Production d'échafaudages cellulaires épais pour applications de génie tissulaire via impression 3D d'encre fugitive

Production d'échafaudages cellulaires épais pour

applications de génie tissulaire via impression 3D

d'encre fugitive

Mémoire

Simon Collin

Maîtrise en génie mécanique - avec mémoire

Maître ès sciences (M. Sc.)

Production d’échafaudages cellulaires épais pour

applications en génie tissulaire via impression 3D

d’encre fugitive

Mémoire

Simon Collin

Sous la direction de :

Jean Ruel, directeur de recherche

André Bégin-Drolet, codirecteur de recherche

Résumé

Les travaux présentés dans ce mémoire s’inscrivent dans un projet visant à fabriquer des valves aortiques bioartificielles de remplacement pour des patients atteints de maladies cardiaques. La méthode globale étudiée consiste à produire un moule sacrificiel en sucre vitrifié produit par fabrication additive, prenant la forme d’une valve aortique et injecté avec un échafaudage cellulaire. En soumettant la valve moulée aux conditions physiologiques ressenties par une valve aortique réelle, il est espéré qu’une valve aortique fonctionnelle sera développée. Un des éléments importants dans ce procédé est l’échafaudage cellulaire. Puisque ce biomatériau contient des cellules vivantes, il doit être à l’abri de toutes sources de contamination. De plus, il doit permettre aux cellules de survivre et de sécréter de la matrice extracellulaire, dans le but d’éventuellement transformer l’échafaudage cellulaire en un tissu biologique fiable.

Ce mémoire présente une technique de fabrication d’échafaudages cellulaires qui tient compte des enjeux liés à l’utilisation de cellules vivantes. Il s’agit d’une preuve de concept visant à s’intégrer au projet de valves aortiques bioartificielles. Afin de tester la méthode, une expérience in vitro de fabrication et de culture dynamique fut menée. Celle-ci démontra que cette méthode de fabrication fut adaptée au contexte de travail en environnement stérile, que les cellules ensemencées dans les spécimens furent distribuées de manière homogène, et que les moules en sucre vitrifié fabriqués par impression 3D ne causèrent pas de mortalité cellulaire dans ce contexte. Toutefois, des dommages mineurs furent observés après plusieurs semaines de culture, et les taux de viabilité cellulaire furent plus bas qu’attendu à cause d’un défaut au niveau de la perfusion des spécimens. Ainsi, la technique développée est prometteuse pour le projet de fabrication de valves aortiques, mais des améliorations doivent être apportées au niveau de la perfusion et du maintien de l’intégrité physique des tissus.

Abstract

The work presented in this thesis is part of a project which aims at fabricating bioartificial aortic replacement valves for patients suffering from cardiac diseases. The global method studied to achieve this consists of fabricating sacrificial molds made of carbohydrate glass, produced by additive manufacturing, replicating the geometry of an aortic valve, and injected with a cellular scaffold. By exposing the molded valve to the physiological conditions a real aortic valve would experience, it is hoped that a functional aortic valve will be developed. One important aspect of this process is the cellular scaffold. Since this biomaterial contains live cells, it has to be isolated from all possible sources of contamination. Moreover, it has to favor cell survival, as well as extracellular matrix secretion, in order to eventually transform the scaffold into a reliable biological tissue.

This thesis presents a fabrication technique for cellular scaffold that takes into account all the challenges linked to the use of live cells. It is a proof of concept with the aim of being included to the artificial aortic valve project. To validate this process and its aspects, an in vitro experiment of fabrication and dynamic culture was conducted. The results of this experiment showed that this method is adapted to the sterile work environment context, and that the cells seeded in the specimens were distributed homogeneously. This experience also demonstrated that the carbohydrate molds fabricated by additive manufacturing did not cause cell mortality in this context. However, minor damage was observed after several weeks of dynamic culture, and the cell viability rates were lower than expected because of suboptimal perfusion rates. This fabrication technique for cellular scaffolds is promising for the artificial aortic valves project, but improvements in terms of perfusion and preservation of physical integrity should be made.

Table des matières

Résumé ... iii

Abstract ... iv

Table des matières ... v

Liste des tableaux ... viii

Liste des figures ... ix

Remerciements ... xii

Avant-propos ... xiii

Introduction ... 1

Objectifs de l’étude et méthodologie ... 6

Structure du mémoire ... 8

Chapitre 1 Revue de littérature ... 10

1.1 Polymères synthétiques biodégradables ensemencés de cellules autologues ... 11

1.2 Fibrine ... 13

1.3 Méthode d’auto-assemblage ... 15

1.4 Décellularisation ... 17

1.5 Bioimpression 3D ... 19

1.6 Moulage ... 22

1.7 L’alginate et le génie tissulaire ... 23

1.8 Impression tridimensionnelle de sucre vitrifié ... 24

Chapitre 2 Introduction à la culture cellulaire ... 26

2.1 Décongélation des cellules ... 26

2.2 Ensemencement ... 27 2.3 Changement de milieu ... 28 2.4 Trypsination ... 28 2.5 Décompte cellulaire ... 29 2.5.1 Compteur Coulter ... 30 2.5.2 Hématimètre ... 30 2.6 Congélation ... 32

2.7 Biopsies pour analyses terminales ... 32

2.7.1 Viabilité cellulaire ... 33

2.7.2 Histologie ... 34

2.7.3 Immunofluorescence ... 35

Chapitre 3 Impression tridimensionnelle de sucre vitrifié ... 36

3.3 Discussion ... 41

3.4 Conclusion ... 43

Chapitre 4 Conception d’un bioréacteur adapté pour la culture d’échafaudages cellulaires ... 44

Résumé ... 44

Design of a Custom Bioreactor for the Dynamic Culture of Perfused Cell-Laden Alginate Scaffolds Obtained by 3D Printing ... 45 Abstract ... 45 Introduction ... 45 Bioreactor Description ... 46 Culture chambers ... 46 Bioreactor ... 48 Experimental Validation ... 50 Flow experiment ... 50 In vitro experiment ... 51 Discussion ... 52 Conclusion ... 53

Chapitre 5 Fabrication d’échafaudages cellulaires en alginate via l’utilisation de moules en sucre vitrifié produits par impression 3D ... 54

Résumé ... 54

An innovative technique for the fabrication of cell-laden alginate scaffolds using 3D-printed carbohydrate glass molds ... 55

Abstract ... 55

Introduction ... 55

Materials and methods ... 57

Carbohydrate glass molds fabrication ... 57

Cell culture and alginate scaffolds fabrication ... 57

Culture conditions ... 58

Biopsies for terminal analyses ... 59

Results and discussion ... 59

Cell-laden scaffolds fabrication and culture ... 59

Biopsies for terminal analyses ... 61

Conclusion ... 65

Acknowledgements ... 66

Funding ... 66

Conclusion ... 67

Retour sur les objectifs initiaux et les résultats obtenus ... 67

Perspectives pour la suite du projet ... 70

Liste des tableaux

Tableau 1 : Tolérances et dimensions nominales pour certaines caractéristiques des moules avec treillis internes imprimés en 3D avec l’imprimante de sucre vitrifié. ... 39 Tableau 2 : Contribution des auteurs. ... 44 Tableau 3 : Contribution des auteurs. ... 54

Liste des figures

Figure 1 : Représentation schématique de la valve aortique ouverte (colonne de gauche) et fermée (colonne de droite). a) Valve aortique saine. b) Valve aortique bicuspide pour laquelle les feuillets du haut sont

fusionnés. ... 2

Figure 2 : Valves mécaniques commerciales. a) Valve de Starr-Edwards [4]. b) Valve de Björk-Shiley [5]. c) Valve cardiaque de Saint Jude [6]. ... 3

Figure 3 : Représentation schématique de la procédure de Ross. D’abord, la valve aortique (Ao) est retirée et les artères coronaires sont détachées de l’aorte. Ensuite, la valve pulmonaire (PA) est retirée des artères pulmonaires pour être rattachée à la place de la valve aortique, et une homogreffe remplace la valve pulmonaire. Finalement, les artères coronaires sont rattachées à la valve pulmonaire qui, dorénavant, joue le rôle de la valve aortique. Adapté de [8]. ... 4

