enveloppe externe des bactéries à Gram négatif (33, 38). Théoriquement, n'importe quelle chaîne peut être

liée par des moyens chimiques avec le noyau 6-APA pour former une nouvelle pénicilline (336).

(28)

8

PÉNICILLINES Pénici 11 i ne G Méthicilli ne Ampicilline Cloxaci11ine Méci11inam

COOH

Péname

Acide 6-amino-pënicillanique

COOH

Témocilline

COOH

Sch 29482

COOH

Pénème

Acide clavulanique

COOH

Clavame ou oxapéname

Peu de molécules de ce type ont été décri tes

Clavème ou oxapénème

Peu de molécules de ce type ont été décri tes

Carbapéname

SCH=CHNH-R

R,-OCH

Acide olivanique Epithiénamycine

COOH

Carbapénème

CH 3 CH

Thiénamycine Imipénème

COOH

Figure 2. (3-lactamines dont le cycle azétidinone

est accolé à un pentacycle.

(29)

9

CÉPHALOSPORINES Acide 7-amino- céphalosporanique

COOH

Céphème

RrCHCONH

Céfamandole Cefsulodine

COOH

R.-CONH

a non-substituées Cëphalothine Cëfotiam

COOH

et aminées Groupe 3 de

COOH

RrC-CONH

Ceftazidime Cëfotaxime Ceftriaxone

COOH

CÉPHAMYCINES

R,- CONH

Cëphamycine C Céfoxitine Cefmëtazole

CH,-R

COOH

,CHÇONH

COOH

Oxacéphème

Moxalactam

COOH

Peu de molécules de ce type ont été décrites

Carbacéphème

Figure 3.

6-1actaminés dont le cycle azëtidinone

est accolé à un hexacycle insaturé.

(30)

10

3 4

Azétidlne-2-one

NH2

HOOC-CHCH

COOH

NOCARDICINES Nocardicine A

RrNH.

OH

O-R,

MONOPHOSPHAMES

RrNH,

conhso

2-

r

3

MONOCARBAMES MONOSULFACTAMES

NH2

nso

3

h ch

3

ccooh

CH,

ch

3 CH,CONHCHCONH-

r

H

j—N \ so

3

h MONOBACTAMES Acide 3-amino- bactamique Azthréonam Suifazécine

(31)

11

2.2.2. _Lej3 céjghjîlosjsoj?ijies

De nombreuses molécules appartiennent à cette famille des g-1actamines (262, 384). Les céphalosporines sont le pro

duit d'une condensation oxydative d'acétate, de L-cystéine, de

D-valine et d'acide a-aminoadipique. Leur noyau, composé de

l'anneau à fonction g-lactame fusionné avec un anneau dihydrothiazine, s'appelle l'acide 7-aminocépha 1osporanique (7 -A CA) (figure 3-A). En général , des substitutions et des modifica

tions en position 7 altèrent l'activité antimicrobienne et le spectre d'activité, alors que des modifications en position 3

résultent d'abord en un changement des propriétés pharmacociné tiques et métaboliques (384).

Contrairement aux plus anciennes céphalosporines,

comme la majorité des céphèmes, les nouvelles molécules ont un

spectre d'activité élargi. Les propriétés de certains de ces

antibiotiques comme la ceftazidime, la ceftriaxone et la moxa-

lactame, leur permettent d'atteindre une proportion importante

de la flore y compris, bien sûr, les micro-organismes patho gènes résistants aux molécules plus anciennes (34).

2.2.3. k'.âc_i.de. c:lavjjl_an_iq_ue_

L'acide clavulanique a été découverte alors que l'on étudiait les produits de fermentation d'actinomycètes (290).

La structure chimique de ce composé ressemble à celle d'un

péname, à la différence qu'un atome d'oxygène remplace l'atome

de soufre sur l'anneau thiazolidine d'où le nom d'oxapéname (figure 2-C). L'acide clavulanique ne possède qu'une faible

activité antibactérienne, mais il peut être un puissant inhibi teur des g-1actamases (2 91, 416).

