Quantification des poussières,des pathogènes humains
et des gènes de résistance dans l'air des bâtiments
porcins québécois
Mémoire
Jonathan Pilote
Maîtrise en microbiologie - avec mémoire
Maître ès sciences (M. Sc.)
Quantification des poussières, des pathogènes
humains et des gènes de résistance dans les
bâtiments porcins québécois
Mémoire
Jonathan Pilote
Sous la direction de :
Caroline Duchaine
Résumé
L’évolution de l’industrie porcine québécoise et canadienne caractérisée par une densification des troupeaux a, dans les dernières décennies, mené à une augmentation du confinement dans les bâtiments d’élevage. Les éleveurs de carrières occupent ces bâtiments pour une partie considérable de leur journée de travail, s’exposant ainsi à cet environnement confiné. Les porcheries sont reconnues comme étant des environnements fortement contaminés en poussières et bioaérosols. De plus, des effets néfastes sur la santé des occupants sont soupçonnés dans ces nouveaux bâtiments. Cette étude vise à détecter la présence et à quantifier six pathogènes humains, à mesurer la concentration en poussières et à détecter la présence de gènes de résistance d’importance en médecine humaine dans l’air des porcheries du Québec. Pour ce faire, dix porcheries québécoises ont été visitées et des échantillons d’air ont été prélevés dans chacune d’elle. Les six pathogènes à l’étude ont été investigués par des méthodes traditionnelles de culture et par biologie moléculaire. La concentration des poussières et suspension a été mesurée par gravimétrie ainsi que par lecture directe du diamètre aérodynamique de ces dernières. Les gènes de résistance ont été détectés par biologie moléculaire. Les résultats obtenus renforcent l’hypothèse que les porcheries en environnements tempérés comme celles du Québec et du Canada abritent de fortes concentrations en bioaérosols pouvant potentiellement avoir des effets néfastes sur la santé des travailleurs agricoles.
Abstract
Changes in the swine industry of the Province of Quebec and Canada characterized by larger herds as lead to an increase in confinement levels inside pig buildings. Swine workers occupy these buildings several hours per day, exposing themselves to this confined environment. Pig buildings are environments well known to be heavily contaminated by dust and bioaerosols. Moreover, adverse effects on the health of the occupants are suspected. The present study aims at detecting and quantifying six human pathogens, measuring airborne dust concentrations, and detecting resistance genes of medical importance in the air of swine confinement buildings in the Province of Quebec. To do so, ten pig buildings were visited and air samples were collected in each of them. Human pathogens were investigated using classic culture methods as well as molecular biology. Airborne dust concentrations were calculated using gravimetric methods and a direct measurement of the aerodynamic diameter or particles. Resistance genes were detected by molecular biology. Results obtained during this study reinforce the hypothesis that swine confinement buildings in temperate environments such as the Province of Quebec host high concentrations of bioaerosols which can potentially have adverse effects on the workers’ health.
Table des matières
Résumé ... iii
Abstract ... iv
Table des matières ... v
Liste des tableaux ... vii
Liste des figures ... viii
Liste des abréviations et des sigles ... ix
Remerciements ... x
Avant-Propos ... xi
Introduction ... 1
L’industrie porcine du Canada et du Québec ... 1
Problèmes de santé occupationnels liés aux porcheries ... 2
Les poussières dans les bâtiments d’élevage ... 3
Les bioaérosols ... 4
Bactéries à l’étude ... 6
La résistance aux agents antimicrobiens ... 9
mecA et la résistance à la méticilline... 9
czrC et la résistance au zinc... 10
CTX-M et la résistance aux ß-Lactames ... 11
Mcr-1 et la résistance à la colistine ... 12
Les endotoxines dans les porcheries ... 13
Problématique, objectifs et hypothèses de l’étude ... 13
Problématique ... 13
Objectifs de la recherche ... 15
Hypothèses de recherche ... 16
Partie 1 : Quantification of airborne dust, endotoxins, human pathogens and antibiotic and metal resistance genes in Eastern Canadian swine confinement buildings ... 17
Abstract ... 18
Résumé ... 19
Introduction ... 20
Objectives and Hypotheses ... 24
Methods ... 25
Results ... 29
Discussion ... 33
Partie 2 : Discussion ... 44
Les poussières dans les bâtiments d’élevage ... 44
Les bactéries totales et les pathogènes dans les bâtiments d’élevage ... 44
Les gènes de résistance dans les bâtiments d’élevage ... 45
Liste des tableaux
Table 1: Conditions used for quantification of culturable human pathogens and mesophilic bacteria
Table 2 : Primers and probes used for PCR quantification of the studied human pathogens and resistance genes
Table 3: Concentrations for the targeted human pathogens obtained by quantitative PCR and culture
Liste des figures
Figure 1 : Airborne dust concentrations in studied SCBs Figure 2 : Airborne endotoxin concentrations in studied SCBs
Figure 3 : Correlation of airborne total dust concentrations obtained using gravimetric analysis (closed faced 37mm cassettes) and real-time measurements (DustTrak DRX Aerosol
Liste des abréviations et des sigles
CA : community associated
CDI : clostridium difficile infection CFU : colony-forming unit
DNA : deoxyribonucleic acid EU : Endotoxin unit kg : kilogramme l : litre
LA : livestock associated
LAL : Limulus amoebocyte lysate LPS : lipopolysaccharide m : mètre m3 : mètre cube mg : milligramme min : minute mm : millimètre
MRSA : methicilin resistant Staphylococcus aureus PBP : penicillin binding protein
PM : particulate matter PVC : Polyvinyl chloride
qPCR : quantitative polymerase chain reaction SARM : Staphylococcus aureus résistant à la méticilline SCB : swine confinement building
SCCmec : Staphylococcal chromosomic cassette mec
VEMS : volume expiratoire maximal par seconde µl : microlitre
Remerciements
À Caroline, je n’aurais pas pu rêver côtoyer meilleur mentor durant c’est deux années passées au sein de ton équipe de recherche. Mise à part, les projets de recherche fascinants et les équipements à la fine pointe, ce qui rend ton équipe aussi unique et intéressante, c’est toi. Je ne saurais assez te remercier pour les beaux moments que j’ai pu vivre grâce à toi. Ne laisse surtout rien changé ton sens de l’humour…unique. Ce fût un honneur de pouvoir être, l’espace d’un instant, l’un de tes étudiants.
Un merci des plus spécial à Valérie. Tu as su me guider comme personne n’aurait pu le faire durant plus de deux ans et je t’en serai à jamais reconnaissant. Les longues journées passées avec toi mon fait découvrir la femme extraordinairement passionnée que tu es.
Marc et Nathalie. Continuez à garder le fort comme vous le faites si bien depuis des années. Une équipe de recherche n’est rien sans des piliers solides et c’est exactement ce que vous êtes. Merci pour les milles et uns conseils et les commentaires constructifs. Vous êtes les meilleurs.
Hamza, Marie-Ève, Vanessa, Laetitia et Évelyne. Vous aurez fait en sorte que ces deux années passent trop vite. Ce fût un énorme plaisir d’apprendre à connaître chacun d’entre vous. J’espère sérieusement vous revoir dans notre vie future, ce sera ma tournée.
Merci aux membres de mon comité aviseur, Yan et Matthieu. Vos judicieux conseils ont été très appréciés tout au long de ce projet. Nous n’aurions pas pu y arriver sans vous.
J’aimerais terminer en remerciant ma famille qui m’a toujours encouragé tant dans ma vie académique, sportive et sociale. Votre présence a fait de moi ce que je suis aujourd’hui, pour le meilleur et pour le pire. Je vous aime.
