Analyse des herbicides phénoxyacides par chromatographie en phase liquide : 1er essai inter-laboratoires

Analyse

des

herbicides phénoxyacides par

chromatographie

en

phase

liquide

:

1er

essai

inter-laboratoires

HPLC

analysis

of

phenoxyacid

herbicides

:

1st

interlab

oratory

comparison

study

Alain

TURCANT»*,

Betty

DEHON(2)#,

Catherine

GANIÈRE-MONTEIL3*,

Sylvain

DULAURENT4*, Moustapha

MOULSMA(5),

Corinne

CHARLIER

m

(1) Phai-macologie-Toxicologie,CHUAngers (2) Biochimie UF Toxicologie, CHU

Lille

(3) Pharmacologie, CHU Nantes (4)Pharmacologie-Toxicologie, CHU Limoges (5) UF Pharmacotoxicologie, CHUE. Herriot Lyon (6) Toxicologie Clinique etMédicolégale,CHU Liège #Groupedetravail "Pesticides" delaSFTA

*Auteuràquiadresserlacorrespondance :

Alain TURCANT,

ServicedePharmacologie etToxicologie,

CHU, 4,rueLarrey- 49933 ANGERS Cedex 9 - France Tel : 02 41 35 45 52 -Fax : 0241 3548 77 - E-mail : alturcant@chu-angers.fr

RESUME

Afindedocumenter au mieux,pardesdosagesplasmatiques,

les casd'intoxicationparlesherbicides phénoxyacides, six laboratoires ont évalué diverses approches analytiques de

type CLHPaprès purificationparsimpleprécipitation des

protéines plasmatiquesparVacétonitrileouaprèsextraction liquide-liquide en milieu acide ou encore après extraction liquide-solide. Un essai comparatifconcernant 4 plasmas surchargéset4casréelsd'intoxicationamontréunevaria¬

bilité correcte avec un CVlaplupart du temps inférieurà

20%.L'extractionliquide-solide, non totalement satisfaisan¬

te dans cetessai, nécessite une investigation pluspoussée

tandis que la simple précipitation protéique apporte une

(Reçule 16

février

2006; acceptéle19

juin

2006)

SUMMARY

The evaluation

of

acutephenoxyacid poisonings in.humans requirestheidentification

of

theherbicideand,

if

possible, its quantification in plasma. Six laboratories tested different analyticalapproaches, using HPLC, aftersampletreatment either by simple protein precipitation or by liquid-liquid extraction under acidic pH conditions or by solid phase extraction. A comparative study on4 spiked plasmas and4

real acutecasesshowedgood resultswith CV < 20%. Solid phase extraction needsfurther investigation while simple precipitation byacétonitrileprovidesa rapidandsufficient cleaning procedure toevaluate themajority

of

acutepoiso¬

nings. Liquid-liquid extraction, providing lower limits

of

135

Analyse

des

herbicides phénoxyacides par

chromatographie

en

phase

liquide

:

1er

essai

inter-laboratoires

HPLC

analysis

of

phenoxyacid

herbicides

:

1st

interlab

oratory

comparison

study

Alain

TURCANT»*,

Betty

DEHON(2)#,

Catherine

GANIÈRE-MONTEIL3*,

Sylvain

DULAURENT4*, Moustapha

MOULSMA(5),

Corinne

CHARLIER

m

(1) Phai-macologie-Toxicologie,CHUAngers (2) Biochimie UF Toxicologie, CHU

Lille

(3) Pharmacologie, CHU Nantes (4)Pharmacologie-Toxicologie, CHU Limoges (5) UF Pharmacotoxicologie, CHUE. Herriot Lyon (6) Toxicologie Clinique etMédicolégale,CHU Liège #Groupedetravail "Pesticides" delaSFTA

*Auteuràquiadresserlacorrespondance :

Alain TURCANT,

ServicedePharmacologie etToxicologie,

CHU, 4,rueLarrey- 49933 ANGERS Cedex 9 - France Tel : 02 41 35 45 52 -Fax : 0241 3548 77 - E-mail : alturcant@chu-angers.fr

RESUME

Afindedocumenter au mieux,pardesdosagesplasmatiques,

les casd'intoxicationparlesherbicides phénoxyacides, six laboratoires ont évalué diverses approches analytiques de

type CLHPaprès purificationparsimpleprécipitation des

protéines plasmatiquesparVacétonitrileouaprèsextraction liquide-liquide en milieu acide ou encore après extraction liquide-solide. Un essai comparatifconcernant 4 plasmas surchargéset4casréelsd'intoxicationamontréunevaria¬

bilité correcte avec un CVlaplupart du temps inférieurà

20%.L'extractionliquide-solide, non totalement satisfaisan¬

te dans cetessai, nécessite une investigation pluspoussée

tandis que la simple précipitation protéique apporte une

(Reçule 16

février

2006; acceptéle19

juin

2006)

SUMMARY

The evaluation

of

acutephenoxyacid poisonings in.humans requirestheidentification

of

theherbicideand,

if

possible, its quantification in plasma. Six laboratories tested different analyticalapproaches, using HPLC, aftersampletreatment either by simple protein precipitation or by liquid-liquid extraction under acidic pH conditions or by solid phase extraction. A comparative study on4 spiked plasmas and4

real acutecasesshowedgood resultswith CV < 20%. Solid phase extraction needsfurther investigation while simple precipitation byacétonitrileprovidesa rapidandsufficient cleaning procedure toevaluate themajority

of

acutepoiso¬

nings. Liquid-liquid extraction, providing lower limits

of

AnnalesdeToxicologie Analytique, vol.

XVIII,

n° 2,2006

bonne rapiditédepréparationdeséchantillonsetunesensi¬

bilité suffisante pour la majorité des cas d'intoxication

aiguë. L'extraction liquide-liquidepermetunemeilleuresen¬

sibilité, notammentavec unedétectionparspectrométriede masse en tandem et rendcetteapproche applicable auxcas

d'intoxicationfaible voireaux expositions professionnelles.

MOTS-CLES

Phénoxyacides, phytohormones, plasma, CLHP.

herbicides, intoxication,

detection especiallywhen tandem massspectrometryis used,

will be moreinteresting inminororprofessional exposition

to theseherbicides.

KEY-WORDS

Phenoxyacids, herbicides, acutepoisoning, plasma, HPLC.

Introduction

Les herbicides phénoxyacides (fig.

la)

constituent une

famille

de produits phytosanitaires agissant de façon

systémique par pénétration

foliaire

en stimulant de façon anarchique làcroissance de la plante. Sept sub¬

stances sontcommercialisées en France : cinq sont de

type acide phénoxy-acétique, avecdifférentes substitu¬ tions par un ou plusieurs atomes de chlore (Cl) ou un groupement méthyle (CH3),deuxd'entre ellesprésen¬ tant un groupement méthyle sur la chaîne alcanoïque, d'où leur autre appellation d'acides phénoxy-propio-niques, et 2 sont des acides phénoxy-butyriques (Tableau I). Lefénopropou 2,4,5-TP, égalementappe¬

lé silvex, noncommercialisé en France mais référencé en Belgique comme devant être recherché dans les eaux derivières,complète cetteliste.Letriclopyr,où le cycle phényle est remplacé par un noyaupyridine, est apparenté à cette famille (fig.

lb).

Les pKa diffèrent légèrement d'une substance àl'autre en fonctionde la longueurdela chaîne acide ou delasubstitutionpar un ou plusieurs Cl ou un groupement méthyle. Ces pro¬ duits sont souvent commercialisés en association par deux ou encore avec d'autres molécules comme le dicamba (herbicidedela

famille

des dérivés del'acide benzoïque). Ces herbicides agissent comme

l'Acide

Indole Acétique

(IAA)

qui est une auxine naturelle et sont donc également appelés auxines de synthèse ou encorephytohormones (1). L'analogie structurale avec

F

IAA

(fig.2) est basée sur 3 similitudes :

- unepartie plane (cycles aromatiques),

- laprésence d'unefonction acide carboxylique

- l'existence d'une structuredipolaire entrele groupe¬ ment acide et une zone électrophile, azote du noyau indoleou carbone enposition2 du cycle. En raison de

l'effet

électro-attracteur des halogènes, la distance

entre lescharges estvoisine de5,5 angstroms (1).

