~tude des interactions épithélio-mésenchymateuses dans un système de co-culture de cellules intestinales humaines
par
Josée Durand
Département d'anatomie et de biologie cellulaire
Mémoire présenté à la Faculté de médecine en vue de l'obtention du grade de
maitre ès sciences (M.Sc.)
TABLE DES MATIÈRES
LISTE DES ILLUSTRATIONS •
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••• VI LISTE DES ABRÉVIATIONS.. .
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.VIII LISTE DES PUBLICATIONS ••••.•..•.•..•••••••••••••••••••• • .,IX RÉSUMÉ • •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• X!.INTRODUCTION ••..•• . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1. Composition de la lame basale •••••.•••.••••••••••••• 4 1.1 Le collagène IV •..•••...•••••• .4 1.2 La laminine et ses homologues.
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. .... 6 1.3 Le protéoglycan de type héparan-sulfate •.•.••• 81. 4 La f ibronectine . ... 8 1. 5 La ténascine . ... 9 2 • La décor ine •.•....• . ... 10
3. Rôle de la matrice extracellulaire et de la 4.
5.
. ... 11
membrane basilaire ..•.•.••••••
Les fibroblastes péricryptaux.
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.13Notremodèle .••••.•••...•••••• .15
5. 1 Les cellules Caco-2/15 ••••••.•••••••.•••••••• 15 5.2 Le support mésenchymateux. . ... 17
6. Objectifs du projet de maitrise ••••••..•••••••••••• 1~
II. MATÉRIEL ET MÉTHODES. . ... 19
1.1 Culture de cellules ...•...•...•. 19 1.1.1 Cellules mésenchymateuses
intestinales humaines (HIM) •.••.••.... 19 1. 1. 2 Cellules caco-2/15.
1.1.3Co-cultures .•••• 1. 2 Tissus humains foetaux. 1.3 Tissus adultes humains.
.20 .,21 .21 .22 2. Microscopie à contraste de phase .•..•..••••.•••.•.• 22 3 . Immunof 1 uorescence . ... 2 2
4.
3.1 Préparation des échantillons. 3.1.lTissus ... 3.1.2 Cellules en culture. 3. 2 Coupes ...• 3.3Immunodétection. Électrophorèse ....•... . ... 22 • ••• 2 2 •••• 2 3 . ... 23 . ... 24 . ... 25
4.1 Préparation des échantillons ..•...•••..•..••. 25
4. 1. 1 Tissus ... .25
4.1.2 Cellules en culture. ... 26 4.2 Séparation des protéines sur gel
d'acrylamide. . ... 27
5. Transfert Western .. •••••• 2 8
5.1 Transfert sur nitrocellulose. .2~
5 • 2 Détection des antigènes.
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.29 6. Anticorps . ... . .29 III. RÉSULTATS • ...•...•....•....••...••.•...•.•.. 3 21. Caractérisation des cellules mésenchymateuses •••••• 32 1.1 Localisation des marqueurs
cytosquelettiques dans le jéjunum
humain adulte ... 32
1.2 Localisation des marqueurs
cytosquelettiques dans le jéjunum
foetal humain . ... 34 1.3 Expression des marqueurs
cytosquelettiques par les cellules mésenchymateuses intestinales humaines
en culture ... 34
.
2. Caractérisation des co-cultures ..•••••.••...•.• 36 2 .1 Caractérisation morphologique ...•...••••• 36 2.2 Expression des marqueurs cytosquelettiques des
cellules en cc-culture .•••....•.••.•••••.•••. 37 2.3 Différenciation des cellules Caco-2/15
en co-culture •••••...•••••..•...•...•••••••• 43 3. Expression des protéines de la matrice
extracellulaire dans les co-cultures •••••••••••.•.• 45 3.1 Expression de la fibronectine et
de la ténascine .•...•..•••••.•...••.••• 46 3.2 Expression du collagène IV, de la
laminine et du protéoglycan de type héparan-sulfate dans les co-cultures •..•...•.•••• 47 4. Expression de la décorine dans les co-cultures ... 57
IV. DISCUSSION . ...•..•..•.. 58 1. Caractérisation des cellules mésenchymateuses •.••.• 58 2. Caractérisation des co-cultures .•.•••..••••.•..••.• 61
2.1 caractérisation morphologique et
cytosquelettique . ... 61 2.2 Expression des enzymes de la bordure
en brosse ...•...•. 65 3. Protéines de la matrice extracellulaire et
de la membrane basilaire ....•...•...••...•.•. 66 3.1 Localisation en co-culture .••••••••..••...•.• 67 3.2 Variations avec l'âge des co-cultures .•.••..• 74
.
4. Expression de la décorine dans les co-cultures •.•.. 75 5. Discussiongénérale ....•.••••••••..•....•..•.•..•.• 77 V. CONCLUSIONS GÉNÉRALES ••••••••••••••••••••••••••••••••••• 83
REMERCIEM.ENTS • •••.••.••.•...•••••••.••••••••••••••••••••• 8 6
LISTE DES ILLUSTRATIONS FIGURE
1. Caractérisation des cellules HIM .••••••••••••••••••••. 35 2. Caractérisation morphologique et cytosquelettique
des cellules Ca2/15 et des cellules HIM en co-culture . ... 3 8 3. Expression des protéines du cytosquelette et de
la sucrase-isomaltase dans les co-cultures de différents stades, les cellules en culture seules
et le jéjunum foetal humain ••.•••••••••••••••••.••••• 42 4 • Irnmunodétection de la sucrase-isomal ta se sur des
co-cul tures de 1 jour confluence et 10 jours post-confluence . ... 44 5. Irnmunolocalisation de la laminine, du collagène IV,
de la f ibronectine et de la ténascine dans les co-cultures . ... 4 9 6. Irnmunolocalisation du HSPG dans les co-cultures et
l'intestin foetal humain .•.••....•••••.••••.•.••••••• 51 7. Irnmunolocalisation de la chaine A de la laminine
dans différents stades de co-culture .••..•••.••.•.•••• 52 8. Expression des protéines de la matrice extracellulaire
et de la membrane basilaire dans les co-cultures de différents stades, les cellules en culture seules et le jéjunum foetal humain . ... 54 9. Immunolocalisation de la chaîne a5(IV) du collagène
IV dans les co-cultures, les cellules en culture
seules et le jéjunum foetal humain ••••.••••.••••••.•• 56 10. Immunolocalisation de la décorine dans les
BB BSA C-IV DPP IV ECM FN HIM HSPG LB LN MB PBS PC SI TN
LISTE DES ABRÉVIATIONS Bordure en brosse
Bovine serum albumin (albumine de sérum bovin) Collagène de type IV
Dipeptidylpeptidase IV Matrice extracellulaire : Fibronectine
: Human intestinal mesenchymal cells (cellules mésenchymateuses intestinales humaines)
Protéoglycan de type héparan-sulf ate Lame basale
Laminine
Membrane basilaire
Phosphate buffered saline (solution saline tamponnée aux ions phosphate)
Post-confluence Sucrase-isomaltase Ténascine
LISTE DES PUBLICATIONS ISSUES DU TRAVAIL DE MAITRISE 1. Beaulieu J.-F., Vachon P. H., Herring-Gillam F.E.,
Simoneau A., Perreault N. et Durand J. (1994). Expression of the a:-5 (IV) Collage.n chain in the foetal human small Intestine. Gastroenterology (sous presse)
2. Beaulieu J.-F., Jutras s., Durand J., Vachon P. H. et Perreault N. (1993a). Relationship between tenascin and a:-smooth muscle actin expression in the developing human small intestinal mucosa. Anat. Embryol. 188:149-158 3. Vachon P. H., Durand J. et Beaulieu J.-F. (1993).