Avant-Propos
Le présent mémoire est composé de trois parties distinctes. En premier lieu, une introduction s’intéressant aux bâtiments d’élevage porcins québécois et aux effets de cet environnement sur les travailleurs de l’industrie. Des concepts généraux d’aérobiologie seront aussi mentionnés. La secondes section arborant la méthodologie et les résultats sera présentée sous la forme d’un article scientifique soumis le 2 mai 2018 dans Aerobiologia (numéro de manuscrit : AERO-D-18-00043). La troisième et dernière section comportera une discussion sur les résultats présentés dans l’article ainsi qu’une conclusion.
Introduction
L’industrie porcine du Canada et du Québec
Le Canada est l’un de leader mondial en ce qui a trait à la production porcine. L’industrie porcine représente, en effet, une partie importante de l’économie du pays. Le Canada se positionne en ce moment au cinquième échelon des plus grands exportateurs de porcs au niveau mondial avec 9% de l’exportation mondiale avec la moitié de son rendement produit par la province de Québec uniquement. Chaque année, le Québec produit plus de 8 millions de porcs destinés à l’alimentation, soit environ un porc par habitant (Canada-Pork, 2015). Ces animaux sont engraissés dans les quelque 1900 établissements abritant le cheptel québécois. Cette production est assurée chaque année par plus de 10 000 travailleurs oeuvrant dans ce secteur (Brisson, 2014). Au cours de dernières décennies, le visage de l’industrie porcine nord-américaine a grandement changé. Les élevages familiaux de quelques dizaines de porcs ont maintenant fait place en grande majorité aux élevages commerciaux avec des lots de milliers d’animaux afin de répondre à la demande (Canada-Pork, 2015). En 1976, la porcherie canadienne moyenne abritait 91 porcs. En 2016, ce chiffre est passé à environ 1900. C’est donc dire qu’en l’espace de 40 ans, le nombre de porcs par ferme a augmenté de 2 088%. Par contre, le nombre de porcheries au pays a diminué de 913% durant la même période. Donc plus de porcs répartis dans moins de porcheries. En parallèle avec ce phénomène vient l’apparition des éleveurs de carrières. C’est ouvriers agricoles ne sont pas propriétaires de porcheries, mais sont employés par des compagnies afin de s’occuper de la manutention dans plusieurs porcheries à la fois, prolongeant ainsi leur temps d’exposition à l’air de ces derniers. Afin d’augmenter le rendement de leurs troupeaux et par le fait même augmenter la rentabilité de leur entreprise, certains éleveurs utilisent des antibiotiques et des métaux lourds afin de stimuler la croissance des porcs. Cette pratique contribue à l’apparition constante de nouvelles souches bactériennes résistantes à une quantité croissante d’agents antimicrobiens. En effet, l’utilisation d’antibiotiques en prophylaxie créer une pression de sélection sur la communauté bactérienne favorisant la colonisation de l’environnement par les bactéries portant des gènes de résistances. Ces derniers peuvent ensuite être disséminés dans la communauté bactérienne par
nouvellement résistantes sont les agents responsables d’une partie non négligeable des infections récences par les centres de soins de santé. On peut penser à la souche ST398 de Staphylococcus aureus maintenant bien établie dans la communauté et causant des infections répertoriées dans les hôpitaux de l’ensemble de la province (van der Mee-Marquet et al., 2011).
En raison de conditions climatiques présentent au Québec, les bâtiments sont entièrement fermés afin de pouvoir mieux contrôler l’environnement dans lequel les porcs sont gardés. Le contrôle s’exerce essentiellement à l’aide du débit de ventilation et d’unités de chauffage. En hiver, le taux de changement d’air est très bas afin d’apporter le moins d’air possible de l’extérieur et de conserver la chaleur à l’intérieur du bâtiment. Combiné avec la forte densité en animaux dans le bâtiment, ces deux facteurs font en sorte que l’air intérieur se charge rapidement en contaminants divers. On peut aussi parler de niveau de confinement plus élevé en hiver qu’en été (Duchaine et al., 2000).
Problèmes de santé occupationnels liés aux porcheries
Comme mentionné plus haut, les bâtiments porcins sont considérés comme un environnement hautement contaminé au niveau de la qualité de l’air. Les éleveurs de porcs sont donc exposés constamment à cet air chargé en contaminants. Les gaz, la poussière et les bioaérosols en suspension peuvent mener au développement de diverses pathologies, la plupart respiratoires (Cormier et al., 1991; Douwes et al., 2003; Keessen et al., 2013; Radon et al., 2002). Le travail réalisé lors d’une étude antérieure a permis d’établir un lien direct entre le nombre d’heures passées au sein d’un élevage porcin et le risque de contracter un ou plusieurs problèmes respiratoires liés aux contaminants de l’air (Donham et al., 1989). Dans le cas des éleveurs de porcs, on parle plus de symptômes chroniques acquis sur le long terme, la bronchite chronique étant un bon exemple, contrairement aux effets d’une exposition aiguë constatés chez des personnes naïves (Heederik et al., 2007).
Les communautés résidant dans des zones géographiques abritant de fortes concentrations en bâtiments d’élevage agricoles sont également touchées par la qualité de l’air émanant de ces
étaient plus significativement plus susceptibles de rapporter des cas de respirations sifflantes et d’avoir une réduction au niveau de leur volume expiratoire maximal en une seconde (VEMS) (Radon et al., 2002). De plus, il fut démontré que des niveaux élevés d’endotoxines sont retrouvés dans les maisons où les habitants ont des contacts fréquents avec les animaux de la ferme (Douwes et al., 2003). Sachant qu’une exposition prolongée aux endotoxines peut possiblement exacerber l’asthme chez les personnes ayant un stade précoce de la maladie (Thorne et al., 2005). Les personnes asthmatiques sont aussi plus sensibles à l’effet des endotoxines sur les voies respiratoires que les personnes non asthmatiques (Caillaud et al., 2009). Augmentant ainsi les effets néfastes possibles dus à l’exposition à l’air de bâtiments d’engraissement porcins.
La présente étude vise à établir un portrait global de la situation au niveau de certains contaminants de l’air au sein des élevages porcins du Québec. Ce travail se concentre plus spécifiquement sur les bioaérosols tels les poussières, les bactéries et les endotoxines.
Les poussières dans les bâtiments d’élevage
Les poussières sont une constituante ubiquitaire de la majorité des environnements, par contre, leurs concentrations et compositions diffèrent selon les sources et les conditions ambiantes. Le terme poussière, de manière générale, représente de fines particules à la texture fibreuse ou poudreuse en suspension dans l’air ou sédimentée sur une surface. Leur taille diffère grandement selon leur source et le mécanisme par lequel elles sont créées (Yang et al., 2015). En général, on sépare les poussières en différentes sous-populations selon leur taille. Dans le domaine des aérosols, on parle alors de diamètre aérodynamique.
Diamètre aérodynamique
Le diamètre aérodynamique d’une particule représente le diamètre d’une particule parfaitement sphérique possédant les mêmes caractéristiques motrices que la particule en question. En effet, dans les conditions naturelles, il est rare de voir des particules parfaitement sphériques, mais il serait beaucoup trop complexe d’étudier chaque particule individuellement, d’où la notion de diamètre aérodynamique. En général, cette estimation permet de prédire le comportement d’une
particule en particulier dans l’air en la comparant à une particule sphérique de même densité (Flagan, 1988). Dans l’étude des aérosols, on sépare les populations de poussières selon ce diamètre aérodynamique. Au cours de cette étude, nous nous intéresserons plus particulièrement aux PM 10 et aux PM 2.5. PM signifie «particulate matter», soit un solide ou un liquide en suspension dans l’air ambiant.
Les PM 10 correspondent aux particules ayant un diamètre aérodynamique inférieur à 10 microns. Ces dernières sont plus susceptibles de se déposer dans les voies respiratoires supérieurs comme le nasopharynx et le larynx (Kim et al., 2015). Elles sont donc, par le fait même, moins propices à causer des infections pulmonaires, car elles ne pénètrent pas suffisamment l’arbre respiratoire. De la même façon, les PM 2.5, aussi appelées particules fines, correspondent aux particules ayant un diamètre aérodynamique inférieur à 2,5 microns. Ces particules font partie de la fraction respirable des aérosols, soient les particules susceptibles de pénétrer profondément dans le poumon de se déposer dans aussi loin que les alvéoles pulmonaires. Il va donc s’en dire que ces dernières ont plus de chance d’être responsables de pathologies pulmonaires (Kim et al., 2015).