Tableau I : Dénomination, substituants, pKa et masses

molairesdes différents phénoxyacidesetapparentés(cffor¬ mulesfigure 1). (a) R, I R,

O

l3 0-(CH)n-COOH Ac. Phénoxy-acétiques, 2,4-D(2"4-dichloro-) 2,4,5-T(2,4,5-trichloro-) MCPA(2-méthyl-4-chloro-) propioniques 2,4-DCP(Dichlorprop) 2,4,5-TP (Fénoprop) MCPP(Mécoprop) butyriques 2,4-DB(2,4-dichloro-) MCPB(2-raéthyI-4-chloro-)

riclopyr(cyclepyridine)

Ri Cl Cl CH3 Cl Cl CH3 Cl CH3 Cl R2 Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl R3 H Cl H H Cl H H H Cl R4 H H H CH3 CH3 CH3 H H. . H n pKa 1 2,64 1 2,80 1 3,07 1 3,00 1 2,80 1 3,78 3 4.80 3 4,84 1 2,68 MM 221,0 255,5 200,6 235,1 269,5 214,6 249,1 228,7 256,5 o-0

1

5,5Ally v /-°\ \/ V CI-' ' S*

T

1

KA

N:!

Figure 1 : Formules chimiques des phénoxyacides (a) et

triclopyr(b).

Figure 2 :Analogie géométrique entre l'acide indole acé¬

tiqueetl'acide2,4-D.

Si latoxicité par absorption cutanée est faible,

il

n'en est pas de même lors d'ingestion orale puisque les dosespotentiellement mortelles sont évaluées entre 80 et 800 mg/kg selon les substances, soit quelques grammes (2). Les principaux signes cliniques en cas

d'intoxication

aiguë sont les vomissements précoces,

lestroublesdela conscience,l'hypotension artérielleet

Facidose métabolique.

Les méthodes de dosage plasmatique et/ou urinaire de

cesherbicides phénoxyacides, décritesdansla littératu¬

reencas

d'intoxication,

sontessentiellementbaséessur

lachromatographieenphaseliquideavecdétection

UV

(3,4) plus facile à mettre en oeuvre que la chromato¬ graphie en phase gazeuse qui nécessite une étape de méthylation (5).

Le groupe de travail « Pesticides » de la Société Française de Toxicologie Analytique s'est intéressé au

suividesintoxicationsparherbicides phénoxyacidesen AnnalesdeToxicologie Analytique, vol.

XVIII,

n° 2,2006

bonne rapiditédepréparationdeséchantillonsetunesensi¬

bilité suffisante pour la majorité des cas d'intoxication

aiguë. L'extraction liquide-liquidepermetunemeilleuresen¬

sibilité, notammentavec unedétectionparspectrométriede masse en tandem et rendcetteapproche applicable auxcas

d'intoxicationfaible voireaux expositions professionnelles.

MOTS-CLES

Phénoxyacides, phytohormones, plasma, CLHP.

herbicides, intoxication,

detection especiallywhen tandem massspectrometryis used,

will be moreinteresting inminororprofessional exposition

to theseherbicides.

KEY-WORDS

Phenoxyacids, herbicides, acutepoisoning, plasma, HPLC.

Introduction

Les herbicides phénoxyacides (fig.

la)

constituent une

famille

de produits phytosanitaires agissant de façon

systémique par pénétration

foliaire

en stimulant de façon anarchique làcroissance de la plante. Sept sub¬

stances sontcommercialisées en France : cinq sont de

type acide phénoxy-acétique, avecdifférentes substitu¬ tions par un ou plusieurs atomes de chlore (Cl) ou un groupement méthyle (CH3),deuxd'entre ellesprésen¬ tant un groupement méthyle sur la chaîne alcanoïque, d'où leur autre appellation d'acides phénoxy-propio-niques, et 2 sont des acides phénoxy-butyriques (Tableau I). Lefénopropou 2,4,5-TP, égalementappe¬

lé silvex, noncommercialisé en France mais référencé en Belgique comme devant être recherché dans les eaux derivières,complète cetteliste.Letriclopyr,où le cycle phényle est remplacé par un noyaupyridine, est apparenté à cette famille (fig.

lb).

Les pKa diffèrent légèrement d'une substance àl'autre en fonctionde la longueurdela chaîne acide ou delasubstitutionpar un ou plusieurs Cl ou un groupement méthyle. Ces pro¬ duits sont souvent commercialisés en association par deux ou encore avec d'autres molécules comme le dicamba (herbicidedela

famille

des dérivés del'acide benzoïque). Ces herbicides agissent comme

l'Acide

Indole Acétique

(IAA)

qui est une auxine naturelle et sont donc également appelés auxines de synthèse ou encorephytohormones (1). L'analogie structurale avec

F

IAA

(fig.2) est basée sur 3 similitudes :

- unepartie plane (cycles aromatiques),

- laprésence d'unefonction acide carboxylique

- l'existence d'une structuredipolaire entrele groupe¬ ment acide et une zone électrophile, azote du noyau indoleou carbone enposition2 du cycle. En raison de

l'effet

électro-attracteur des halogènes, la distance

entre lescharges estvoisine de5,5 angstroms (1).

Tableau I : Dénomination, substituants, pKa et masses

molairesdes différents phénoxyacidesetapparentés(cffor¬ mulesfigure 1). (a) R, I R,

O

l3 0-(CH)n-COOH Ac. Phénoxy-acétiques, 2,4-D(2"4-dichloro-) 2,4,5-T(2,4,5-trichloro-) MCPA(2-méthyl-4-chloro-) propioniques 2,4-DCP(Dichlorprop) 2,4,5-TP (Fénoprop) MCPP(Mécoprop) butyriques 2,4-DB(2,4-dichloro-) MCPB(2-raéthyI-4-chloro-)

riclopyr(cyclepyridine)

Ri Cl Cl CH3 Cl Cl CH3 Cl CH3 Cl R2 Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl R3 H Cl H H Cl H H H Cl R4 H H H CH3 CH3 CH3 H H. . H n pKa 1 2,64 1 2,80 1 3,07 1 3,00 1 2,80 1 3,78 3 4.80 3 4,84 1 2,68 MM 221,0 255,5 200,6 235,1 269,5 214,6 249,1 228,7 256,5 o-0

1

5,5Ally v /-°\ \/ V CI-' ' S*

T

1

KA

N:!

Figure 1 : Formules chimiques des phénoxyacides (a) et

triclopyr(b).

Figure 2 :Analogie géométrique entre l'acide indole acé¬

tiqueetl'acide2,4-D.

Si latoxicité par absorption cutanée est faible,

il

n'en est pas de même lors d'ingestion orale puisque les dosespotentiellement mortelles sont évaluées entre 80 et 800 mg/kg selon les substances, soit quelques grammes (2). Les principaux signes cliniques en cas

d'intoxication

aiguë sont les vomissements précoces,

lestroublesdela conscience,l'hypotension artérielleet

Facidose métabolique.

Les méthodes de dosage plasmatique et/ou urinaire de

cesherbicides phénoxyacides, décritesdansla littératu¬

reencas

d'intoxication,

sontessentiellementbaséessur

lachromatographieenphaseliquideavecdétection

UV

(3,4) plus facile à mettre en oeuvre que la chromato¬ graphie en phase gazeuse qui nécessite une étape de méthylation (5).

Le groupe de travail « Pesticides » de la Société Française de Toxicologie Analytique s'est intéressé au

évaluant les capacités analytiques de six laboratoires, tant

d'un

point de vue

qualitatif

que quantitatif, soit par la miseenplaced'une méthodeanalytique nouvel¬ le soit par une réévaluation de sa propre méthode de dosage vis-à-visde 9 substances. Ladémarche

initiale

aété, pourchaquelaboratoire,depréciserles limitesde détection de ces produits avec sa propre méthode de screening toxicologiqueparchromatographie enphase

liquide

avec détection

UV

à barrette de diodes

(CLHP/BD)aprèsextractionalcaline, méthode miseen dans la plupart des laboratoires pour la recherchedes substances en cause au coursd'intoxica¬ tions aiguës médicamenteuses. L'extraction en

milieu

alcalinest a

priori

défavorablepourla miseenéviden¬ cedesherbicides phénoxyacides. Ensuite, chaquelabo¬ ratoireparticipantdevaitétablir des conditions optimi¬

séesderecherche etdosage deces produitsens'aidant éventuellement d'une démarche analytique de type CLHP/BD, proposée parlelaboratoired'Angers, mais chacun disposaitdu libre choixtant pourl'aspectchro¬ matographiquequepourladétectionou lapréparation

de

l'échantillon

par extractionliquide/liquideou liqui¬

de/solide ou encore par simple précipitation des pro¬ téines.Enfinunessai inter-laboratoires aétéréalisé sur

8 échantillonsplasmatiques correspondant à4 plasmas surchargés età4 casréels

d'intoxication.