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Basement membrane formation and re-distribution of the Bl integrins in a human intestinal co-culture system. Anat. rec. 236:567-576
4. Vachon P.H., Durand J. et Beaulieu J.-F. (1992). Études des interactions épithélio-mésenchymateuses intestinales à l'aide d'un système humain de co-culture cellulaire. Médecine-Sciences 8 (suppl. 2): 53
5. Vachon P.H., Durand J. et Beaulieu J.-F. (1992). Modulation of basement membrane elaboration and redistribution of the Bl integrins in a human intestinal co-culture system. Gastroenterology 102: A552
Étude des interactions épithélio-mésenchymateuses dans un système de cc-culture de cellules intestinales humaines
Jasée Durand
Département d'anatomie et biologie cellulaire Faculté de médecine, Université de Sherbrooke
Des cc-cultures composées uniquement de cellules intestinales humaines ont été générées dans le but d'étudier les interactions épithélio-mésenchymateuses. Les cellules épithéliales et mésenchymateuses sont les Caco-2/15 et les HIM
( cellules mésenchymateuses intestinales humaines ) respectivement.
Les cellules HIM ont été obtenues d'un jéjunum foetal humain de 18 semaines. Elles ont été caractérisées en analysant l'expression de marqueurs cytosquelettiques des fibroblastes et des cellules musculaires lisses soit la vimentine, l 'a-actine de muscle lisse, la desmine et la myosine. Elles sont comparables aux myof ibroblastes péricryptaux du grêle adulte.
Dans les cc-cultures, le maintien des caractéristiques cytosquelettiques des deux types cellulaires a été observé, les cellules Caco-2/15 exprimant toujours la cytokératine 18 et 19.
principaux constituants de la lame basale épithéliale intestinale a été analysée. Le collagène de type IV et la ténascine proviennent du compartiment mésenchymateux, la laminine et la fibronectine proviennent d'une contribution à la fois des Caco-2/15 et des HIM. Il y a apparition d'expression et de déposition de protéoglycan de type héparan-sulfate (HSPG) par les cellules épithéliales en co-cultures seulement. Ceci suggère qu'il existe des interactions épithélium-mésenchyme spécifiques dans lesquelles les cellules HIM modulent l'expression du HSPG par les cellules épithéliales. La lame basale retrouvée dans les co-cultures a la même composition que celle retrouvée dans le jéjunum foetal humain.
A la lumière de ces résultats, le modèle de co-culture de Caco-2/15 - HIM est un modèle valable pour l'étude
in vitro
de la formation de la lame basale dans le contexte des interactions épithélio-mésenchymateuses intestinales.!.INTRODUCTION
Le développement morphologique et fonctionnel de la muqueuse intestinale humaine a déjà fait l'objet de plusieurs recherches (Revues: Grand et al., 1976; Bustamante et Kodolvsky, 1981; Colony, 1983; Ménard et Calvert, 1991).
Chez l'humain, contrairement à ce que l'on peut observer chez les animaux de laboratoire à courte période de gestation (rat, souris), l'architecture et les principales fonctions de l'intestin sont acquises
in
utero. Environ à la moitié de la gestation, la muqueuse intestinale foetale a déjà atteint une morphologie adulte et plusieurs de ses capacités digestives. A 6-7 semaines de gestation, la paroi intestinale consiste en un endoderme pluristratif ié entouré par des couches de cellules mésenchymateuses concentriques.Vers 8-9 semaines, les villosités commencent à se former et les premiers signes de différenciation en cellules épithéliales se manifestent. Des cryptes primitives apparaissent vers 12 à 14 semaines. Finalement, vers 20 semaines, l'intestin est constitué de villosités et de cryptes bien différenciées, délimitées par un épithélium simple soutenu par un tissu conjonctif, la lamina propria.
L'épithélium intestinal demeure un système très dynamique au niveau adulte. L'unité fonctionnelle du renouvellement cellulaire se trouve sur l'axe crypte-villosité. A la base de la crypte se trouve une zone de cellules souches. Les cellules souches qu'on y retrouve sont pluripotentes (Cheng et Leblond, 1974). C'est à cet endroit que les cellules prolifèrent pour donner des cellules filles. Ces cellules vont migrer le long de la crypte jusqu'à l'atteinte d'un micro-environnement où elles vont réagir à des signaux de différenciation et vont continuer à proliférer, mais de moins en moins jusqu'au tiers supérieur de la crypte, où elles atteignent un dernier micro-environnement et ne prolifèrent plus pour atteindre leur niveau de différenciation terminal. Ces cellules deviendront principalement des entérocytes, des cellules caliciformes et des cellules entéro-endocrines. Il existe aussi les cellules de Paneth qui se retrouvent dans la zone de cellules souches. Ces cellules plutôt que de migrer de façon ascendante, vont migrer vers le bas de la crypte, après avoir passé la zone des signaux de différenciation juste au-dessus de la zone des cellules souches.
Les cellules absorbantes expriment plusieurs changements distincts lors de leur différenciation, tant morphologiques , biochimiques que fonctionnels (Grand et al., 1976; Lacroix et al., l984b). A l'entrée de la villosité, elles acquièrent une bordure en brosse (BB) apicale bien définie (Grand et al.,
1976) et expriment plusieurs enzymes digestifs comme l' aminopeptidase N, la dipeptidylpeptidase IV - (DDP IV) , la lactase et la sucrase-isomaltase (SI) (Lacroix et al., 1984b; Weiser, 1973).
Les mécanismes responsables de la régulation, de la prolifération et de la différenciation des cellules épithéliales intestinales sont peu connus, mais on sait que certains peuvent être impliqués. Par exemple, il a été démontré que certains facteurs de croissance et hormones ont un effet soit sur la différenciation ou la prolifération. Arsenault et Ménard (1985) ont démontré que l'hydrocortisone augmente l'activité enzymatique de la lactase alors que le facteur de croissance épidermique diminue la prolifération cellulaire (Ménard et Arsenault, 1988; Ménard et al., 1988) et plus récemment, Dignass et al. (1994) ont démontré que les facteurs de croissance des fibroblastes modulent la croissance et la migration des cellules épithéliales intestinales.
Il est aussi de plus en plus clair que la matrice extracellulaire (ECM) et les interactions épithélio-mésenchymateuses sont impliquées (Simon-Assmann et Kedinger, 1993; Haffen et al., 1989; Dauca et al., 1990; Mizuno et Yasugi, 1990). Les mécanismes impliqués dans ces interactions sont par ailleurs très peu compris. Un rôle crucial a tout de même été suggéré pour la ECM (Adams et Watt, 1993) et
particulièrement la lame basale, compte-tenu de sa position critique à l'interface épithélium-mésenchyme (Hay, 1981; Timpl et Dziadek, 1986, Bissel et Barcelos-Hoff, 1987; Mc Donald, 1989; simon-Assmann et Kedinger, 1993; Hahn et al., 1990}
1. La composition de la lame basale
Les principales composantes de la lame basale (LB) sont le collagène de type IV (C-IV), la laminine ·(LN}, le nidogène/ entactine habituellement associé à la LN, le protéoglycan de type héparan-sulfate (HSPG} et d'autres composantes mineures
(Timpl, 1989; Paulsson, 1992).
Deux composantes de la ECM (ECM} sont aussi retrouvées à l'interface épithélium-mésenchyme dans certains tissus, dont l'intestin. Ce sont la fibronectine (FN) et la ténascine (TN)
(Timpl et Dziadek, 1986; Beaulieu et al., 1991, Beaulieu et al., 1993a,b)
1.1 Le collagène IV
Le C-IV est une glycoprotéine de haut poids moléculaire (600 Kd). C'est un collagène non-fibrillaire retrouvé sous forme d'hétérotrimère composé de deux chaines al(IV) et une chaine a2(IV), chacune étant génétiquement distincte (al(IV}
vs 0:2 (IV) ) . Les trois chaines sont assemblées sous forme d'hélice o:. La région carboxy-terminale du c-IV est un gros domaine globulaire non-collagèneux (NCl). La région N-terminale est appelée le domaine 7S. Les domaines 7S et NCl sont les sites cruciaux pour la formation d'oligomères de c-IV, des dimères peuvent être formés avec les extrémités NCl et les tétramères avec les domaines 7S (Timpl, 1989). Les molécules de collagène s'assemblent aussi par des croisements parallèles et anti-parallèles et par des interactions latérales hélices-hélices. La structure supramoléculaire résultante est retrouvée à la LB.