(32)

12

2.2.4. Les. ç.aj^fcmpj|nènms_

On compte plus d'une trentaine de molécules qui ap partiennent à cette branche. Elles possèdent toutes un pentacycle insaturé avec un carbone en position 1 (figure 2- D ) . On

peut les diviser en quatre groupes selon la nature chimique de

leur chaîne latérale en position 6: isopropy1 e, isopropy1idène,

éthyle et thiénamycine. La thiénamycine fut le premier repré

sentant des carbapénèmes. Cette substance n'était pas adéquate

cliniquement à cause de son instabilité en solution concentrée

et à l'état solide. La synthèse du dérivé amidine, la N - formimidoy1 -thiénamycine (imipénème) a permis l'utilisation à

des fins thérapeutiques d'un composé plus stable et avec des propriétés antibactériennes supérieures à la thiénamycine (171). On retrouve également dans cette branche les acides

olivaniques, chez lesquels on a mis en évidence des propriétés inhibitrices des g -1ac tamases (80).

2.2.5. J.ejs J3-^la_ctjJmjinjis_moinocj£C_l i_gues_

Les g-lactamines monocycliques, aussi appelées mono- lactames (_5J5) comprennent les nocardicines, les monophosphames,

les monocarbames, les monosu 1factames et les monobactames (fi

gure 4). La première molécule à appartenir à cette branche fut

la nocardicine A (12). Par ailleurs, les monobactames, pro

duits par des bactéries saprophytes (154, 365) et des actinomy cètes (254), représentent un développement récent dans le champ

de recherche des nouvelles g-lactamines. Contrairement aux

pénicillines et aux céphalosporines, les monobactames naturels

possèdent une faible activité antibactérienne. On a ainsi dû

procéder à des modifications chimiques de leur structure afin d'améliorer leur potentiel antibactérien (3_8, 71).

(33)

13

2.3. Mode d'action

L'étude des mécanismes d'action des 6-lactamines est

un vaste champ de recherches que nous tenterons de résumer

brièvement. Des revues détaillées sur le sujet ont été pu bliées récemment (288, 357, 400).

Les g-lactamines exercent leur action antibactérienne en interférant dans les stades finaux de la biosynthèse du

peptidog 1 ycan. Le peptidog1ycan est une molécule en forme de filet (288) et un constituant important de la paroi cellulaire de la plupart des bactéries (l_8_, 33). Il fournit une rigidité

à la paroi tout en protégeant le micro-organisme contre les

hautes pressions osmotiques à 1'intérieur de la cellule. Toute

interférence avec la synthèse ou l'hydrolyse du peptidog1ycan

conduit à la formation d'un réseau fragile qui échoue à fournir le support nécessaire à la cellule (288).

Chez toutes les bactéries, à l'exception des myco plasmes (217b), on retrouve sur la membrane cytoplasmique un

ensemble de 3 à 10 protéines différentes, de poids moléculaire

variant de 30,000 à 100,000. Ces protéines lient la péni cilline de façon covalente (380). Quelques auteurs franco phones les appellent PLP (protéines liant les pénicillines)

mais elles sont mieux connues sous le nom de PBP (penicillin binding proteins).

Elles peuvent être séparées par électrophorèse et détectées par des techniques autoradiographiques (356). Les

PBP sont impliquées dans la synthèse du peptidoglycan, la régulation de la croissance cellulaire et la division cellu laire (410). Elles catalysent principalement des réactions de

transglycosylation et de transpeptidation (7_) avec les enzymes

D-carboxypeptida ses et transpeptidases. On a même identifié des PBP qui pourraient jouer un rôle bifonctionnel (193, 241).

Les PBP constituent la cible des effets des B-lactamines qui

(34)

11u-14

1 ai re (incluant des altérations morphologiques comme la produc

tion de formes rondes ou de filaments (219)) à la mort et la

lyse de la cellule bactérienne (245). L'effet létal ou lytique

est une conséquence secondaire de l'inhibition de l'assemblage

de la paroi cellulaire et il implique un groupe de protéines appelées autolysines (347).