Le diamètre aérodynamique d’une particule dépend d’une multitude de facteurs tels la source, le processus d’aérosolisation, la température ambiante et l’humidité relative de l’environnement pour ne nommer que ceux-ci (Cambra-Lopez et al., 2010).
Les bioaérosols
Le terme bioaérosol fait référence à n’importe quelle entité biologique ou dérivés de cette dernière qui se retrouvent de façon transitoire ou non dans l’air. On parle alors de bactéries, moisissures, virus, endotoxines, pollens, fragments de plantes, squames de peau d’animaux etc. Les bioaérosols sont souvent étroitement liés aux poussières. En effet, il est rare de retrouver une particule biologique aérosolisée en tant que particule unique dans des conditions naturelles. Les bioaérosols sont étroitement liés à la propagation de diverses infections bactériennes et virales. Ont peut penser, entre autres, à la tuberculose pour laquelle la voie de l’air est la seule voie de
contamination entre deux individus connue (Fogel, 2015). Le fait que cette menace pour la santé ne soit pas observable à l’œil nu ne la rend pas moins importante pour autant.
Certains groupes sont plus susceptibles d’être affectés par les bioaérosols. En effet, tout dépendant de l’environnement dans lequel une personne se retrouve, les risques ne sont pas toujours les mêmes. Par exemple, une personne travaillant dans un édifice à bureaux sera exposée en moyenne à 102 par mètre cube d’air bactéries alors qu’un ouvrier agricole travaillant dans une porcherie sera exposé à en moyenne 106 bactéries potentiellement pathogènes par mètre cube d’air (N, 2001)
Sources des bioaérosols dans les porcheries
Les animaux, les lisiers, la nourriture, les litières et le sol sont les principales sources de bioaérosols dans les porcheries (Nehme et al., 2008 2005). Les particules sont mises en suspensions par différents processus allant de la simple respiration des animaux aux machines complexes distribuant la nourriture dans les enclos contenant les porcs. Les mouvements d’air dans le bâtiment jouent aussi un grand rôle dans l’aérosolisation et le maintien des particules en suspension dans l’air (Park et al., 2013). Au cours de cette étude, les bactéries et les endotoxines seront ciblées. Une étude passée réalisée en Amérique du Nord a mesuré des concentrations en bactéries totales dans l’air pouvant atteindre 2×106 CFU/m3 (Letourneau et al., 2010b) .
Les endotoxines, comme leur nom l’indique se retrouve à l’intérieur des cellules bactériennes et qui n’est relâché uniquement lors de la lyse des cellules. Comparativement aux exotoxines sécrétées par certaines bactéries lors de certaines phases de leur cycle cellulaire. Il s’agit en fait du lipopolysaccharide (LPS), un constituant de la membrane externe des bactéries à Gram négatif. La composante toxique du LPS est le lipide A.
Diverses bactéries pouvant être possiblement pathogènes pour les humains ont été mises en évidence dans les bâtiments porcins québécois dans les dernières années (Letourneau et al., 2010a). Des bactéries telles, Clostridium perfringens, Enterococcus sp., Escherichia coli, de Yersinia enterocolitica en plus de gènes de résistance à la tétracycline. Cette étude vise à améliorer la connaissance en matière
de bactéries pathogènes dans les porcheries du Québec en investiguant sur la présence de 6 bactéries potentiellement pathogènes pour l’homme.
Bactéries à l’étude Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus est une bactérie à Gram positif colonisant la majorité des animaux à sang
chaud (Werckenthin et al., 2001). C’est une bactérie commensale de la peau chez les humains et chez les porcs (Agerso et al., 2014). Ce coque fait aussi partie de la flore bactérienne normale du nez (Espinosa-Gongora et al., 2015). Bien qu’inoffensif dans la majorité des situations, des infections de la peau sont possibles en cas de blessures/coupures. Des septicémies peuvent même résulter des cas les plus graves. (Kluytmans et al., 1997).
Une particularité de cette bactérie la rendant plus intéressante au niveau pathologique est son habilité à acquérir des gènes de résistance à divers agents antimicrobiens (Davies and Davies, 2010). En effet, cette bactérie possède une cassette chromosomique de résistance lui permettant de stocker des gènes de résistance acquis par le passé dans son génome (Hanssen and Sollid, 2006; Wisplinghoff et al., 2003). L’exemple le plus populaire étant le Staphylococcus aureus résistant à la méticilline, mieux connu dans la communauté sous le nom de Staphylococcus doré. L’importance pathologique de cette bactérie ne vient pas de la sévérité des infections qu’elle cause, mais bien de la difficulté à traiter ces infections en raison de la résistance (Fritz et al., 2008).
Comme mentionné plus haut, Staphylococcus aureus est présent dans tous les bâtiments porcins. Cette bactérie fait partie de la flore normale de la peau des porcs. Pour cette raison, elle se retrouve en quantité importante dans l’air de ces bâtiments. La desquamation de la peau des animaux étant la principale source supposée de la bactérie.
Clostridium difficile, une bactérie à Gram-négatif possédant la capacité de former des spores.
C’est un organisme anaérobie strict, signifiant que la bactérie ne peut se développer uniquement en absence d’oxygène. Clostridium difficile est une bactérie de la plus grande importance en santé humaine. En effet, elle cause plus de diarrhées infectieuses dans les hôpitaux du Québec que n’importe quelle autre bactérie. Cette bactérie s’attaque à l’épithélium du colon causant la colite pseudo-membraneuse. Son apparition est étroitement liée à l’utilisation d’antibiotiques (Baxter et al., 2008). Ces derniers affectent la flore normale, favorisant l’établissement de C.difficile dans le système digestif (Levy et al.).
Étant donné son affinité avec le tube digestif, il ne serait pas surprenant de retrouver cette bactérie dans les porcheries du Québec. Une étude publiée par la passée a démontré la dissémination de cette bactérie à proximité des bâtiments porcins (Keessen et al., 2011). De plus, la transmission du porc à l’homme a été démontrée comme possible par le passé (Hopman et al., 2011)
Listeria monocytogenes
L.monocytogenes est depuis longtemps connu comme un pathogène important en santé humaine. La
listériose humaine, bien que relativement rare, est une infection grave ayant un taux de mortalité atteignant les 50% dans certains cas. Cette infection est plus courante chez les nouveaux nés, les femmes enceintes et les personnes immunosupprimées. Plusieurs formes de la maladie existent, les plus communes étant les formes se développant durant la grossesse et la méningite. L’infection touchant les femmes enceintes peut également infecter le fœtus et causer un avortement spontané et la mort du fœtus. L’enfant peut également attraper la maladie lors de l’accouchement, on parle alors de listériose tardive. La forme la plus souvent diagnostiquée demeure toutefois la méningite aussi appelée listériose du système nerveux central. Cette forme cause une fièvre sévère avec une rigidité de la nuque. Les symptômes plus graves sont des tremblements et convulsions. La bactérie peut aussi causer des gastro-entérites avec les symptômes courants tels les vomissements et la diarrhée (Santé-Canada).