Figure 4 : Quelques exemples de prothèses valvulaires biologiques. a) Prothèse valvulaire biologique fabriquée à partir de tissus animaux et implantée par thoracotomie [9]. b) Bioprothèse Edwards Sapien [9]. c) Bioprothèse CoreValve Medtronics [10]. ... 6

Figure 5 : Représentation schématique de la méthode de fabrication des échafaudages cellulaire. Les cellules sont d’abord cultivées et les moules sont fabriqués en simultané, par impression tridimensionnelle. Ensuite, l’alginate liquide est mélangé aux cellules et le tout est injecté dans les moules. L’alginate se gélifie dans les moules, qui sont dissouts une fois la gélation complétée, révélant ainsi les échafaudages cellulaires pouvant être perfusés. ... 8

Figure 6 : Valve aortique artificielle développée par Hoerstrup et al., après 14 jours de culture en bioréacteur, tiré de [11]. ... 11

Figure 7 : Valve aortique artificielle fabriquée par moulage de fibrine ensemencée de cellules dérivées d’artères carotides bovines, adapté de [20]. ... 14

Figure 8 : Représentation schématique d’une valve tubulaire fixée à une aorte, adaptée de [33]. ... 16

Figure 9 : Valve AutoTissue Matrix P®, adapté de [49]. ... 19

Figure 10 : Valve aortique fabriquée par bioimpression 3D, développée par Duan et al., adapté de [82]. ... 21

Figure 11 : Exemple de construction fabriquée par l’imprimante de sucre de Dussault, adapté de [105]. ... 25

Figure 12 : Quadrillé présent sur un hématimètre pour le décompte cellulaire. Afin de normaliser les décomptes, uniquement les cellules situées dans les groupes de carrés aux quatre coins et dans le groupe de carrés central sont comptées. ... 31

Figure 13 : a) Imprimante Airwolf3D XL commerciale. b) Imprimante Airwolf3D XL avec tête d’extrusion personnalisée pour l’impression de sucre vitrifié [104, 105]. ... 37

Figure 14 : Représentations 3D générées par ordinateur du moule avec treillis interne à imprimer en sucre vitrifié. a) Modèle simulé par le logiciel de contrôle Repetier Host à partir du code G. b-d) Modèle tridimensionnel généré par ordinateur à l’aide du logiciel Creo. b) Vue isométrique. c) Coupe longitudinale du moule. d) Coupe transversale du moule. ... 38

Figure 15 : a) Photo d’un moule avec treillis imprimé en sucre vitrifié. b) Vue en coupe longitudinale d’un moule imprimé en sucre imagé par TACO, provenant du logiciel MicroView. c-d) Reconstructions tridimensionnelles provenant des balayages par TACO, assemblées à l’aide du logiciel MeshLab. c) Vue de dessus, avec la cote de longueur interne (19.5mm) et la cote de largeur interne (9.7mm). d) Vue de face, avec la cote de hauteur (9.9mm). (Balayages par TACO : Theophraste Lescot, laboratoire MA Fortin)... 40

Figure 16 : Résultats de l’analyse comparative entre la reconstruction digitale du moule imagé par TACO et le CAD d’origine, provenant du logiciel MeshLab. a) Graphique de l’erreur, i.e. la distance mesurée entre le CAD original et la reconstruction digitale, en fonction de la fréquence de récurrence. b-c) Reconstruction digitale du balayage par TACO colorée en fonction de l’erreur entre le CAD et celui-ci. Tel qu’indiqué par le graphique de la Figure 16a, les couleurs froides représentent des distances négatives et les couleurs chaudes représentent des distances positives. b) Vue isométrique. c) Vue partielle avec deux plans de coupes. ... 41 Figure 17: a) Schematic representation of the culture chamber. Media enters through sub-chamber X and is partially blocked by the cell-seeded scaffold placed in the red section, which builds up pressure and facilitate

culture chamber. The grey circle is where the O-ring was placed, and stainless screws placed outside the seal are used to fasten the top component of the culture chamber to the bottom. b) Close-up view of a culture chamber. Media enters through the right connector into the entry zone, goes through the tissue, penetrates in the exit zone, and goes out of the culture chamber through the left connector. c) Left: 3D-printed carbohydrate sugar sacrificial mold. Right: Molded free alginate scaffold with the dimensions and geometry of the cell-seeded scaffolds cultured in vitro. ... 48 Figure 18: Schematic representation of the bioreactor with four culture chambers. The black part of the three-way valves is blocked. Loop with culture chamber A: Three-three-way valves are positioned for dynamic culture of the tissue in chamber A. Loop with culture chamber B: Three-way valves are positioned for early filling of culture chamber B. Only air should exit the culture chamber at this stage through the filter in the bypass. As soon as some media starts flowing out of the culture chamber, the three-way valves must be positioned as in A or C. Loop with culture chamber C: This setup is equivalent to Loop A. Loop with culture chamber D: Three-way valves are positioned to empty culture chamber D. ... 49 Figure 19: One of the two four-culture chambers bioreactors placed in a conventional incubator. Cell-seeded alginate scaffolds were cultured for three to eight weeks at 37°C, 8% CO2 in this particular bioreactor. Media was changed every two or three days (80 mL out of 110 mL). ... 50 Figure 20: Flow experiment. A cell-free alginate scaffold was placed in a culture chamber that was linked to a peristaltic pump producing a green-dyed PBS flow through the culture chamber at a rate of 1.5mL/min. The green-colored micro-channels in the scaffolds (black arrows) show that the fluid is able to easily flow through the transversal channels. However, it seems harder for the fluid to flow through the longitudinal channels (red arrows), because the green color is less perceptible than through the transversal micro-channels. Scale bar: 5 mm. ... 51 Figure 21: Live/dead staining results of a 10 million cells-seeded alginate scaffolds cultured for six weeks in a bioreactor. A sample with a thickness of 2 mm was stained and scanned over a depth of 800 μm. Live cells are green and dead cells are red. The white dashed line at the top left represents the approximate location of a longitudinal micro-channel. Scale bar: 80 μm. ... 52 Figure 22: Representation of the carbohydrate molds and cast alginate. A) Computer-aided design (CAD) of a carbohydrate mold. B) Open-view of a CAD of a carbohydrate mold. C) CAD of a cast alginate, with perfusion channels shown in contrast. CADs were produced using Creo 4.0 (PTC Creo). ... 58 Figure 23: A carbohydrate glass mold and an alginate specimen at different moments during the fabrication and culture stages. A) A carbohydrate glass mold directly after 3D printing. B) A mold injected with the liquid alginate mixture, before the dissolution step. C) An alginate specimen immediately after dissolution of its carbohydrate mold. D) An alginate construct removed from the culture chamber after six weeks of dynamic culture in a bioreactor. E) An alginate specimen freshly inserted into its culture chamber, before complete assembly of the bioreactor. F) Enclosed culture chamber plugged to the bioreactor, and inside which an alginate specimen is cultured. G) The alginate construct in its culture chamber after eight weeks of dynamic culture, before terminal biopsies. ... 61 Figure 24: Histological assessment of the alginate specimens. Representative regions of the constructs after H&E staining are presented, from week 0 to week 8, for both densities of cell seeding. Results at week 0: alginate constructs cultured under static conditions for 20 hours. Results from week 3 to 8: alginate constructs cultured under dynamic conditions. Cell nuclei are stained in dark blue, whereas proteins are stained in pink.63 Figure 25: Cell density and viability analysis. Data at week 0: alginate constructs cultured under static conditions for 20 hours. Data from week 3 to 8: alginate constructs cultured under dynamic conditions. A) Example of stacked confocal scan layers of a specimen from group A, at week 3. B) Example of stacked confocal scan layers of a specimen from group B, at week 3. A-B) Height X width X depth of confocal imaging: 639 μm x 639 μm x 602 μm. C) Evolution of total cell count from week 3 to week 8. D) Evolution of live cell density from week 3 to week 8. E) Evolution of cell viability from week 0 to week 8. ... 64

Remerciements

Je souhaite d’abord remercier mon directeur de recherche, Jean Ruel, et mon codirecteur de recherche, André Bégin-Drolet. Par leur rigueur, ils m’ont poussé à relever mes standards. Par leur ingéniosité, ils ont fait croître ma créativité. Par leurs conseils, ils m’ont permis d’accomplir bien des choses qui m’apparaissaient hors d’atteinte. Jean, ta franchise et ton honnêteté ont toujours été très appréciés. Si Pr. Ruel n’est pas d’accord, on le sait tout de suite et il n’y a pas de perte de temps ! Cela a renforci mon caractère et a fait de moi un étudiant persévérant. André, ta capacité à tout remettre en question m’a appris à ne rien tenir pour acquis. Ta coutume de faire les choses une étape à la fois a développé ma patience. Grâce à vous, j’ai acquis non seulement des connaissances en ingénierie, mais j’ai également beaucoup grandi en tant que personne et je vous en serai toujours reconnaissant.