Le mécanisme d'action des g-lactamines implique l'a cylation d'un résidu sérine du site actif des peptidases (117 )

pour former un intermédiaire enzyme-antibiotique relativement

stable, et qui empêche l'accès du substrat naturel au site actif (407). Tipper et Strominger (378) ont suggéré que la

pénicilline serait un analogue de structure du substrat des

transpeptidases et des carboxypeptidases, le dipeptide D -

a 1 any 1-D-a 1 an i ne. La comparaison des modèles moléculaires

tridimensionnels de la pénicilline et du constituant dipeptidi-

que du peptidoglycan a montré des similitudes significatives entre les deux (401). Bien que l'hypothèse précédente ait été

vérifiée pour les D-carboxypeptidases de faible poids molécu laire, on n'a pas encore prouvé sa validité pour les P B P à poids moléculaire élevé qui sont les cibles létales de la pénicilline (357).

Des études de la conformation spatiale des atomes ont

démontré que le lien g - 1ac tame des pénicillines et des céphalo

sporines doit être intact pour manifester une activité antibac térienne (288). La découverte récente des g-lactamines monocy

cliques a permis de confirmer l'affirmation précédente et

d'infirmer le pré requis qu'une structure bicyclique est essen tielle pour obtenir une activité biologique (3JL, _LL> 122, 407 ).

L'activité d'une B-laetamine particulière pour chaque P B P dépend de sa taille, de la distribution spatiale des atomes qui

la constituent, ainsi que de la charge des chaînes latérales sur le noyau g -lactame (277).

On a entrepris récemment des études crystallographi-

(35)

15

(57., 69., 99., 239) , des B- lactamines (288) et des PBP (178).

Les connaissances acquises dans ce domaine permettront de des siner de nouveaux antibiotiques qui pourront inactiver des PBP

essentielles sans être reconnus et détruits par les B-lacta mases ( TjS ).

(36)

16

3. LA RESISTANCE BACTERIENNE AUX BETA-LACT AM I NE5

Dans les dernières décennies, les multiples efforts déployés pour combattre les bactéries pathogènes ont permis au

corps médical de compter sur une variété d'antibiotiques pour

traiter les infections. Néanmoins, l'incidence des micro

organismes résistants n'a cessé de croître depuis l'avènement des antibiotiques (92). On a notamment impliqué l'usage répan

du et parfois irrationnel des antibiotiques pour expliquer l'augmentation des bactéries résistantes (200, 203, 297).

D'une façon générale, un antibiotique doit, pour être

efficace, agir sur une ou plusieurs cibles dans la cellule

bactérienne, atteindre des cibles en concentration suffisante

et éviter l'inactivation due à des substances produites par la cellule (296). Pour affecter les bactéries, les 3-1 actamines

doivent traverser les enveloppes externes à la surface de la

cellule, doivent posséder une affinité pour les protéines im pliquées dans la synthèse de la paroi cellulaire et enfin, éviter la destruction par les B-lactamases (243).

3.1. Structure de 1 a paroi

Afin de mieux comprendre les mécanismes responsables

de la résistance bactérienne aux g-lactamines, il apparaît

important de décrire succintement la structure de la paroi

cellulaire bactérienne.

3.1.1. j3 ajc tj| r^Leja Çjr a/n^n^gja M ve^s_

Chez les bactéries à Gram négatif, la paroi est composée de plusieurs couches superposées (figure 5-A). Un

antibiotique doit d'abord traverser la membrane externe compo

sée de lipoprotéines, de lipopolysaccharides, de phospholipides

et de protéines. La membrane externe peut être considérée comme une double couche hydrophobe parsemée de canaux (porines)

(37)