En plus d’être fortement associée avec les bâtiments porcins (Boscher et al., 2012), cette bactérie est maintenant bien connue comme étant colonisatrice de la moulée sèche et des
excréments (Erickson et al., 2015) dans les bâtiments d’élevage d’animaux (Skovgaard and Morgen, 1988). Tenant compte du fait que la nourriture est une source importante d’aérosols dans les bâtiments d’élevage, nous pouvons nous attendre à la retrouver dans l’air des bâtiments. De plus, les pratiques communément utilisées dans la désinfection des bâtiments porcins semblent avoir du mal à éliminer cette bactérie (Aarnisalo et al., 2000)
Mycobacterium avium
Cette bactérie représente une cause importante de pneumonie atypique en santé humaine bien que les infections à mycobactéries soient plus courantes chez les personnes immunodéficientes, des sujets saints peuvent aussi être affectés. Plusieurs formes d’infections à cette bactérie peuvent subvenir. Les plus communes étant celles prenant la forme d’infiltrat tuberculeux ou d’infiltrat diffus. On peut aussi voir des nodules dans une autre forme d’infection appelée la bronchectasie nodulaire (Santé-Canada).
Mycobacterium avium se retrouve généralement de façon ubiquitaire dans le sol, elle est donc présente
dans la majorité des environnements. Les porcheries n’y font pas exception (Pakarinen et al.). De plus, les porcs sont l’un des hôtes que la bactérie peut infecter, comme les hommes le sont aussi (Fogel, 2015). Cette bactérie est aussi reconnue pour sa persistance impressionnante dans l’environnement. En effet, des structures résistantes semblables à des spores ont été observées chez cette bactérie (Lamont et al.). De plus, le lavage conventionnel des bâtiments agricoles ne semble pas venir à bout de cette bactérie (Eisenberg et al., 2011).
Salmonella spp.
Les bactéries du genre Salmonella causent des infections du système digestif appelées salmonelloses. Bien que la cause la plus connue de transmission de cet agent soit par la consommation d’aliments contaminés par la bactérie (Parry et al., 2002), cette dernière peut aussi se transmettre par contact direct ou indirect (Santé-Canada). Les porcs et de nombreux autres animaux domestiques et sauvages sont connus comme étant porteurs de la bactérie et peuvent la
surfaces contaminées par des fèces est le mode de transmission le plus probable dans le cas des éleveurs de porcs (Andres and Davies, 2015).
La résistance aux agents antimicrobiens
Dans les dernières années, la résistance aux antimicrobiens est devenue l’une des menaces les plus importantes pour la santé humaine à l’échelle planétaire (Davies and Davies, 2010). En effet, de nouvelles souches bactériennes résistantes aux antibiotiques et aux autres agents sont découvertes constamment. Ces résistances rendent le traitement des infections causées par ces bactéries beaucoup plus difficiles à l’aide des techniques d’antibiothérapie traditionnelles. En plus des résistances de plus en plus fréquentes et variées, on peut ajouter le fait que le développement des antibiotiques est au ralenti depuis plusieurs années (Silver)
Lors de cette étude, trois gènes de résistance sont recherchés dans les bâtiments d’élevages du Québec. La section suivante vise à décrire plus en détail ces gènes et l’importance qu’ils ont en santé humaine.
mecA et la résistance à la méticilline
Depuis des décennies au cœur des discussions à propos de la résistance aux antibiotiques, la résistance à la méticilline reste toujours l’un des enjeux prioritaires en santé humaine à travers le monde. L’exemple le mieux connu reste le Staphylococcus aureus résistant à la méticilline. Cette bactérie peut être à l’origine d’une multitude de pathologies telles les infections de la peau, les septicémies et les pneumonies (Frazee et al., 2005; Fritz et al., 2008). Une étude démontre que 2% de la population américaine serait porteuse du SARM au sein de sa flore nasopharyngée et serait donc susceptible de transmettre la bactérie (Fritz et al., 2008). Chaque année dans ce pays, plus de 80 000 personnes sont hospitalisées en raison d’infection au SARM (Malani, 2014). La méticilline est un antibiotique de la famille des ß-Lactames généralement utilisés dans le traitement des infections à staphylocoques et à streptocoques. La résistance à cet agent rend toutefois son usage limité de nos jours.
La résistance à la méticilline chez Staphylococcus aureus est généralement acquise par l’entremise du gène mecA (Katayama et al., 2000). Ce dernier est transféré d’une cellule à l’autre par l’entremise de la Staphylococcus aureus Chromosomic Cassette mec (SCCmec)(Hanssen and Sollid, 2006). Cette cassette chromosomique contient obligatoirement le gène mecA et les gènes responsables de sa régulation et peut aussi contenir d’autres gènes de résistance à d’autre ß-Lactames organisés en un seul élément génétique mobile (Deurenberg et al.). Des gènes de résistance à d’autres familles d’agents antimicrobiens peuvent aussi se retrouver sur les SCCmec, comme le gène czrC responsable de la résistance au zinc chez certaines bactéries (Argudin et al., 2016; Cavaco et al., 2011). Il existe plusieurs types de SCCmec, mais tous ont la même utilité et un fonctionnement similaire.
Le gène mecA confère la résistance à la méticilline en codant pour une protéine nommée Penicillin
Binding Protein 2A (PBP2A). Les Penicillin Binding Proteins (PBP) sont une famille d’enzyme jouant
un rôle primordial dans la synthèse du peptidoglycane bactérien. Les PBP permettent la synthèse des chaines de glycan (transglycosylation) et la ligature des chaines ensemble pour former le peptydoglycane bactérien (transpeptidation). Toutefois, c’est protéine ont une forte affinité pour la méticilline et les autres ß-Lactames, rendant les bactéries susceptibles à ces antibiotiques. La PBP2A joue le même rôle que les PBP sans toutefois avoir d’affinité pour la méticilline, rendant par le fait même, la bactérie résistante à cet antibiotique (Hartman and Tomasz, 1984; Reynolds and Brown, 1985; Utsui and Yokota, 1985).
czrC et la résistance au zinc
Il est connu depuis un certain temps que des concentrations suffisantes de certains métaux lourds comme le zinc et cadmium constituent un inhibiteur efficace de la chaine de transport des électrons lors de la respiration chez les bactéries (Beard et al., 1995; Kasahara and Anraku, 1974). Pour cette raison, entre autres, les éleveurs de porcs emploient souvent ces métaux dans la diète des animaux d’élevages afin de prévenir la croissance de bactéries intestinales potentiellement pathogènes (Argudin et al., 2016). Cette utilisation constante de métaux a mené, au fil du temps, à l’apparition de souches de bactéries résistantes. Le gène czrC n’est étudié que depuis très récemment. On constate toutefois une dissémination du gène très répandue, surtout chez les Staphylocoques (Cavaco et al., 2011). En effet, le gène czrC serait intimement lié à l’acquisition de
résistances sont contenus au sein de la même cassette de résistance génomique possédée par
Staphylococcus, facilitant, de surcroit, le transfert simultané des deux gènes (Cavaco et al., 2010).
Le gène czrC code pour un complexe protéique qui se retrouve dans la membrane des bactéries. Ce complexe agit comme un transporteur de zinc et de cadmium antiport. En bref, le complexe fait entrer des protons à l’intérieur de la cellule en faisant sortir les ions métalliques simultanément, empêchant ainsi l’effet toxique de ces derniers (Hassan et al., 1999).
Étant donné que les métaux lourds ne sont pas fréquemment utilisés dans le traitement des infections en médecine humaine, cette résistance est plus inquiétante en raison de sa relation avec la résistance à la méticilline. Il est estimé que 74% des souches de SARM retrouvées dans les environnements agricoles sont résistantes au zinc et porteuses du gène czrC. Dans la communauté, ce pourcentage diminue, mais reste significatif à 48% (Cavaco et al., 2010).