Le rôle principal du C-IV est de former l'échafaud structural des LB. C'est à même cet échafaud que les autres constituants de la LB viennent s'ajouter (Paulsson, 1992; Leblond et Inoue, 1989; Timpl, 1989).
D'autres chaines de type C-IV ont récemment été caractérisées soient o:J(IV) {Saus et al., 1988), o:4(IV)
(Gunwar et al., 1990), o:5(IV) (Kashtan et al., 1986) et o:6(IV) (Zhou et al., 1993). Comparativement aux chaines o:l(IV) et o:2 (IV) , ces chaines ont une distribution tissulaire plus restreinte. Le rôle exact de ces chaines mineures du C-IV est peu connu, malgré que l'on sache déjà que les chaines o:J(IV) et a5(IV) semblent impliquées dans des maladies, respectivement le syndrome de Goodpasture et le syndrome
d'Alport (Hudson et al., 1993; Weber et al., 1992; Tryggvason et al., 1993).
La chaîne a5(IV) a été localisée de façon transitoire dans les membranes basilaires (MB) de l'intestin foetal (Beaulieu et al., 1994). Sa localisation dans les co-cultures nous a donc intéressés.
1.2 La laminine et ses homologues
La LN est la composante non-collagéneuse prédominante des LB (Yurchenco et Schittny, 1990; Timpl, 1989). C'est une glycoprotéine de haut poids moléculaire (900 Kd) composée de trois sous-uni tés: deux chaînes légères d'environ 2 OO Kd correspondant aux chaînes Bl et B2 et une chaîne lourde de 400 Kd, la chaine A (Beck et al., 1990). La structure hétérotrimérique de la LN est maintenue par des ponts disulfures. Leur assemblage résulte en une structure cruciforme où le bras long est composé de trois chaînes assemblées en hélice a et se termine par le domaine globulaire de la chaine A en c-terminal. D'autre part, les bras courts sont formés par les extrémités N-terminales de chacune des chaînes également par des domaines globulaires.
La LN se lie seulement aux triples hélices du C-IV à deux ou trois sites de liaison. La LN peut se lier au C-IV soit par
différents sites dans les bras courts ou par le domaine globulaire du bras long. Elle peut aussi reconnaitre le HSPG par l'extrémité du bras long ou plus faiblement par les bras courts.
La LN contient aussi des sites d'attachement aux cellules dans la région terminale du bras long et un second site d'attachement au niveau des bras courts (Timpl, 1989) et aussi un site de promotion de la prolifération cellulaire. La LN, vu tous les sites de liaison qu'elle possède, joue un rôle à la fois dans l'adhésion, la croissance, la polarisation, la migration et la différenciation des cellules (Beck et al., 1990; Timpl, 1989; Paulsson, 1992). La LN pourrait aussi être impliquée dans l'assemblage des LB, mais à un degré moindre que le C-IV.
La mérosine est un homologue de la LN dans laquelle la chaine A est remplacée par une chaine M, homologue (Ehring et al., 1990). Dans plusieurs tissus déjà étudiés, les LB contiennent toujours soit la chaine A ou la chaine M, mais jamais les deux (Engvall et al., 1990; Weiver et al., 1992; Beaulieu et Vachon, 1994). Dans l'intestin adulte humain, la chaine M est restreinte à la région de la crypte (Beaulieu et Vachon, 1994) et la chaine A apparait à la jonction crypte-villosité. Il y a toujours une distribution complémentaire, pas de co-expression dans une région donnée.
1.3 Le protéoglycan de type héparan-sulfate
Les protéoglycans de type héparan-sulfate sont le principal type de protéoglycan retrouvé à la LB. Le principal d'entre eux est celui de haut poids moléculaire appelé perlecan. La protéine de soutien est un polypeptide de 467 Kd
(Kullunki et Tryggvason, 1992) . Le modèle suggéré pour la macromolécule est une protéine contenant des domaines de liaison qui se terminent à une extrémité par trois chaines héparan-sulfate. Elle contient plusieurs domaines d'homologie retrouvés dans les protéines d'adhésion comme la LN (Wight et al., 1992; Kullunki et Tryggvason, 1992; Murdoch et al., 1992). E~le peut aussi interagir avec les autres protéines de
la ECM (par exemple la FN) et ainsi empêcher la liaison avec leurs récepteurs cellulaires (les intégrines entre autre). Il a aussi été démontré que les HSPG peuvent être impliqués dans le contrôle de la migration cellulaire en l'inhibant et dans le contrôle de la prolifération cellulaire (Wight et al., 1992). Le HSPG aurait un rôle d'intégrateur structural de la LB en interagissant avec le C-IV et la LN et pourrait être impliqué dans la stabilisation des interactions collagène-collagène. Il contribue donc d'une certaine façon à l'assemblage de la LB (Yurchenco et al., 1986).
La FN est une composante de la ECM aussi retrouvée à l'interface épithélium-mésenchyme {Timpl et Dziadek, 1986; Beaulieu et al., 1991). Cette glycoprotéine de 550 Kd est retrouvée sous deux formes. La FN sérique est présente dans les liquides interstitiels et dans le sérum sous forme soluble. La FN cellulaire, celle qui est étudiée, est la forme retrouvée au niveau des ECM et des LB, sous forme insoluble (Abrahamson, 1986). Deux chaines polypeptidiques de 270-290 Kd non-identiques composent la FN. Ces deux chaines sont liées par une paire de ponts disulfures à leur extrémité carboxyterminale.
Les chaines de la FN contiennent des domaines structuraux et fonctionnels, entre autre dans les régions amino-terminales et carboxyterminales. Également, elles contiennent un si te de liaison de tous les types de collagène et un site d'attachement cellulaire (via des intégrines) dans leurs domaines centraux. La FN peut donc influencer l'adhésion ainsi que la migration des cellules.
Le rôle de la FN serait possiblement de participer au maintien de la LB et à l'attachement des cellules à celle-ci
(Abrahamson, 1986; Hynes, 1986; Ruoslahti, 1988). 1.5 La ténascine
La TN est une glycoprotéine de la ECM formée de six sous-uni tés de 190 à 320 Kd selon l'espèce et -les variantes analysées (Gulcher et al., 1986; Jones et al., 1989; Kruse et al., 1985) qui est aussi retrouvée à l'interface épithélio-mésenchymateuse (Beaulieu et al., 1991; Beaulieu et al., 1993a). Elle est formée à partir de deux trimères qui s'associent par leur globule central à l'aide de ponts disulfures. La TN comporte des sites de liaisons aux cellules. Elle a aussi des propriétés adhésives et anti-adhésives (Erickson et Bourdon, 1989; Chiquet-Ehrismann et al., 1991; Sage et Bernstein, 1991; Beaulieu et al., 1993a) qui sont localisées dans des régions bien distinctes du polypeptide. De plus, différentes variantes de la TN sont produites par de l'épissage alternatif. Dans l'intestin foetal humain, la TN est exprimée au niveau du mésenchyme de la villosité en formation, selon un gradient positif de la crypte vers le haut de la villosité. Elle est également localisée à la membrane basilaire de tout l'épithélium lorsque le jéjunum est complètement développé. Elle pourrait donc jouer un rôle dans la migration cellulaire et la l'expulsion des cellules épithéliales dans la lumière intestinale (Probstmier et al., 1990) .
2. La décorine
chodroitine/dermatan sulfate contenant une seule chaine de glycasaminoglycan. Ce protéoglycan est retr~uvé dans la
matrice extracellulaire. La décorine a la propriété d'être un ligand biologique à la fois pour des molécules de la ECM et des facteurs de croissance (Gallagher, 1989; Ruoslahti et Yamaguchi, 1991; Kjellén et Lindhal, 1991). Par exemple, on le retrouve lié au Collagène I empêchant la fibrillogénolyse (Vogel et Trotter, 1987) et au TGF-B, neutralisant l'activité biologique de ce dernier. De plus, une augmentation de l'expression de la décorine est observé dans les cancer de côlon humain et ce phénomène est observable également dans des cultures de cellules mésenchymateuses et de cellules de cancer de côlon (Iozzo et al., 1989; Bantra et al., 1994).