17 A- Bactéries gram-négatives

MEMBRANE EXTERNE ESPACE PÉRIPLASMIQUE hEMBRANE CYTOPLASMIQUE

m ? ? fi ? «

PROTÉINE PORINE PHOSPHOLIPIDS LIPOPOLYSACCHARIDE LIPOPROTÉINE PEPTIDOGLYCAN BÊTA-LACTAMASE PBP PROTÉINE DE TRANSPORT

B- Bactéries gram-positives

CAPSULE PEPTIDOGLYCAN MEMBRANE CYTOPLASMIQUE

mnRRmmmfljam—

6 6 U ü> & b

otf o o o o o o olf o 0 <>

BÊTA-LACTAMASE

HYDRATE DE CARBONE

PROTÉINE

PHOSPHOLIPIDS

PROTÉINE

(38)

18

et de polysaccharides hydrophiles. La double couche est ancrée

à des points spécifiques au peptidoglycan sous-jacent. Une molécule d'antibiotique, ou toute autre molécule n'utilisant

pas un système de transport spécifique, est forcée d'ouvrir une brèche dans cette barrière pour atteindre sa cible. Deux voies

sont possibles. La première est hydrophile: on pense que la majorité des g-lactamines empruntent les porines constituées

d'un canal rempli d'eau et qui donne accès à l'espace périplas- mique (253, 325, 426). La seconde, utilisée par des antibioti

ques hydrophobes, emprunte la double couche de phospholipides hydrophobes. On a démontré que certaines pénicillines, dont

l'ampicilline, préfèrent cette route (420, 421). Les deux

voies présentent cependant des contraintes à la perméabilité

des molécules. Des facteurs comme la taille et la conformation

des molécules d'antibiotiques, ou la distribution des charges

sur les couches externes de la membrane, peuvent limiter l'accès à une quantité suffisante d'antibiotique vers les

cibles (126, 148, 253). Dans l'espace périplasmique, on

retrouve les protéines cibles (PBP) et les g-lactamases. Ces

dernières peuvent inactiver les g-lactamines qui sont parvenues dans l'espace périplasmique, avant même qu'elles ne puissent se

fixer sur les PB P.

3.1.2. B.a.£tj|r-!e_s Hra.m^po^s_i t_ivj3S

Le problème de perméabilité est presqu'inexistant

chez les bactéries à Gram positif, puisqu'il n'y a pas de membrane externe (figure 5-B). La couche de peptidoglycan est

cependant plus épaisse, mais elle n'empêche pas la diffusion de l'antibiotique vers les protéines cibles sur la membrane cyto plasmique (300). La g-lactamase peut quitter la cellule et

détruire l'antibiotique dans le milieu extracellulaire.

3.2. Aspects génétiques

D'un point de vue strictement génétique, les mécanis

(39)

résistance naturelle, aussi appelée résistance intrinsèque, est

commune à une majorité de souches d'un même groupe de bactéries (125, 300). Par exemple, la résistance naturelle des bactéries

à Gram négatif est due à la présence d'une g-lactamase, mais

surtout à la structure relativement imperméable de leur paroi

cellulaire qui ralentit la diffusion des molécules d'antibioti ques vers leurs cibles (300). C'est le cas notamment de Pseu

domonas aeruginosa chez qui la faible pénétration à travers la

membrane externe le rend hautement résistant à la plupart des g-lactamines (11, 126, 196). On a également invoqué chez cette

espèce une faible affinité de PBP pour les g-lactamines (304)

quoique d'autres travaux soutiennent le contraire (357, 428).

Au contraire, chez les micro-organismes gram-positifs, les g -

1actamines n'ont généralement qu'à traverser la couche du pep tidoglycan pour atteindre les PBP. Cette couche ne semble pas

barrer l'accès à des molécules de la taille des antibiotiques, à moins qu'il n'y ait du matériel capsulaire (glycocalyx) (277)

qui de toute façon n'influencerait que marginalement leur dif

fusion. Baci1 lus meqaterium échappe cependant à la règle (70).