Je souhaite également remercier tous mes collègues au laboratoire de recherche sur les procédés d’impression 3D, présents et passés. D’abord, merci à Marc-André Dussault de m’avoir formé pour l’utilisation des imprimantes de sucre. Merci à Gabrielle Gauvin-Rossignol pour tes conseils sur l’alginate. Merci à Jean-François Provost-Blais et Jade Clouâtre pour votre aide avec la production d’impressions de sucre. Puis, merci à Marc-André Plourde-Campagna, Olivier Fortin-Moreau, Alexandre Winter, Alexandre Paré, Maxime Joly, Patrice Roberge et Charles Lavoie-St-Cyr pour toutes nos discussions, pour les parties de Spike Ball et le tournoi de golf !

Je souhaite poursuivre en remerciant Julie Fradette et Cindy Jean Hayward du Centre multidisciplinaire en développement du génie tissulaire (LOEX). Cindy, ton aide pour les mille expériences, essais, tests et biopsies que nous avons menées est infiniment appréciée. Jamais je n’aurais pu produire tous ces résultats si ce n’avait pas été de tes conseils, de ton aide, de tes explications et de tes précieux services. Je tiens aussi à remercier Julie Fradette, une chercheuse incroyable qui m’a appris de nombreuses notions par rapport aux cellules et qui, par sa rigueur et son professionnalisme, m’a poussé à être ordonné et à ne rien négliger. Ce fut un honneur de faire partie de ton équipe et je suis hautement reconnaissant d’avoir eu accès aux équipements du LOEX, grâce à ta collaboration.

Je souhaite remercier Philippe Legros, Théophraste Lescot et Marc-André Fortin qui ont participé à la caractérisation des moules sacrificiels en sucre vitrifié en procédant à l’imagerie de ces derniers.

Finalement, je souhaite remercier ma famille, ma copine et mes amis pour leur support continu à travers cette aventure. Vous êtes les meilleurs !

Avant-propos

Ce projet a été mené en collaboration avec l’équipe de Julie Fradette, chercheuse au Centre multidisciplinaire en développement du génie tissulaire (LOEX). Toutes les expériences in vitro et les biopsies ont été effectuées dans cet établissement, avec l’aide de cette équipe et des professionnels de recherche du LOEX. Les travaux de fabrication mécanique pour le bioréacteur ont été effectués à l’atelier de fabrication mécanique du département de génie mécanique de l’Université Laval. Les impressions 3D de moules en sucre vitrifié ont été effectuées au Laboratoire de recherche sur les procédés d’impression 3D de l’Université Laval. La caractérisation des moules en sucre vitrifié a été effectuée au Laboratoire de Biomatériaux pour l’Imagerie Médicale (BIM) du professeur Marc-André Fortin de l’Université Laval.

Ce projet a mené à la rédaction de deux articles scientifiques et a été présenté dans plusieurs événements. D’abord, le projet a été présenté dans le cadre d’une présentation par affiche et d’une courte présentation devant public dans le cadre de l’Assemblée Générale Annuelle du réseau ThéCell 2018. Ensuite, il a été présenté devant public dans le cadre du congrès « Joint CSME-CSCFD Congress 2019 » à London en Ontario, ce qui a également mené à la rédaction d’un article scientifique. Finalement, les résultats finaux du projet ont été présentés dans un article scientifique soumis au journal « Additive manufacturing ». Au moment de déposer ce mémoire, l’article est encore en travail, car des expériences supplémentaires furent demandées par les évaluateurs du journal. Ci-dessous se trouvent les différentes citations.

S. Collin, A. Bégin-Drolet, C. J. Hayward, J. Fradette, J. Ruel. (Présentation) Production de tissus biologiques épais pour applications en génie tissulaire via impression 3D. 10e _{Assemblée Générale Annuelle du réseau} ThéCell - Session ThéCell en Bref, 21 novembre 2018, CRCHUM, Montréal, Canada

S. Collin, A. Bégin-Drolet, C. J. Hayward, J. Fradette, J. Ruel. (Présentation) Production de tissus biologiques épais pour applications en génie tissulaire via impression 3D. 10e _{Assemblée Générale Annuelle du réseau} ThéCell – Présentation par affiche, 21 novembre 2018, CRCHUM, Montréal, Canada

S. Collin, A. Bégin-Drolet, C. J. Hayward, J. Fradette, J. Ruel. (Présentation) Design of a Custom Bioreactor for the Dynamic Culture of Perfused Cell-Laden Alginate Scaffolds Obtained by 3D Printing. Joint Congress of the Canadian Society for Mechanical Engineering and CFD Society of Canada, 3-5 juin 2019, Western University, London, Canada

S. Collin, A. Bégin-Drolet, J. Fradette, C. J. Hayward, J. Ruel. Design of a Custom Bioreactor for the Dynamic Culture of Perfused Cell-Laden Alginate Scaffolds Obtained by 3D Printing. Joint Conference of the Canadian Society for Mechanical Engineering and CFD Society of Canada, London, Ontario, Canada, June 2nd-5th 2019. 265-268. Article de conference

S. Collin, A. Bégin-Drolet, J. Fradette, C. J. Hayward, J. Ruel. An innovative technique for the fabrication of cell-laden alginate scaffolds using 3D-printed carbohydrate glass molds. Additive Manufacturing (Article soumis le 10/04/20)

Introduction

La médecine d’aujourd’hui est en mesure de faire des merveilles et de sauver la vie de millions de gens sur la planète. La vaccination permet de prévenir des maladies qui faisaient des ravages dans le passé, comme la rougeole, et les antibiotiques permettent de guérir bien des infections qui, autrefois, étaient parmi les premières causes de mortalité au monde, comme la pneumonie. De plus, grâce aux techniques développées par les pionniers de la chirurgie moderne, comme le cathétérisme et la thoracotomie, les médecins d’aujourd’hui font des petits miracles tous les jours. Toutefois, cela n’empêche qu’un certain type de maladie, qui autrefois se plaçait dans les rangs inférieurs des causes de mortalité, soit une source de défis majeurs pour les systèmes de santé : les maladies cardiovasculaires. Celles-ci englobent toutes les affections qui touchent les vaisseaux sanguins et le cœur. Cela inclut les angines, l’infarctus du myocarde, les accidents vasculaires cérébraux (AVC), la sténose aortique, … En 2016, ce type de maladie était la cause de 31.4% des décès mondiaux selon l’Organisation mondiale de la santé (OMS) [1], et d’ici 2035, il est estimé que 130 millions d’adultes aux États-Unis, soit 45.1% de leur population, souffriront d’une maladie cardiovasculaire [2]. La valve aortique est un des composants principaux du cœur, responsable de la régulation de la totalité du flux sanguin à travers le système cardiovasculaire. Lors de la diastole, les ventricules droit et gauche du cœur se remplissent de sang, les valves mitrale et tricuspide sont ouvertes, et les valves pulmonaire et aortique sont fermées. Lors de la systole, le sang quitte les ventricules droit et gauche, les valves mitrale et tricuspide sont fermées, et les valves pulmonaire et aortique sont ouvertes. La valve pulmonaire gère le sang non oxygéné se dirigeant vers le système pulmonaire pour oxygénation, alors que la valve aortique gère le sang oxygéné se dirigeant vers le reste du système cardiovasculaire. Cela signifie que l’énergie insufflée au sang passant par la valve aortique doit être suffisamment élevée pour que l’irrigation du système soit complète. Ainsi, à chaque cycle cardiaque, la valve aortique est soumise à des contraintes mécaniques parmi les plus intenses du système cardiovasculaire. Ce n’est donc pas une surprise lorsqu’on apprend que les maladies de la valve aortique sont très sérieuses et qu’un patient atteint de l’une d’entre elles doit être suivi de près par un médecin tout au long de sa vie. Deux maladies très répandues sont la sténose aortique et la régurgitation aortique. La sténose aortique est une maladie qui se caractérise par une valve aortique qui n’est pas en mesure de s’ouvrir ou de se fermer correctement. Les symptômes incluent généralement l’obstruction du sang par la valve aortique lors de la systole, faisant en sorte que le ventricule gauche du cœur pompe plus fort pour faire passer le sang à travers l’obstruction et que la pression dans celui-ci est trop élevée. La régurgitation aortique est un reflux du sang à travers la valve aortique, causant possiblement de l’insuffisance cardiaque. Les causes exactes de ces deux maladies sont multiples et difficiles à prévoir. Une des causes observées est une