3. Rôle de la matrice extracellulaire et de la membrane basilaire
Un rôle crucial des composantes de la ECM et en particulier de la MB, à cause de sa position privilégiée à l'interface épithélium-mésenchyme, a déjà été proposé (Hay, 1981; Timpl et Dziadek, 1986; Bissell et Barceloss-Hoff, 1987; Sanders, 1987; Hahn, 1990) pour une variété d'organes en développement dont l'intestin humain.
Des études
in vitro
avec des cultures primaires et des lignées cellulaires ont permis de suggérer un rôle direct desmolécules de la LB dans l'adhésion cellulaire intestinale, la prolifération et la différenciation (Kedinger et al., 1987b; Caroll et al., 1988; Hahn et al., 1990).
Au cours de la morphogénèse intestinale, une variation dans la distribution des molécules de la ECM dans le mésenchyme et la MB dans plusieurs espèces dont l'humain ( Simon-Assmann et al., 1986; Aufderheide et Ekblom, 1988; Senior et al., 1988) rend encore plus probable leur rôle dans les interactions cellules-matrice (Probstmeier et al., 1990; Beaulieu et al., 1991; Beaulieu et al., 1993a,b).
De pl11s, il a été démontré que pour la déposition d'une MB normale, il doit y avoir la présence à la fois des cellules épithéliales et du mésenchyme (Simon-Assmann et al., 1990b; Haffen et al., 1989; Simon-Assmann et al. 1988; Kedinger et al., 1987b). Récemment, Frish et Francis (1994) arrivaient à la conclusion que l'élimination des interactions cellules-matrice induit l'apoptose des cellules épithéliales. Ceci vient donc appuyer les affirmations d'autres groupes qui concluent que les molécules de la ECM serait un signal pour l'interaction entre l'épithélium et le mésenchyme (Bissel et Barcellos-Hoff, 1987; Mc Donald, 1989; Simon-Assmann et al., 1990b) .
à jouer au moins dans la médiation de certaines réponses hormonales et ainsi agir sur la différenciation.entérocytaire ( Bouziges et al., 1989; Kedinger et al., 1989) . Le rôle directe de la LB n'a tout de même pas encore été clairement établi. Par ailleurs, très peu d'études ont porté sur l'effet de la présence de cellules épithéliales sur la différenciation des cellules du mésenchyme . Il commence pourtant à être de plus en plus évident que de telles interactions existent
(Kedinger et al., 1990; Beaulieu et al., 1993a, b). 4. Les fibroblastes péricryptaux
L'utilisation de marqueurs de différenciation comme les protéines cytosquelettiques ont permis de noter une hétérogénéité phénotypique entre les cellules mésenchymateuses encore plus précise que simplement les différences morphologiques (Sappino et al., 1989; Sappino et al., 1990).
Les fibroblastes péricryptaux sont des cellules qui morphologiquement ont l'apparence de fibroblastes, mais ont aussi des caractéristiques de cellules musculaires lisses: elles contiennent des microfilaments avec des "corps" denses et ont des jonctions intercellulaires. Elles ont aussi des ressemblances avec les cellules musculaires lisses par leur réaction en immunocytochimie qui démontre la présence de composantes cytosquelettiques retrouvées dans les cellules
musculaires lisses tel, l'a-actine de muscle lisse, la myosine et la desmine (Richman et al., 1987; Beaulieu et al., 1993a; Kedinger et al., 1990) ce qui a amené Richman et al. à les qualifier de myofibroblastes.
Certains auteurs avaient rapporté que les cellules péricryptales migraient en bloc avec les cellules épithéliales dans le jéjunum de lapin (Pascal et al., 1968; Parker et al., 1974), mais plus tard, des études chez les rongeurs n'ont jamais confirmé ces résultats (Neal et Potten, 1981; Maskens et al., 1979} même que Maskens et al. ont plutôt démontré que la couche péricryptale est une structure stable sur laquelle les cellules épithéliales migrent en se différenciant.
La fonction des fibroblastes péricryptaux n'a pas encore été clairement établie (Richman et al., 1987,; Beaulieu et al., 1993; Beaulieu et al. 1992). Par contre, il a été proposé qu'ils participent aux interactions épithélium-mésenchyme avec les cellules épithéliales adjacentes et auraient un rôle à la fois dans le support et le contrôle de la différenciation des cellules épithéliales (Pascal et al., 1968; Mathan et al., 1972). De plus, un rôle de contraction et de sécrétion est suggéré pour ces cellules (Richman et al., 1987; Furaya et Furaya, 1993}. Richman et al., (1987) proposent même un rôle dans la production de matériel de la ECM qui pourrait influencer la différenciation et la croissance épithéliales.
D'autre part, quelques études menées jusqu'à maintenant proposent, par des interactions épithélio-mésenchymateuses, une implication des cellules épithéliales dans la différenciation des cellules musculaires lisses et également des cellules péricryptales en myof ibroblastes (Beaulieu et al., 1993a; Kedinger et al., 1990).
5. Notre modèle
Afin de permettre l'étude des interactions épithélio-mésenchymateuses, plus particulièrement de leur rôle dans la différenciation épithéliale, la différenciation des cellules du mésenchyme et l'implication des molécules de la LB, nous avons élaboré un système intestinal humain de co-culture • Les cellules choisies pour représenter les compartiments épithélial et mésenchymateux sont les cellules Caco-2/15 et les cellules HIM respectivement.
5.1 Les cellules Caco-2/15
La lignée mère Caco-2 a été obtenue d'un adénocarcinome humain par Fogh (Fogh et al., 1977a et b). Un peu plus tard, Pinto et al. (1983) ont démontré leur potentiel à se différencier. En culture, les cellules de la lignée caco-2 se différencient graduellement pour atteindre d'abord une morphologie cylindrique typique, et ensuite acquérir les
propriétés des cellules absorbantes de la villosité intestinale. Elles proviennent d'un côlon adulte, mais, lors de la carcinogénèse, elles se dédifférencient et se comportent en cellules épithéliales de côlon foetal (d'environ 16 semaines) . Elles expriment alors les marqueurs de différenciation des cellules absorbantes tel la DPP IV et la SI ainsi que d'autres enzymes de la BB (Daniele et Quaroni, 1991). Elles sont donc comparables aux cellules absorbantes de jéjunum foetal.
Par ailleurs, les cellules de la lignée Caco-2 expriment la SI de façon hétérogène. Alors, Quaroni et ses collaboratenrs ont cloné les cellules de cette lignée afin d'obtenir des cultures homogènes dans l'expression de la SI. La lignée Caco-2/15 a alors été isolée (Beaulieu et Quaroni, 1991), mais elle conserve tout de même une hétérogénéité dans l'expression de la SI. Celle-ci a par contre été démontrée comme étant seulement transitoire (Vachon et Beaulieu, 1992). Elles ont été choisies préférentiellement aux cellules HT-29, même si elles sont qualifiées d' inductibles à se différencier (Zweibum et al., 1985). Le choix a été effectué en se basant sur les expériences de Bouziges et al. qui avaient démontré que les cellules HT-29 réagissent mal en co-culture (Bouziges et al.,1991). Elles ne s'étendent pas sur le tapis mésenchymateux et il y a nécrose. Alors, les Caco-2 qui
ont démontré un potentiel d' inductibili té et une meilleur réaction aux co-cultures s'avèrent donc un modèle plus prometteur.
5.2 Le support mésenchymateux
Des études de co-culture avec des soutiens fibroblastiques ont déjà été effectuées (Stallmach et al., 1989; Bouziges et al., 1991; Kedinger et al., 1990). Dans ces études, les fibroblastes utilisés proviennent soit de la peau d'humain ou de rongeurs ou encore d'intestin de rongeurs. L'utilisation de cellules mésenchymateuses intestinales foetales humaines nous semble plus appropriée parce que, d'une part, il a déjà été démontré que le mésenchyme humain a un pouvoir inducteur plus grand que celui des rongeurs (Lacroix et al., 1984a) et d'autre part, par des études de recombinaison, on en est venu à la conclusion que le mésenchyme peut avoir un effet inducteur ou permissif sur la différenciation épithéliale (revue: Haffen et al., 1989).