Néanmoins, la présence d'une g-lactamase chez les Staphylococ cus (203) ou le manque d'affinité des PBP pour les g-lacta

mines chez les entérocoques (114, 412) constituent des exemples

de résistance naturelle des bactéries gram-positives.

La résistance acquise est une conséquence de la sé lection sous la pression des antibiotiques. Une bactérie peut

acquérir une résistance par mutation qui affectera par exemple un facteur intrinsèque (35, 106). On verra plus loin que

plusieurs mécanismes de résistance sont tributaires des muta

tions. L'acquisition par une bactérie d'une information géné

tique nouvelle sous forme de plasmides de résistance constitue de loin le facteur primordial (245). Les plasmides sont pré

sents chez presque toutes les espèces de bactéries et sont largement distribués dans la nature (246). La résistance p 1 as-

mi d i q u e peut s'illustrer par la synthèse d'une g-lactamase ( 301), quoiqu'elle puisse également entraîner une modifie

(40)

20

3.3. Mécanismes de résistance

La résistance des bactéries aux g-lactamines est connue depuis 1940 ( 3_) • Cependant, la découverte de bactéries

porteuses de résistances multiples au Japon à la fin des années cinquante (393) a pour ainsi dire ouvert la voie à l'étude des

mécanismes de résistance. Les facteurs qui déterminent la

résistance des bactéries sont multiples, si bien que l'on

reconnaît aujourd'hui quatre mécanismes distincts de résistance bactérienne aux g-1actamines (125).

3.3.1. B.aJLriè.re_de per_mj|ajDi_li_té_

On a vu auparavant que cette barrière peut prévenir

l'accès d'une quantité suffisante d'antibiotique vers les PB P. Des souches mutantes déficientes en porines (158, 159, 228) ou

dont le contenu en lipides de la paroi est modifié (205, 326)

atteignent des niveaux de résistance accrus.

3.3.2. üojliJLi-CaJLio.ns. de_lji ç.i.ble.

Ce mécanisme de résistance implique généralement une

réduction de l'affinité des molécules cibles pour l'antibioti

que. On peut mentionner à titre d'exemple les souches de

Staphylococcus aureus où la méthicilline peut induire la syn thèse d'une P B P supplémentaire qui possède peu d'affinité pour

les 6-lactamines et qui rend les cellules résistantes à ces antibiotiques ( 313, 3 8 5 b). Des altérations de P B P ont été

observées tant pour les bactéries à Gram positif (121, 243,

411) que pour les bactéries à Gram négatif (_8_9_, 228, 355).

L'émergence de ce type de résistance chez des souches cliniques qui sécrètent peu ou pas de g-lactamase illustre bien la facul

té d'adaptation des bactéries et il pourrait bien être une cause commune de résistance dans le futur (357).

(41)

21

3.3.3. To_léra_nce^

Parmi les propriétés remarquables des g-lactamines,

le pouvoir bactéricide est l'une des plus importants. Des

concentrations voisines de g-lactamines permettent d'inhiber la croissance d'une bactérie ou de la tuer in vitro (179). Les

auto lysines du peptidog1ycan agissent comme médiatrices de la mort cellulaire après exposition aux g-lactamines (379). Les

bactéries dont la fonction autolytique est déficiente demeurent

sensibles à l'antibiotique, mais peuvent néanmoins survivre en sa présence. Tomasz et ses collègues ont appelé ce phénomène tolérance (381).

Par définition, une souche tolérante montre une di

vergence entre l'activité inhibitrice et l'activité bactéricide

de l'antibiotique, de telle sorte que la concentration minimale bactéricide (CMB) divisée par la concentration minimale inhibi

trice ( C M I ) est plus grande ou égale à 32 (247, 313). Cepen dant, dans une publication récente sur le sujet (277), on

reconnaît que cette définition ne fait pas 1 'unanimité et que le rapport CMB/CMI peut varier de 8 à plus de 64. La tolérance

se manifeste de plus en plus fréquemment en clinique, particu

lièrement chez des bactéries à Gram positif dont les staphylo coques (313) et les streptocoques (134, 179). Elle s'illustre

par des infections prolongées lorsqu'une thérapie à dose nor male, mais trop faible, est utilisée (213).