Matériel

et

Méthodes

Les poudres, obtenues chez

Aldrich,

FlukaetRiedel de Haën(Sigma-Aldrich,SaintQuentin Fallavier,France), chez Cluzeau (Ste Foy la Grande, France) ou LGC Promochem (Molsheim, France), sontde pureté com¬ prise entre 95 et 99,9 % selon les produits. Les solu¬ tionsmères sont préparées, selonles substances, soità

1, à 5 ou à 10

g/L

dansFacétonitrile (pouranalyses) et non le methanolpourminimiserle risque d'estérifica-tionpossible in vitro àlongterme.

La

limite

dedétectionpourchacundecesproduits aété

estimée, pour chaque laboratoire, par l'obtention

d'un

spectre

UV

interprétable, en surchargeant des plasmas témoins àdesconcentrationsallantde 10 à 100

mg/L

et en testant ses propres conditions d'extraction liquide-liquideen

milieu

alcalin.

La méthode proposée pour

l'optimisation

du dosage

desherbicides

fait

appelàuneprise d'essaidelOOpl de plasma auquelestajouté unvolume équivalentd'acéto¬

nitrile

contenant l'acide

2-méthyl-4-chlorophénoxybu-tyrique (MCPB) utilisé comme étalon interne à 300 mg/L, cette substance n'ayant jamais été rencontrée

danslescas

d'intoxication

dans l'expérienceangevine.

Lesurnageantdecentrifugationestensuitediluéau 1/2 dans l'eau puis analysé par chromatographie de parta

ge en phases inversées soit dans les conditions du screening classique de ce laboratoire (6), c'est-à-dire un gradienttampon phosphatepH6 etacétonitrile avec une détection à 3 longueurs d'onde (230, 285 et 210 nm), soit par une élution isocratique en tampon formiate2mMàpH3etacétonitrile67/33 v/v pourpal¬

lier

une insuffisance de séparation decertains produits dans les premières conditions. Un exemple de gamme d'étalonnage entre 50 et500

mg/L

pour les6 produits habituellement testésest présenté dans lafigure3. Les limites de quantification sontde 10mg/L.

L'essai inter-laboratoires proposé comportait 4 plasmas témoinssurchargés(800 ulpourchaquelaboratoire)et4 plasmas (300 à 1000 ul) correspondaientàdes casréels stockés en sérothèque à -20°C. Certains de ces échan¬

tillonsdataientdeplusde 10 ans.Les surchargesontété effectuées par ajout sur 5 ml de plasma témoin d'un volume maximum de 200 ul d'acétonitrile contenant une ou deuxmoléculesàdifférentes concentrations. Les plasmas ont été envoyés congelés et chaquelaboratoire disposaitde2moispourrépondreàcet essai.

Lesconditions analytiques utilisées par chaquelabora¬ toiresont rapportées dansle tableau

II

: 3 ontchoisila

précipitation

par acétonitrile, 2

l'extraction

liquide/liquide enmilieu trèsacide (pH <1) et un l'ex¬

traction

liquide/solide

sur cartouche échangeuse

d' anions (OASIS©

MAX)

à partir de lOOpl de prise d'essai. La séparation chromatographique est réalisée surcolonne C8ou

Cl

8 éventuellement avecfaibledia¬

mètre interne (2 voire

lmm)

avec des tampons phos¬ phate ou formiate de concentration et de pH variés, 4 laboratoires ayant des conditions de gradientet 2 des

conditions isocratiques avec des temps de séparation comprisentre 15et30 min.Un laboratoire aidentifiéet dosé les phénoxyacides par spectrométrie de masse tandem, les autres utilisant

FUV

barrette de diodes avec une ou plusieurs longueurs d'onde. Cinq labora¬ toires ont quantifié avec

l'aide

d'un étalon interne, 1

par étalonnage externe, ce laboratoire ayant procédé à

l'identification initiale

parCPG/SMaprèsméthylation.

Résultats

Les résultats des analyses dans les conditions de scree¬

ningmontrent évidemment lafaibledétectabilitédeces

molécules acides dans desconditions d'extractionalca¬

line même si, compte tenu des concentrations impor¬ tantes rencontrées en intoxication,

il

n'est pas impos¬ sibledelesmettreenévidence. SelonlepHetlesolvant d'extraction on observe une grande disparité de détec¬

tion. Uneextraction deplasmaàpH 11 par le dichloro¬

méthane ne permet pas de détecter ces produits à la concentration de 100 mg/1. Uneextraction enprésence évaluant les capacités analytiques de six laboratoires,

tant

d'un

point de vue

qualitatif

que quantitatif, soit par la miseenplaced'une méthodeanalytique nouvel¬ le soit par une réévaluation de sa propre méthode de dosage vis-à-visde 9 substances. Ladémarche

initiale

aété, pourchaquelaboratoire,depréciserles limitesde détection de ces produits avec sa propre méthode de screening toxicologiqueparchromatographie enphase

liquide

avec détection

UV

à barrette de diodes

(CLHP/BD)aprèsextractionalcaline, méthode miseen dans la plupart des laboratoires pour la recherchedes substances en cause au coursd'intoxica¬ tions aiguës médicamenteuses. L'extraction en

milieu

alcalinest a

priori

défavorablepourla miseenéviden¬ cedesherbicides phénoxyacides. Ensuite, chaquelabo¬ ratoireparticipantdevaitétablir des conditions optimi¬

séesderecherche etdosage deces produitsens'aidant éventuellement d'une démarche analytique de type CLHP/BD, proposée parlelaboratoired'Angers, mais chacun disposaitdu libre choixtant pourl'aspectchro¬ matographiquequepourladétectionou lapréparation

de

l'échantillon

par extractionliquide/liquideou liqui¬

de/solide ou encore par simple précipitation des pro¬ téines.Enfinunessai inter-laboratoires aétéréalisé sur

8 échantillonsplasmatiques correspondant à4 plasmas surchargés età4 casréels

d'intoxication.

Matériel

et

Méthodes

Les poudres, obtenues chez

Aldrich,

FlukaetRiedel de Haën(Sigma-Aldrich,SaintQuentin Fallavier,France), chez Cluzeau (Ste Foy la Grande, France) ou LGC Promochem (Molsheim, France), sontde pureté com¬ prise entre 95 et 99,9 % selon les produits. Les solu¬ tionsmères sont préparées, selonles substances, soità

1, à 5 ou à 10

g/L

dansFacétonitrile (pouranalyses) et non le methanolpourminimiserle risque d'estérifica-tionpossible in vitro àlongterme.

La

limite

dedétectionpourchacundecesproduits aété

estimée, pour chaque laboratoire, par l'obtention

d'un

spectre

UV

interprétable, en surchargeant des plasmas témoins àdesconcentrationsallantde 10 à 100

mg/L

et en testant ses propres conditions d'extraction liquide-liquideen

milieu

alcalin.

La méthode proposée pour

l'optimisation

du dosage

desherbicides

fait

appelàuneprise d'essaidelOOpl de plasma auquelestajouté unvolume équivalentd'acéto¬

nitrile

contenant l'acide

2-méthyl-4-chlorophénoxybu-tyrique (MCPB) utilisé comme étalon interne à 300 mg/L, cette substance n'ayant jamais été rencontrée

danslescas

d'intoxication

dans l'expérienceangevine.

Lesurnageantdecentrifugationestensuitediluéau 1/2 dans l'eau puis analysé par chromatographie de parta

ge en phases inversées soit dans les conditions du screening classique de ce laboratoire (6), c'est-à-dire un gradienttampon phosphatepH6 etacétonitrile avec une détection à 3 longueurs d'onde (230, 285 et 210 nm), soit par une élution isocratique en tampon formiate2mMàpH3etacétonitrile67/33 v/v pourpal¬

lier

une insuffisance de séparation decertains produits dans les premières conditions. Un exemple de gamme d'étalonnage entre 50 et500

mg/L

pour les6 produits habituellement testésest présenté dans lafigure3. Les limites de quantification sontde 10mg/L.

L'essai inter-laboratoires proposé comportait 4 plasmas témoinssurchargés(800 ulpourchaquelaboratoire)et4 plasmas (300 à 1000 ul) correspondaientàdes casréels stockés en sérothèque à -20°C. Certains de ces échan¬

tillonsdataientdeplusde 10 ans.Les surchargesontété effectuées par ajout sur 5 ml de plasma témoin d'un volume maximum de 200 ul d'acétonitrile contenant une ou deuxmoléculesàdifférentes concentrations. Les plasmas ont été envoyés congelés et chaquelaboratoire disposaitde2moispourrépondreàcet essai.