6. Objectifs du projet de maîtrise
Suite aux connaissances déjà acquises sur les interactions épithélio-mésenchymateuses dans le développement et la différenciation intestinale, les objectifs du projet de recherche sont donc:
1. Valider le système de co-culture de cellules Caco-2/15 et de cellules HIM utilisé.
2. Caractériser la composante mésenchymateuse des co-cultures en étudiant l'expression de marqueurs cytosquelettiques.
3. Analyser la formation et la composition de la lame basale retrouvée à l'interface des deux types cellulaires. 4. Déterminer s'il existe des interactions
épithélio-mésenchymateuses entre les cellules Caco-2/15 et les cellules HIM.
II. MATÉRIEL ET MÉTHODES
1. Spécimens
1.1 Culture de cellules
1.1.1 Cellules mésenchymateuses intestinales humaines CHIM) Les
dérivées
cellules mésenchymateuses d'un jéjunum foetal de
intestinales 18 semaines
ont été (post-fertilisation). Pour l'obtention des cultures primaires, des explants de 1 mm3 de jéjunum étaient soumis à une digestion
partielle par la trypsine ( 0,5 % trypsine - 0,54 mM EDTA dans du PBS exempt de ca2+ et Mg2+, 2 x 10 min. à 23 °C). Les
fragments restants étaient récoltés par centrifugation et incubés à 37 °C dans un atmosphère de 95% air et 5% co2 pendant
12 heures dans des vases de Pétri de plastique de 100 mm Falcon à raison de 10 fragments par vase dans 1 ml de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM; Gibco Canada, Burlington, Ont.) contenant 10 % de sérum de veau foetal (FBS; Gibco), 50 U/ml de pénicilline, 20 mM d'HEPES, 50 µg/ml de streptomycine et 4mM de glutamine. Ensuite, 10 ml du même milieu étaient ajoutés et les explants étaient incubés pendant 48 heures supplémentaires. Dans ces conditions, seulement les cellules de type fibroblastiques ont poussés hors des fragments. Les
explants étaient ensuite enlevés, le milieu renouvelé et les cellules de type fibroblastique étaient maintenues en culture durant 2-3 jours dans le but d'obtenir 60-70 % de confluence. Des sous-cultures étaient produites après un traitement à la trypsine (0,5 % trypsine-0,54 mM EDTA dans du PBS, 5min à 23 °C). Les populations cellulaires obtenues ont été congelées au passage 2 dans l'azote liquide. Les cellules utilisées pour ce travail proviennent des passages 4 et 5.
employées comme contrôle sont âgées de confluence.
1.1.2 Cellules Caco-2/15
Les cellules HIM 10 jours
post-La lignée cellulaire Caco-2/15 nous a été donnée par le Dr. A. Quaroni (Cornell University, Ithaca, NY). Ce clone provient de la lignée cellulaire Caco-2 (HBB 37; ATTC, Rockville, MD) et a déjà été caractérisé (Beaulieu et Quaroni, 1991; Vachon et Beaulieu, 1992). Les conditions de culture pour les Caco-2/15 ont également déjà été décrites (Beaulieu et al., 1989) et sont les mêmes que pour les cellulers HIM. Les passages étaient effectués lorsque les cellules se trouvaient à environ 80 % de confluence. Les cellules ont été utilisées entre les passages 53 et 70. Les cellules en culture seules employées comme contrôle étaient de 8 ou 9 jours post-confluence.
1.1.3 Co-cultures
Pour obtenir les co-cul tures, les cellules Caco-2/15 étaient ensemencées à haute densité (1 x 107 cellules) sur des
cellules HIM à 2 jours de post-confluence. Les cultures étaient conservées jusqu'à 14 jours en renouvelant le milieu tous les deux jours. Le milieu et les conditions de culture étaient les mêmes que pour les autres cellules (Caco-2/15 et HIM, voir section 1.1.1). Les âges des cc-cultures utilisées sont de 1 jour avant la confluence jusqu'à 11 jours post-confluence. Pour l'immunofluorescence, une première série de cc-cultures comprend des stades de -1, 1, 5, 8, 10 et 11 jours post-confluence et une deuxième série de cc-cultures de
o,
2 et 6 jours post-confluence. Pour le transfert Western, une première série comprend des stades de 36 heures de culture, 1 et 6 jours post-confluence et une deuxième série des stades deo,
2 et 6 jours post-confluence. L'atteinte de la confluence prend environ de 6 à 7 jours de culture.1.2 Tissus humains foetaux
Les jéjunums de foetus âgés de 18 à 20 semaines étaient obtenus à la suite d'avortements thérapeutiques légaux. L'âge foetal était déterminé soit selon le dossier médical ou l'échographie.
1.3 Tissus humains adultes
Les sections saines d'intestins grêles {bordant les sections malades) étaient obtenues suite à une résection de patients atteints de maladies tel l'iléite ou d'obstructions intestinales.
L'utilisation de tissus humains a été approuvée par le comité d'éthique du Centre Hospitalier de l'Université de Sherbrooke pour ces recherches.
2. Microscopie à contraste de phase
Les cultures de cellules étaient observées avec un microscope à contraste de phase Wild Leitz {Heerbrugg, suisse) équipé pour la photographie optique.
3. Immunofluorescence
3.1 Préparation des échantillons 3.1.1 Tissus
Des sections d'environ 1 cm de jéjunum foetal intact {qui n'ont pas été ouvertes longitudinalement) étaient d'abord lavées dans du PBS et égouttées sur du papier buvard puis
incluses dans l'OCT (Optimum cutting temperature; Tissu Tek, Miles Laboratories, Elkart, IN) • Les blocs étaient ensuite congelés rapidement à -80°C dans l'azote liquide et conservés à
-ao
0c.
Les régions saines des spécimens adultes étaient d'abord lavées dans du PBS puis égouttées sur du papier buvard. Des segments d'environ 1 cm de long par 0,5 cm de large étaient in cl us dans l 'OCT comme précédemment. Les segments étaient généralement exempts des couches musculaires externes pour permettre une meilleure inclusion.
3.1.2 Cellules en culture
Les trois types de cultures utilisés étaient préparés avec la même méthode. Les milieux étaient d'abord aspirés et les cellules rincées 2 fois au PBS. Dans un vase de Pétri de 100 mm, lml d'OCT était ajouté et par grattage mécanique les cellules étaient mélangées à l 'OCT. Dans le cas des co-cul tures, une attention partico-culière était apportée à cette étape. Autant que possible, la couche cellulaire était gardée intacte en formant des petits rouleaux de co-cul ture. Les mélanges de cellules et d'OCT étaient congelés dans l'azote
liquide et les blocs conservés à -80 °C. 3.2 Coupes
Des coupes de cellules et de tissus de 2-3 µm d'épaisseur étaient réalisées à l'aide d'un cryostat Jung frigocut 2800N (Leica Instruments, Nussluch, Allemagne) et déposées sur des lames silanisées (Mazia et al., 1975). Les lames étaient laissées une heure à 37°C afin de laisser adhérer les coupes puis conservées à
-ao
0c.
3.3 Immunodétection
Les coupes conservées à -80°C étaient d'abord ramenées à la température de la pièce. Ensuite, elles étaient fixées soit avec une solution de formaldéhyde 1% dans du tampon phosphate de sodium 100 mM à pH 7,4 une heure à 4°C ou avec de l'acétone ou du méthanol 10 minutes à -20 °C selon l'anticorps utilisé (voir tableau 1). Trois lavages de 10 minutes au PBS étaient ensuite faits avant l'incubation de 45 minutes à 4 °C avec une solution de lOOmM de glycine dans du PBS. Cette dernière étape avait pour but de neutraliser les groupements aldéhydes résiduels. Les coupes étaient relavées 3 x 10 min dans du PBS.