malformation congénitale de la valve aortique. Dans un tel cas, deux des trois feuillets de la valve aortique fusionnent, formant ainsi une valve bicuspide, tel qu’illustré à la Figure 1. Selon une étude menée entre 1994 et 2009, environ 1.37% des Norvégiens seraient nés avec une valve bicuspide [3]. Bien que cela ne cause pas toujours de complications, une personne vivant avec une telle valve doit nécessairement consulter un médecin sur une base régulière. D’autres causes sont plutôt liées au vieillissement du patient, comme la calcification et la scarification de la valve aortique. Cela se caractérise par des dommages visibles sur la valve et une restriction de la quantité de sang circulant à travers celle-ci.

Figure 1 : Représentation schématique de la valve aortique ouverte (colonne de gauche) et fermée (colonne de droite). a) Valve aortique saine. b) Valve aortique bicuspide pour laquelle les feuillets du haut sont fusionnés.

Il existe plusieurs options thérapeutiques et interventionnelles pour un patient souffrant de complications liées à une valve aortique défectueuse, dépendamment de la gravité de celles-ci, de l’âge du patient et des ressources disponibles. Par exemple, un patient souffrant d’une défection mineure de la valve aortique avec peu de symptômes et qui ne peut pas subir d’opérations peut recourir à des médicaments. Cela représente une solution facile, mais qui ne sert qu’à alléger les symptômes. La valve aortique reste donc défectueuse et il y a une possibilité réelle de futures complications. Une autre option passe par la réparation de la valve aortique. Souvent préférée à la troisième option qui est plus risquée, soit le remplacement de la valve, celle-ci permet de conserver le tissu d’origine, ce qui évite beaucoup de problèmes liés aux rejets du système immunitaire. Par exemple, une intervention couramment effectuée est la valvuloplastie par ballonnet. Cela consiste à insérer un cathéter contenant un ballonnet dans l’aorte, puis à gonfler le ballonnet pour forcer l’ouverture de l’aorte et ainsi étirer les feuillets obstrués. Il s’agit d’une opération qui demande beaucoup de minutie au niveau du choix de la grosseur du ballonnet, car une pression imposée étant trop élevée au niveau de la valve aortique peut mener à de graves complications, comme une perméabilité indésirable de la valve aortique suite à un surétirement des feuillets, nécessitant le remplacement complet de la valve aortique. Certains patients souffrant d’une défectuosité grave de la valve aortique ou de complications insurmontables n’ont aucun autre choix que de procéder au remplacement complet de la valve aortique. Bien qu’il s’agisse

en plus de remplacements sont effectués avec succès grâce aux nouvelles technologies développées dans les dernières années. Plusieurs types de valves de remplacement sont disponibles : les valves mécaniques, les valves transplantées et les valves biologiques. Les valves mécaniques consistent en des assemblages de métaux et de polymères jouant le rôle de la valve aortique, mais avec une forme différente de celle-ci et d’origine non biologique. Il s’agit de valves idéales pour les jeunes adultes, étant donné leur longue durée de vie, mais qui imposent une prise constante d’anticoagulants afin d’éviter les risques d’obstruction dans la valve. La Figure 2 présente trois types de valves mécaniques. Sur la Figure 2a, on peut observer un des premiers modèles de la valve de Starr-Edwards. Créée par Albert Starr et Lowell Edwards, un cardiologue et un ingénieur en hydraulique respectivement, il s’agit d’une armature métallique en stellite dans laquelle se situe une bille de silicone [4]. Bien qu’elle soit encore commercialisée aujourd’hui, elle sert uniquement à remplacer des valves mitrales. Sur la Figure 2b, on peut observer la valve de Björk-Shiley. Conçue par l’ingénieur Donald Pearce Shiley et le chirurgien cardiaque Viking Olov Björk, il s’agit d’un disque en alliage cobalt-chrome recouvert de téflon, dans lequel se situe une ailette en carbone pyrolytique oscillant entre deux crochets. Bien que plusieurs centaines de milliers de valves de ce type aient été implantées dans les années 1970 et 1980, leur commercialisation fut interrompue en 1986 à cause de multiples cas de fracture de l’ailette [5]. La troisième valve mécanique présentée à la Figure 2c est la valve cardiaque de Saint Jude. Créée à l’université du Minnesota, Twin Cities, en 1972, et développée par la compagnie Saint Jude dans le Minnesota, aux États-Unis, elle est composée d’un anneau gainé de Dacron et de deux demi-disques en graphite, imprégnés de tungstène et recouverts de carbone pyrolytique. Cette valve peut aussi bien remplacer des valves mitrales que des valves aortiques [6]. La valve de Saint Jude est la plus populaire en ce qui a trait aux valves mécaniques.

a) b) c)

Figure 2 : Valves mécaniques commerciales. a) Valve de Starr-Edwards [4]. b) Valve de Björk-Shiley [5]. c) Valve cardiaque de Saint Jude [6].

Une autre option pour les patients souffrant de valves aortiques défectueuses est de se faire transplanter celle d’un donneur. Cette intervention est peu commune, à cause de la quantité limitée de valves aortiques disponibles dans les banques d’organes. De plus, une telle valve de remplacement a une durée de vie de 10 à 20 ans, habituellement [7]. C’est pourquoi une alternative a été développée. Il s’agit de la procédure de Ross. Celle-ci consiste à remplacer la valve aortique défectueuse du patient par sa propre valve pulmonaire, puis de

remplacer cette valve pulmonaire par celle d’un donneur, tel qu’illustré à la Figure 3. Comme la valve pulmonaire qui remplace la valve aortique provient du patient, le taux de succès de la procédure est élevé, c’est-à-dire que les chances de rejet sont très basses, qu’aucune médication à long terme n’est nécessaire, que la valve continue de grandir avec le patient et qu’elle conserve sa fonctionnalité à long terme. Comme la valve pulmonaire est un organe qui normalement subit des forces beaucoup moins grandes que la valve aortique, elle est plus facile à remplacer que la valve aortique et la demande pour un tel type de valve est moins grande dans les banques d’organes. Un donneur compatible est toutefois quand même nécessaire, alors cette procédure n’est pas encore la solution parfaite.

Figure 3 : Représentation schématique de la procédure de Ross. D’abord, la valve aortique (Ao) est retirée et les artères coronaires sont détachées de l’aorte. Ensuite, la valve pulmonaire (PA) est retirée des artères pulmonaires pour être rattachée à la place de la valve aortique, et une homogreffe remplace la valve pulmonaire. Finalement, les artères coronaires sont rattachées à la valve pulmonaire qui, dorénavant, joue le rôle de la valve aortique. Adapté de [8].

