Gestion du stress oxydatif comme déterminant de la santé des salmonidés

GESTION DU STRESS OXYDATIF COMME DÉTERMINANT DE LA SANTÉ DES SALMONIDÉS

THÈSE PRÉSENTÉE

COMME EXIGENCE PARTIELLE DU DOCTORAT EN BIOLOGIE

UQAM-INRS0IAF EXTENSIONNÉE À L’UQAR

PAR FELIX CHRISTEN

UNIVERSITÉ DU QUÉBEC À RIMOUSKI

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la liberté de diffuser et de commercialiser ou non ce travail dont il possède un exemplaire.

Tout d'abord merci à Pierre Blier.

De m'avoir accepté en tant que candidat au doctorat de m'avoir soutenu pendant les 5 dernières années de m'avoir fait confiance et de m'avoir laissé me réaliser

de m'avoir laissé façonner mon doctorat à ma guise et de m'avoir accompagné là-dedans.

J’ai été choyé de t’avoir comme directeur.

Merci surtout pour ton écoute et d'être la quand il faut!

Merci Grant Vandenberg mon codirecteur, de m'avoir accompagné dans cette aventure et de m'avoir accueilli dans son laboratoire à l’Université LAVAL pendant la deuxième année de mon doc.

Merci aux membres du comité d'avoir pris le temps de corriger le présent document.

Merci à Guy Claireaux, Denis Chabot et Pierre Blier de m'avoir accepté dans vos projets de recherche malgré mes relevés de notes extrêmement moyens.

Merci à tout le monde qui fait ou faisait partie du lab à Pierre pendant que j'étais là surtout Véro, Nicolas, Dan, Enriquez, Bernouche, Gab, Ari, Manu Vandasmaehren, Mireille et tous ceux que j'ai oubliés de nommer

Merci à tous les étudiantes et étudiants qui ont aidé à la réalisation de ce projet, Santiago, Mathilde, Amélie, Aude, Kévin, Christophe, Yannis, David, Manue, Gab, Oscar, Géraldine et tous ceux que j’ai oubliés

Merci à Daniel, Jo, Steven et Pierre Roux. Je n’aurais pas ben ben avancé sans vous.

Merci à tous mes amies et amis sur Rimouski.

Merci à Florence de t'être occupée aussi bien de Lena pendant le dernier bout

Merci à l'équipe de soutien dans le dernier Blitz de la fin de rédaction que ce soit pour la correction la mise en page ou la mise en garde des enfants. (Mitch, Enrique, Elise, Max et Flo)

Merci aux beaux-parents de nous avoir autant aidés dans ces 5 années

Merci à Sam et Bertrand

Merci surtout à Pascale de m'avoir enduré pendant tout ce temps, de m'avoir soutenue de m'avoir écouté de me faire voir qu'il y autre chose que la science.

Merci d'être ma coauteure pour nos deux meilleures <<publications>> Lena et Lutz c'est dur d'avoir un facteur d'impact plus important que ça.

ABSTRACT ... xiii

RÉSUMÉ ...xv

INTRODUCTION GÉNÉRALE ... 1

0.1 Les oméga-3 et la santé humaine ... 3

0.2 Les rôles et les voies de synthèse des oméga-3 et oméga-6 ... 4

0.3 Les poissons comme source d’oméga-3 ... 6

0.4 Oméga-3 et stress oxydatif – The dark side of n-3 ... 7

0.5 La mitochondrie ...12

0.6 Mitochondrie et DRO ...14

0.7 CT

...16

0.8 Le rôle central du cœur ...17

0.9 Mitochondries et température ...20

0.10 Le modèle animal ...22

0.11 Les hybrides ...23

0.12 Objectifs du projet ...25

CHAPITRE 1

OXIDATIVE STRESS AND GROWTH PERFORMANCE IN

SALMONIDS ...28

1.0 Abstract ...30

1.1 Introduction...31

1.2 Material and methods ...32

1.2.1 Fish ... 32

1.2.2 Feeding and diets ... 33

1.2.3 Fish sampling ... 34

1.2.4 Proximate analysis ... 35

1.2.5 Fatty acid profiles of filets and experimental diets... 35

1.2.6 Oxidative stress parameters and antioxidant activity ... 36

1.2.7 Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) ... 36

1.2.8 Protein Carbonyls ... 36

1.3 Results ...38

1.3.1 Fatty acid composition and proximate analysis of diets and fish ... 38

1.3.2 Growth rates and oxidative stress parameters ... 41

1.4 Discussion ...42

1.4.1 Fatty acid profiles ... 43

1.4.2 Oxidative stress related parameters ... 44

1.5 Conclusion ...46

CHAPITRE 2

THERMAL TOLERANCE AND FISH HEART INTEGRITY: FATTY

ACIDS AS PREDICTORS OF SPECIES RESILIENCE ...48

2.0 Abstract ...49

2.1 Introduction...50

2.2 Materials and methods ...52

2.2.1 Fish ... 52

2.2.2 Temperature challenge test (TCT) ... 52

2.2.3 ROS production on permeabilized fibres ... 53

2.2.4 Fatty acid profiles of ventricular muscle ... 53

2.2.5 Calculations and Statistical Analysis ... 54

2.3 Results ...55

2.3.1 Temperature challenge test (TCT)mass effect and ROS production ... 55

2.3.2 Fatty acid profiles and correlations with time to CT

... 58

2.4 Discussion ...60

2.4.1 Thermal tolerance and body mass ... 60

2.4.2 Fatty acid profiles, oxidative stress and thermal tolerance ... 61

CHAPITRE 3

THERMAL TOLERANCE AND THERMAL SENSITIVITY OF HEART

MITOCHONDRIA: MITOCHONDRIAL INTEGRITY AND ROS

PRODUCTION...65

3.0 Abstract ...66

3.1 Introduction...67

3.2.3 Isolation of heart mitochondria ... 70

3.2.4 High resolution respirometry. ... 71

3.2.5 Detection of H

O

production ... 72

3.2.6 Statistical analysis... 72

3.3 Results ...74

3.3.1 CT

, PMS

and H

O

production ... 74

3.3.2 Loss of ROS management... 76

3.3.3 Complex I and II ... 77

3.4 Discussion ...78

3.4.1 Respiration rates at extreme temperatures ... 78

3.4.2 Hydrogen peroxide production rates ... 79

3.4.3 Possible sources of increased ROS production ... 81

3.4.4 Higher respiration rates decrease ROS production ... 81

3.4.5 Roles of complex I and II ... 82

3.5 Conclusion ...83

4. DISCUSSION GENERALE ...85

4.1 Oméga-3, stress oxydatif et croissance ... 85

4.2 Production de DRO, profils d’acides gras cardiaques et résistance thermique ... 89

4.3 L’homéostasie du stress oxydatif mitochondrial ... 93

4.4 Conclusion ... 98

4.5 Perspectives ... 101

4.5.1 Mitochondrie et CT

... 101

4.6.2 Métabolites des acides gras ... 105

4.6.3 Gestion du stress oxydatif comme indicateur de la santé des animaux ... 106

4.6.4 Mitochondries cardiaques et sélection ... 107

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 0.1 : Liste des espèces réactives de l’oxygène tirée de Halliwell and

Gutteridge (2015) ...9

Table 1.1 : Diet formulation ... 33

Table 1.2 : Lipid and proximate composition of the two experimental diets ... 34

Table 1.3 : Proximate composition (% on wet weight basis) of muscle and whole

bodies of experimental fish. ... 38

Table 1.4 : Lipid composition (% of total fatty acids) of filets of the 4 experimental

groups and two dietary treatments ... 39

Table 2.1: Mean values of morphologic, temperature related and ROS variables ... 57

Table 2.2 : Lipid composition (% of total fatty acids) of cardiac muscle of the four

groups, Arctic char, Brook char, Hybrid arctic and hybrid brook. ... 58

LISTE DES FIGURES

Figure 0.1 : Représentation théorique de l’évolution du régime alimentaire, tirée de