Le blocage des sites non-spécifiques était effectué à la température de la pièce dans une chambre à humidité soit à l'aide d'une solution de 2% de sérum bovin (BSA) dans du PBS pH 7,4 ou de Blotto 10 % (lait en poudre dans du PBS). Puis les coupes étaient lavées deux fois 5 minutes au PBS. Les
sites antigéniques étaient détectés en incubant une heure
àla
température de la pièce avec les anticorps primaires dilués
dans l'agent bloquant. Trois lavages de 10 minutes au PBS
étaient effectués avant l'incubation d'une heure avec les
anticorps secondaires. Après trois lavages de 10 minutes, les
lames étaient montées
àl'aide d'une solution de glycérol-PBS
9:1 contenant 10 µg de paraphénylènediamine, puis observées
avec un microscope de type Reichert Polyvar 2 (Leica Canada,
St-Laurent, Qué.) équipé pour l'épifluorescence.
Des contrôle négatifs étaient réalisés en incubant avec
l'agent bloquant dépourvu d'anticorps primaire.
4. Électrophorèse
4.1 Préparation des échantillons
4 .1.1 Tissus
Les tissus employés pour l'électrophorèse étaient des
échantillons de jéjunum foetal de 18 semaines. Ils étaient
d'abord lavés dans du PBS puis asséchés sur du papier buvard
et coupés transversalement en sections d'environ 2mm
àl'aide
d'un scalpel. Le tout était homogénéisé
àl'aide d'un appareil
Polytron (Brinkmann Instruments; Rexdale, Ont.) deux fois une
minute
àla vitesse 7 dans du tampon d'homogénéisation ou
simplement de l'eau déionisée à raison de 100 mg de tissu par ml. La composition du tampon d'homogénéis~tion est la
suivante:
Tampon tris-HCl 10 mM à pH 6.8 contenant: PMSF 0.1 mM EDTA 0,1 mM EGTA 0,1 mM Inhibiteurs de protéases: Pepstatine(Sigma) Leupeptine(Sigma)
Antipaine(BoehringerMannheim, Laval, Qué) Aprotinine(Boehringer Mannheim) Benzamidine(Sigma) Chymostatine(Boehringer Mannheim) o,5 µg/ml 2,0 µg/ml 2 ,5 µg/ml 1,0 µg/ml 10,0 µg/ml 2,5 µg/ml Les homogénats étaient ensuite dilués 1:2 dans du tampon de solubilisation 2X dont la composition est la suivante:
Tampon Tris-HCl 125 mM contenant: SDS 4,6 %
S-mercaptoéthanol 10 %
Bleu de bromophénol 0,002 % Glycérol 20 %
Les échantillons étaient ensuite chauffés à 90°C 10 minutes en vortexant régulièrement puis centrifugés à 13,000g 5 minutes. Le surnageant était récupéré et congelé en aliquots à -80 °C.
4.1.2 Cellules en culture
Dans le cas des cellules en culture, le milieu était aspiré et les cellules lavées avec du PBS. Les cellules étaient ensuite diluées dans du tampon de solubilisation lX à raison de 1 ml de tampon/Pétri, par grattage, puis soniquées
(modèle XL 2010, Mendel scientific Co. Farmingdale, NY) pendant 10 secondes à vitesse 4.
4.2 Séparation des protéines sur gel d'acrylamide
Les protéines étaient séparées sur gel d'acrylamide par électrophorèse (SOS-PAGE) selon la méthode de Laemmli {Laemmli, 1970), mais en utilisant un gel de séparation de type Thomas et Kornberg {Thomas et Kornberg, 1975). Selon les protéines analysées, la concentration en acrylamide du gel de séparation variait de 8% pour les protéines de haut poids moléculaire à 12 % pour les plus petites. La composition des gels était la suivante:
Produit Gel d'entassement Gel de séparation (4% acrylamide) 8% 10 % 12% Acrylamide/bis 30:0.15
--
26,8% 33 % 40 % Acrylamide/bis 30:0.8 13 %--
--
--Tampon tris 1,5M pH 8,8--
25 % 25 % 25 % Tampon tris 1 M pH 6,8 12,5%--
--
--H20 bidistillée 73,7% 46,8% 40,3% 33,5 % SOS 10 % 1% 1% 1% 1% Persulfate d'ammonium 0,5% 0,25% 0,25% 0,25% Temed 0,05% 0,05% 0,05% 0,05%Le tampon d'électrode utilisé était celui de Laemmli dont la solution est la suivante: 1 % SDS, 14,4 % glycine et 3,03 % Tris. La migration des échantillons se faisait environ 1 heure à 70 volts puis environ 4 heures à 170 volts. Les échantillons étaient préparés pour la migration en les chauffant à 100 °C environ 5 minutes et en centrifugeant 5 minutes à 13 ooog. Ils étaient ensuite déposés sur le gel.
Après la migration, le gel était soit coloré au bleu de Coomassie (Biorad) pour ajuster approximativement les volumes de protéines déposées dans chacun des puits ou utilisé pour le transfert Western.
5. Transfert Western
5.1 Transfert sur nitrocellulose
La méthode utilisée pour le transfert Western a été décrite par Towbin et al., (1979). Elle consiste d'abord à laisser incuber le gel dans le tampon de transfert (composé de 1,4 % glycine et 0,3 % Tris) à 4°C, 30 minutes, puis à mettre en contact une membrane de nitrocellulose (BioRad, Missisauga, Ont. ou Gibco) et le gel dans un appareil de transfert
Suite au transfert, la membrane est rincée à l'eau 2 X 10 minutes puis les protéines sont colorées au _Ponceau rouge (0,5g de Ponceau
s,
38 ml TCA 20 %, complété à 250 ml avec HiO) pour localiser les protéines et les marqueurs standards de poids moléculaire. La membrane est lavée au PBS puis à l'eau. 5.2 Détection des antigènesLa membrane était incubée dans l'agent bloquant, du Blotto 10 % dans du PBS pH 7,4, soit une nuit complète à la température de la pièce ou 1 heure à 37 °C puis 1 heure à la température de la pièce. La membrane incubait avec l'anticorps primaire dilué dans dn Blotto 10 % soit 1 heure ou toute la nuit selon le temps de blocage. Suivaient plusieurs lavages au PBS, totalisant 30 à 45 minutes avant un second blocage d'une heure au Blotto 10 % puis l'incubation avec l'anticorps secondaire, également 1 heure. La membrane était ensuite bien lavée en effectuant plusieurs lavages au PBS. La membrane était équilibrée dans le tampon de révélation (Tampon ALP: Tris 1,21 %, NaCl 0,58 %, MgC12 1,02% dans H20 bidistillée, pH 9, 5 ou BioRad) 5 min. Puis les si tes de réaction étaient localisés à l'aide d'un substrat chromogénique (BioRad) dilué dans le tampon ALP. La réaction était arrêtée par des lavages à l'eau distillée.
Les anticorps primaires utilisés sont énumérés dans le tableau 1. Certains étaient utilisés pour l' immunofluorescence et le transfert Western, d'autres étaient utilisés seulement pour l'un ou l'autre. Il s'agissait soit d'anticorps polyclonaux de lapin ou de monoclonaux de souris. Pour l'immunofluorescence, les anticorps secondaires étaient soit des anti-lapins ou des anti-souris couplés à la lissamine-rhodamine ou à la fluorescéine dilués 1/25 dans l'agent bloquant. Pour la détection en transfert Western, les anticorps secondaires étaient soit des anti-souris ou des anti-lapins couplés à la phosphatase alcaline (BioRad) dilués 1/3000 dans du Blotto 10
% .