Pour contrer le manque de valves aortiques dans les banques d’organes, des techniques innovatrices pour fabriquer des valves de remplacement à partir de tissus biologiques ont été développées. L’une d’entre elles consiste à assembler des tissus animaux sur un gabarit pour construire une valve aortique biologique. En général, ces tissus proviennent du péricarde de veaux ou de valves aortiques de porc. Elles sont intéressantes pour le patient, car elles ne demandent pas l’utilisation d’anticoagulants, contrairement aux valves mécaniques. Toutefois, ces valves se dégradent avec le temps et ont une durée de vie de 10 à 20 ans

seulement [9]. Ainsi, pour un jeune patient, des chirurgies additionnelles et de nouvelles valves seront nécessaires, éventuellement. La Figure 4a présente une telle valve.

Au début des années 2000, une nouvelle procédure fut développée pour l’implantation de valves cardiaques. En effet, certains patients ne peuvent subir de thoracotomie pour des raisons de santé, ce qui rend le remplacement de leur valve aortique impossible selon les techniques de chirurgie conventionnelles. C’est pourquoi des valves sont dorénavant implantées par cathéter. Ces valves sont nommées TAVI pour « transcatheter aortic valve implant » ou TAVR pour « transcatheter aortic valvular replacement ». Elles sont insérées directement à l’intérieur de la valve aortique défectueuse, sans avoir besoin de la retirer au préalable, via cathéter, similairement à une endoprothèse vasculaire (stent). La valve est d’abord manipulée sous forme compacte, c’est-à-dire repliée sur elle-même, puis est dépliée en prenant expansion, poussant ainsi la vieille valve sur les parois de l’aorte et permettant au tissu à l’intérieur du TAVI de remplir le rôle de la valve défectueuse. Comme les valves mécaniques ne peuvent se replier sur elles-mêmes, seules des valves biologiques peuvent être insérées par cathéter. Les deux types de TAVI couramment observées sont la prothèse Edwards Sapien, une bioprothèse provenant de péricarde bovin directement posée sur un stent de cobalt-chrome recouvert de polyéthylène téréphtalate (PET) (Figure 4b), et la prothèse CoreValve Medtronic, une bioprothèse auto-expansible provenant de péricarde porcin suturé sur un cadre en nitinol (Figure 4c). Cette procédure est de plus en plus populaire, pour plusieurs raisons. D’abord, le temps de récupération du patient est très rapide, soit 3 à 5 jours. Ensuite, compte tenu de la nature animale des tissus utilisés, ce type de valve est facilement accessible, contrairement aux valves provenant de donneurs. Toutefois, la procédure n’est pas sans risque. Comme la technique est relativement jeune, on ignore encore les effets à long terme de l’implantation d’un TAVI. Il est possible que le contact à long terme entre le TAVI et les parois de l’aorte cause des réactions indésirables, et la viabilité à long terme de la valve est encore à démontrer. C’est pourquoi, pour le moment, l’implantation d’un TAVI est principalement recommandée pour les personnes âgées ou qui ne peuvent absolument pas subir de thoracotomie.

a) b) c)

Figure 4 : Quelques exemples de prothèses valvulaires biologiques. a) Prothèse valvulaire biologique fabriquée à partir de tissus animaux et implantée par thoracotomie [9]. b) Bioprothèse Edwards Sapien [9]. c) Bioprothèse CoreValve Medtronics [10].

Bien que les procédures chirurgicales soient de plus en plus raffinées, que les options de valves de remplacement soient de plus en plus intéressantes et que les chances de survie des gens souffrant de dysfonctionnement de la valve aortique soient de plus en plus élevées, il n’existe toujours pas de solution idéale. La valve idéale consiste en une réplique parfaite qui ne provoque pas de réactions inflammatoires ou immunitaires graves, qui ne nécessite pas la prise d’anticoagulants, qui se développe en même temps que le patient, qui ne se dégrade pas dans le temps, qui ne perturbe pas l’équilibre du système cardiovasculaire et qui n’entre jamais en rupture de stock.

Le génie tissulaire est un domaine émergent qui cherche, entre autres, à fabriquer des organes artificiels à partir de cellules provenant de tissus hôtes et qui regroupe entre autres des experts en biologie, en biochimie, en chimie, en médecine et en ingénierie. Le chapitre 1 de ce mémoire présente plus en détail les travaux modernes provenant du génie tissulaire pour la fabrication de valves aortiques.

Objectifs de l’étude et méthodologie

Ce mémoire s’insère dans un projet de recherche dans lequel le groupe du Pr. Ruel est impliqué depuis plus d’une décennie, soit la fabrication de valves aortiques biologiques de remplacement par ingénierie tissulaire. Plusieurs techniques prometteuses furent testées dans le passé et sont présentées au chapitre 1. À ce jour, le défi majeur du projet est encore au premier plan, c’est-à-dire de développer un échafaudage cellulaire qui est en mesure d’évoluer pour atteindre des propriétés mécaniques similaires à celles d’une valve aortique native en santé. Suite au développement d’une technologie de pointe pour la fabrication de moules sacrificiels, soit l’impression tridimensionnelle de sucre vitrifié, le groupe du Pr. Ruel a de nouveaux outils permettant l’exploitation d’une toute nouvelle avenue pour la fabrication des échafaudages cellulaires, soit le moulage. L’objectif premier des travaux présentés dans ce mémoire était de développer une technique de fabrication d’échafaudages à base d’alginate et ensemencés de cellules mésenchymateuses humaines à l’aide de

bioréacteur pouvant accueillir un ou plusieurs échafaudages cellulaires pour la culture dynamique de ceux-ci. Finalement, suite au développement de la technique de fabrication et du bioréacteur, l’objectif final était d’effectuer une expérience de culture in vitro en bioréacteur des échafaudages fabriqués et d’effectuer diverses biopsies sur ceux-ci.

Grâce à une précieuse collaboration avec l’équipe de Pr. Julie Fradette du Centre de recherche en organogénèse expérimentale de l’Université Laval (LOEX), ce projet a pu bénéficier de l’expertise de chercheurs et de professionnels de recherche en génie tissulaire comptant plusieurs années d’expérience et d’un pavillon de recherche contenant plusieurs laboratoires de culture cellulaire à la fine pointe de la technologie. De plus, une collaboration avec le groupe de recherche de Pr. Marc-André Fortin a permis de caractériser les moules fabriqués par impression tridimensionnelle.

Suivant les différents objectifs du projet, l’étude s’est déroulée en trois étapes. D’abord, la méthode de fabrication des échafaudages cellulaires a été élaborée en détail, en tenant compte de tous les aspects en jeu, comme la culture des cellules ensemencées, les caractéristiques des moules fabriqués et les composants chimiques et biologiques des échafaudages. La méthode est résumée schématiquement à la Figure 5. Ensuite, un bioréacteur a été conçu spécifiquement selon les dimensions et caractéristiques propres aux échafaudages moulés. Celui-ci a également dû être conçu en tenant compte des limitations imposées par la manipulation de cellules, soit l’importance de pouvoir assembler rapidement et aseptiquement le bioréacteur et la nécessité d’œuvrer en circuit fermé et de pouvoir changer le fluide en circulation de manière rapide et aseptique. De plus, tous les composants du bioréacteur devaient impérativement pouvoir être aseptisés. Une fois les deux premières étapes complétées, la phase ultime de l’étude fut lancée, soit une expérience in vitro complète faisant à la fois intervenir la méthode de fabrication des échafaudages et la culture dynamique de ceux-ci à l’aide des bioréacteurs personnalisés. Au terme de l’expérience, des biopsies furent effectuées sur les échafaudages cellulaires cultivés afin de déterminer la viabilité et la dispersion des cellules ayant évoluées dans ceux-ci ainsi que les avenues d’améliorations possibles pour le futur.

Figure 5 : Représentation schématique de la méthode de fabrication des échafaudages cellulaire. Les cellules sont d’abord cultivées et les moules sont fabriqués en simultané, par impression tridimensionnelle. Ensuite, l’alginate liquide est mélangé aux cellules et le tout est injecté dans les moules. L’alginate se gélifie dans les moules, qui sont dissouts une fois la gélation complétée, révélant ainsi les échafaudages cellulaires pouvant être perfusés.