Simopoulos, 2001. ...3

Figure 0.2: Conversion d’acides gras issus de plantes en acides gras à longue chaîne

et polyinsaturés. ...6

Figure 0.3 : Représentation schématique du système de transport des électrons. La

figure a été mise à disposition par Enrique Rodriguez (MS). ... 13

Figure 0.4 : Représentation schématique du système de transport des électrons avec

les principaux sites de production de ROS. De plus, les trois principaux antioxydants

sont présentés : la superoxide dismutase (SOD), la catalase (CAT) et le glutathion

(GSH). La figure a été mise à disposition par Enrique Rodriguez (MS). ... 14

Figure 0.5 : Augmentation de la température de l’eau d’un bassin expérimental. Tirée

de Roze et al., 2013. ... 16

Figure 0.6 : Corrélation entre le CT

et le volume ventriculaire relatif par rapport à

la masse totale de l’individu. Tirée de Anttila et al., 2015. ... 18

Figure 0.7 : Taux de production d’ATP et ratio ATP/respiration de mitochondries

cardiaques en fonction de la température. La ligne verticale en pointillé représente le

CT

de Notolabrus celidotus (27,5° C). Tirée de Iftikar and Hickey, 2014... 20

Figure 0.8 : Participation du génome nucléaire et mitochondrial dans l’expression de

sous-unités formant les complexes respiratoires. Figure tirée de Ellison et Burton,

2006. ... 24

Figure 1.1 : Specific growth rates (SGR) for all four groups in the two experimental

dietary treatments ... 40

Figure 1.2 : Differences in TBARS content between dietary treatments and groups.

(W. standard omega-3 content and WW. high omega-3 content). With Arctic char

(AC). Brook char (BC). Hybrid Arctic (HA). and Hybrid Brook (HB). Different

letters indicate significant differences (p < 0.05). values are mean ± SEM. ... 41

Figure 1.3 : Relationships between TBARS content, total omega 6 content (a), DHA

(b), N3/N6 ratio (c) and catalase activity (d) for the two dietary treatments. With W

(standard omega-3 content) in empty circles and dashed regression lines and WW

(high omega-3 content) with closed circles and solid regression lines. Equation for

regression lines a) solid (WW) : TBARS = 22.43x -35.5. dashed (W) : TBARS =

9.88x +4.00. b) solid (WW) : TBARS = 5.4x +184.34. dashed (W) : TBARS =

3.96x+121.06. c) solid (WW) : TBARS = 10.96x+154.42. dashed (W) : TBARS =

-6.17x+ 92.36 and d) solid (WW) : TBARS = 2983.23x+11.87. dashed (W): TBARS =

1249.14x+16.91. ... 42

Figure 2.1 : Frequency distribution of CT

(Temperature at which fish lose

equilibrium) of the 4 experimental groups. Arctic char (AC, black bars), Hybrid arctic

(HA, dark grey bars), Hybrid brook (HB, light grey bars) and Brook char (BC, white

bars), N = 18, 21,16 and 17 respectively. ... 55

Figure 2.2 : Relationship between body mass (g) and TCT challenge duration (min).

Arctic char (AC, full circles), Brook char (BC, full suqares), Hybrid arctic (HA,

empty circles) and Hybrid brook (HB, empty squares). Equation for all groups; TCT

duration (min) = -0.08x+321.8, for AC: TCT duration (min) = -0.12x+306.28, BC:

TCT duration (min) = -0.04x+330.27,HA: TCT duration (min) =-0.03x+315.65, HB:

TCT duration (min) = -0.1x+330.78. ... 56

Figure 2.3 : Relationships between Peroxidation Index (a), total omega-3 content (b),

EPA (c), ARA (d) and temperature challenge test (TCT) duration in min. All values

are expressed as residuals calculated from least linear regressions on body mass.

Arctic char (AC, full circles), Brook char (BC, full squares), Hybrid arctic (HA,

empty circles) and Hybrid brook (HB, empty squares). Equation a) Peroxidation

index = -0.69x+8.74*10

_{, b) Total n-3 content= -0.087x+3.32*10}

_{, c) EPA =}

-0.017x+8,6*10

_{and d) ARA = -0.009x+3,93*10}

_{. ... 59}

Figure 3.1 : Frequency distribution of CT

(Temperature at which fish lose

equilibrium) of experimental fish (n=18). ... 74

Figure 3.2 : Effect of temperature on mitochondrial oxygen consumption (closed

black circles) and hydrogen peroxide production (open white diamonds) during PMS

fuelled with pyruvate, malate, succinate and ADP (10°C; n = 5, 15°C; n = 7, 20°C; n

= 7, 25°C; n=6). The vertical dashed line represents mean CT

(23.16 ± 0.31°C).

Different letters indicate a significant difference, lowercase letters for oxygen

consumption and uppercase letters for H

O

production (P < 0.05). Values are mean ±

SEM. ... 75

Figure 3.3 : Relationship between individual H

O

production and mitochondrial

respiration rates during OXPHOS fueled with pyruvate, malate, succinate and ADP at

a) 10°C, b) 15°C, c) 20°C and d) 25°C. R

_{and probability values are from least}

squares linear regression analysis with the following equations a) y=0.043x-0.089, b)

y=0.125x-0.030, c) y=0.155x-0.041, and d) y=0.003+0.089. ... 76

Figure 3.4 : Maximum mitochondrial respiration rates for complex I (CI) and

complex II (CII) working concomitantly and the sum of the two working separately.

White bars represent the sum of PM

(pyruvate, malate, ADP) and S

(succinate,

rotenone, ADP). Grey bars show PMS

(pyruvate, malate, succinate, ADP). Different

letters indicate statistical difference (P < 0.05). Values are mean ± SEM. ... 77

Figure 3.5 : Temperature influence on the relative contribution of complex I (CI) and

complex II (CII) to OXPHOS with pyruvate, malate and succinate. a) box plot of the

... contribution of complex II to total respiratory flux. Box plots show maximum,75

quartile, median, 25 percentile and minimum. Outliers are represented individually as

points. Different letters indicate statistical difference (P < 0.05). Values are mean ±

SEM. ... 78

ABSTRACT

The human species possesses a very limited ability to synthesize long-chain polyunsaturated fatty acids such as omega-3 (n-3). These fatty acids are an essential component of cell membranes and their health benefits to human beings are undeniable. Humans rely mostly on their diet to get a sufficient n-3 supply and the main source of n-3 are fatty fish. Global fish populations have reached their limit of exploitation and aquaculture has become more and more important and now accounts for 50% of worldwide fish supply. The industry is currently trying to further increase the amount of omega-3 in fish to improve their nutritional quality for humans. However, due to their structure n-3s are extremely sensitive to peroxidation processes, a process triggered by reactive oxygen species. Due to the high omega-3 content in fish flesh, they are highly susceptible to oxidative stress caused by reactive oxygen species that can induce damage to membrane lipids, protein, and DNA that may negatively affect the fish health. In this context, the aim of this thesis is to provide a complete picture of fish health in aquaculture and the effect of oxidative stress on two biomarkers of an organism's health: growth and resistance to heat stress. In particular, it attempts to fill gaps in the understanding of the consequences of the high LC-PUFA content of fish in aquaculture at the level of mitochondrial biochemistry and oxidative stress management. The animal model, Arctic char (Salvelinus alpinus), brook trout (S. fontinalis) and their hybrids were chosen because of their importance in the Quebec aquaculture industry.

The first objective was to evaluate the impact of an n-3 rich diet on growth performance, fatty acid profiles, oxidative stress markers and antioxidant activity in the four groups of salmonids. Omega-3 rich feed induced a loss in growth performance in all four groups. This was accompanied by an increase in oxidative damage. Growth thus seemed to be an indicator of the loss of homeostasis correlated with markers of oxidative stress, thus highlighting the validity of these markers in animal health. In addition, the endogenous antioxidant defenses appeared to have reached their limit of protection against omega-3-induced oxidative stress.