CTX-M et la résistance aux ß-Lactames
Les ß-Lactames constituent l’une des familles d’antibiotiques depuis le plus longtemps utilisé en médecine humaine. En effets, la pénicilline est utilisée depuis les années quarante (Grossman, 2009). Toutefois, bien de nouveaux membres se sont joints à la famille depuis ce temps. Encore aujourd’hui ce groupe représente une partie importante du répertoire d’antibiotiques modernes. Leur utilisation constante a toutefois mené, avec le temps, à l’apparition de résistance au sein du monde bactérien. En effet, l’acquisition de Bêta-Lactamases inhibant l’antibiotique par les bactéries à Gram négatif plus particulièrement rend le traitement à ces antibiotiques plus difficile (Bradford, 2001). Les bactéries à Gram positif ont aussi acquis un mécanisme de défense contre ces molécules en modifiant la structure de leur cible, soient les PBP, notamment par l’entremise du gène mecA (Hartman and Tomasz, 1984; Reynolds and Brown, 1985; Utsui and Yokota, 1985).
Plusieurs gènes peuvent induire la production de Bêta-Lactamases chez la bactérie. Au cours de cette étude, il fut choisi de se concentrer sur le groupe de gène blaCTX-M en raison de leur dissémination rapide à travers le monde au cours des dernières décennies (Canton and Coque, 2006; Coque et al., 2008; Rossolini et al., 2008). Ces gènes sont surtout exprimés chez les
entérobactéries, groupe fortement associé aux environnements agricoles comme les porcheries. Ces gènes sont transférables horizontalement d’une bactérie à l’autre par des plasmides contribuant à l’intérêt que leur porte la communauté scientifique en raison de leur potentiel de dissémination élevé (Moodley and Guardabassi, 2009; Partridge et al., 2011).
Le gène blaCTX-M code pour une ß-lactamase à spectre étendu, signifiant que l’enzyme est capable de dégrader la majeure partie des molécules possédant un anneau ß-lactame. Les familles d’antibiotiques susceptibles sont les céphalosporines de toutes les générations et les monobactames (Livermore et al., 2007).
Mcr-1 et la résistance à la colistine
Il y a de ça quelques années, la littérature scientifique ne comportait que très peu d’articles au sujet de la colistine et encore moins portant sur la résistance bactérienne à cette dernière. En effet, la colistine est un antibiotique qui n’est presque plus utilisé en médecine humaine en raison des effets secondaires qui lui sont associés. En effet, la toxicité rénale et neurologique entrainée par la prise de l’antibiotique lui a valu être mise de côté dans les années 1970 (Spapen et al., 2011). Son utilisation a toutefois augmenté dans les dernières années en raison de l’apparition de souches bactériennes infectieuses n’étant susceptibles à aucun antibiotique couramment utilisé. La colistine est maintenant considérée comme un traitement de dernier recours dans les cas d’infections à bactéries multirésistantes (Biswas et al., 2012). L’antibiotique agit en s’attachant aux (LPS) de la membrane bactérienne puis en s’intercalant dans la membrane externe, formant des pores qui mènent à la lyse de la bactérie (Koike et al., 1969).
En mai 2016, une femme des États-Unis fut admise dans un hôpital de la Pennsylvanie pour une infection urinaire. Lors des analyses de son échantillon d’urine, on constata que l’infection était causée par une bactérie bien connue, Escherichia coli, rien de surprenant dans le cas d’une infection urinaire. Ce qui était surprenant par contre, c’est que cette bactérie en particulier était multirésistante et porteuse du gène mcr-1, un gène conférant une résistance à la colistine. Bien que l’infection ne fût pas fatale, il s’agissait du premier cas recensé d’infection par une bactérie résistante
multirésistante est répertorié dans l’état du Nevada. Cette fois ci, l’infection est causée par Klebsiella
pneumoniae. La bactérie en question porte aussi le gène de résistance à la colistine et aucune option
de traitement n’est envisageable. Cette infection causa la mort de la femme à l’hôpital. Comme de quoi la résistance aux antibiotiques peut être mortelle (Chen et al., 2017).
Le gène mcr-1 code pour une enzyme appelée phosphoétanolamine transférase. Cette enzyme modifie activement la structure des LPS en ajoutant un groupement phosphoéthanolamine à ce dernier. Ce changement de conformation empêche ainsi la colistine de reconnaître sa cible et d’avoir un effet bactéricide (Kim et al., 2014). Cette mutation peut potentiellement transformé une bactérie commensale de l’intestin en pathogène possiblement mortel pour l’homme.
Les endotoxines dans les porcheries
Sachant que les bâtiments porcins abritent de fortes concentrations de bactéries et qu’une forte concentration d’entre eux est à Gram négatif (Letourneau et al., 2010b), il n’est pas surprenant de constater une forte concentration de ces dernières dans les bâtiments porcins. Par le passé, des concentrations en endotoxines pouvant atteindre plus de 56 000 unités d’endotoxines par mètre cube d’air (Yang et al., 2013). Un lien direct entre la présence d’endotoxines et l’exacerbation des symptômes de l’asthme a été observé (Caillaud et al., 2009).
Problématique, objectifs et hypothèses de l’étude
Problématique
Les porcheries en général sont des environnements très contaminés en bioaérosols et autres contaminants provenant pour la plupart du lisier et des porcs eux-mêmes. Les porcs sont connus pour être capables de transmettre des pathogènes aux humains. Il est donc naturel de croire que les travailleurs agricoles oeuvrant dans ce domaine sont susceptibles d’être atteints par des infections en lien avec cet environnement. Bien que plusieurs études aient démontré l’importance de la charge en contaminants dans les bâtiments porcins, très peu de travailleurs du milieu portent une protection respiratoire lors de leur quart de travail. L’étude de l’exposition des travailleurs à des agents pathogènes humains contribuera sans doute à la sensibilisation de ces derniers en ce qui
a trait aux risques associés à leur profession et possiblement à la mise en place de mesures pour protéger la santé des ouvriers dans le domaine.
Objectifs de la recherche
Dix porcheries québécoises ont été visitées au cours de cette étude afin de recueillir des échantillons d’air à l’intérieur de ces dernières. Les trois objectifs suivants ont été poursuivis lors de l’analyse des échantillons :
Évaluer les concentrations en particules aérosolisées dans l’air des bâtiments porcins par méthode gravimétrique ainsi qu’à l’aide de lectures directes du diamètre aérodynamique des particules en suspension.
Mesurer la concentration de bactéries totales et la concentration de six pathogène dans les porcheries à l’aide de méthodes de culture ainsi que par biologie moléculaire.
Détecter la présence de gènes de résistance à trois agents antimicrobiens dans l’air des porcheries à l’aide de technique de biologie moléculaire.
Hypothèses de recherche
À la lumière des connaissances actuelles, les trois hypothèses suivantes ont été avancées concernant les objectifs de recherche.
Les concentrations en poussières en suspension dépasseront les valeurs limites d’exposition pour un quart de travail.
Tous les pathogènes seront détectés dans l’air des porcheries et la concentration en bactéries totales aérosolisées dépassera la valeur limite recommandée.
Les gènes de résistance au zinc et à la méticilline seront détectés dans les porcheries, mais le gène de résistance à la colistine ne le sera pas en raison de l’utilisation très restreinte de cet antibiotique.
Partie 1 : Quantification of airborne dust, endotoxins, human
pathogens and antibiotic and metal resistance genes in Eastern
Canadian swine confinement buildings
Jonathan Pilote1,2, Valérie Létourneau2, Matthieu Girard3, Caroline Duchaine1,2
1Université Laval, 2 Centre de Recherche de l’Institut Universitaire de Cardiologie et de Pneumologie de Québec, 3 Institut de Recherche et de Développement en Agroenvironnement
Correspondance: Caroline Duchaine
Institut universitaire de cardiologie et de pneumologie de Québec - Université Laval Pavillon A bureau A2128
2725 Chemin Ste-Foy Ste-Foy (Québec) Canada G1V 4G5 tel: 418 656-8711 poste 5837 fax: 418 656-4509 [email protected]
This project received funding from the following: Agrivita Inc.
IRSST (Institut de Recherche Robert Sauvé et Santé et en Sécurité au Travail) Agriculture and Agri-Food Canada.