Anticorp1 Antlgme m/p~• Fixation12Y Agent Dilution Source/réf."' blocant IF;WB
vim3B4 Vimentine M AIBSA2% 1/10;1/SO Bochringcr I (1)
1A4 a-actine de muscle 1iue M AIBSA2% 1/1000; 1/SOO Sigma I (2)
anti-desmine Dcamine M AIBSA2% Smg/ml; lmg/ml Bochringer I (-)
MY21 Myoeine M FIBSA2% 1noo (IF) Sigma/(-) Anti-myoeine Myoeine de muscle. 1iue p FIBSA2% 1/100;1nOO Sigma I (-)
et aquclettique
a-SMC Cellub de muscle 1iue M AIFCS2% 1/10 (IF) Bochringer I (3)
CY90 Cytokc!ratine 18 M FouAIBSA 2% 1/200;1/1000 Sigma I (4)
clone4,62 Cytokmtine 19 M AIBSA2% 1/20 (IF) Sigma/ (S) clone 1165 Cytokmtine 19 M _,_ 1/lOOO(WB) Sigma I (S)
DA07/219 DPPIV M FIBSA 2% 1/100 (IF) Dr. A. Quaroni/(6) Caco3n3 ou SI M AIBSA2% 1/S;l/SOO Dr. A. Quaroni/(7)
HIS-14
FN-IS Fibronectine cellulaire M FIBSA 2% 1/100;112000 Sigma/(-) FN-3E'l Fibroncctine cellulairc M FIBSA 2% 1/100 (IF) Sigma I (-)
TN Tma.cine p FIBSA2% 1/SO;l/300 Chemicon lnt. I (8) Ab748 C-IV p _,_ 1/SOO(WB) Chemicon lnt./ (-)
M3F7 C-IV M FIBSA 2% 1/100 (IF) Bank(•) I (9) a-Ùlmc Laminine placentaire p FIBSA 2% 1/SO;l/300 Calbiocbem / (10) (ab428004) humaine
2E8 chaine Bl laminine M AIBSA 2% 1/SO (IF) Bank(~ /(10) Anti-1.N-A Chaine A Laminine M MIBSA2% 11100 (IF) Telios I (-)
(ab42800S)
Anti-1.N-M Mc!roeine M MIBSA2% 1/lOO(IF) Telioe / (-)
7E12 prob!inc de l'HSPG M FIBSA 2% 115 (IF) Chemicon lnt. I (11) J-2 ..S(IV) du collagme IV p F/Blotto 10 % 11200;1/300 Produit dans notre labo.
I (12)
PG40 Dc!corine p AIBSA2% 1/lOO(IF) Chemicon lnt./ (13-14)
U>: M: monoclonal, P: polyclonal;
~: A: acétone, F: formaldéhyde 1%, M: méthanol
<3>: 1: Heid et al. (1988); 2: Skalli et al. (1986); 3: Vollmer et al. (1987); 4: Levy et al. (1988); 5: Gigi-Leitner et al. (1986); 6: Daniele et Quaroni (1990); 7: Idem; 8: Beaulieu et al. (1991); 9: Foellmer et al. (1983); 10: Engvall et al. (1986); 11: Kemeny et al. (1988); 12: Beaulieu et al. ( 1994); 13: Brennman et al. ( 1984); 14: Krusius et Ruoslahti E. ( 1986)
III.RÉSULTATS
1. Caractérisation des cellules mésenchymateuses
Afin de bien caractériser les cellules mésenchymateuses obtenues
in vitro,
l'expression de protéines cytosquelettiques spécifiques à certains types cellulaires soit l'actine et la myosine, retrouvées surtout au niveau des microf ilaments ainsi que la vimentine et la desmine surtout présentes au niveau des filaments intermédiaires des cellules mésenchymateuses et musculaires a été analysée. Leur localisation au ni veau du jéjunum foetal et adulte, et leur expression dans les cultures de cellules mésenchymateuses a été effectuée par immunofluorescence indirecte.Les protéines principales qui ont été analysées sont la vimentine , avec l'anticorps VIM 3B4, l'a-actine de muscle lisse à l'aide de l'anticorps 1A4, la desmine avec un anti-desmine monoclonal de Boehringer et la myosine à l'aide d'un anticorps monoclonal, le MY21 et un antisérum contre la myosine de muscle lisse et squelettique(M-7648 de sigma) (voir Tableau 1).
1.1 Localisation des marqueurs cytosguelettigues dans le jéjunum humain adulte
exprimée au niveau de la muscularis mucosae et des cellules de la lamina propria, également par les - fibroblastes péricryptaux. Dans la sous-muqueuse, un marquage des cellules isolées et des cellules musculaires lisses des vaisseaux sanguins est observée {Fig. la).
A la figure lb, on remarque la présence de l'a-actine de muscle lisse dans la muscularis mucosae, qui est fortement marquée, et des fibroblastes péricryptaux. Les cellules musculaires lisses de la lamina propria et du tissu conjonctif présentent aussi une forte expression d'actine. Au niveau de la sous-muqueuse, un marquage est observé dans les membranes des vaisseaux sanguins seulement.
La desmine, pour sa part est localisée dans la muscularis mucosae et est fortement exprimée. Les cellules musculaires lisses isolées de la lamina propria sont caractérisées par une forme très allongée et expriment également fortement la desmine. Par ailleurs, elle n'est pas détectée dans les fibroblastes péricryptaux. (Fig. le).
Les deux anticorps contre la myosine démontrent sensiblement le même marquage. La myosine est faiblement exprimée par les cellules épithéliales (du côté apical). Elle est modérément exprimée par les cellules musculaires lisses isolées de la lamina propria, les fibroblastes péricryptaux et
les cellules de la muscularis mucosae (non-montrés). 1.2 Localisation des marqueurs cytosguelettigues dans le
jéjunum foetal humain
A la figure 1, on observe l'expression des 3 marqueurs cytosquelettiques dans le jéjunum foetal de 18 semaines. La vimentine est fortement exprimée dans tout le mésenchyme, du bout de la villosité jusqu'à la couche musculair,e externe (Fig. ld). L'a-actine de muscle lisse est localisée au niveau de la muscularis mucosae, des cellules isolées de la villosité et des couches musculaires externes, où on observe un fort marquage (Fig. le) • Selon la figure lf, dans l'intestin foetal, la desmine est retrouvée dans la muscularis mucosae, fortement exprimée et dans les couches musculaires externes. A noter que dans les figures ld, e et f, les couches musculaires externes ne sont pas représentées.
1.3 Expression des marqueurs cytosguelettigues par les
cellules mésenchymateuses intestinales humaines en culture Les cellules mésenchymateuses obtenues
proviennent d'un jéjunum foetal de 18 semaines
in vitro
et ont été isolées tel que décrit dans la section "Matériel et méthodes". Elles ont été nommées cellules HIM pour "Human intestinal
La vimentine (a,d,g), l'a-actine de muscle_ lisse (b,e,h)
et la desmine (c,f ,i) sont détectées par immunofluorescence
indirecte sur des coupes de jéjunum adulte et foetal de 18
semaines ainsi que sur des cellules HIM en culture seules
ayant été cultivées simultanément aux co-cultures de
6jours
post-confluence.
Grossissement: a,b,c: 125x
d,e,f: 50x
g,h,i: 250x
Représentation schématique des coupes transversales d'intestin
adultes et foetales. La partie encadrée est celle représentée
sur la figure.
a,b,c
adulte
d,e,f
foetal
g
.t
.
mesenchymal".
In vitro,
les cellules HIM ont une morphologie fusiforme typique, tel qu'observé par microscopie à contraste de phase (Fig.2b). Elles croissent rapidement. L'étude de l'expression des mêmes constituants cytosquelettiques que ceux localisés dans le jéjunum (vimentine, a-actine de muscle lisse, desmine et myosine) a été réalisée afin de caractériser plus précisément les cellules obtenues en culture.Les cellules HIM expriment la vimentine (Fig. lg), l'a-actine de muscle lisse (Fig. lh) et la myosine (non-illustrée), mais sont négatives pour la desmine (Fig. li). Afin de confirmer l'origine mésenchymateuse, l'expression de la cytokératine 18 (reconnue par l'anticorps CY 90), une protéine cytosquelettique spécifique aux cellules épithéliales, a été analysée. Les cellules HIM ne l'exprime pas, comme prévu.