Lesconditions analytiques utilisées par chaquelabora¬ toiresont rapportées dansle tableau

II

: 3 ontchoisila

précipitation

par acétonitrile, 2

l'extraction

liquide/liquide enmilieu trèsacide (pH <1) et un l'ex¬

traction

liquide/solide

sur cartouche échangeuse

d' anions (OASIS©

MAX)

à partir de lOOpl de prise d'essai. La séparation chromatographique est réalisée surcolonne C8ou

Cl

8 éventuellement avecfaibledia¬

mètre interne (2 voire

lmm)

avec des tampons phos¬ phate ou formiate de concentration et de pH variés, 4 laboratoires ayant des conditions de gradientet 2 des

conditions isocratiques avec des temps de séparation comprisentre 15et30 min.Un laboratoire aidentifiéet dosé les phénoxyacides par spectrométrie de masse tandem, les autres utilisant

FUV

barrette de diodes avec une ou plusieurs longueurs d'onde. Cinq labora¬ toires ont quantifié avec

l'aide

d'un étalon interne, 1

par étalonnage externe, ce laboratoire ayant procédé à

l'identification initiale

parCPG/SMaprèsméthylation.

Résultats

Les résultats des analyses dans les conditions de scree¬

ningmontrent évidemment lafaibledétectabilitédeces

molécules acides dans desconditions d'extractionalca¬

line même si, compte tenu des concentrations impor¬ tantes rencontrées en intoxication,

il

n'est pas impos¬ sibledelesmettreenévidence. SelonlepHetlesolvant d'extraction on observe une grande disparité de détec¬

tion. Uneextraction deplasmaàpH 11 par le dichloro¬

méthane ne permet pas de détecter ces produits à la concentration de 100 mg/1. Uneextraction enprésence

Annales deToxicologie Analytique,vol.

XVIII,

n°2,2006 Area Ratio 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

Area Ratio=0.9869428"AmtRatio-K!

Rel.Res%(1):7.575 4 3 2 1 Correlatio

Area Ratio=0.82851396-AmtRalio+0 Area Ratio=113050765'AmtRatio+0

5 4 Correlation: 0.99996 Amount Ratio AreaRatio 1.4 '1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Rel.Res%(1):7.462 3 2 1 5 4 Correlation: 0.99986 Amount Ratio Area Ratio 2 1.75 1.5 1.25 1 0.75 0.5 0.25 0 Rel Res%(1):9.540 3 2 Correlation:0.99972 Am n ti

Area Ratio=0.98701534'AmtRatio +0 Area Ratio=0.82032223*AmtRatio +0 Area Ratio 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Rel Res%(1):5.333 3 2 1 4 Correlatior A 5 [j i :0.99976 mountR tî reaRatio 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Correlation:0.99872

Area Ratio=0.89068111*AmtRatio+0 Area Ratio Re|.Res%(l):4.492

1.4 1.2 1 0.8 4 0.6 3 0.4 2 0.2 ! 0 Correlation: 0.99991

Figure3:Courbesd 'étalonnagede6phénoxyacidesentre50et500mg/L après simpleprécipitationdesprotéines plasmatiques (El =MCPB300 mg/L).

TableauII : Conditions analytiques utiliséesparles différentslaboratoires.

P. c. s. D. LQ Ll CH3CN 1/1 v/ve C18 Hypersil di2,1mm P20mM pH6 CH3CN G 18min UV-BD (230,285,210) El:MCPB 10mg/L L2 HC1 IN 1/2v/ve Ether 8/1 v/ve C8 Symmetry P44mM pH3,8 CH3CN G 30min UV-BD (230) El:Prazépam 0,2mg/L L3 OasisMAX L: MeOH E:MeOH/ac formique 98/2 C18 Eclipse F5mM pH3 CH3CN I70/30 15min UV-BD (230) El:MCPB 1à 10mg/L L4 HC16N 1/4v/ve AcEt 4/1 v/ve C18 Nucleosil di1mm F2mM pH3 CH3CN G 18min SM/SM MRM (2ions) El:Méphénytoïne 20 à 50fig/L L5 CH3CN 1/1 v/ve C18 Atlantis di 2,1mm F5mM pH6 CH3CN 167/33 30min UV-BD (230,200) EE L6 CH3CN 1/1v/ve C8 Symmetry P50mM pH3,6 CH3CN G 25min UV-BD (220) El:MCPB

(P.:préparationéchantillon;v/vevolumeréactif/volume échantillon;L.lavage;E.élution;C.colonne;didiamètreinterne;S.solvant;P.phos¬

phate;F.formiate;Ggradient;Iisocratique;D. détection;BDbarrette de diodes,longueursd'onde dequantificationentre parenthèses;SM/SM

spectrométriedemasse entandem;MRMmultiplereactionmonitoring;étalonnageinterneElouexterneEE;LQlimitedequantification).

de carbonate 1M (2/1 v/v) par un solvant quaternaire éther/dichlorométhane/hexane/alcool isoamylique 50/30/20/0,5

v/v/v/v

permet de détecter les herbicides entre 10 et 100 mg/L selon le pKa du produit. Une

extraction à pH 9,5 en milieu NH4C1 saturé par un mélange ternaire chloroforme/isopropanol/heptane 60/14/26

v/v/v

permetàdeuxlaboratoires une détection proche de 10 mg/L,quelles quesoientles molécules. Annales deToxicologie Analytique,vol.

XVIII,

n°2,2006

Area Ratio 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

Area Ratio=0.9869428"AmtRatio-K!

Rel.Res%(1):7.575 4 3 2 1 Correlatio

Area Ratio=0.82851396-AmtRalio+0 Area Ratio=113050765'AmtRatio+0

5 4 Correlation: 0.99996 Amount Ratio AreaRatio 1.4 '1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Rel.Res%(1):7.462 3 2 1 5 4 Correlation: 0.99986 Amount Ratio Area Ratio 2 1.75 1.5 1.25 1 0.75 0.5 0.25 0 Rel Res%(1):9.540 3 2 Correlation:0.99972 Am n ti

Area Ratio=0.98701534'AmtRatio +0 Area Ratio=0.82032223*AmtRatio +0 Area Ratio 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Rel Res%(1):5.333 3 2 1 4 Correlatior A 5 [j i :0.99976 mountR tî reaRatio 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Correlation:0.99872

Area Ratio=0.89068111*AmtRatio+0 Area Ratio Re|.Res%(l):4.492

1.4 1.2 1 0.8 4 0.6 3 0.4 2 0.2 ! 0 Correlation: 0.99991

Figure3:Courbesd 'étalonnagede6phénoxyacidesentre50et500mg/L après simpleprécipitationdesprotéines plasmatiques (El =MCPB300 mg/L).

TableauII : Conditions analytiques utiliséesparles différentslaboratoires.

P. c. s. D. LQ Ll CH3CN 1/1 v/ve C18 Hypersil di2,1mm P20mM pH6 CH3CN G 18min UV-BD (230,285,210) El:MCPB 10mg/L L2 HC1 IN 1/2v/ve Ether 8/1 v/ve C8 Symmetry P44mM pH3,8 CH3CN G 30min UV-BD (230) El:Prazépam 0,2mg/L L3 OasisMAX L: MeOH E:MeOH/ac formique 98/2 C18 Eclipse F5mM pH3 CH3CN I70/30 15min UV-BD (230) El:MCPB 1à 10mg/L L4 HC16N 1/4v/ve AcEt 4/1 v/ve C18 Nucleosil di1mm F2mM pH3 CH3CN G 18min SM/SM MRM (2ions) El:Méphénytoïne 20 à 50fig/L L5 CH3CN 1/1 v/ve C18 Atlantis di 2,1mm F5mM pH6 CH3CN 167/33 30min UV-BD (230,200) EE L6 CH3CN 1/1v/ve C8 Symmetry P50mM pH3,6 CH3CN G 25min UV-BD (220) El:MCPB

(P.:préparationéchantillon;v/vevolumeréactif/volume échantillon;L.lavage;E.élution;C.colonne;didiamètreinterne;S.solvant;P.phos¬

phate;F.formiate;Ggradient;Iisocratique;D. détection;BDbarrette de diodes,longueursd'onde dequantificationentre parenthèses;SM/SM

spectrométriedemasse entandem;MRMmultiplereactionmonitoring;étalonnageinterneElouexterneEE;LQlimitedequantification).

de carbonate 1M (2/1 v/v) par un solvant quaternaire éther/dichlorométhane/hexane/alcool isoamylique 50/30/20/0,5

v/v/v/v

permet de détecter les herbicides entre 10 et 100 mg/L selon le pKa du produit. Une

extraction à pH 9,5 en milieu NH4C1 saturé par un mélange ternaire chloroforme/isopropanol/heptane 60/14/26

v/v/v

permetàdeuxlaboratoires une détection proche de 10 mg/L,quelles quesoientles molécules.