The second objective was to determine whether there is a correlation between stress resistance (an increase in temperature), heart fatty acid content, and ROS production rates in salmonids. At this stage we failed to demonstrate a direct link between ROS production and individual temperature resistance. In this paper we chose to work on permeabilized cardiac fibers which are known to keep the natural environment of mitochondria intact. It appears that increased temperature induced ROS production was efficiently managed by the cardiac cellular apparatus. Since we have not quantified oxidative damage at this stage, it is impossible to conclude with certainty on an absence of the correlation between oxidative stress and temperature resistance. Moreover, we have been able to establish a link between temperature resistance and cardiac peroxidation index, an indicator of susceptibility to oxidative stress. The latter is significantly higher for species and individuals less resistant to a rapid temperature increase. The susceptibility to oxidative stress induced by a greater quantity of n-3 seems then closely related to the management of the functional homeostasis of the heart during stress. The final objective was to determine the effect of an acute increase in temperature on cardiac mitochondria isolated from Arctic char. The heart was chosen as an organ due to its primary role in the adaptation of fish to temperature. We have shown that at temperatures close to the maximum of this species mitochondrial integrity deteriorated and the production of reactive oxygen species increased significantly. The temperature resistance seems to be related to the generation of ROS at the cardiac level. Oxidative stress would therefore be a parameter that increases at high temperatures and deteriorates the mitochondrial function thus limiting stress resistance.

RÉSUMÉ

L’espèce humaine a des capacités très limitées de synthétiser les acides gras polyinsaturés à longue chaîne comme les oméga-3 (n-3). Alors que ces acides gras sont une composante essentielle des membranes cellulaires et que leurs bienfaits sur la santé des êtres humains sont indéniables. Il devient alors primordial de s’approvisionner en n-3 à travers notre alimentation et la source principale de ces derniers sont les poissons gras. Les stocks de poisson sauvages ayant atteint leur limite d’exploitation l’aquaculture a pris de plus en plus de place et représente aujourd’hui 50% de la production. L’industrie essaye d’augmenter davantage la quantité d’oméga-3 dans les poissons afin d’améliorer leur qualité nutritionnelle pour l’humain. Cependant, dû à leur structure les n-3 sont extrêmement sensibles aux processus de peroxydation, un processus enclenché par les espèces réactives de l’oxygène. Vu le contenu élevé en oméga-3 dans la chair des poissons, ils hautement susceptible au stress oxydatif causé par les espèces réactives de l’oxygène qui peut induire des dommages au niveau des lipides membranaires, des protéines et de l’ADN affectant négativement la santé des poissons. Dans ce contexte, le but de cette thèse est de dresser une image complète de la santé des poissons en aquaculture et de l’effet du stress oxydatif sur deux marqueurs de la santé : la croissance et la résistance au stress thermique. Cela en partant de l’organisme entier, en passant par le cœur pour finir au niveau de la mitochondrie. Elle tente notamment de combler les lacunes béantes dans la compréhension des conséquences du contenu élevé en LC-PUFA des poissons en aquaculture au niveau de la biochimie mitochondriale, de la gestion du stress oxydatif et de l’homéostasie des poissons. Le modèle animal, l’omble chevalier (Salvelinus

alpinus), l’omble de fontaine (S. fontinalis) et leurs hybrides ont été choisis en raison de leurs

importances au niveau de l’industrie aquacole du Québec.

Le premier objectif était d'évaluer l'impact d'un régime riche en n-3 sur les performances de croissance, le profil d'acides gras de la chair, certains marqueurs du stress oxydatif et l'activité antioxydante dans les quatre groupes de salmonidés. Un aliment riche en omgéga-3 induisait une perte au niveau des performances de croissance chez les quatre groupes. Ceci était accompagné d’une augmentation des dommages oxydatifs. La croissance semblait donc être un indicateur de la perte d’homéostasie corrélée aux marqueurs du stress oxydatif, soulignant

ainsi la validité de ces marqueurs comme étant représentatif de la santé des animaux. De plus les défenses antioxydantes endogènes semblaient avoir atteint leur limite de protection contre le stress oxydatif induite par les oméga-3, et ce même dans le traitement avec un aliment avec un taux de n-3 proches des aliments commerciales.

Le deuxième objectif était de déterminer s’il existe une corrélation entre la résistance au stress (une augmentation de la température), la teneur en acides gras du cœur et les taux de production de DRO dans nos quatre groupes de salmonidés. Nous avons démontré qu’il ne semble pas exister un lien direct avec la production de DRO à température élevé et la résistance à la température individuelle. Ici nous avons choisi de travailler sur des fibres cardiaques perméabilisées qui gardent intact l’environnement naturel de la mitochondrie. Il semblerait alors que, une production de DRO accrue induite par la température a été efficacement gérée par l’appareil cellulaire cardiaque. Vu que nous n’avons pas quantifié les dommages oxydatifs à ce stade-ci, il reste que c’est impossible de conclure sur une absence de corrélation entre stress oxydatif et résistance à la température. Par ailleurs nous avons pu déterminer un lien entre la résistance à la température et l’indice de peroxydation cardiaque, un indicateur de la susceptibilité au stress oxydatif. Ce dernier est nettement plus élevé pour les espèces et individus tolérant moins bien une augmentation rapide de la température. La susceptibilité au stress oxydatif induit par une plus grande quantité de n-3 semble alors étroitement liée à la gestion de l’homéostasie fonctionnelle du cœur pendant un stress.

Le dernier objectif était de déterminer l’effet d’une augmentation aiguë de la température sur des mitochondries cardiaques isolées de l’omble chevalier. Le cœur a été choisi comme organe dû à son rôle primordial dans l’adaptation des poissons à la température. Nous avons démontré qu’à des températures près de la limite maximale de cette espèce l’intégrité mitochondriale se détériorait et la production d’espèces réactives de l’oxygène augmentait significativement. La résistance à la température semble alors liée à la génération de DRO au niveau cardiaque. Le stress oxydatif serait donc être un paramètre qui augmente à températures élevées et détériorait le fonctionnement mitochondrial ainsi limitant la résistance au stress thermique de cette espèce. Néanmoins, une approche in vitro comme les mitochondries isolées est loin des conditions physiologiques réelles. Nous n’avons donc pas pu conclure définitivement si cette

augmentation des espèces réactives de l’oxygène causait effectivement des dommages au niveau cardiaque.

Mots clés : CTmax, mitochondrie, stress oxydatif, DRO, homéostasie, oméga-3

INTRODUCTION GÉNÉRALE

Il y a 200 000 ans, l’espèce humaine arrivait à un moment décisif de son évolution. La croissance de la taille du cerveau est passée d’une croissance qui était jusque-là linéaire à une augmentation exponentielle de la masse (Crawford et al., 1999 ; Ruff et al., 1997). Ce phénomène serait à l’origine de l’évolution remarquable d’Homo spp. grâce à une amélioration des capacités cognitives et une augmentation de la conception d’outils sophistiqués (Ambrose, 2001 ; Susman, 1994).

Cependant, l’élément déclencheur de ce changement drastique dans la croissance de la masse cérébrale reste le sujet de fervents débats dans la communauté scientifique. Plusieurs hypothèses tentent d’explorer ce phénomène. Une des approches explicatives se nomme la « expensive tissue hypothesis » (l’hypothèse du tissu couteux) de Aiello et Wheeler (Aiello & Wheeler, 1995). Cette hypothèse tire son origine du fait que le taux métabolique de base des êtres humains et celui de leur plus proche parent, le genre des chimpanzés, sont semblables alors que l’humain possède un cerveau 2 à 3 fois plus grand et que sa demande en carburant métabolique est largement supérieure aux autres organes (Magistretti & Allaman, 2015). La question se posait alors : comment a-t-il pu y avoir un doublement de la masse cérébrale sans autant affecter le métabolisme de base ? Leur explication insinue qu’il existerait un compromis entre la taille du cerveau et celle du tractus digestif, ce dernier étant nettement moins développé chez le genre Homo spp. Le réacheminent de l’énergie métabolique mise à disposition par un rétrécissement de l’appareil digestif vers le cerveau aurait soutenu l’augmentation de son taux de croissance. Cette théorie est loin d’être acceptée de manière unanime dans la communauté scientifique. Elle a récemment été déconstruite par un article démontrant une absence de corrélation négative entre la taille du cerveau et la masse des organes digestifs (Navarrete et al., 2011). Les chercheurs ici proposent que l’augmentation de la masse cérébrale vienne plutôt d’une amélioration de la qualité nutritionnelle des aliments, d’un approvisionnement en nourriture plus constant et d’une diminution des dépenses énergétiques liées à la locomotion, la reproduction et la croissance.