Abstract
Pig farming practices in Eastern Canada changed drastically in the last decades. More animals are being raised in confined buildings and, consequently, workers are exposed to larger amount of airborne organic particles or bioaerosols. The nature and concentrations of bioaerosols were studied in 10 swine confinement buildings (SCB). Airborne dust, endotoxins, total bacteria, six human pathogens (Staphylococcus aureus, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Salmonella spp.,
Mycobacterium avium, Clostridium difficile and Listeria monocytogenes), and three metal and antibiotic
resistance genes (czrC, mcr-1 and blaCTX-M-1) were used as markers of air quality. All studied human pathogens and resistance genes were detected in the air of at least one SCB. Airborne dust, endotoxins and bacterial concentrations were determined to be higher than recommended by diverse scientific committees. This study reinforces the fact that SCB contain bioaerosols that are known to affect human health and can therefore contribute to the development of adverse health effects among workers.
Résumé
Les pratiques utilisées dans les élevages porcins de l’Est du Canada ont grandement changé au cours de la dernière décennie. Une plus grande quantité d’animaux sont élevés au sein de bâtiments confinés exposant les travailleurs à de plus fortes concentrations en particules organiques en suspension ou en bioaérosols. La nature et la concentration en bioaérosols a été étudié dans 10 bâtiments d’élevage porcin. La poussières en suspension, les endotoxines, les bactéries totales, six pathogènes humains (Staphylococcus aureus, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Salmonella spp.,
Mycobacterium avium, Clostridium difficile et Listeria monocytogenes) ainsi que trois gènes de résistances
aux agents antimicrobiens (czrC, mcr-1 and blaCTX-M-1) ont été utilisés comme indicateurs de la qualité de l’air. Tous les pathogènes humains et les gènes de résistance ont été détecté dans au moins un des bâtiments visités. Les poussières en suspension, les endotoxines et les concentrations en bactéries totales ont été mesurés à des seuils supérieurs que recommandés par divers comités scientifiques. Cette étude appuie le fait que les bâtiments d’élevage porcins contiennent des bioaérolsols connus comme pouvant affecter la santé humaine et, par le fait même, contribuer au développement d’effets néfastes pour la santé des travailleurs.
Introduction
Since 1976, pig farming has drastically changed in Canada. Animal production intensified and more pigs are now being produced in fewer swine confinement buildings (SCB). Forty years ago, more than 63,000 farms reported producing pigs in Canada. Today, the number dropped to less than 7,000, a 900% decrease. While the number of pig farms constantly lowered, the total number of pigs did not. In fact, the average number of pigs on a farm in 1976 was 91. Today it reaches around 1,900, an increase of over 2,000% (Canada-Pork, 2015). Basically, producers house more pigs in fewer buildings. To keep up with the demand, animal density and building confinement are now higher and farm workers are spending more time in the SCBs, leaving them exposed to air contaminants for prolonged periods of time.
Workers' exposure and health risks are now better understood thanks to extensive research carried out over the last decades. The air in SCBs is known to be loaded with dust, bacteria, toxins, gases and various other contaminants (Letourneau et al., 2010; Xu et al., 2016; Yang et al., 2015). The average value of total suspended dust is 3.81 mg of dust per cubic metre of air (mg/m3) with values as high as 21.4 mg/m3 (Crook et al., 1991; Xu et al., 2016). Cultivable bacteria concentrations may reach 2×106 colony forming units per cubic metre of air (CFU/m3) (Letourneau et al., 2010) which is higher than the recommended safe occupational exposure value of 1×104 CFU/m3 in Eastern Canada (N, 2001). In 2013, North American finishing facilities were characterized by airborne endotoxin concentrations ranging from 693 to 3,588 endotoxin units per cubic metre of air (EU/m3), with a mean at 1,508 EU/m3 (Yang et al., 2013). Other studies from Eastern Canada showed endotoxin concentrations as high as 18,000 EU/m3 (Duchaine et al., 2001) and 56,000 EU/m3 (Letourneau et al., 2010). Exposure to SCB air contaminants may provoke adverse effects on human health (Hedelin et al., 2016). Workers are at risk of developing pathologies such as chronic bronchitis (Cormier et al., 1991; Donham et al., 1989; Iversen et al., 2000), asthma, reduced lung function andinfections to pathogens due to the inhalation of airborne contaminants (Keessen et al., 2013; Poggenborg et al., 2008). The prevalence of pathologies related to poor air quality was shown to increase with the duration of the exposure (Radon et al., 2002).
presence in SCBs was confirmed many times (Espinosa-Gongora et al., 2015; Sun et al., 2015) and the colonization of farmers is common (Springer et al., 2009). The bacterium is known to cause several forms of infections ranging from skin infections (Skov and Baadsgaard, 2000) to endocarditis (Fowler et al., 2005). More importantly, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is becoming a threat to human health. Following the first use of methicillin in clinical settings, cases of MRSA were reported (Jevons et al., 1961) and, for many years, it was more considered a nosocomial pathogen than a community-acquired infectious agent. The first case of community-acquired MRSA in the United States was reported in 1968 (Barrett et al., 1968). Various strains of MRSA are now in circulation around the world causing problems regarding the treatment of the S. aureus related infections (Coombs et al., 2004; Frazee et al., 2005; Fritz et al., 2008). Strains are, for the most part, grouped either into community associated (CA), healthcare-associated (HA) or livestock-associated (LA). A particular strain of LA-MRSA (ST398), which is associated with the swine environment, is now causing more and more infections in persons that had never been exposed to pig farms (Uhlemann et al., 2012; van der Mee-Marquet et al., 2011).
Multi-resistance in Staphylococcus aureus is mainly associated with the Staphylococcal chromosomic cassette containing the mecA gene (SCCmec), which confers methicillin resistance (Ito et al., 1999; Katayama et al., 2000). Although mecA is present in most of the cases (Wisplinghoff et al., 2003), many other resistance genes can be encoded on the SCCmec (Chu et al., 2013). Resistances to gentamicin, trimethoprim, levofloxacin, erythromycin, and chloramphenicol have been documented. It is now clear that infections by Staphylococcus aureus or its MRSA counterpart represent a serious threat to human health, whether they are farmers or members of the general population.
Clostridium difficile is one of the main nosocomial pathogens in industrialized countries (Gravel et
al., 2009). The principal risk of contracting a Clostridium difficile infection (CDI) is antibiotherapy (Cohen et al., 2010). Its presence was established in SCBs (Hopman et al., 2011) as it is likely to colonize the gut of pigs. It was also found in manure and it was demonstrated that workers having regular contact with pigs carry genetically related C. difficile animal strains (Keessen et al., 2013). Farmers are then likely to be colonized by bacteria from the pig's microflora. CDIs generally result in cases of pseudomembranous colitis, which is an infection of the colon characterized by the formation of nodules creating a pseudo-membrane that covers the epithelium. Symptoms are abdominal cramps, diarrhea, and fever (Farooq et al., 2015; Fekety, 1997; Kawamoto et al., 1999).
Salmonella spp. have mostly been associated with foodborne infections in humans (Pui et al., 2011).
Different serotypes of Salmonella are responsible for illnesses such as typhoid fever and gastroenteritis, which are annually associated with up to 3 million deaths worldwide (Bhunia, 2008). Even though Salmonella is mostly associated with food poisoning, the presence of the bacteria in pig herds was acknowledged and is mostly found in feces (Kich et al., 2011) and on the skin (Boyen et al., 2008). Transmission from animal to human was deemed possible by various studies (Dore et al., 2004; Hendriksen et al., 2004) making it a potential threat to the health of the swine workers.