3.3.4. üé_si.st _ance_ejnzxroa.t i.qHe_

Trois catégories d'enzymes bactériennes peuvent réa

gir avec les g-lactamines avant qu'elles puissent accéder aux protéines cibles.

3.3.4.1. Les g-lactamases

Elles catalysent l'hydrolyse du lien g-lacta me des pénicillines et des céphalosporines (figure 6). Cette réaction

(42)

22 Céphalosporines

O 11

COOH

ACYLASE

ESTERASE

B-LACTAMASE

COOH

R-C-NH

O

Pénicillines

(43)

23

irréversible détruit le site de l'activité antibactérienne.

Ainsi jouent-elles un rôle très important dans la résistance clinique aux antibiotiques (267, 301, 367). Nous les étudie

rons plus en détail au point 4. Il est cependant opportun de

mentionner qu'en plus de leur fonction hydrolytique, des au

teurs ont postulé que les g - 1ac tamases peuvent bloquer l'accès

des R BP à certaines g-1actamines par un mécanisme appelé bar rière non-hydrolytique (367) ou "trapping" (374). Ce type de

résistance affecterait principalement les céphalosporines stables aux g-lactamases ( .5 _3 , 270 , 2 80 , 3_21_, 323 ) . On

l'observe particulièrement chez les bactéries à Gram négatif qui possèdent une g -1actamase inductible (12 8, 129). Celle-ci

est déréprimée de façon stable par mutation ou de façon réver sible par l'antibiotique qui agit comme un inducteur (130, 204,

321). La résistance aux nouvelles céphalosporines serait ainsi

causée par une production accrue de g - lactamases qui vont lier les molécules d'antibiotiques en un complexe stable (270). En

condition d'excès d'enzymes, il serait peu probable que l'anti biotique puisse atteindre les P BP en quantité suffisante (322).

Vu et Nikaido (393) ont récemment mis en doute la théorie du

"trapping". D'après eux, la résistance des bactéries aux 6 -

lactamines à spectre large s'expliquerait davantage par un mécanisme hydrolytique: la g -1ac t amase qu'ils ont étudiée peut

inactiver, quoique lentement, les molécules d'antibiotiques

ayant franchi la barrière de perméabilité.

3.3.4.2. Les estérases

Les estérases (364), aussi appelées acylesté rases

(2 33), acéty1 esté rases (2 67) ou hydrolases d'ester carbox y 1i-

ques (84), hydro 1ysent le groupement acétoxyméthyle en position

3 de l'anneau dihydrothiazine de certaines céphalosporines comme la céphalosporine C (37) (figure 6). Une fois transformé

en désacéty1-cépha1osporine, l'antibiotique possède une activi té antibactérienne réduite (364). Les estérases sont largement

distribuées dans la nature (387). Elles ont été isolées chez des bactéries (1^, 3J7 , 2 3 3), des actinomycètes ( 9_8_) et des

(44)

24

champignons (260). Ces enzymes ne constituent pas un facteur

important dans la résistance aux g-lactamines des bactéries pathogènes (267).

3.3.4.3. Les acylases

Cette classe d'enzymes a été particulièrement bien étudiée à cause du rôle qu'elle joue dans la fabrication de 6 - lactamines semisynthétiques (212, 388). Les acylases sont

connues sous une variété d'appellations: pénicilline amidase,

pénamidase, pénicilline G acylase, "penicillin splitting and

synthesizing enzyme" , acy11ransférase , pénicilline déacylase, pénicilline acylase, pénicilline G amidohydro1ase (138); amido-

hydrolase (296); amidase (364). Elles ont la propriété de

rompre par hydrolyse le lien peptidique par lequel le groupe ment latéral acy1e en position 6 de la molécule de pénicilline est relié au noyau 6-APA (figure 6). Pour les céphalosporines,

l'enzyme agit en position 7. Dans un cas ou dans l'autre,

1 ' acy1ase réduit l'activité biologique de l'antibiotique sans complètement l'inactiver (9_i, 10 3, 137, 296). Dans certaines

conditions, l'action de l'enzyme est réversible (387).