L’amélioration du régime alimentaire constitue un point commun de plusieurs théories évolutives de l’expansion de l’encéphale. Une équipe de scientifiques autour des chercheurs

Crawford, Cunnane et Broadhurst proposent que cette bonification de l’alimentation se soit produite par le biais de l’inclusion d’aliments d’origine marine (Broadhurst et al., 2002 ; Crawford, 1992 ; Crawford et al., 1999 ; Cunnane et al., 2007). En effet, Crawford et al., 1999, soulignent que la majorité des fossiles appartenant à Homo spp. ont été découverts en milieu côtier ou en proximité de courants d’eau douce. De plus, des analyses d’isotopes stables des ossements de ces spécimens prouvent que la protéine animale qu’ils consommaient majoritairement était d’origine aquatique (Richards et al., 2001). Ce régime était avantagé par l’abondance de crustacés, mollusques et poissons dans ces régions et par leur facilité d’accès (Broadhurst et al., 2002).

Cependant, d’après ces trois chercheurs, la principale différence d’un tel régime par rapport à un régime essentiellement terrestre est son contenu en acides gras polyinsaturés à longue chaîne (LC-PUFA) et surtout en acide docohexaénoïque (ADH). Le nom LC-PUFA provient du fait que ces acides gras possèdent plusieurs doubles liaisons C=C. Le ADH, qui fait partie de la classe des oméga-3 (n-3), est l’acide gras le plus abondant dans le cerveau des mammifères (Innis, 2007) alors que la plupart d’entre eux, incluant l’humain, sont incapables de les synthétiser de novo et doivent s’en procurer par le biais de la nourriture. Le faible niveau d’abondance du ADH dans la chaîne alimentaire terrestre (Hixson et al., 2015) aurait limité l’expansion de la masse cérébrale. Conséquemment, la grande différence entre le ratio masse cérébrale/masse corporelle de l’humain et celui d’autres mammifères terrestres, comme le genre des chimpanzés (4,26 et 1,57 respectivement; Harvey and Clutton-Brock, 1985), serait induite par une grande divergence dans le contenu en ADH de leurs régimes alimentaires (Crawford et al., 1999). Cette hypothèse semble confirmée par une récente augmentation du nombre d’études sur le cerveau soulignant l’importance des oméga-3 dans son fonctionnement. En effet, les oméga-3 (surtout le ADH) jouent un rôle dans le vieillissement du cerveau (Denis et al., 2015), dans la prévention de maladies neurodégénératives comme l’Alzheimer (Thomas et al., 2015) et pendant le développement de celles-ci (Lassek & Gaulin, 2015 ; Lauritzen et al., 2016).

0.1 Les oméga-3 et la santé humaine

L’omniprésence des n-3 dans la recherche sur la santé humaine (Calder, 2014 ; Simopoulos, 2008 ; Wall et al., 2010a ; Yashodhara et al., 2009) ne peut que témoigner du rôle primordial que ces acides gras ont pu jouer dans l’évolution de l’espèce humaine. La découverte du rôle essentiel que jouent les n-3 dans la santé humaine date des années 60-70. Une augmentation exponentielle de l’incidence des maladies cardiovasculaires dans les années 60 mettait pression sur la communauté médicale et scientifique à trouver la cause de la propagation massive de ces maladies. Même si cela n’a été prouvé que dans les années 2000 (Hunter, 2005), les chercheurs associaient ces maladies à un changement important dans l’approvisionnement en nourriture des êtres humains. Ce changement était largement encouragé par la révolution industrielle et l’intensification du machinisme agricole rendant plus accessibles les huiles de graines de céréales riches en oméga-6 (n-6). De plus en plus de ces acides gras étaient introduits dans l’alimentation en même temps que la consommation d’oméga-3 diminuait, déplaçant ainsi le ratio entre les deux en faveur des oméga-6 (Simopoulos,2002, Fig.0.1).

Figure 0.1 : Représentation théorique de l’évolution du régime alimentaire, tirée de Simopoulos, 2001.

En même temps, plusieurs observations venaient souligner l’importance des n-3 dans la santé cardiovasculaire. Par exemple, l’équipe de Bang a mis en évidence un faible taux de maladies

cardiovasculaires chez un peuple autochtone vivant au Groenland, dont le régime alimentaire était principalement constitué de viandes riches en n-3 (Bang et al., 1971). De plus, au Japon, les personnes dont le régime alimentaire était marqué par une grande consommation d’oméga-3 sous forme de poisson démontraient elles aussi une incidence moindre de maladies liées au système circulatoire (Hirai et al., 1980). Dans les deux cas, les chercheurs associaient une mortalité inférieure induite par ce type de maladie à une forte concentration en oméga-3 du plasma sanguin menant à une augmentation de la fluidité sanguine et à une réduction du taux de formation de thrombocytes souvent à l’origine d’un AVC. Les exemples de conséquences bénéfiques des n-3 et de leurs métabolites sur la santé humaine sont nombreux : une diminution d’apparition d’ulcères et une réduction de maladies cardiovasculaires, chroniques et inflammatoires (Barbosa et al., 2003 ; Hudert et al., 2006 ; Kris-Etherton, 2002 ; Lordan et al., 2011 ; C. Wang & Harris, 2006). Aujourd’hui, il est largement accepté que le déplacement du ratio N3/N6 en faveur des n-6 soit responsable d’une multitude de maladies (Patterson et al., 2012). Afin de comprendre les modes d’action des oméga-3 et oméga-6 et comment ils peuvent avoir un effet sur la santé, il faut en savoir plus sur leur structure et leurs voies de synthèse et de dégradation.

0.2 Les rôles et les voies de synthèse des oméga-3 et oméga-6

Les principaux n-3, soit l’AEP, le DPA et le ADH, se retrouvent surtout dans les membranes cellulaires et mitochondriales, et la plupart de leurs effets fonctionnels dépendent de leur incorporation dans ces membranes (Calder, 2014). Leur structure influence les propriétés physicochimiques des membranes et module le fonctionnement des protéines transmembranaires. Ainsi, ils agissent sur la signalisation cellulaire entre autres à travers l’activation ou l’inhibition de certains facteurs de transcription et la modulation de l’expression génétique qui en découle (Rodríguez-Cruz & Serna, 2017). La dégradation ciblée des oméga-3 produit des molécules antiinflammatoires appelées « résolvines », alors que la dégradation des n-6 entraîne la production de molécules pro-inflammatoires. Ce mécanisme semble être à l’origine de l’effet bénéfique des n-3 sur les maladies inflammatoires, le système immunitaire et la thrombose (Moro et al., 2016). Autrement dit, le débalancement du ratio N3/N6 pendant la dernière décennie a joué en faveur de la voie de dégradation des n-6 et de la production de

métabolites pro-inflammatoires, induisant ainsi cette augmentation exponentielle de l’incidence de maladies cardiovasculaires dans les années 60 (Simopoulos, 2006). Une autre raison pour le débalancement du ratio N3/N6 s’explique à partir des voies de synthèse des LC-PUFA (Fig. 0.2). Premièrement, à cause de leur incapacité à synthétiser de doubles liaisons C=C aux positions n-3 et n-6, les mammifères (et les poissons) doivent se procurer les acides gras dans leur nourriture. De ce fait, les acides linoléiques et alpha linoléniques se nomment des « acides gras essentiels » (Burr, 2000). L’humain ainsi que le poisson ont une capacité très limitée de synthétiser d’autres n-3 et n-6 à partir de leurs précurseurs, et loin d’être suffisante pour soutenir les besoins de l’organisme. De plus, les voies de désaturation et d’élongation des n-3 et n-6 partagent les mêmes enzymes; ils entrent donc en compétition directe (Calder, 2015). Vu que le régime alimentaire est manifestement dominé par les n-6, l’activité de synthèse déjà très faible se situe surtout du côté des oméga-6. Donc, étant donné notre incapacité de synthétiser efficacement des oméga-3, le rôle primordial des oméga-3 dans notre santé, la place centrale que le ADH joue dans le développement et le vieillissement du cerveau et surtout en raison d’un déséquilibre flagrant du ratio N3/N6 dans notre régime alimentaire, l’humain doit consommer des oméga-3 à travers sa nourriture afin d’améliorer sa santé.

Figure 0.2: Conversion d’acides gras issus de plantes en acides gras à longue chaîne et polyinsaturés.