Structure du mémoire

Le premier chapitre de ce mémoire consiste en une revue de littérature portant d’abord sur les projets de recherche passés et actuels concernant les valves aortiques biologiques de remplacement fabriquées selon des techniques de génie tissulaire. La revue se concentre également sur l’utilisation de l’alginate en génie tissulaire pour la fabrication d’organes artificiels et sur des technologies d’impression tridimensionnelle de sucre vitrifié. Puis, les chapitres subséquents portent sur la méthode de fabrication développée au cours du projet. D’abord, une population de cellules est sélectionnée, décongelée et cultivée afin d’obtenir une certaine quantité de cellules prédéterminée. Le détail des techniques de culture cellulaire exploitées dans le projet est présenté au chapitre 2. En parallèle, un moule est fabriqué par impression tridimensionnelle et les différents constituants de l’échafaudage d’alginate sont préparés et décontaminés. La particularité du projet réside dans cette étape. En effet, les moules imprimés comportent un réseau de filaments internes. Ainsi, l’alginate injecté et gélifié dans ces moules comporte nécessairement un réseau interne de perfusion qui permet une diffusion accrue de l’oxygène et des nutriments et qui débloque la possibilité de fabriquer des échafaudages d’une épaisseur considérable, soit plusieurs millimètres. La méthode d’impression tridimensionnelle ainsi que les moules utilisés sont présentés au chapitre 3. Lorsque tous ces éléments sont prêts, les constituants de

l’échafaudage sont mélangés aux cellules, l’agent de gélation est ajouté et le tout est rapidement injecté dans le moule. Une fois la gélation de l’alginate complété, le moule est dissout, ce qui termine la fabrication de l’échafaudage cellulaire. Tel que mentionné, cet échafaudage doit être cultivé de manière à permettre aux cellules y étant insérées de survivre et de fonctionner normalement, menant ainsi la sécrétion de matrice extracellulaire, un composant essentiel pour l’atteinte de propriétés mécaniques adéquates. La stratégie adoptée dans ce projet consiste à développer un bioréacteur qui tient l’échafaudage en place et qui impose un débit à travers son réseau de perfusion. Le chapitre 4 présente un article scientifique publié dans le cadre du congrès « CSME-CFDSC Congress 2019 » qui porte sur ce bioréacteur. Finalement, une expérience in vitro complète fut menée afin de tester l’efficacité à la fois de la méthode de fabrication des échafaudages cellulaires et de la méthode de culture dynamique en bioréacteur. Le chapitre 5 présente les détails de cette expérience, ainsi que les résultats qui en sont ressortis, par l’entremise d’un article rédigé pour le journal « Additive Manufacturing ». Ces résultats sont encourageants et ont fait ressortir une multitude d’avenues d’améliorations au niveau de la composition des échafaudages cellulaires, des moules fabriqués par impression 3D et des bioréacteurs, ainsi que de futures expériences à mener. Tout cela est discuté en conclusion de cet ouvrage.

Chapitre 1

Revue de littérature

Le génie tissulaire est un domaine vaste qui comprend une multitude de méthodes de fabrication d’échafaudages cellulaires, d’organes artificiels et de tissus biologiques. Cette revue de littérature focalise principalement sur les méthodes liées à la fabrication de valves cardiaques par génie tissulaire (tissue

engineered heart valves, TEHV), puisqu’une revue exhaustive de toutes les méthodes de fabrication

d’organes artificiels en génie tissulaire dépasse la portée des travaux de ce mémoire. D’abord, les travaux basés sur la fabrication de valves à l’aide d’échafaudages à base de polymères synthétiques biodégradables, comme la poly(acide glycolique) (PGA), le poly(glycerol sebacate) (PGS), la polycaprolactone (PCL), la prolyl 4-hydroxylase (P4HB) et l’acide (L)-lactique (PLLA), sont présentés. Ensuite, une protéine fibreuse couramment utilisée pour l’encapsulation de cellules est présentée, soit la fibrine, ainsi que plusieurs projets de fabrication de valves biologiques se basant sur ce biomatériau. Puis, la méthode d’auto-assemblage est introduite. Celle-ci est très prometteuse par le fait qu’elle évite complètement les matériaux exogènes, éliminant ainsi les risques de rejet immunitaire. Par la suite, la méthode suivante se base sur le principe de décellularisation de tissus vivants. Cette technique vise à éliminer le contenu cellulaire selon diverses stratégies dans le but d’atténuer les risques de rejet immunitaire, pour ensuite réensemencer les matrices décellularisées avec des cellules autologues. Cette stratégie est très intéressante, car elle permet de conserver la matrice extracellulaire du tissu hôte, tout en limitant la dégradation des propriétés mécaniques de celui-ci. Ensuite, le concept de bioimpression 3D est présenté, avec ses différentes formes et ses avancées dans le domaine de la fabrication de valves biologiques. Puis, différents projets exploitant le moulage pour la fabrication de TEHV sont présentés. Par la suite, l’alginate, un biomatériau qui constitue l’échafaudage cellulaire exploité dans ce projet, est présenté en détail, en passant par sa provenance, ses propriétés et ses différents processus de gélation. Finalement, la méthode de fabrication des moules, soit l’impression tridimensionnelle de sucre vitrifié, est présentée. Ce procédé est très populaire chez certains groupes de recherche par la simplicité intrinsèque du sucre à être dissout, sans avoir à utiliser d’agents cytotoxiques, et par sa biocompatibilité avec la plupart des cellules. Les différentes approches du moment pour ce procédé sont présentées, en finissant avec les travaux de notre laboratoire dans ce domaine.

1.1 Polymères synthétiques biodégradables ensemencés de

cellules autologues

Les valves aortiques à base de polymères synthétiques biodégradables constituent un des premiers types de valves aortiques biologiques développées. Ce type de biomatériau a particulièrement intéressé plusieurs chercheurs grâce aux nombreux avantages qu’il offre en opposition avec les valves mécaniques traditionnelles ou les valves aortiques fabriquées à partir de matériaux exogènes. D’abord, les valves biologiques à base de polymères biodégradables s’intègrent mieux à leur hôte que les valves mécaniques, diminuant ainsi le risque de devoir prendre des anticoagulants et, contrairement aux valves aortiques extraites de porcs, elles ont peu de risques de déclencher des réactions immunitaires lorsqu’elles sont ensemencées de cellules autologues. Partant de ces principes, dans le début des années 2000, Hoerstrup et al. orientèrent leurs recherches sur un principe de fabrication utilisant de la PGA recouverte de P4HB [11]. Ces polymères biodégradables et thermoplastiques furent assemblés par application de chaleur pour fabriquer des valves à trois feuillets et furent ensemencés de myofibroblastes et de cellules endothéliales autologues. Après 14 jours de culture en bioréacteur à conditions progressives, leurs valves furent implantées en position pulmonaire sur des moutons. La Figure 6 présente une de ces valves.

Figure 6 : Valve aortique artificielle développée par Hoerstrup et al., après 14 jours de culture en bioréacteur, tiré de [11].