AnnalesdeToxicologie Analytique, vol.

XVHI,

n°2, 2006

Les plasmas surchargés

(PI

àP4) contenaientsoit une seule molécule, le

triclopyr

(PI)

ouun mélangede 2,4-D etDCP (P2), un mélange 2,4,5-Tet fénoprop (P3) ou encoreun mélangeMCPA etMCPP (P4). Le chro¬ matogramme obtenu par

l'un

des laboratoires, après extractionparl'éther,est présentédanslafigure4.Les spectres

UV

de ces différentes substances (fig.5) pré¬

sentent des analogies spectrales avec, pourtous, une

1.20 1.10 1.00 0,80 0,80 0.70 30.60 0.50 0.40 0,30 050 0.10 0,00 o. 2.O0

3.716

4.00 6.00 8.00 10,00 12.00 CD O i 2 3 14.00 16.00 16.00 20.00 Minutes O Si R 22.00 24.00 26,00 28.00 30.00.

Figure 4: Chromatogramme obtenuà230nm (laboratoire 12) après extraction acidepar l'éther de l'échantillon P3 contenant l'acide 2,4,5-Tà 75 mg/L (tr = 16,5 min) et le

fénoprop (2,4,5-TP)à250mg/L

(tr

= 18,5min). (El=

pra-zépam, tr =23,9 min).

longueur d'onde maximale ou un épaulement à 230 nm, ainsi qu'un 2emaximum entre 280 à 300nm selon le nombre de Cl. Ces analogies sont plus importantes

lorsqu'il

y a unmême type de substitution (2 Cl, 3 Cl

ou

lCl-lMe),

le spectre du

triclopyr

montrant une intensitédesmaxima très différenteenraisondu cycle pyridine.

L'identification

nepourra donc complètement

se faire surle simple spectre mais nécessite une sépa¬

ration chromatographique satisfaisante pour un maxi¬ mumde spécificité.

Les plasmas issus des cas réels P5, P6 et P7 (fig. 6-8) contenaient respectivement du triclopyr, du 2,4-D et MCPP ou du 2,4-D et 2,4,5-T. Le dernier échantillon P8 (fig.9) contenait un mélange 2,4-D etMCPA, non séparésdansles conditionsd' élutionàpH6,comme on peut le

voir

dans la superposition spectrale et dans la comparaison du spectre hybride etde celui de chacun

desproduits (fig.10aetb).Mais ceux-ci sontséparés à

pH 3 (fig.11).

Les résultats quantitatifs (Tableau

III)

montrent une assezbonnehomogénéité parrapport auxvaleurs ajou¬ tées avec, pour 4 produits sur 7 un CV < 20 %. Cependant 9 sur 42 valeurs, soit 20 % des résultats, s'écartentdeplus de20 % de lavaleurmoyenne et les extrêmes peuventallerdu simpleau double.Les résul¬ tats surles cas réels(Tableau

IV)

sontplutôt meilleurs

3.4 DB ~2«-DCP(DICHLORPROP! ACIDE S^D Norm. 200 150

2

Cl

20 20 20 20 30 30 30 30 30 "MCPB MCPP cMECOf-'ROF) MCPA Norm. 500 400 TRICLOPYR *2.1,5TP(FENOPROP! "ACIDE 2.3.5T

3

Cl

600 500 400 300 200 100 0 (a) 20 20 20 20 30 30 340 30 30

1

CL

1

Me

20 20 20 20 30 30 30 30 30 nm

Figure 5 : Spectres UVobtenus

àpH6

entre210et400nm desphénoxyacidesetapparentés:(2C1) dérivésdichlorés;(3C1) dérivéstrichlorésdontletriclopyr(a);

(ICI,

IMe)dérivéschloro-etméthyl-.

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Les plasmas surchargés

(PI

àP4) contenaientsoit une seule molécule, le

triclopyr

(PI)

ouun mélangede 2,4-D etDCP (P2), un mélange 2,4,5-Tet fénoprop (P3) ou encoreun mélangeMCPA etMCPP (P4). Le chro¬ matogramme obtenu par

l'un

des laboratoires, après extractionparl'éther,est présentédanslafigure4.Les spectres

UV

de ces différentes substances (fig.5) pré¬

sentent des analogies spectrales avec, pourtous, une

1.20 1.10 1.00 0,80 0,80 0.70 30.60 0.50 0.40 0,30 050 0.10 0,00 o. 2.O0

3.716

4.00 6.00 8.00 10,00 12.00 CD O i 2 3 14.00 16.00 16.00 20.00 Minutes O Si R 22.00 24.00 26,00 28.00 30.00.

Figure 4: Chromatogramme obtenuà230nm (laboratoire 12) après extraction acidepar l'éther de l'échantillon P3 contenant l'acide 2,4,5-Tà 75 mg/L (tr = 16,5 min) et le

fénoprop (2,4,5-TP)à250mg/L

(tr

= 18,5min). (El=

pra-zépam, tr =23,9 min).

longueur d'onde maximale ou un épaulement à 230 nm, ainsi qu'un 2emaximum entre 280 à 300nm selon le nombre de Cl. Ces analogies sont plus importantes

lorsqu'il

y a unmême type de substitution (2 Cl, 3 Cl

ou

lCl-lMe),

le spectre du

triclopyr

montrant une intensitédesmaxima très différenteenraisondu cycle pyridine.

L'identification

nepourra donc complètement

se faire surle simple spectre mais nécessite une sépa¬

ration chromatographique satisfaisante pour un maxi¬ mumde spécificité.

Les plasmas issus des cas réels P5, P6 et P7 (fig. 6-8) contenaient respectivement du triclopyr, du 2,4-D et MCPP ou du 2,4-D et 2,4,5-T. Le dernier échantillon P8 (fig.9) contenait un mélange 2,4-D etMCPA, non séparésdansles conditionsd' élutionàpH6,comme on peut le

voir

dans la superposition spectrale et dans la comparaison du spectre hybride etde celui de chacun

desproduits (fig.10aetb).Mais ceux-ci sontséparés à

pH 3 (fig.11).

Les résultats quantitatifs (Tableau

III)

montrent une assezbonnehomogénéité parrapport auxvaleurs ajou¬ tées avec, pour 4 produits sur 7 un CV < 20 %. Cependant 9 sur 42 valeurs, soit 20 % des résultats, s'écartentdeplus de20 % de lavaleurmoyenne et les extrêmes peuventallerdu simpleau double.Les résul¬ tats surles cas réels(Tableau

IV)

sontplutôt meilleurs

3.4 DB ~2«-DCP(DICHLORPROP! ACIDE S^D Norm. 200 150

2

Cl

20 20 20 20 30 30 30 30 30 "MCPB MCPP cMECOf-'ROF) MCPA Norm. 500 400 TRICLOPYR *2.1,5TP(FENOPROP! "ACIDE 2.3.5T

3

Cl

600 500 400 300 200 100 0 (a) 20 20 20 20 30 30 340 30 30

1

CL

1

Me

20 20 20 20 30 30 30 30 30 nm

Figure 5 : Spectres UVobtenus

àpH6

entre210et400nm desphénoxyacidesetapparentés:(2C1) dérivésdichlorés;(3C1) dérivéstrichlorésdontletriclopyr(a);

(ICI,

IMe)dérivéschloro-etméthyl-.

Annales deToxicologie Analytique, vol.

XVÏÏI,

n°2, 2006

avec des

CV

tous inférieurs à 20 % et seulement 7 résultatsendehorsde±20%.Lesvaleurs trouvées sont voisines de celles initialement rendues par le labora¬ toireangevin,montrantunebonnestabilitéà-20°C.Le plasma6était un mélange de3 prélèvements avec des valeurs voisinesde 150à200

mg/L

pourle2,4-D et de 600 à700mg/L pourle MCPP. Int 3.0e5 2.0e5 1.0e5 0 ensity, çps 2 4 Triclopyr Fluroxypyr N11.26 6 8 10 12 Time, min 13.48 | II... 14 16

Figure6:Chromatogramme obtenuen CLHP/SM/SMpour l'échantillon réel P5 contenantle triclopyr(tr = 13,5min,

MRM 254/196) et le fluroxypyr (tr - 11,3 min, MRM 253/195). (El = méphénytoine, tr =11,1 min, MRM 217/137,9). 0*0 0.55 0» 0.45 0.40 u» 030 3 020-, O.l f'l1 ooo ; S3 s \ I . '-'A,

OOO EOO 1OO0 15.00

Miiutc jj n 1

*Ai

20 00 i \ 25m do'oo -t 35CO

Figure 7: Chromatogramme obtenu à 220nm (laboratoire L6)pour l'échantillonréelP6 contenantle2,4-D (tr = 15,9

min)et leMCPP(tr=18,5min).(El= MCPB,tr=21,3min).