0.3 Les poissons comme source d’oméga-3

Les principales sources d’oméga-3 sont les fruits de mer et surtout les poissons gras comme les salmonidés, le maquereau ou encore le hareng (FAO, 2014). Ces poissons sont naturellement riches en n-3 par bioaccumulation à travers la chaîne alimentaire, en partant du phytoplancton. Ce dernier possède la capacité de synthétiser efficacement les oméga-3 de novo en raison de la présence de la delta-15 désaturase (Fig. 0.2). Toutefois, plus de 50 % des stocks de poissons pêchés commercialement sont surexploitées et les pêcheries mondiales stagnent (Worm et al., 2009). De ce fait, le secteur de l’aquaculture a pris de plus en plus de place dans l’approvisionnement en poissons et représente aujourd’hui la moitié du poisson consommé mondialement (FAO, 2014). Néanmoins, il existe un paradoxe : l’aliment utilisée en aquaculture pour nourrir les poissons est majoritairement élaborée à partir de poissons fourrages et contribue donc à augmenter la pression exercée sur la pêche de ces espèces (Tacon

Acide linoléique (18:2n-6) Acide docosahexaéonïque (22:6n-3) Élongase Acide éicosatétraénoïque (20:4n-3) Acide stéaridonique(18:4n-3) Acide alpha-linolénique (18:3n-3) Δ-6 désaturase Acide eicosapentaéonïque (20:5n-3) Δ-5 désaturase Élongases Δ-6 désaturase Δ-15 désaturase Acide gamma-linolénique (18:3n-6)

Acide dihomo gamma-linolénique (20:3n-6)

Acide arachidonqiue (20:4n-6,)

Acide docosapentaénoïque(22:5n-6)

β-oxidation

& Metian, 2015). Il s’avère donc indispensable de développer des solutions durables quant à l’alimentation du poisson en aquaculture (Lenihan-Geels et al., 2013). Un exemple de solution prometteuse est la culture de microalgues capables de synthétiser des oméga-3 de novo ou encore de plantes génétiquement modifiées possédant les gènes nécessaires à la synthèse de n-3 (Adarme-Vega et al., 2014). Une autre alternative a fait sujet de multiples recherches dans les 20 dernières années et portait sur le remplacement des farines et huiles d’origine marine par une alternative à base de plantes terrestres (riche en n-6 et pauvre en n-3). Cependant, enlever toute source marine dans la formulation de l’aliment a des conséquences négatives sur l’apport en LC-PUFA et surtout, le faible taux d’oméga-3 rend la chair moins intéressante pour la consommation humaine (Bell et al., 2001; Turchini et al., 2009). Comme chez l’humain, les n-3 sont une composante essentielle des membranes cellulaires, constituent une source d’énergie incontournable et sont nécessaires à une bonne croissance chez le poisson (Tocher, 2010). Une carence en oméga-3 peut alors affecter négativement la santé des poissons. La santé étant définit par la capacité du poisson de réagir et de s’adapter à des changements dans son milieu et/ou d’en contrôler les impacts (Frankish et al., 2001). Dans certains cas, un régime pauvre en n-3 peut détériorer cette capacité et causer une diminution de la croissance, un arrêt des activités liées à la reproduction, diverses pathologies ou encore causer la mort de l’animal (Das, 2006). D’après Tocher, il y a trois niveaux d’approvisionnement en oméga-3 chez les poissons en aquaculture : 1) un niveau de base qui permet la survie de l’organisme et qui n’affecte pas sa santé globale; 2) un niveau assurant un taux de croissance maximale; et 3) un niveau qui dépasse de loin les besoins nutritionnels de l’animal, mais augmente sa qualité nutritionnelle (Tocher, 2015). Non seulement ce troisième point assurerait un apport élevé en n-3 au consommateur, mais aurait aussi des effets positifs sur la rentabilité de l’industrie piscicole. Depuis quelques années, plusieurs recherches visent à augmenter quantité de n-3 dans la chair de poisson. Toutefois, ils existent des limites supérieures quant à la quantité maximale de n-3 que peut contenir un poisson sans affecter sa santé.

0.4 Oméga-3 et stress oxydatif – The dark side of n-3

Une stratégie pour augmenter le contenu en n-3 dans la chair du poisson est de simplement enrichir sa nourriture en n-3. Néanmoins, un excès de n-3 dans les aliments peut entraîner des

effets néfastes sur la santé. Un régime alimentaire riche en n-3 augmente la quantité de ces derniers dans la chair, mais provoque une diminution du taux de croissance chez l’omble chevalier (Olsen & Henderson, 1997) et la carpe (Carassius auratus gibelio Chen et al., 2011). Cette détérioration de la santé serait induite par une augmentation de la dégradation des lipides (Olsen et al., 1999 ; Tocher et al., 2003). Ce phénomène est lié à la structure des LC-PUFA. Les nombreuses doubles liaisons carbone-carbone fragilisent les liaisons C-H à proximité, facilitant l’arrachement des atomes d’hydrogène et les rendant extrêmement sensibles au processus d’oxydation, on parle alors de peroxydation. Par la suite, les métabolites de la peroxydation des lipides peuvent réagir avec les LC-PUFA membranaires adjacents. Une réaction en chaîne en résultera et aura des impacts sur la fluidité et la perméabilité membranaire ainsi que sur le métabolisme (Nigam & Schewe, 2000), entraînant un déséquilibre de l’homéostasie cellulaire de l’organisme avec des conséquences néfastes sur la santé du poisson. En raison de la haute teneur en LC-PUFA dans la chair des poissons, ceux-ci sont extrêmement sensibles aux processus de peroxydation (Filho, 2007).

Les dommages aux lipides sont principalement induits par des molécules hautement réactives : les dérivés réactives de l’oxygène (DRO, tableau 0.1).

Tableau 0.1 : Liste des dérivés réactifs tirée de Halliwell and Gutteridge (2015)

Le tableau 1 met en évidence la grande diversité des dérivés réactifs qui existent soit les dérivées de l’oxygène, mais également ceux de l’azote, du chlore et du brome. Les DRO sont généralement séparées en deux grandes catégories : les radicaux libres et les dérivés réactifs non radicalaires. La différence majeure entre les deux est que les radicaux libres possèdent un électron non apparié. Cette caractéristique les rend beaucoup plus réactifs parce qu’ils vont chercher à arracher un électron d’autres molécules (comme les LC-PUFA) pour avoir deux électrons appariés. Ils vont ainsi oxyder les molécules auxquelles ils s’attaquent et qui deviennent à leur tour des radicaux libres. A basse concentration, plusieurs DRO sont indispensables dans de multiples processus biochimiques et sont des molécules messagères dans de nombreuses voies de signalisation cellulaires, notamment l’apoptose, la croissance cellulaire, le développement (Finkel, 2011 ; Turrens, 2003) ou encore le vieillissement (Cui et al., 2012). Une surproduction de DRO et/ou une élimination insuffisante peut causer ce qu’on appelle le « stress oxydatif ». Dans ce cas, les DRO peuvent induire des dommages non seulement aux lipides, mais aussi aux protéines ou encore, au niveau de l’ADN (Halliwell & Gutteridge, 2015). Chez les poissons, le stress oxydatif peut être provoqué par une surexposition à des produits toxiques (Gabriel et al., 2013), par une diminution de la disponibilité en oxygène (Clanton, 2007) ou encore par une augmentation de la température (Vinagre et al., 2012). L’organisme possède de nombreux mécanismes de défense antioxydants endogènes et exogènes face à ce stress oxydatif. Par exemple, les agents dits « sacrificiels », comme l’alpha-tocophérol (Serbinova et al., 1991) ou les plasmalogènes (Braverman & Moser, 2012), qui vont réagir de manière préférentielle avec les DRO dans un ratio 1 :1, afin de protéger d’autres molécules telles les lipides membranaires. Une autre classe d’agents sacrificiels sont les caroténoïdes (telle l’astaxanthine) qui sont capables de physiquement capter certains radicaux libres éliminant ainsi leur toxicité (Edge & Truscott, 2018 ; Kobayashi & Sakamoto, 1999). Les protéines chaperon telles les HSP (heat shock proteins) expriment leur pouvoir antioxydant en protégeant des structures telles l’ADN, les lipides membranaires ou encore d’autres protéines contre le stress oxydatif (Kalmar & Greensmith, 2009). Une des barrières de défense antioxydantes les plus étudiées sont les enzymes antioxydants tels la catalase, la superoxyde dismutase ou encore la thiorédoxine réductase. Contrairement aux molécules comme l’alpha tocophérol dont le pouvoir antioxydant est directement proportionnel au nombre de molécules présentes, les enzymes ne sont pas affectées par l’interaction avec le