Après plusieurs semaines de maturation, les valves furent explantées et analysées, pour démontrer des résultats encourageants, soit des surfaces valvulaires lisses et confluentes, des propriétés mécaniques comparables à celles d’une valve pulmonaire, une dégradation complète du polymère après 8 semaines et un contenu relatif en matrice extracellulaire comparable à une valve pulmonaire native après 20 semaines. De plus, des échographies démontrèrent que les feuillets des valves étaient mobiles et fonctionnels, sans sténose, thrombose, ni anévrisme jusqu’à 20 semaines. Quelques années plus tard, ce même groupe retenta l’expérience en utilisant plutôt des cellules souches mésenchymateuses (mesenchymal stem cells, MSC) et en comparant l’évolution des valves à court terme en bioréacteur par opposition à l’évolution en culture statique, ce qui démontra la nécessité du bioréacteur par les résultats supérieurs pour les valves cultivées dynamiquement [12]. Puis, en 2005, ces chercheurs remplacèrent la P4HB par des fibres de PLLA et

laissèrent finalement les valves évoluer sur une plus longue période, soit jusqu’à 8 mois dans des moutons [13]. Les résultats furent similaires à ceux de leur première expérience, malgré la prolongation de la période d’implantation. Ces expériences démontrèrent des résultats encourageants, mais jamais les propriétés mécaniques d’une valve aortique native ne furent atteintes, et certaines preuves restaient à faire, comme l’implantation chez l’humain et l’étude de la dégradation à plus long terme, sur plusieurs années. Finalement, en 2014, ce groupe tenta d’améliorer les propriétés mécaniques des valves en combinant différents étages de polymères ensemencés de différents types de cellules [14]. Ils fabriquèrent d’abord un étage central en PGS ensemencé de cellules interstitielles de valve (valvular interstitial cells, VIC) à l’aide d’une technique de micromoulage de feuillets à surface à pores diamantés, puis des étages externes en composite de PGS/PCL fibreux ensemencés de MSC et assemblés par électrofilage. Le but de cette stratégie était de reproduire les propriétés anisotropes des valves natives en respectant l’organisation triétagée des tissus valvulaires natifs, soit un étage central poreux et des couches externes élastiques et résistantes. Le problème majeur de cette technique était le taux de dégradation inégale observé entre les étages et le respect seulement partiel des propriétés mécaniques d’une valve aortique.

D’autres chercheurs se sont intéressés à cette avenue pour la fabrication de valves biologiques. En 2006, Sodian et al. assemblèrent des valves aortiques à l’aide de P4HB et de gabarits provenant de balayages par tomographie axiale calculée par ordinateur (TACO) de valves réelles [15]. Ils ensemencèrent leurs valves avec des cellules de cordon ombilical et les cultivèrent dans un système à débit pulsatif durant 7 jours. Suite à cela, ils observèrent la formation de tissus denses, en étages et à surfaces confluentes, ainsi que de la prolifération cellulaire. Toutefois, ils n’implantèrent pas leurs valves sur des animaux, ne démontrèrent pas de durabilité à long terme et n’atteignirent pas les propriétés mécaniques souhaitées. Plusieurs années plus tard, un autre groupe tenta d’exploiter le micromoulage de feuillets à surface à pores diamantés [16]. Engelmayr Jr. et al. fabriquèrent ces feuillets en PGS et les ensemencèrent de VIC, pour finalement les cultiver statiquement durant 2 à 4 semaines. Ils observèrent une rigidité anisotrope suivant l’alignement des pores diamantés et de l’accumulation de collagène. Toutefois, ils n’implantèrent pas leurs valves sur des animaux et ne démontrèrent pas l’atteinte des propriétés mécaniques d’une valve native. Plus récemment, Hasan et al. fabriquèrent des valves aortiques dont les feuillets étaient composés de PCL et de PLLA assemblés par électrofilage, le tout monté sur un stent en polymère fabriqué par prototypage rapide [17]. Ils démontrèrent la capacité de la PCL à conférer de la raideur et de la résistance à la valve, et la capacité du PLLA à favoriser l’attachement cellulaire lors d’essais in vitro. Ils furent également en mesure d’atteindre le niveau de pression physiologique d’une valve pulmonaire, soit ~20 mmHg, sans observer la défaillance des valves, mais ils ne furent pas en mesure d’atteindre la pression physiologique d’une valve aortique, soit ~90 mmHg. De plus, ils n’implantèrent pas les valves sur des animaux et ne vérifièrent pas le comportement des valves à long terme.

En résumé, les valves de remplacement fabriquées à l’aide de polymères biodégradables synthétiques permettent un bon contrôle sur les propriétés mécaniques, car on peut combiner différents polymères pour former des composites à propriétés mécaniques modulables, ou utiliser des techniques de fabrication et d’assemblage qui permettent d’améliorer la résistance du polymère. De plus, plusieurs expériences ont démontré que certains polymères favorisent l’attachement, la viabilité, la prolifération et la différenciation cellulaire, ce qui favorise la formation de tissus biologiques pour remplacer les échafaudages en polymère. Toutefois, on n’a toujours pas réussi à fabriquer des valves ayant à la fois un contenu relatif en matrice extracellulaire et des propriétés mécaniques équivalentes à une valve aortique native, tout en étant en mesure d’ouvrir et de fermer complètement lorsqu’on impose les conditions physiologiques de l’aorte. De plus, ce type de valve n’a jamais été implanté chez l’humain, alors les réactions à court terme (immunitaire ou inflammatoire) et à long terme (dégradation de la valve, thrombose, calcification) sont peu connues.

1.2 Fibrine

La fibrine est une protéine filamenteuse insoluble qui provient d’une autre protéine soluble du sang, le fibrinogène. Lors de la coagulation, la thrombine transforme le fibrinogène en fibrine, formant ainsi un caillot dans lequel un maillage emprisonne les cellules sanguines [18]. Comme il s’agit d’un matériau biologique qui peut être produit à partir du sang d’un patient et qui peut emprisonner ou encapsuler des cellules facilement, la fibrine a retenu l’attention de plusieurs chercheurs en génie tissulaire.

Dès l’an 2000, Zünd, un collaborateur d’Hoerstrup, s’intéressa à ce biomatériau pour la culture tridimensionnelle de cellules. Son équipe et lui récoltèrent des myofibroblastes de tissus aortiques et les cultivèrent dans du gel de fibrine. Ils observèrent une croissance cellulaire homogène, de la production de collagène, la formation de tissu et l’absence de dégradation toxique et de réaction inflammatoire [19]. Ce fut probablement ce qui inspira son collègue Jockenhoevel, plusieurs années plus tard, à fabriquer des valves à trois feuillets par moulage de fibrine ensemencée de cellules dérivées d’artères carotides bovines [20]. Celui-ci cultiva les valves en bioréacteur à débit pulsatif progressif pendant 12 jours. Il observa de bons résultats au niveau biologique, soit la sécrétion de matrice extracellulaire (extracellular matrix, ECM) et de l’attachement cellulaire, mais dut se contenter de valves à parois très épaisses par rapport à une valve native, sans démontrer l’atteinte des propriétés mécaniques d’une valve aortique. De plus, il ne put implanter les valves sur des modèles animaux. La Figure 7 présente une des valves fabriquées par ce groupe de recherche.

Figure 7 : Valve aortique artificielle fabriquée par moulage de fibrine ensemencée de cellules dérivées d’artères carotides bovines, adapté de [20].

Les années se sont écoulées et l’intérêt de ce groupe de recherche par rapport à la fibrine ne s’est pas éteint. En 2014, l’équipe de Jockenhoevel, en collaboration avec la chercheuse Mela, publia plusieurs articles rapportant la fabrication de valves tubulaires en fibrine [21, 22]. D’abord, Weber développa une méthode de fabrication par moulage de valves dont la racine et les sinus de Valsalva furent faits de silicone et les feuillets, en fibrine ensemencée de cellules de cordon ombilical bovin [21]. Suite à différentes approches de culture dynamique (étirement/contraction ou ouverture/fermeture), des quantités notables d’ECM furent observées après 3 semaines. Puis, Moreira développa également une méthode de fabrication par moulage, mais suturant les feuillets de fibrine sur un stent en nitrinol au lieu de sinus en silicone, dans le but de permettre l’implantation percutanée des valves [22]. Le maintien de la fonctionnalité des valves fut vérifié suite au sertissage pour implantation. On observa un maintien de la capacité d’ouverture et de fermeture, et aucun impact sur le contenu relatif en collagène et les propriétés mécaniques. Toutefois, les performances d’une valve native ne furent pas atteintes. En 2016, Moreira tenta de repousser les limites mécaniques des valves en fibrine en les combinant à un biotextile composite imbriqué dans les feuillets. Ce biomatériau était composé d’un copolymère de L-lactide et DL-lactide (PLDL) recouvert de filaments de PLGA, assemblés par électrofilage [23]. Les résultats s’avérèrent meilleurs que les précédents, c’est-à-dire que ce type de valve était en mesure de résister aux conditions de débit et de pression physiologique aortique, tout en démontrant une flexibilité accrue des feuillets après maturation. La résistance mécanique était toutefois encore inférieure à celle d’une valve native, tout comme le contenu relatif en collagène. Récemment, Mela et al. testèrent une technique innovatrice pour fabriquer des feuillets de valve plus solides, mécaniquement. Cela consista en l’électro-impression de matière fondue (MEW), une technique combinant le prototypage rapide et l’électrofilage traditionnel [24]. Ce procédé permit de fabriquer des feuillets de PCL avec une géométrie en serpentins afin de leur conférer des propriétés mécaniques anisotropes. Les feuillets de PCL furent ensuite utilisés comme renforcement pour des valves aortiques en fibrine ensemencée de cellules musculaires lisses et fabriquées par moulage. Cette étude confirma que les propriétés mécaniques des feuillets peuvent être contrôlées selon l’arrangement des fibres de PCL (diamètre et espacement des serpentins, degré de courbature, nombre d’étages, …), pour atteindre potentiellement une résistance et une élasticité comparables à une valve native.