Listeria monocytogenes, the causal agent of listeriosis, is another bacteria mostly associated with
foodborne infections, particularly resulting from the consumption of dairy products (Cartwright et al., 2013). It has also been linked to miscarriages, premature deliveries and neonatal infections in pregnant women and newborn children (Prevention, 2016). Each year, it is responsible for more than 250 deaths in the USA (Scallan et al., 2011). Possible forms of listeriosis include diarrhea, meningitis, and encephalitis with mortality rates of 20 to 30% (Akhtar et al., 2017). The presence of Listeria monocytogenes in SCBs is known and it is hard to get rid of using traditional cleaning methods (Aarnisalo et al., 2000).
Mycobacterium avium is an important pathogen in SCBs. It causes lymph node infections in the
digestive tract of affected animals (Hibiya et al., 2010). In humans, M. avium can cause pulmonary and systemic infections in immunocompromised patients (Inderlied et al., 1993) and with lymphadenitis, in children (Jarzembowski and Young, 2008). Nowadays, however, more cases of nontuberculous infections have been seen in immunocompetent persons (Shah et al., 2016). Infections with M. avium are difficult to treat and can sometimes require surgical interventions. M.
avium can be excreted in the feces of colonized pigs (Fischer et al., 2003) thus, it is likely that these
bacteria can become aerosolized and inhaled by workers. Viable airborne M. avium are also present in cattle farms and still detected after emptying and cleaning the building (Eisenberg et al., 2011). Use of antibiotics in SCBs has led to the selection of drug-resistant microorganisms. Antibiotics may be used for three reasons in pig finishing buildings. Firstly, antimicrobial agents are used to prevent bacterial infections by feeding pigs sub-therapeutic doses throughout animal life. For
for prophylactic purposes. Secondly, antimicrobials are often used as growth factors. Pigs receiving a continuous sub-therapeutic dose of antibiotics gain weight faster than non-medicated animals (Looft et al., 2012). The phenomenon is mainly explained by the fact that there is less competition for feed nutrients between the animal and its gut microbiota (Visek, 1978). Moreover, a thinner intestinal mucosa resulting from an antibiotic treatment promotes nutrient absorption by the animal (Gaskins et al., 2002). Finally, antibiotics are obviously used sporadically to treat infected animals. Drug-resistant microorganisms have been detected in animals destined for human consumption since 1951 (Starr and Reynolds, 1951). Drug-resistant bacteria were described in various agricultural settings. In swine, it was shown that usage on pigs of a combination of three antibiotics was enough to select for more than twenty antibiotic resistance genes (Looft et al., 2012). A recent study carried out in China showed a mean 192-fold increase in the amount of resistance genes in swine manure treated soils compared to control soils. In addition, three times more resistance genes diversity was observed in swine soil samples. Resistance to many antibiotic families such as aminoglycosides, beta-lactams, fluconazole, MLSB (macrolide-lincosamide-streptogramin B), tetracycline, and vancomycin was detected in the soil samples (Zhu et al., 2013). For the herein study, three resistance genes were investigated: the zinc resistance gene czrC, the third generation cephalosporin resistance gene blaCTX-M and the colistin resistance gene mcr-1. Zinc, even though necessary for the survival of microorganisms, is toxic at high concentrations. It is therefore used in animal feed to prevent intestinal infections. There are a few genes, such as the
czrC gene, that are associated with resistance to zinc ions, most of them coding for cation
antiporters keeping the ions out of the cell (Hassan et al., 1999; Nies, 1992). Extensive use of zinc in animal feed has led to the proliferation of zinc-resistant bacterial communities in swine farms (Agerso et al., 2012; Argudin et al., 2016). Zinc being practically unused in human medicine, the interest of detecting the czrC gene comes from its potential association with methicillin resistance. The czrC gene is located on the same genetic element as the mecA gene and other resistance genes in MRSA (Cavaco et al., 2010). Using zinc in animal feed could, therefore, apply selection pressure for other antibiotic resistance genes and imply more serious human health risks.
Given the importance of 3rd generation cephalosporins in human medicine, it is understandable that resistance to these antibiotics is of major concern. Third generation cephalosporins are frequently used in hospitals (Powers et al., 2001). A few bacterial mechanisms were identified to
confer resistance to 3rd generation cephalosporins. The bla
CTX-M gene family codes for enzymes, known as extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs), allowing the hydrolysis of the antimicrobial molecules. ESBLs confer resistance to 1st, 2nd and 3rd generation cephalosporins (Livermore, 1995), meaning that resistance acquired against one cephalosporin will lead to resistance to many members of these classes of antibiotics. The presence of the gene was documented in European SCBs (Horton et al., 2011). The gene blaCTX-M is strongly associated with members of Enterobacteriaceae, which include bacteria infecting humans (Coque et al., 2008). Moreover, it was shown that acquisition of the gene can lead to resistance to other classes of antibiotics such as quinolones, aminoglycosides, chloramphenicol, and other cephalosporins since genes to all these antibiotics can coexist on the same IncFII plasmid (Partridge et al., 2011).
Polymyxin E, also known as colistin, was previously commonly used in human medicine. Reoccurring cases of toxicity affecting the kidneys and the nervous system eventually led to it being less and less used in the 1980s (Flanagan, 1971). Nowadays, it is used mostly as a last resort antibiotic for multi-resistant bacteria (Biswas et al., 2012). Resistance to colistin in bacteria is critical regarding the fact that it is the very last treatment option in the case of an infection by multi-resistant gram-negative bacteria. Resistance to colistin was thought to be chromosomic at first, but plasmid transmission of the responsible gene has since been observed (Liu et al., 2016). This gene,
mcr-1, is mostly present in Enterobacteriaceae that is a family of bacteria strongly associated with SCBs.
The gene mcr-1 is coding for a phosphoethanoamide transferase which catalyzes the transfer of a phosphoethanoamide group on lipopolysaccharides (LPS) of the cells. LPS being the target of colistin, the antibiotic is unable to recognize its target and thus, it is useless (Gao et al., 2016). The presence of mcr-1 in bacteria originating from pigs has been observed in China (Liu et al., 2016). A recent study carried in Denmark established the likelihood of animal to human transmission of resistance genes harboured by enteric bacteria (Moodley and Guardabassi, 2009). Colistin use in Canadian pig buildings is strictly limited and supervised by veterinarians. Treatment is only chosen for multiresistant strains of enterotoxigenic Escherichia coli F4 and F18 associated with cases of post-weaning diarrhea in pigs as informed by local veterinarians.
Objectives and Hypotheses
would be present in the air of the visited SCBs since these pathogenic agents had already been found in SCBs, as previously mentioned, but had never been investigated in the air. A second hypothesis was that the czrC and the blaCTX-M genes would be detected airborne. However, the
mcr-1 gene was hypothesized to be absent from the air samples since colistin is of limited use in the
Canadian pig industry. Supervised by veterinarians, colistin treatment is only chosen for multiresistant strains of enterotoxigenic Escherichia coli F4 and F18 associated with cases of post-weaning diarrhea in pigs. It was nevertheless included in the studied resistance genes since there are an increasing number of clinical cases in North America of infections with bacteria harbouring the mcr-1 gene. Finally, it was hypothesized that airborne dust and endotoxin concentrations would be similar to what had already been published. Sampling of the air was carried out during winter (minimal air exchange rate or worst case of occupational exposure) in 10 swine confinement buildings for quantification of dust, endotoxins, and bacteria using traditional culture methods and molecular biology.
Methods
The recruited Eastern Canadian SCBs had to meet all the following criteria: a finishing facility with between 800 and 1,200 pigs, animals weighing between 90 kg and 120 kg as well as pelleted feed. The building had to be mechanically ventilated (fans) and air inlets automatically adjusted. These selection criteria which represent the conditions found in most of the Eastern Canada SCBs helped to limit variability in SCBs management, and therefore strengthen statistical analyses. Furthermore, all field sampling took place during winter, between November and March. Finally, a brief questionnaire was filled out by the farm manager prior to sampling to confirm that there were no unusual signs of illness affecting the animals.