Les micro-organismes capables de synthétiser une acy

lase sont nombreux et se distribuent tant chez les bactéries et les actinomycètes, que chez les levures et moisissures (387).

Une des premières classifications considérait les acylases fongiques (type I) et les acylases bactériennes (type II)

séparément (138). Aujourd'hui, on distingue les acylases selon

leur origine et la spécificité de leur(s) substrat(s): les

pénicillines acylases microbiennes (3 types), les céphalospo

rines acylases microbiennes et les pénicillines acylases non- microbiennes (389).

Les propriétés biochimiques particulières des acy lases, comme une faible affinité pour leurs substrats, une

activité optimale à pH alcalin et un pouvoir antibactérien du

(45)

25

de ces enzymes dans la résistance bactérienne (138, 267, 296).

3.3.5. Conclusion

En résumé, 1'émergence de la résistance aux g-lacta-

mines a considérablement réduit la valeur d'antibiotiques qui

étaient auparavant efficaces contre des espèces comme Entero- bacter, Serratia, Citrobacter, Pseudomonas ou Staphylococcus.

Ces micro-organismes comme d'autres, réussissent à tenir en

échec les moyens entrepris pour les contrôler afin d'assurer leur survivance. Il est possible que des mécanismes d'adapta

tion encore inconnus puissent apparaître dans l'avenir en ré ponse à l'introduction de nouvelles molécules (187).

(46)

26

4. LES BETA-LACTAMASES

4.1. Définition

Ainsi que nous l'avons vu précédemment, les B -lacta mase s [pénicilline (céphalosporine) g - 1actame amidohydrolases,

EC 3.5.2.6 3 hydrolysent le lien g- lactame des pénicillines et

des céphalosporines susceptibles pour donner un produit biolo giquement inactif (figure 6). Les produits d'hydrolyse des

pénicillines, les pénici11oates, sont stables et peuvent être facilement détectés (364, 361), Puisqu'ils portent un groupe

ment acide de plus que la molécule mère, on les retrouve par fois sous l'appellation d'acides pénicil lo'iques. Par contre,

les cépha1osporoates issus de l'hydrolyse des céphalosporines sont des intermédiaires instables (142). Ils subissent par

conséquent d'autres étapes de dégradation en fonction de la nature du radical chimique en position 3 (249). Il est par

conséquent difficile de les détecter. Quant aux autres molé cules qui contiennent un anneau g -1actame (comme les céphamy-

cines, les clavames, les oxacéphèmes, les carbapénèmes et les monobactames), la plupart sont considérés comme des substrats

potentiels pour les g-lactamases. En outre, certaines de ces

nouvelles molécules semblent être hydro 1ysées par une variété de g-lactamases (225), mais l'identification des produits d'hy

drolyse n'a pas encore été réalisée (366).

4.2. Mécanisme d'action

A l'aide de dérivés halogénés de la pénicilline comme

l'acide 6-g-bromopénicillanique, on a démontré qu'une sérine était responsable de l'attaque du cycle g-lactame ((7(7, 186).

Cette attaque provoque l'ouverture de l'anneau pour former une acy1-enzyme. Chimiquement, 1'acy1-enzyme est dérivée du grou pement a-carboxyle de l'acide pénicilloïque et du groupement

hydroxyle de la sérine. C'est l'hydrolyse de l'ester de sérine

et non l'ouverture du cycle g-lactame qui constituerait l'étape limitative de la réaction (18 5). En outre, malgré leur re 1 a

(47)

27

t i v e spécificité envers des composés à cycle g-lactame, les

g-lactamases possèdent un site actif assez souple leur permet

tant de s'adapter à une vaste gamme de substrats (5_9, 12).