0,35 0,30 0,2 0,20

^

0,15 0,10 0.0 0,00 2,303 2,00 3,364 4,00 6,653 6,00 8,00 10,00

Figure 8 : Chromatogramme obtenu à 230nm (laboratoire L3)pour l'échantillonréelP7 contenantle2,4-D(tr = 2,30 min)et le2,4,5-T(tr=3,63min).(El= MCPB, tr=6,65min).

DAD1A.Sig=230.4Ref=650.100 (AOUT05\0810-Q21 rnAU i I 400-j 300! l 056 11! "* 200-! 100\ 0\ L

%h

-^

ïv 0 2 4 6 D) -7.396 j! 8 min

Figure 9 : Chromatogramme obtenu à 230 nm et à

pH

6 (laboratoireLl) pourl'échantillonréelP8 contenantle 2,4-D(tr=4,05min)etleMCPA(tr= 4,05 min). (El=MCPB, tr= 7,40min).

*DAD1.3.978(231mAU,Up2) Ref= 5.501of0810-021D

*OAD1.4053(37^SmAU.Apx) Refe5501of0810021.D

*DAD1.4.16S(327mAU.Dnl)Ref= 5.501of 0810-021.D

Norm. 350 300 250 200 150 100 50 0 (a) 220 240 260 280 300 320 340 360 380 nm Norm. 350 300 250 200 150 100 50 0 "MCPA ACIDE 2,*D

DAD1,4.056(374mAU.Apx) Ref=5.501 of0810-021.D

«-3

(b)

1

t

2

220 240 260 280 300 320 340 360 380 nm

Figure10 : (a) : Testdepuretédupic(tr=4,06min)dela figure9:(b):comparaisonentrespectrehybrideausommet

(1)etspectresdu2,4-D (2) etduMCPA(3).

Annales deToxicologie Analytique, vol.

XVÏÏI,

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avec des

CV

tous inférieurs à 20 % et seulement 7 résultatsendehorsde±20%.Lesvaleurs trouvées sont voisines de celles initialement rendues par le labora¬ toireangevin,montrantunebonnestabilitéà-20°C.Le plasma6était un mélange de3 prélèvements avec des valeurs voisinesde 150à200

mg/L

pourle2,4-D et de 600 à700mg/L pourle MCPP. Int 3.0e5 2.0e5 1.0e5 0 ensity, çps 2 4 Triclopyr Fluroxypyr N11.26 6 8 10 12 Time, min 13.48 | II... 14 16

Figure6:Chromatogramme obtenuen CLHP/SM/SMpour l'échantillon réel P5 contenantle triclopyr(tr = 13,5min,

MRM 254/196) et le fluroxypyr (tr - 11,3 min, MRM 253/195). (El = méphénytoine, tr =11,1 min, MRM 217/137,9). 0*0 0.55 0» 0.45 0.40 u» 030 3 020-, O.l f'l1 ooo ; S3 s \ I . '-'A,

OOO EOO 1OO0 15.00

Miiutc jj n 1

*Ai

20 00 i \ 25m do'oo -t 35CO

Figure 7: Chromatogramme obtenu à 220nm (laboratoire L6)pour l'échantillonréelP6 contenantle2,4-D (tr = 15,9

min)et leMCPP(tr=18,5min).(El= MCPB,tr=21,3min).

0,35 0,30 0,2 0,20

^

0,15 0,10 0.0 0,00 2,303 2,00 3,364 4,00 6,653 6,00 8,00 10,00

Figure 8 : Chromatogramme obtenu à 230nm (laboratoire L3)pour l'échantillonréelP7 contenantle2,4-D(tr = 2,30 min)et le2,4,5-T(tr=3,63min).(El= MCPB, tr=6,65min).

DAD1A.Sig=230.4Ref=650.100 (AOUT05\0810-Q21 rnAU i I 400-j 300! l 056 11! "* 200-! 100\ 0\ L

%h

-^

ïv 0 2 4 6 D) -7.396 j! 8 min

Figure 9 : Chromatogramme obtenu à 230 nm et à

pH

6 (laboratoireLl) pourl'échantillonréelP8 contenantle 2,4-D(tr=4,05min)etleMCPA(tr= 4,05 min). (El=MCPB, tr= 7,40min).

*DAD1.3.978(231mAU,Up2) Ref= 5.501of0810-021D

*OAD1.4053(37^SmAU.Apx) Refe5501of0810021.D

*DAD1.4.16S(327mAU.Dnl)Ref= 5.501of 0810-021.D

Norm. 350 300 250 200 150 100 50 0 (a) 220 240 260 280 300 320 340 360 380 nm Norm. 350 300 250 200 150 100 50 0 "MCPA ACIDE 2,*D

DAD1,4.056(374mAU.Apx) Ref=5.501 of0810-021.D

«-3

(b)

1

t

2

220 240 260 280 300 320 340 360 380 nm

Figure10 : (a) : Testdepuretédupic(tr=4,06min)dela figure9:(b):comparaisonentrespectrehybrideausommet

Discussion

Enraison du caractère acide faibledes herbicides phé¬

noxyacides, les procédures classiques d'extraction en milieu alcalin, mises en Auvre dans les méthodes de screening toxicologique, ne sont pas complètement adaptéesàladétectiondeces substances,surtoutencas

Figure11 :Séparationchromatographiqueà

pH

3 (labora¬ toire

Ll)

de

l'

échantillonréelP8:2,4-D

(tr

= 8,51 min)et

MCPA

(tr

=8,56 min). (El=MCPB,

tr

= 11,75 min).

d'intoxication

mineure.

Il

estdoncnécessaire de dispo¬

serd'une méthode de dosage spécifiquepour ces her¬

bicides même si lesintoxications sévères, caractérisées pardes concentrations plasmatiques de quelques cen¬

taines de mg/L, sont généralement mises en évidence parces conditions descreeningtoxicologique.

Parmi les 7 molécules présentes dans l'essai, deux

n'ont

pas été correctement identifiées dans un premier

temps par deux laboratoires, car ces substances n'étaientpas référencées dans leur méthode : dans un

cas, le

triclopyr

a étéconfondu avec leMCPA malgré

un spectre

UV

a

priori

différentet dansl'autre cas, les transitions SM/SM du fénoprop n'avaient pas été inclusesdans la tabled'acquisition.Après actualisation desméthodes,chacunapuprocéderaudosage.Pour un laboratoire,

l'identification

et le dosage du plasma P8 ontnécessitéunchangementdephasemobileenraison de lacoélution du 2,4-D etdu MCPA àpH6.

Les résultats des 8 essais ont montréune bonnehomo¬ généitépourles laboratoires ayantutiliséla simple pré¬

cipitation des protéines ou l'extraction liquide-liquide. Cependant le laboratoire ayantutilisél'extraction liqui¬ de-solideaprésentéplusieurs valeurs endehors de ± 20%.Cetteapprocheserait-elle moinsperformantepour

cesproduitsou uneaméliorationdelaprocédure est-elle envisageable ? Plusieurs questions peuvent être

soule-Tableau

III

:Résultats(mg/L)parlaboratoire

(Ll

à16)et moyenne, écart-typeetcoefficientdevariation(m, s, CV%)desplas¬ massurchargés(PI àP4).

PI P2 P3 P4 Triclopyr(150mg/L) 2,4-D(250mg/L) DCP(150mg/L) 2,4,5-T(75mg/L) 2,4,5-TP (250mg/L) MCPA(250mg/L) MCPP (150mg/L) Ll 155 255 156 75 265 250 150 L2 154 228 152 82 292 217 123 L3 103* 154* 110* 89 173* 340* 269* L4 126 207 158 60 155* 176* 120 L5 121 188* 119 60 276 200 137 L6 139 256 143 67 279 247 138 m 133 215 140 72 240 238 156 s 20 40 20 12 60 57 56 " CV% 15 19 15 17 25 24 36

Valeurscibles entre parenthèses.*:écartsupérieurà20%.

Tableau

IV

: Résultats(mg/L)parlaboratoire

(Ll

àL6)et moyenne, écart-typeetcoefficientdevariation (m, s, CV%) descas

réels(P5àP8). P5 P6° P7 P8 Triclopyr(250mg/L) 2,4-D MCPP 2,4-D(155 mg/L) 2,4,5-T(92mg/L) 2,4-D (370mg/L) MCPA(340mg/L) Ll 260 202 760 170 95 375 400 L2 231 177 670 160 104 330 321 L3 255 133* 553 101* 61* 461* 442* L4 160* 196 680 173 96 328 306 L5 228 141 611 135 82 276* 300 L6 216 202 695 168 97 359 349 m 225 175 662 151 89 355 353 s 36 31 72 28 16 62 57 CV% 16 18 11 19 17 17 16

Valeursinitialesentre parenthèses.°poolde3plasmas.*:écartsupérieurà20%.