2. Caractérisation des co-cultures 2.1 Caractérisation morphologique
En culture seules, les cellules Caco-2/15 croissent par petits ilots de cellules étendues, jusqu'à l'obtention de la confluence. Alors, elles commencent leur différenciation
entérocytaire (Vachon et Beaulieu 1992). Les cellules différenciées forment une monocouche de cellules épithéliales cylindriques, tel qu'illustré à la figure 2a, qui montre une culture à confluence, en microscopie à contraste de phase.
En co-culture, lorsque les cellules épithéliales sont ensemencées sur les cellules HIM confluentes (Fig.2b), elles adhèrent facilement et croissent par ilots en monocouche. Le temps nécessaire à l'atteinte de la confluence est semblable aux monocultures sur plastique (3-4 jours) (Vachon et Beaulieu, 1992). Par microscopie à contraste de phase, on remarque deux types de colonies (Fig.2c). Environ la moitié des cellules épithéliales ont poussé sur la couche de cellules HIM (Fig.2c:e/m). Par ailleurs, l'autre moitié des cellules Caco-2/15 proviennent de cellules ayant atteint le plastique lors de l'ensemencement en pénétrant entre des cellules de la couche fibroblastique à des endroits oü celle-ci était moins dense (fig.2c:e/p). La croissance de ces colonies a écarté les fibroblastes, jusqu'à l'obtention d'une monocouche de cellules épithéliales confluentes.
2.2 Expression des marqueurs cytosguelettigues des cellules en co-culture
La conservation des caractéristiques cytosquelettiques spécifiques a été analysée pour chacun des deux types
des cellules Caco-2/15 et HIM en co-culture
Observation en microscopie à contraste de phase des cellules Ca2/15 (a), des cellules HIM (b), et des co-cultures de Caco-2/15 sur des HIM (c). Les cellules Caco-2/15 et les co-cultures sont à 6 jours post-confluence et les cellules HIM en culture seules ont été cultivées et récupérées simultanément aux HIM des co-cultures récupérées à 6 jours post-conf luence.
En immunofluorescence indirecte, la dipeptidylpeptidase IV (d) et la cytokératine 18 (e,f) ont été localisées dans les
.
co-cultures à 6 jours pot-confluence (cellules épithéliales vers le haut) (d,e) et un jéjunum foetal de 18 semaines (f). La vimentine (g) et l'a-actine de muscle lisse (h), ont été détectées sur des co-cultures à 10 jours post-confluence.
e: couche de cellules Caco-2/15 m: couche de cellules HIM
p: plastique Grossissement: a,b,c: l88x d: 310x e: 250x f: lOOx g et h: 125X
cellulaires impliqués dans les co-cul tures. Les mêmes antisera ou anticorps monoclonaux ont été utilisés pour- détecter les protéines spécifiques aux cellules mésenchymateuses qu'à la section précédente (et tableau 1). Les cellules épithéliales ont été caractérisées en localisant les cytokératines 18 et 19 avec les anticorps CY 90 et CK 4.62 respectivement.
Par immunofluorescence indirecte, la vimentine (Fig. 2g) et l'a-actine de muscle lisse (Fig. 2h) sont fortement détectées sur toute l'épaisseur de la couche de cellules HIM. La desmine n'est pour sa part pas exprimée (résultat non-montré), comme dans les cellules HIM en culture seules. Par ailleurs, les celluleE Caco-2/15 n'expriment aucun de ces trois constituants. Par contre, l'expression de la cytokératine 18 est restreinte à la couche de cellules épithéliales (Fig.2e), tout comme dans l'intestin foetal de 18 semaines (Fig. 2f). Le marquage est plutôt péricellulaire et un peu cytoplasmique. Une autre cytokératine, la 19 est exprimée au niveau de l'épithélium intestinal humain. Son expression a été observée dans les cc-cultures selon un patron de marquage très semblable à la cytokératine 18.
L'expression de toutes ces protéines cytosquelettiques a été analysée par transfert Western. Dans ce cas, en plus de vérifier l'expression des protéines dans quelques stades de cc-culture (voir section II et la figure 3 pour les âges),
chacun des types cellulaires en culture seuls ainsi que l'intestin foetal humain de 18 semaines ont - été analysés simultanément, comme contrôle. La quantité de matériel utilisée dans chaque puit a d'abord été ajustée à l'aide d'un gel SOS-PAGE coloré au bleu de Coomassie. La détection de la cytokératine 18 sert de référence pour comparer le nombre de cellules épithéliales et la vimentine pour la quantité de cellules HIM. Les antisera et les anticorps monoclonaux utilisés sont les mêmes que pour l'immunofluorescence sauf pour la cytokératine 19 qui a été détectée avec l'anticorps CK 1165. La myosine est reconnue par l'antisérum polyclonal (voir Tableau 1).
La vimentine (Fig. 3b), dont la bande est détectée à environ 53 Kd, est fortement exprimée dans les trois stades de cc-culture (lignes 2-4) et les fibroblastes seuls (ligne 5). Comme prévu elle n'est pas détectée dans les Caco-2/15 en culture seules (ligne 6). L'a-actine de muscle lisse (fig.Je), détectée à environ 52 Kd, est exprimée par les mêmes types cellulaires que la vimentine. Il est intéressant de constater, par contre que dans le plus jeune stade de cc-culture elle est plus faiblement exprimée pour une quantité de vimentine comparable. Alors, les cellules HIM semblent produire plus d'actine avec le temps en cc-culture (comparer lignes 2-4). La desmine (Fig. 3d) est exprimée seulement dans l'intestin foetal où on voit la bande à environ 42 Kd, ce qui confirme
les résultats observés précédemment en immunofluorescence indirecte. La myos ine n'a pas été analysée dans tous les stades de co-culture, mais seulement les plus avancés (Fig. 3g) . Elle est exprimée fortement dans les cultures de cellules HIM seules (ligne 5) et les Caco-2/15 seules (ligne 6), de même que dans les co-cultures (ligne 4) et le jéjunum foetal (ligne 1). La bande reconnue par l'antisérum correspond à la chaine lourde de la myosine, aux environs de 200 Kd.
La cytokératine 18 présente une bande en transfert Western à environ 45 Kd (Fig. Je; Mollet al., 1982). Comme prévu, on retrouve la présence de la cytokératine 18 dans l'intestin foetal (ligne 1), les co-cultures de tous les stades (ligne 2-4) et les Caco seules (ligne 6). L'intensité de marquage est plus faible dans l'intestin que dans les cellules caco-2/15 en culture seules ou en co-culture. On note une très légère expression de la cytokératine 18 dans les cellules HIM en culture seules (ligne 5).
La cytokératine 19 (Fig. 3f) pour sa part est plus faiblement détectée que la cytokératine 18 (aux environs de 40 Kd). Elle n'est pas détectée dans l'intestin foetal (ligne 1), probablement parce que la révélation est trop faible. Par ailleurs, elle est détectée dans les co-cultures (lignes 2-4) et les Caco 2/15 seules (ligne 6). Elle n'est pas détectée dans les cellules HIM seules non plus (ligne 5).
Sucrase-Isomaltase dans les co-cultures de différents stades, les cellules en culture seules et le jéjunum foetal humain
La SI (a), la vimentine (b), l'a-actine de muscle lisse (c), la desmine (d), la cytokératine 18 {e), la cytokératine 19 (f) et la myosine (g) sont détectées par transfert Western dans l'intestin foetal humain de 18 semaines (ligne 1), les co-cul tures de 3 6 heures de culture, 1 et 6 jours post-conf luence (lignes 2, 3 et 4 en b, c et d) ou
o,
2 et 6 jours post- confluence (lignes 2, 3 et 4 en a, e, f et g) ainsi que dans les cellules HIM équivalentes aux co-cultures de 6 jours confluence (ligne 5) et les Caco-2/15 à 8 jours post-confluence {ligne 6).En (g), la flèche indique la myosine non-musculaire et la tête de flèche la myosine de muscle lisse.