Les B-lactamases de Staphylococcus aureus (6_4) , de Bacillus cereus type I (186) et TEM (110 ) possèdent toutes un

site actif où la sérine joue un rôle prédominant. Par exemple,

la substitution de la sérine du site actif par la thréonine rend l'enzyme TEM totalement inactive ( 90). Ces B-lactamases

montrent aussi une homologie de la séquence des acides aminés (_8). Par ailleurs, on a isolé des acy 1-enzymes chez Enterobac-

ter c 1 oacae P99 (4_0, 168), Pseudomonas aeruginosa et Escheri

chia coli K12 (184, 186). La séquence peptidique de ces B-

lactamases chromosomiques est voisine mais elle diffère consi dérablement des trois premières (4JD, 185). S'il semble que les

g-lactamases soient toutes des sérine-enzymes, la B-lactamase

II de Bacillus cereus échappe néanmoins à la règle. En plus, elle diffère des autres par un besoin d'ion Zn++ et par une

absence d'homologie de la séquence d'ADN (144).

4.3. Propriétés générales

Les B-lactamases sont présentes dans une grande di

versité de familles et d'espèces microbiennes, notamment chez les bactéries à Gram positif (_5, ^2, 101), les bactéries à Gram négatif (119, 369), les actinomycètes (100, 267, 394), les

mycobactéries (176), les levures (227) et les cyanobactéries (201). Elles possèdent des poids moléculaires variant de

12,000 (223) à 186,000 (391). En dépit de leur spécificité

pour les composés à cycle B-lactame, les profils d'activité mesurés sur les pénicillines et les céphalosporines montrent

une certaine diversité. Les profils enzymatiques varient de la "pénici11inase" à la "cépha1osporinase", avec toute une gamme d'intermédiaires (301).

L'information génétique peut être portée par le chro mosome, par un plasmide ou un transposon (225). La synthèse de

(48)

28

la protéine est généralement constitutive pour les g-lactamases

plasmidiques et peut être inductible pour plusieurs g-lacta mases chromosomiques (301, 367). Les études des mécanismes

génétiques de régulation de la synthèse ont porté surtout sur les espèces Staphy1ococcus aureus, Bacillus cereus, Bacillus 1 ichenif ormis (133) et chez les entérobactéries, sur Escheri chia coli (161), Enterobacter cloacae (129) et Citrobacter

freundii (328, 422 ). Depuis les travaux d'Ambler ( 9_) sur la

séquence en acides aminés des g-lactamases, on a récolté de

nombreuses informations sur la structure du gène actif, 11 homo logie des séquences et la nature de la séquence "signal". La présence de celle-ci, aussi appelée peptide de tête, a été

remarquée chez toutes les g-lactamases étudiées jusqu'à présent (230). De nature hydrophobique et comportant environ 25 acides aminés (16), elle facilite l'exportation de la protéine vers la

membrane (93). La séquence est coupée avant ou juste après le

passage de la protéine à travers la membrane (215). La g -

lactamase est une enzyme périp 1 asmique chez les bactéries grain-

négatives. Quant aux micro-organismes gram-positifs, on peut retrouver une forme de g-lactamase hydrophobe liée à la mem

brane ainsi qu'une exoenzyme hydrosoluble, toutes les deux produites par le même gène (250).

4.4. Rôle dans 1a résistance

Le rôle des g-lactamases dans la résistance des bac

téries pathogènes aux g-1actamines est un sujet très controver

sé et qui doit être réévalué très souvent à cause de l'évolu

tion rapide des connaissances. Par ailleurs, l'activité d'une

g-laetamine particulière sur une souche bactérienne donnée est

souvent le résultat d'une combinaison complexe de facteurs (voir point 3) dans lesquels la g-lactamase peut jouer une

variété de rôles (225, 298). Sabath (315) a proposé une vision

simplifiée de ce sujet; un micro-organisme produit une g- lactamase qui inactive l'antibiotique avant que l'antibiotique n'ait causé des changements irréversibles dans la cellule bac