Discussion

Enraison du caractère acide faibledes herbicides phé¬

noxyacides, les procédures classiques d'extraction en milieu alcalin, mises en Auvre dans les méthodes de screening toxicologique, ne sont pas complètement adaptéesàladétectiondeces substances,surtoutencas

Figure11 :Séparationchromatographiqueà

pH

3 (labora¬ toire

Ll)

de

l'

échantillonréelP8:2,4-D

(tr

= 8,51 min)et

MCPA

(tr

=8,56 min). (El=MCPB,

tr

= 11,75 min).

d'intoxication

mineure.

Il

estdoncnécessaire de dispo¬

serd'une méthode de dosage spécifiquepour ces her¬

bicides même si lesintoxications sévères, caractérisées pardes concentrations plasmatiques de quelques cen¬

taines de mg/L, sont généralement mises en évidence parces conditions descreeningtoxicologique.

Parmi les 7 molécules présentes dans l'essai, deux

n'ont

pas été correctement identifiées dans un premier

temps par deux laboratoires, car ces substances n'étaientpas référencées dans leur méthode : dans un

cas, le

triclopyr

a étéconfondu avec leMCPA malgré

un spectre

UV

a

priori

différentet dansl'autre cas, les transitions SM/SM du fénoprop n'avaient pas été inclusesdans la tabled'acquisition.Après actualisation desméthodes,chacunapuprocéderaudosage.Pour un laboratoire,

l'identification

et le dosage du plasma P8 ontnécessitéunchangementdephasemobileenraison de lacoélution du 2,4-D etdu MCPA àpH6.

Les résultats des 8 essais ont montréune bonnehomo¬ généitépourles laboratoires ayantutiliséla simple pré¬

cipitation des protéines ou l'extraction liquide-liquide. Cependant le laboratoire ayantutilisél'extraction liqui¬ de-solideaprésentéplusieurs valeurs endehors de ± 20%.Cetteapprocheserait-elle moinsperformantepour

cesproduitsou uneaméliorationdelaprocédure est-elle envisageable ? Plusieurs questions peuvent être

soule-Tableau

III

:Résultats(mg/L)parlaboratoire

(Ll

à16)et moyenne, écart-typeetcoefficientdevariation(m, s, CV%)desplas¬ massurchargés(PI àP4).

PI P2 P3 P4 Triclopyr(150mg/L) 2,4-D(250mg/L) DCP(150mg/L) 2,4,5-T(75mg/L) 2,4,5-TP (250mg/L) MCPA(250mg/L) MCPP (150mg/L) Ll 155 255 156 75 265 250 150 L2 154 228 152 82 292 217 123 L3 103* 154* 110* 89 173* 340* 269* L4 126 207 158 60 155* 176* 120 L5 121 188* 119 60 276 200 137 L6 139 256 143 67 279 247 138 m 133 215 140 72 240 238 156 s 20 40 20 12 60 57 56 " CV% 15 19 15 17 25 24 36

Valeurscibles entre parenthèses.*:écartsupérieurà20%.

Tableau

IV

: Résultats(mg/L)parlaboratoire

(Ll

àL6)et moyenne, écart-typeetcoefficientdevariation (m, s, CV%) descas

réels(P5àP8). P5 P6° P7 P8 Triclopyr(250mg/L) 2,4-D MCPP 2,4-D(155 mg/L) 2,4,5-T(92mg/L) 2,4-D (370mg/L) MCPA(340mg/L) Ll 260 202 760 170 95 375 400 L2 231 177 670 160 104 330 321 L3 255 133* 553 101* 61* 461* 442* L4 160* 196 680 173 96 328 306 L5 228 141 611 135 82 276* 300 L6 216 202 695 168 97 359 349 m 225 175 662 151 89 355 353 s 36 31 72 28 16 62 57 CV% 16 18 11 19 17 17 16

Annales deToxicologie Analytique, vol.

XVIII,

n° 2,2006

vées : une estérification de ces produits sur la colonne

lors del'étapedelavageau methanol est-elle possible ?

Le pourcentaged'acideformique(2%)danslemethanol est-il suffisantpour éluerdela même façontous lespro¬

duits ? Cependant celaboratoire ayantutilisé le MCPB comme étalon interne etpar ailleurs les gammes d'éta¬ lonnage' ayant étéfaites dans les mêmes conditions que les plasmas tests, ces différences restent difficiles à

expliquer. Un nouvel essai a été effectué par ce même laboratoire,5moisplus tard, sur les mêmeséchantillons, avec une colonne chromatographique neuve et des

gammes d'étalonnage obtenues à partir de nouvelles poudresstandards.Lesrésultatssontpluscohérents avec lesvaleurs attenduesmais 3 concentrations (1 surcharge et 2casréels) sontencoreendehors de± 20%. Laques¬

tionreste doncpourlemomentensuspens.

Deux laboratoires ont mentionnéla présence dans les

casréels de2 autres substances : le

fluroxypyr

(8et 14

mg/L) dans

l'échantillon

P5 etle clopyralid (63 mg/L)

dans

l'échantillon

P8. Le

fluroxypyr

est unemolécule

dérivée, comme le triclopyr, de l'acide pyridoxyacé¬

tique, le clopyralid étantdérivé de l'acide pyridoxy-2-carboxylique. Le cas n°5 (H, 56 ans) correspondait effectivement à une intoxication modérée par 5 à 6

verres de

GARLON©,

mélangede

triclopyr

etfluroxy¬ pyrà60et20

g/L

respectivement.Leprélèvementaété effectué environ à la 7e heure après l'ingestion. Une intoxication modérée par un mélange 2,4-D et MCPP (cas n° 6, H, 42 ans) a cependantmontré des concen¬ trations initiales (T2h)assez importantes etrespective¬ mentégales à 240 et870 mg/L. Mais

l'évolution

aété favorablesansdouteenraisondela priseenchargepré¬

coce de ce patient en milieu hospitalier spécialisé. Le

cas n° 7 (H, 36 ans) est une intoxication au 2,4-D et 2,4,5-Tavecunesymptomatologiemineureetuneprise encharge àla 3eheure. Le cas n°8 (H, 88 ans) est une

intoxication mortelle par 500 ml de

LONPAR©,

mélange de2,4-D, MCPAetclopyralidrespectivement

à 150, 175 et 35

g/L

(7). Les concentrations plasma¬ tiques, égales à 700

mg/L

pour le 2,4-D et 750

mg/L

pourleMCPAaumomentdel'admission(T4h), étaient respectivement de 370 et 340 mg/L au moment du décèsà la26e heure.

Enfin le laboratoire utilisant la spectrométrie de masse entandem a signalé laprésencede certains deces phé¬

noxyacidesàl'étatde«traces»(<2mg/L)tantdans les plasmas surchargés, correspondant àdes impuretés des

produits purs, que dans les cas réels pouvant peut-être s'expliquer soit par des impuretés des produits tech¬

niques ingérésparles patientsou paruneexposition de ceux-ci àcesproduits endehors d'uncontexte aigu.

tiondesprotéinesplasmatiques suivied'une

dilution

au

1/2 dansl'eau etd'unechromatographieavecdétection

UV

etidentificationspectrale estuneapproche simple, rapide, nécessitant peu d'échantillon plasmatique et largement suffisantepour

l'objectif

défini. Dans lescas

d'intoxication

légère, le recours à une approche par

extraction liquide/liquide, ou peut-être liquide/solide,

d'un

volume plus important de plasma devrait per¬

mettred'abaisserla

limite

dedétection. Cette approche devra être envisagéeencas d'expositionprofessionnel¬ le et la spectrométrie de masse en tandem sera le meilleur mode de détection pourmesurer des concen¬ trations faibles dans

l'urine

(de quelques pg/L à 0,5 mg/L) de personnes exposées à ces substances lors d'applications agricoles (8-11).

Références

Conclusion

Dans cette étude orientée sur le diagnostic analytique

des intoxicationsaiguës parherbicides phénoxyacides, plusieursméthodologies ontété évaluées. La

précipita-1. Fournier J. Identité chimique et activité biologique d'un produit. In :FournierJ., Chimiedespesticides. Lavoisier,

Paris, 1988 : 95-109.

2. Poisindex,Micromedex Healthcareseries, Chicago,2006,

Vol 127.