Measurement of dust concentrations was performed using two approaches. First, a real-time measurement of total dust concentrations, PM1, PM2.5, and PM10 were performed using a DustTrak DRX Aerosol Monitor (Model 8534, TSI Incorporated, Shoreview, MN, USA) at a flow rate of 3 l/min for 3 hours. Results were extracted using the TrakPro software (Version 4.6.1.0, TSI Incorporated) bundled with the instrument and expressed in milligrams per cubic metre (mg/m3). Total dust was also sampled in duplicate for gravimetric analyses using a closed face 37 mm cassette (SKC Inc., Eighty-Four, PA, USA) loaded with 5 µm pore size polyvinyl chloride (PVC) filter (SKC Inc.). Cassettes were connected to portable pumps calibrated at a flow rate of 2
l/min (GilAir-5 Air Sampling Pumps, Sensidyne, St. Petersburg, FL, USA) for a 4-hour collection time. Field blanks were as well done by bringing cassettes to the sampling site without connecting them to a pump. Filters were weighed before and after sampling in a temperature and humidity controlled chamber.
Total endotoxins were sampled in duplicate using 2-pieces closed face 37 mm cassettes loaded with 1 µm pore size glass fibre filters (SKC Inc.). Field blanks were again included. Filters used for endotoxin measurements were stored at -20°C prior to extraction. The analysis was performed using a Kinetic-QCL™ Kinetic Chromogenic LAL Assay (Lonza Inc., Allendale, NJ, USA). Briefly, endotoxins were extracted from the filters by agitation in 20 ml of sterile salt solution (0.9% NaCl + 0.025% Tween 20) for one hour at 4°C. Extracted samples were then centrifuged and the supernatant was transferred to depyrogenated borosilicate tubes. Tubes were kept at -20°C until analysis. Endotoxins were quantified by using standard concentrations of endotoxins from
Escherichia coli O55: B5 and a chromogenic substrate, and by following optical densities over time with a Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Reader (BioTek, Winooski, VT, USA). Total endotoxin concentrations were then expressed in endotoxin units per cubic metre of air (EU/m3).
Air was also sampled in triplicate using three air samplers (9 samples total) located at 1 m above the ground. First, a wet cyclone, the Coriolisµ (Bertin Corp., Rockville, MD, USA), was used at 200 l/min for 10 minutes in order to collect 2 m3 of air. The SASS®2300 Wetted-Wall Air Sampler (Research International, Inc., Monroe, WA, USA), another wet cyclone, was also used for 10 minutes at a flow rate of 325 l/min (3.25 m3 of sampled air). Finally, the SASS®3100 Dry Air Sampler (Research International, Inc.), a portable air sampler using an electret filter media, was used for 33 minutes and 20 seconds at a flow rate of 300 l/min (10 m3 of air). For each air sampler, field blanks were included. Culturable human pathogens and mesophilic bacteria were quantified from wet samples by plating in triplicate 100 µl of 10-fold serial dilutions of samples on selective media and on brain-heart infusion agar supplemented with amphotericin, respectively (see Table 1). Three millilitres of the remaining samples were centrifuged, the supernatant removed and the pellets stored at -20°C prior to DNA extraction. Samples collected on the SASS®3100 filters were extracted in 5 ml of buffer (phosphate buffer saline pH 7.4 + 0.05% Triton X-100) using the SASS®3010 Particle Extractor (Research International, Inc.). Again, 3 ml of the samples were
Total DNA extraction of air samples was performed using the PowerLyzer® PowerSoil® DNA Isolation Kit (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA, USA). Briefly, pellets were suspended in a lysis buffer and shaken at high frequency against glass beads in order to break down cell walls (Mixer Mill, Model MM301, Retsch, Haan, Germany). DNA was then purified using silica columns. Recovered DNA was stored at -20°C until analysis.
Table 1: Conditions used for quantification of culturable human pathogens and mesophilic bacteria
Microorgani
sms Selective culture media
Incubatio n conditions Incubati on time (h) Manufacturer Staphylococ
cus aureus CHROMagar Staph aureus Aerobic / 37°C 48
Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ,
USA
MRSA CHROMagar MRSA Aerobic / 37°C 48 Becton Dickinson
Salmonella
spp. Bismuth Sulfate Agar Aerobic / 37°C 48 Becton Dickinson
Clostridium
difficile Clostridium difficile Agar Anaerobic / 37°C 48 Becton Dickinson
Mycobacteri
um avium Middlebrooke 7H10 + OADC Agar 5% CO37°C 2 / 240 Becton Dickinson
Listeria monocytoge
nes PALCAM Agar
5% CO2 /
37°C 48 Becton Dickinson
Mesophilic
bacteria Brain Heart Infusion Agar + 5 µg/mL amphotericin Aerobic / 37°C 48 Becton Dickinson
Real-time polymerase chain reaction (qPCR) was used to quantify total bacteria, the six human pathogens and the three studied resistance genes. A list of the primers and probes used is included in Table 2. PCR runs were all conducted in CFX-96 and CFX-384 Touch™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Data was analyzed using the Bio-Rad CFX Manager software (Version 3.1). Standard curves ranging from 1×106 to 1 copy of the targeted genes were designed for each protocol using genomic DNA as a template or synthetic genes (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA). All primers and probes were also purchased from Integrated DNA Technologies. Results were analyzed using linear regression of log10(target copy number)=ƒ(threshold cycle) function. The efficiency of the PCR runs were obtained using
E=10(-slope) – 1. PCR runs with efficiency between 90 and 110% were used to calculate concentrations. Negative controls were included to each PCR run. Copy numbers were then converted and expressed in gene copies per cubic metre of air (copies/m3). For total bacteria,
Escherichia coli’s genome was used to construct the standard curve and results were then expressed
in E. coli equivalent genomes per cubic metre of air.
Table 2 : Primers and probes used for PCR quantification of the studied human pathogens and resistance genes
Targete d human pathoge n or resistanc e (gene)
Primers sequence 5’ 3’ Probe sequence 5’ 3’
Hybrid ization temper ature (°C) Amp lico n (bp) Referen ces Staphylo coccus aureus (nuc) 5’-GGATCAAACGGCCTGCAC A-3’ 5’-GTCAAAAATCATGAACCT CATTACTTATG-3’ 5’-CGTAGTTACTGCGTTGTAA GACGTC-3’ 59 176 (Francoi s et al., 2003) MRSA (mecA)* 5’-CATTGATCGCAACGTTCA ATTT-3’ 5’-TGGTCTTTCTGCATTCCT GGA-3’ 5’-TGGAAGTTAGATTGGGAT CATAGCGTCAT-3’ 59 174 (Huletsk y et al., 2004) Salmone lla spp. (invA) 5’-GTGAAATTATCGCCACGT TCGGGCAA-3’ 5’-TCATCGCACCGTCAAAGG AACC-3’
N/A 60 284 (Fallschissel et
al., 2009) Clostridi um difficile (16S rDNA) 5’-TTGAGCGATTTACTT CGGTAAAGA – 3’ 5’-TGTACTGGCTCACCTTT GATATTCA-3’ 5’-CCACGCGTTACTCACCCGT CCG-3’ 60 151 (Bandelj et al., 2013) Mycoba cterium avium (16S rDNA) 5’-GGGATACTCGAGTGGCG AAC-3’ 5’-GGCCGGCTACCCGTCGTC -3’ 5’-ACCAGAAGACATGCGTCTT G-3’ 60 207 (Cousins et al., 1992) Listeria monocyt ogenes (iap) 5’-AACTGGTTTCGTTAACGG TAAATACTTA-3’ 5’-TAGGCGCAGGTGTAGTT GCT-3’ 5’-CTACTACTCAACAAGCTGC ACCTGCTGC-3’ 60 164 (Adminis tration, 2017) Total bacteria (EUB 16S 5’-GGTAGTCYAYGCMSTAAA CG-3’ 5’-TKCGCGTTGCDTCGAATT AAWCCAC-3’ 62 264 (Bach et al., 2002)