DRO. Il faut toutefois mentionner que les enzymes antioxydants nécessitent des cofacteurs impliqués dans les réactions de détoxification qui eux peuvent s’épuiser de la même façon que les antioxydants exogènes, et doivent donc être régénérés (tel le zinc ou le cuivre chez la superoxide dismutase). Ces enzymes antioxydants sont capables d’éliminer de légères surproductions de DRO (Martínez-Álvarez et al., 2005). La modification du profil lipidique de l’aliment est reconnue pour affecter l’activité et l’expression génétique de certaines de ces enzymes tels la gluthatione réductase et la catalase. (Fontagné-Dicharry et al., 2014 ; Fontagné et al., 2008). Cependant, cette première ligne de défense ne semble pas suffisante pour contrer les effets négatifs d’un aliment enrichie en n-3 (Olsen & Henderson, 1997 ; Tocher et al., 2003). Beaucoup de recherche porte sur les effets protecteurs des antioxydants exogènes (tel l’astaxanthine et le tocophérole) contre le stress oxydatif, et il est reconnu qu’une augmentation de la quantité en n-3 dans l’aliment doit nécessairement être accompagnée d’une dose adéquate d’antioxydants exogènes (Kiessling et al., 2003 ; Olsen et al., 1999 ; Tocher et al., 2002). En dépit de leur pouvoir antioxydant, ces micronutriments, même en travaillant de concert avec les enzymes antioxydantes endogènes, ne suffisent pas toujours pour inhiber les effets négatifs du stress oxydatif sur la santé des poissons (Olsen & Henderson, 1997 ; Takeuchi et al., 1992). Ainsi, considérant le contenu élevé en LC-PUFA et la sensibilité des poissons au stress oxydant, une augmentation de la concentration de n-3 dans la chair, afin d’assurer un effet bénéfique sur la santé du consommateur, risque d’entrainer une détérioration de la santé de l’organisme. Le contenu élevé en LC-PUFA et surtout en n-3 dans les aliments commerciaux entraînent une concentration plus élevée de n-3 dans les poissons d’élevage que dans les poissons sauvages (Henriques et al., 2014). Cette concentration élevé en LC-PUFA exacerbe le risque de subir des dommages induits par le stress oxydatif (Sargent et al., 1999). Par ailleurs, l’optimisation du taux de croissance en aquaculture a poussé les poissons à leur limite physiologique. La mortalité suite à un événement stressant comme la manutention normale augmentent avec l’augmentation de la croissance. Les recherches mettent ici en lien des problèmes liés à l’obésité et l’apparition de maladies du système cardiovasculaire (Ferguson et al., 1990 ; Gamperl & Farrell, 2004 ; Poppe et al., 2003). À notre connaissance, il y a peu de recherche examinant le lien entre le contenu élevé en LC-PUFA, la susceptibilité au stress oxydatif et la réduction de la tolérance au stress des poissons en aquaculture.

Afin de comprendre les modes d’action du stress oxydatif et de son effet au sens large sur l’homéostasie interne d’un organisme et ainsi sa santé, il faut examiner l’origine et le principal lieu de production de DRO : la mitochondrie.

0.5 La mitochondrie

La mitochondrie est un organite cellulaire présent dans les cellules de la vaste majorité des eucaryotes. Elle est communément appelée « la centrale énergétique de la cellule » puisqu’elle produit la majeure partie de l’énergie nécessaire au fonctionnement cellulaire sous forme d’adénosine triphosphate (ATP). La mitochondrie est composée d’une membrane interne et une membrane externe délimitant l’espace inter-membranaire de la matrice (Fig. 0.3). La production d’énergie est réalisée à travers un ensemble de complexes enzymatiques situés dans la membrane interne lors de la phosphorylation oxydative. Cet assemblage de complexes protéiques s’appelle le « système de transport des électrons » (ETS) (Fig. 0.3). Il a pour but principal de transporter les électrons à travers les différents complexes respiratoires jusqu’à l’accepteur final : l’oxygène.

L’entrée d’électrons se fait principalement au niveau du complexe I (NADH coenzyme-Q réductase) et du complexe II (Succinate coenzyme-Q réductase). L’apport en électrons est assuré par des équivalents réduits (NADH et FADH2) qui proviennent de l’oxydation des sucres

(cycle de Krebs) ou par la β-oxydation des acides gras. Par la suite, deux électrons par équivalent réduit sont transférés à l’ubiquinone (Q) qui est ainsi réduite en ubiquinol. L’étape suivante est le passage par le complexe III (Coenzyme-Q cytochrome c réductase). Ici, l’ubiquinol est reoxydé en ubiquinone en réduisant le cytochrome c (Cyt C). Ce dernier assure le transfert des électrons vers le complexe IV (Cytochrome c oxydase) et ensuite le passage vers l’accepteur final; l’oxygène y est réduit en eau. On parle alors de « respiration mitochondriale ». Pendant ces réactions d’oxydoréduction, quatre protons ont pu être transférés de la matrice vers l’espace intermembranaire au niveau du complexe I et III. Deux autres ont été transférés au niveau du complexe IV. Ces protons (H+_{) sont relocalisés dans l’espace}

intermembranaire, créant alors un gradient électrochimique. Ce gradient est à l’origine de la production d’ATP en canalisant le surplus de protons précédemment créé, à travers le complexe V (ATP synthase). Ce processus libère l’énergie nécessaire pour synthétiser l’ATP à partir d’adénosine diphosphate (ADP) et de phosphate inorganique (Pi).

I Matrice Espace intermembranaire II Membrane mitochondriale interne III Q IV CYT c V H+ H+ H+ H + H+ H+ H+ H+ NADH NAD+ 2e -FADH2 FAD ½ O2 H2O H+ _H+ 2e- 2e -ADP + Pi ATP H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ 2e

-Figure 0.3 : Représentation schématique du système de transport des électrons. La figure a été mise à disposition par Enrique Rodriguez (MS).

0.6 Mitochondrie et DRO

C’est ici, pendant le transfert des électrons à travers l’ETS, qu’une grande partie de ces métabolites hautement réactifs, les DRO, sont formées. Un des principaux DRO et le précurseur de la majorité des DRO, l’anion superoxyde (O2‧-), se forme lorsqu’une molécule

d’oxygène rencontre un électron libre dans le système de transport des électrons. Les complexes I, II et III sont les principaux sites de production de DRO (Fig. 0.4). Plus

spécifiquement, il existe au total dix sites de production de DRO sur ces trois complexes, variant selon leur capacité de générer les DRO (Goncalves et al., 2015). Il est possible d’induire une augmentation de la production d’anions superoxydes en utilisant des inhibiteurs spécifiques des complexes I et III (roténone et antimycine A respectivement). Lors d’une inhibition d’un des complexes, le passage des électrons est bloqué, ce qui crée une accumulation de ces derniers. Par conséquent, le risque de rencontrer une molécule d’oxygène est multiplié, ce qui entraîne une augmentation de la production de DRO. En condition naturelle, la vitesse de formation de DRO dépend de l’activité de l’ATPase, du ratio NADH/NAD+_{, de l’intensité du gradient électrochimique et de la concentration en oxygène}

I

II

III

Q

_IV

. -Figure 0.4 : Représentation schématique du système de transport des électrons avec les principaux sites de production de ROS. De plus, les trois principaux antioxydants sont présentés : la superoxide dismutase (SOD), la catalase (CAT) et le glutathion (GSH). La figure a été mise à disposition par Enrique Rodriguez (MS).

dans le milieu cellulaire (Murphy, 2009). En plus de la possible dismutation spontanée, l’anion superoxyde peut être dismuté par la superoxyde dismutase mitochondrial (MnSOD) à l’intérieur de la matrice, ou par une autre forme de superoxyde dismutase (CuZnSOD) dans l’espace intramembranaire (Fukai & Ushio-Fukai, 2011). Le peroxyde d’hydrogène (H2O2)

ainsi formé sera transformé en eau par la catalase ou le glutathion peroxydase (Fig. 0.4, Apel and Hirt, 2004). En présence de Fe2+_{, des radicaux d’hydroxyle (OH}‧_{) peuvent être formés par}

les réactions de Haber-Weiss et Fenton (Kehrer, 2000). Les dommages aux lipides sont causés majoritairement par les radicaux peroxydes et l’OH‧ _{par l’intermédiaire du processus de la}

peroxydation (Catalá, 2010). La mitochondrie est par ailleurs capable de réguler la production et la consommation de DRO en fonction de l’état physiologique dans lequel elle se trouve (Munro & Treberg, 2017).