3. Flanagan

RI,

RuprahM. HPLCmeasurement of chloro-phenoxy herbicides,bromoxynil,andioxynil, in biological

specimens to aid diagnosis of acute poisoning. Clin.

Chem. 1989;35 : 1342-7.

4. VanDammeJC,GalouxM. Méthode d'analyse parchro¬

matographieliquidehauteperformancedesformulationsà

base de mélange d'acides phénoxycarboxyliques, de

dicamba, d'ioxynil et de bromoxynil. J. Chromatogr.

1980; 190: 401-10.

5. Prescott LF., ParkI, DarrienI. Treatmentofsevere2,4-D

and mécoprop intoxication with alkaline diuresis. Br. J.

Clin. Pharmacol. 1979 ;7 : 111-6.

6. Turcant A., Premel-Cabic A., Cailleux A., Allain P.

Toxicological screening ofdrugsby microborehigh-per¬

formance liquid chromatography with photodiode-array detection and UV spectral library searches. Clin. Chem.

1991 ;37 : 1210-5.

7. BlanchetIP., Turcant A., Harry P., Durand R., AllainP.

Intoxication mortelle par le LONPAR. Ann. Tox. Anal.

2000; 12(2) 169.

8. Kolmodin-Hedman B.,HôglundS., Âkerblom M. Studies on phenoxy acid herbicides. I. Field study. Occupational

exposure tophenoxy acidherbicidesin agriculture.Arch. Toxicol. 1983 ;54 :257-65.

9. Kolmodin-Hedman B., Hôglund S., Swensson k-., Âker¬

blom M. Studies onphenoxy acid herbicides. II Oral and

dermal uptake and elimination in urine of MCPA in

humans.Arch. Toxicol. 1983 ;54: 267-73.

lO.Shealy D., BoninM., Wooten I, Ashley D.,Needham L. Application ofan improved method for the analysis of

pesticides and their metabolites in the urine of farmer applicators and their families. Environnement International 1996 ; 22: 661-75.

ll.Maroni M., Colosio C, Ferioli A., Fait A. Biological monitoring ofpesticide exposure : areview. Toxicology

2000;143:1-118. Annales deToxicologie Analytique, vol.

XVIII,

n° 2,2006

vées : une estérification de ces produits sur la colonne

lors del'étapedelavageau methanol est-elle possible ?

Le pourcentaged'acideformique(2%)danslemethanol est-il suffisantpour éluerdela même façontous lespro¬

duits ? Cependant celaboratoire ayantutilisé le MCPB comme étalon interne etpar ailleurs les gammes d'éta¬ lonnage' ayant étéfaites dans les mêmes conditions que les plasmas tests, ces différences restent difficiles à

expliquer. Un nouvel essai a été effectué par ce même laboratoire,5moisplus tard, sur les mêmeséchantillons, avec une colonne chromatographique neuve et des

gammes d'étalonnage obtenues à partir de nouvelles poudresstandards.Lesrésultatssontpluscohérents avec lesvaleurs attenduesmais 3 concentrations (1 surcharge et 2casréels) sontencoreendehors de± 20%. Laques¬

tionreste doncpourlemomentensuspens.

Deux laboratoires ont mentionnéla présence dans les

casréels de2 autres substances : le

fluroxypyr

(8et 14

mg/L) dans

l'échantillon

P5 etle clopyralid (63 mg/L)

dans

l'échantillon

P8. Le

fluroxypyr

est unemolécule

dérivée, comme le triclopyr, de l'acide pyridoxyacé¬

tique, le clopyralid étantdérivé de l'acide pyridoxy-2-carboxylique. Le cas n°5 (H, 56 ans) correspondait effectivement à une intoxication modérée par 5 à 6

verres de

GARLON©,

mélangede

triclopyr

etfluroxy¬ pyrà60et20

g/L

respectivement.Leprélèvementaété effectué environ à la 7e heure après l'ingestion. Une intoxication modérée par un mélange 2,4-D et MCPP (cas n° 6, H, 42 ans) a cependantmontré des concen¬ trations initiales (T2h)assez importantes etrespective¬ mentégales à 240 et870 mg/L. Mais

l'évolution

aété favorablesansdouteenraisondela priseenchargepré¬

coce de ce patient en milieu hospitalier spécialisé. Le

cas n° 7 (H, 36 ans) est une intoxication au 2,4-D et 2,4,5-Tavecunesymptomatologiemineureetuneprise encharge àla 3eheure. Le cas n°8 (H, 88 ans) est une

intoxication mortelle par 500 ml de

LONPAR©,

mélange de2,4-D, MCPAetclopyralidrespectivement

à 150, 175 et 35

g/L

(7). Les concentrations plasma¬ tiques, égales à 700

mg/L

pour le 2,4-D et 750

mg/L

pourleMCPAaumomentdel'admission(T4h), étaient respectivement de 370 et 340 mg/L au moment du décèsà la26e heure.

Enfin le laboratoire utilisant la spectrométrie de masse entandem a signalé laprésencede certains deces phé¬

noxyacidesàl'étatde«traces»(<2mg/L)tantdans les plasmas surchargés, correspondant àdes impuretés des

produits purs, que dans les cas réels pouvant peut-être s'expliquer soit par des impuretés des produits tech¬

niques ingérésparles patientsou paruneexposition de ceux-ci àcesproduits endehors d'uncontexte aigu.

tiondesprotéinesplasmatiques suivied'une

dilution

au

1/2 dansl'eau etd'unechromatographieavecdétection

UV

etidentificationspectrale estuneapproche simple, rapide, nécessitant peu d'échantillon plasmatique et largement suffisantepour

l'objectif

défini. Dans lescas

d'intoxication

légère, le recours à une approche par

extraction liquide/liquide, ou peut-être liquide/solide,

d'un

volume plus important de plasma devrait per¬

mettred'abaisserla

limite

dedétection. Cette approche devra être envisagéeencas d'expositionprofessionnel¬ le et la spectrométrie de masse en tandem sera le meilleur mode de détection pourmesurer des concen¬ trations faibles dans

l'urine

(de quelques pg/L à 0,5 mg/L) de personnes exposées à ces substances lors d'applications agricoles (8-11).

Références

Conclusion

Dans cette étude orientée sur le diagnostic analytique

des intoxicationsaiguës parherbicides phénoxyacides, plusieursméthodologies ontété évaluées. La

précipita-1. Fournier J. Identité chimique et activité biologique d'un produit. In :FournierJ., Chimiedespesticides. Lavoisier,

Paris, 1988 : 95-109.

2. Poisindex,Micromedex Healthcareseries, Chicago,2006,

Vol 127.

3. Flanagan

RI,

RuprahM. HPLCmeasurement of chloro-phenoxy herbicides,bromoxynil,andioxynil, in biological

specimens to aid diagnosis of acute poisoning. Clin.

Chem. 1989;35 : 1342-7.

4. VanDammeJC,GalouxM. Méthode d'analyse parchro¬

matographieliquidehauteperformancedesformulationsà

base de mélange d'acides phénoxycarboxyliques, de

dicamba, d'ioxynil et de bromoxynil. J. Chromatogr.

1980; 190: 401-10.

5. Prescott LF., ParkI, DarrienI. Treatmentofsevere2,4-D

and mécoprop intoxication with alkaline diuresis. Br. J.

Clin. Pharmacol. 1979 ;7 : 111-6.

6. Turcant A., Premel-Cabic A., Cailleux A., Allain P.

Toxicological screening ofdrugsby microborehigh-per¬

formance liquid chromatography with photodiode-array detection and UV spectral library searches. Clin. Chem.

1991 ;37 : 1210-5.

7. BlanchetIP., Turcant A., Harry P., Durand R., AllainP.

Intoxication mortelle par le LONPAR. Ann. Tox. Anal.

2000; 12(2) 169.

8. Kolmodin-Hedman B.,HôglundS., Âkerblom M. Studies on phenoxy acid herbicides. I. Field study. Occupational

exposure tophenoxy acidherbicidesin agriculture.Arch. Toxicol. 1983 ;54 :257-65.

9. Kolmodin-Hedman B., Hôglund S., Swensson k-., Âker¬

blom M. Studies onphenoxy acid herbicides. II Oral and

dermal uptake and elimination in urine of MCPA in

humans.Arch. Toxicol. 1983 ;54: 267-73.

lO.Shealy D., BoninM., Wooten I, Ashley D.,Needham L. Application ofan improved method for the analysis of

pesticides and their metabolites in the urine of farmer applicators and their families. Environnement International 1996 ; 22: 661-75.

ll.Maroni M., Colosio C, Ferioli A., Fait A. Biological monitoring ofpesticide exposure : areview. Toxicology