Pour ces raisons, les mitochondries jouent un rôle central dans l’homéostasie des espèces réactives de l’oxygène et du métabolisme énergétique tant au niveau cellulaire, tissulaire qu’à celui de l’organisme entier (Cheng & Ristow, 2013 ; Dunn et al., 2015 ; Ježek & Hlavatá, 2005 ; Shadel & Horvath, 2015). Un déséquilibre de l’homéostasie des DRO provoqué par un stress biotique ou abiotique, par exemple des contaminants dans l’eau (Farombi et al., 2007 ; Risso-De Faverney et al., 2004 ; Slaninová et al., 2009), la température (Banh et al., 2016), ou encore une altération du régime alimentaire (Kjær et al., 2008), peut affecter les fonctions mitochondriales. Une augmentation de la température du milieu a des impacts majeurs sur les organismes ectothermes comme les poissons (Pörtner & Knust, 2007), et les mitochondries semblent jouer un rôle pivot dans la capacité des poissons d’y faire face. Cette capacité a récemment été avancée comme un bon indicateur de l’intégrité fonctionnelle et ainsi de leur santé (Claireaux et al., 2013 ; Roze et al., 2013). Nous proposons donc d’utiliser un test de résistance au stress thermique comme indicateur de la perte d’intégrité fonctionnelle ou de l’état de santé général des poissons. Cette approche méthodologique permettra d’explorer les liens potentiels entre le métabolisme mitochondrial, la gestion de l’homéostasie des DRO et la résistance au stress des poissons. Ce test de résistance au stress thermique permet de déterminer la limite supérieure de tolérance thermique (CTmax) d’un individu.

0.7 CTmax

Le CTmax représente la température à laquelle le poisson perd ses capacités de locomotion et

sa capacité de maintenir l’équilibre, indiquant ainsi une atteinte à l’intégrité de l’homéostasie pendant une augmentation aigüe de la température (Becker & Genoway, 1979 ; Cowles & Bogert, 1944). La détermination du CTmax des poissons est une méthode couramment utilisée

dans les études de physiologie comparative (Anttila et al., 2013 ; Penney et al., 2014), afin d’évaluer le potentiel d’acclimatation aux changements climatiques (Ekström et al., 2016 ; Farrell et al., 2009a) ou encore l’impact d’un polluant sur les performances d’un organisme

Figure 0.5 : Augmentation de la température de l’eau d’un bassin expérimental. Tirée de Roze et al., 2013.

(Anttila et al., 2017 ; Claireaux et al., 2013 ; Patra et al., 2007). L’évaluation de la répétabilité de la mesure de ce trait a récemment été utilisée afin de souligner la pertinence du CTmax en

tant qu’indicateur de la tolérance thermique des poissons et marqueur de l’état physiologique général (Morgan et al., 2018). Selon le protocole d’augmentation de la température utilisé pour déterminer le CTmax, le résultat final a toutefois tendance à varier (Galbreath et al., 2004). Pour

cette raison il est primordial d’utiliser sensiblement le même protocole d’une expérience afin d’évaluer l’impact d’un polluant par exemple ou alors pour comparer ses résultats avec la littérature. Le protocole utilisé pour déterminer le CTmax dans cette thèse est tiré de Roze et al.,

2013 (Fig. 0.5). Il débute avec une augmentation rapide de la température d’acclimatation jusqu’à approximativement 20°C. Par la suite la température augmente d’environ 2°C par heure, jusqu’au moment que le dernier poisson aie atteint son CTmax. Afin corréler la

performance dans ce test à la gestion du stress oxydatif au niveau mitochondrial et la composition en acides gras des membranes, nous avons choisi de travailler sur des mitochondries cardiaques. Ce choix est inspiré des recherches récentes sur le rôle central que semble jouer le cœur dans la capacité des ectothermes de faire face à des variations de température (Eliason & Anttila, 2017).

0.8 Le rôle central du cœur

Une augmentation de la température entraîne une accélération du métabolisme et augmente les besoins énergétiques de l’organisme (Hochachka & Somero, 1968). Pour contrer l’effet direct de la température et fournir l’énergie nécessaire pour supporter l’augmentation du taux métabolique, les cœurs des poissons sont munis de multiples mécanismes d’adaptation ou d’acclimatation aux variations de la température. Par exemple, la morphologie du ventricule semble jouer un rôle primordial dans la tolérance thermique. Chez le saumon atlantique (Salmo

salar), la masse cardiaque et la tolérance aux changements de température sont corrélées

(Anttila et al., 2013). L’équipe de la docteure Anttila a mis en évidence que des individus avec une masse ventriculaire supérieure auraient un CTmax plus élevé que leurs congénères

(Fig. 0.6). Ils concluaient qu’une masse ventriculaire plus importante par rapport à la masse totale d’un individu, accompagnée d’un débit cardiaque plus élevé, permettrait un meilleur apport en oxygène au niveau tissulaire. Contrairement à cette interprétation, Clark et al., 2008,

émettaient l’hypothèse que des individus avec un cœur plus grand auraient une moins bonne oxygénation du myocarde spongieux limitant ainsi la tolérance thermique maximale. Les moyens d’acclimatation du cœur des poissons à la température sont nombreux et se manifestent entre autres par des changements de la fréquence cardiaque, du volume d’éjection ou de la force d’éjection systolique (Keen et al., 2017).

Aujourd’hui, plusieurs hypothèses proposent que le cœur est le premier organe à faire défaillance lors d’une augmentation de la température (Farrell et al., 2009b, 1996 ; Somero,

2002). Afin de soutenir les besoins énergétiques accrus du muscle cardiaque et de l’ensemble de l’organisme à température élevée, les mitochondries doivent produire davantage d’ATP par la phosphorylation oxydative (Lemieux et al., 2010 ; Rodnick et al., 2014). À partir d’une certaine température les mitochondries cardiaques n’arriveraient plus à augmenter la phosphorylation oxydative suffisamment pour assurer l’augmentation de la puissance cardiaque requise. Il existe une autre théorie qui expliquerait la défaillance cardiaque à haute température. Une diminution de la solubilité de l’oxygène dans l’eau lors d’une augmentation

Figure 0.6 : Corrélation entre le CTmax et le volume ventriculaire relatif par rapport à la masse totale de

de la température associée à des demandes énergétiques accrues, entraînerait un déséquilibre entre l’offre et la demande en oxygène (Pörtner et al., 2017 ; Pörtner & Knust, 2007). Toutefois, une étude sur la perche européenne (Perca fluviatilis) démontre qu’une diminution expérimentale des concentrations en oxygène dissous dans le sang n’affecte pas le CTmax d’un

individu (Brijs et al., 2015). D’autres chercheurs soulignent que l’oxygène semble être plus disponible à température élevée en raison d’une augmentation de son taux de diffusion (Verberk et al., 2011). Une autre équipe a émis l’hypothèse que l’arrêt fonctionnel des neurones moteurs serait la cause de l’arrêt cardiaque, et ceci, indépendamment de la concentration en oxygène (Ern et al., 2015). Finalement, un déséquilibre de la balance ionique des myocytes cardiaques pourrait aussi être à l’origine de la limite de tolérance supérieure du cœur, du moins chez Salmo trutta fario (Vornanen et al., 2014). Cependant, qu’ils soient induits par un manque d’oxygène ou non, les mécanismes impliqués dans la limitation des capacités d’acclimatation des poissons à une augmentation de température ne sont pas encore clairement identifiés (Clark et al., 2013).

0.9 Mitochondries et température

Les mitochondries des cellules cardiaques semblent jouer un rôle déterminant dans l’étendue des températures qu’un organisme est capable de supporter. Le maintien de l’intégrité et l’efficacité des mitochondries cardiaques se détériorent lors d’une augmentation aiguë de la température. Cette perte de fonctionnalité des mitochondries induirait alors une défaillance du cœur au CTmax. En utilisant Notolabrus celidotus, Iftikar et al., 2014, ont pu observer ce lien.

Premièrement, en observant le maintien de la saturation de l’hémoglobine en oxygène, ils ont

conclu que l’apport en oxygène au tissu cardiaque n’était pas limité au CTmax (qui était à

27,5 °C). Deuxièmement, en suivant la production d’ATP lors d’une augmentation de la

Figure 0.7 : Taux de production d’ATP et ratio ATP/respiration de mitochondries cardiaques en fonction de la température. La ligne verticale en pointillé représente le CTmax

de Notolabrus celidotus (27,5° C). Tirée de Iftikar and Hickey, 2014.

température, ils ont observé que la production mitochondriale d’ATP diminuait avant même l’atteinte de la limite maximale de l’organisme (Fig. 0.7). Ceci entraînerait une déficience énergétique au niveau cardiaque et pourrait, en conséquence, affecter son fonctionnement. Plusieurs mécanismes sont potentiellement à l’origine de cette diminution d’efficacité mitochondriale. D’une part, lorsque seuls les substrats du complexe I ou II sont fournis (ici malate, pyruvate et glutamate), la respiration mitochondriale augmente significativement à température élevée, indiquant alors une augmentation de la perméabilité membranaire (Iftikar & Hickey, 2013). Lorsque cette membrane est perméable, les protons peuvent la traverser sans synthèse d’ATP (Brand & Nicholls, 2011). La diminution de l’efficacité mitochondriale peut aussi s’expliquer par une diminution de RCR et une augmentation du relâchement de cytochrome à travers la membrane à l’approche du CTmax. Le RCR (respiratory control ratio)

est une mesure de la qualité mitochondriale qui se calcule en divisant le taux de consommation d’oxygène des mitochondries en OXPHOS (avec des substrats pour les complexes I et II et de l’ADP) par la valeur du LEAK (avec les mêmes substrats sans ADP). Cela dit, une diminution de RCR est interprétée comme une perte d’efficacité de l’ETS puisque celui-ci n’utilise pas l’entièreté des électrons mis à sa disposition afin de produire de l’ATP (Chance & Williams, 1955). Une augmentation de la libération de cytochrome signifie que la membrane mitochondriale externe devient de plus en plus perméable affectant ainsi le gradient électrochimique et ultimement, la production d’ATP. Tout cela suggère que la capacité mitochondriale (consommation d’oxygène et production ATP) plafonne bien avant l’atteinte de la limite maximale de température de l’animal dans cette étude. Ceci arrive lors d’une accélération des processus métaboliques qui engendrent une amplification des besoins énergétiques due à l’augmentation de la température. Les auteurs concluent que cette défaillance pourrait ultimement conduire à l’arrêt cardiaque et à la mort de l’animal. D’autres études semblent confirmer ces résultats. Chez la morue atlantique (Gadus morhua) le métabolisme énergétique cardiaque semble aussi être affecté à des températures près de la limite de tolérance supérieure. La respiration mitochondriale en stade OXPHOS en présence des substrats des substrats du complexe I (ici pyruvate et malate), plafonne à 20 °C, deux degrés en dessous du CTmax (22 °C) de la morue atlantique (Rodnick et al., 2014). D’autres études

des températures près du CTmax, chez l’omble chevalier (Salvelinus alpinus) et le saumon

atlantique (Penney et al., 2014) ou le loup atlantique (Anarhichas lupus, Lemieux et al., 2010). À cet égard, chez trois autres espèces, Thalassoma lunare, Notalabrus fucicola (Iftikar et al., 2014) et le Forsterygion lapillum (Khan et al., 2014), l’efficacité et l’intégrité sont détériorées à des températures inférieures aux CTmax respectifs de ces espèces.

Finalement, certaines enzymes dans le cœur de la perche européenne, impliqués dans le cycle de Krebs, ont démontré une baisse d’activité à l’approche de la température maximale (Ekström et al., 2017). La citrate synthase et la pyruvate déshydrogénase diminuent fortement leurs activités à l’approche du CTmax. Ce sont deux enzymes impliquées dans la catalyse des

réactions conduisant à la production d’équivalents réduits (NADH et FADH2). Une diminution

de la disponibilité de ces derniers abaisserait le flux d’électrons dans le ETS et ainsi la production d’ATP.

Toutefois, chez les poissons, les études sur la production de DRO en présence de combinaison de substrats mitochondrial semblables aux conditions in vivo sont rares. Des fibres perméabilisées de tissu cardiaque de N. celidotus ne semblent pas produire plus de DRO lors de stress thermique (Iftikar & Hickey, 2013). En revanche, chez des mitochondries cardiaques isolées de la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss), la carpe commune (Cyprinus carpio) et l’esturgeon (Acipenser fulvescens), la quantité de DRO produite augmente avec la température (Banh et al., 2015). Néanmoins, à notre connaissance, aucune étude existante ne relie la production de DRO au CTmax d’un animal. De plus, des recherches sur le lien entre contenus

en n-3 du cœur et la résistance à un stress tel que la température sont à ma connaissance inexistantes.

0.10 Le modèle animal

Pour ce projet de doctorat, nous avons choisi deux espèces présentent au Québec, soit l’omble chevalier (AC, de arctic char) et l’omble de fontaine (BC, de brook char) ainsi que leurs hybrides respectifs AC ♀ x BC (HA) et AC x BC (HB). Les deux espèces d’ombles choisies font partie intégrante de la production aquacole au Québec. Le BC vise principalement le marché de l’ensemencent pour la pêche sportive, alors que l’AC est produit pour le marché

de la consommation humaine. Ces deux espèces ont des patrons de distribution géographiques différents avec une plage de tolérance thermique plus ou moins restreinte. L’AC a une distribution holarctique et une plage de température de 0 à 16 °C (Fishbase.org) tandis que le BC a une distribution plus australe, et une tolérance thermique entre 0 et 25 °C (Fishbase.org). Ces caractéristiques font de ces deux espèces un modèle biologique idéal afin d’étudier l’impact de la température sur la gestion du stress oxydatif. De plus, considérant l’importance économique de ces espèces et les efforts investis pour développer des souches commerciales rentables, l’étude de l’impact du contenu des n-3 dans leur aliment sur les performances de croissance et la tolérance au stress est tout-à-fait appropriée.

L’utilisation des hybrides de ces deux espèces augmente la valeur du modèle. Premièrement, de façon générale, les hybrides sont intéressants pour les aquacultures considérant leur taux de croissance pouvant être plus élevé que leur espèce parentale grâce entre autre à leur maturation sexuelle tardive. Elles remédient également au problème de consanguinité des cheptels de poissons présent en aquaculture (Bartley et al., 2000 ; Blackie et al., 2011). Finalement, les deux espèces parentales sont évolutivement et génétiquement proches et leur hybridation a déjà été observée en milieu naturel (Bernatchez et al., 1995 ; Hammar et al., 1991).

0.11 Les hybrides

Le fonctionnement de la mitochondrie et ses réactions à la suite de changements dans son milieu (p. ex., température, composition du milieu cellulaire) sont orchestrés par l’interaction et la synchronisation de son propre génome (ADN mitochondriale) avec le génome nucléaire. Le phénotype mitochondrial dépend du recrutement de plusieurs centaines de protéines codées dans le noyau vers l’intérieur de la mitochondrie (Lotz et al., 2014). Une fois intégré à la mitochondrie, une partie de ces protéines sert de sous-unité aux complexes respiratoires. La production d’énergie chimique au niveau de la mitochondrie est basée sur le travail de ces complexes respiratoires hautement sensibles à la température. Les différentes protéines qui les composent sont donc codées en partie par le génome mitochondrial et majoritairement par le génome nucléaire (Figure 0.8, Blier et al., 2001; Ellison and Burton, 2006).