d’ouverture et de fermeture pour les valves. Toutefois, comme pour toutes les études de ce groupe de recherche, aucun essai in vivo ne fut effectué avec les valves, alors plusieurs paramètres restaient à vérifier, comme la présence de réactions immunitaires ou inflammatoires et le comportement de dégradation à long terme.

D’autres groupes de recherche ont également travaillé avec la fibrine. En 2006, Van Lieshout et al. recouvrirent un maillage de PCL avec de la fibrine dans le but de fabriquer des valves aortiques [25]. Bien qu’ils n’aient pas ensemencé les valves avec des cellules, ils observèrent un maintien de la capacité d’ouverture et de fermeture sur plusieurs millions de cycles. Toutefois, la portée de ces résultats fut limitée par le fait qu’il n’y avait pas de cellules dans les valves. De plus, ils mentionnèrent des fuites près de cinq fois plus élevées dans leurs valves que pour une valve porcine native. Robinson et al. moulèrent également de la fibrine, mais à l’aide d’un montage en polytétrafluoroéthylène (PTFE) autoportant, pour produire des valves à deux et à trois feuillets, le tout ensemencé de fibroblastes dermiques [26]. Ils eurent toutefois des problèmes de dégradation physique et de contraction axiale menant à des déchirements. Pour prévenir cela, ils eurent recours à des sutures avec de la soie, mais ne réussirent pas à produire des valves à trois feuillets viables sur plus de 3 semaines. Bien que les valves à 2 feuillets aient démontré de meilleurs résultats, elles n’atteignirent pas les propriétés mécaniques d’une valve native et ne furent pas implantées.

La fibrine est un biomatériau très prometteur pour la fabrication de valves aortiques biologiques. Elle peut facilement être combinée à des polymères synthétiques pour améliorer ses propriétés mécaniques, et favorise grandement l’attachement, la viabilité, la prolifération et la différenciation cellulaire. Toutefois, beaucoup de travail reste encore à faire pour fabriquer des valves en fibrine destinées à des applications cliniques, comme des études in vivo à court et à long terme.

1.3 Méthode d’auto-assemblage

Certains groupes de recherche sont d’avis que l’utilisation de matériaux synthétiques n’est pas l’idéal pour la fabrication de valves de remplacement, puisque ceux-ci viennent avec des risques inévitables de réactions inflammatoires. C’est pourquoi des méthodes dites d’auto-assemblage ont été développées au cours des dernières décennies. Celles-ci consistent à cultiver des cellules provenant directement d’un patient dans le but de leur permettre de générer des feuillets cellulaires qui, une fois empilés, enroulés et/ou assemblés, peuvent respecter la géométrie et potentiellement les fonctions d’un organe ou d’un tissu cible. Par exemple, cette approche a été utilisée pour fabriquer des tissus simples comme la peau [27], la vessie [28], des vaisseaux sanguins [29] et la cornée [30], tout comme des organes complexes comme la valve aortique [31, 32]. Étant donné que ce procédé évite complètement l’utilisation de matériaux exogènes et se sert uniquement de cellules autologues, les risques de réactions inflammatoires et immunitaires lors de l’implantation sur le patient donneur sont pratiquement nuls.

D’abord, une ancienne étudiante de notre groupe de recherche, Catherine Tremblay, fut une des pionnières dans la fabrication de valves aortiques par la méthode d’auto-assemblage. Sa technique se résumait à cultiver des fibroblastes pour générer des feuillets cellulaires minces qui, par la suite, furent empilés les uns sur les autres pour former des tissus biologiques un peu plus épais, soit jusqu’à 400 μm d’épaisseur [31]. Suite à cela, à l’aide de gabarits spécialement fabriqués, les feuillets furent joints pour former des valves aortiques. Puis, les valves durent être cultivées statiquement durant plusieurs mois afin de permettre aux tissus de développer une certaine résistance mécanique, et finalement, elles furent cultivées en bioréacteur à débit pulsatif afin de faire des essais de fonctionnalité. Les études de Tremblay démontrèrent plusieurs points positifs par rapport à cette technique, notamment une capacité d’ouverture et de fermeture confirmée à partir d’un certain seuil de débit, ainsi que la présence de collagène dans les feuillets. Toutefois, les valves démontrèrent des signes de régurgitation et de sténose à faible débit, ainsi qu’une ouverture asymétrique. De plus, le plus grand défaut de cette technique fut au niveau du grand délai de fabrication, soit près de 7 mois.

Un autre étudiant de notre groupe de recherche, Maxime Picard-Deland, s’est également intéressé à la méthode d’auto-assemblage exploitée par Tremblay. Celui-ci délaissa toutefois les gabarits pour plutôt utiliser la géométrie tubulaire pour fabriquer ses valves [32]. Exploitée par d’autres groupes de recherche, notamment celui de Mela et Jockenhoevel [21, 22], la géométrie tubulaire consiste à fabriquer les feuillets de la valve à l’aide d’un tube glissé à l’intérieur d’un autre tube plus large, en fixant la partie proximale des feuillets à l’aide d’une couture sur toute la circonférence du tube, et la partie distale à l’aide de trois coutures ponctuelles, tel qu’illustré à la Figure 8.

Figure 8 : Représentation schématique d’une valve tubulaire fixée à une aorte, adaptée de [33].

L’avantage des valves tubulaires réside dans leur simplicité de fabrication et dans leur facilité d’implantation percutanée intrinsèque. De plus, cette géométrie a le potentiel de maximiser l’aire d’ouverture lors de la systole et l’étanchéité lors de la diastole. Ainsi, Picard-Deland cultiva des fibroblastes, similairement à Tremblay, afin de générer des feuillets cellulaires. Ensuite, au lieu de faire des empilements, il enroula les feuillets quatre fois sur eux-mêmes, en utilisant des tubes en plastique, pour ensuite les cultiver statiquement

tubulaires, tel que décrit précédemment, et les cultiva en bioréacteur pulsatif à débit croissant, jusqu’à défaillance. Les résultats de ses études démontrèrent une bonne adhésion entre les feuillets, permettant de les manipuler sans risques de bris. De plus, la phase de précontraction permit d’atteindre un diamètre précis et d’augmenter l’épaisseur des tissus fabriqués, tout en améliorant l’orientation cellulaire et favorisant l’adhésion entre les feuillets. Selon les essais mécaniques qu’il mena, les propriétés mécaniques de ses valves furent similaires à celles de tissus natifs. De plus, les valves ouvrirent et fermèrent symétriquement, avec un pourcentage d’ouverture supérieur à celui des valves biologiques fabriquées traditionnellement. Toutefois, les valves tubulaires ne furent pas en mesure de résister aux conditions physiologiques de l’aorte, car on put observer de la régurgitation à travers les feuillets. Finalement, le plus grand défaut de cette technique résida au niveau du phénomène de délamination des feuillets. En effet, après un certain temps en bioréacteur, les feuillets enroulés eurent tendance à se séparer l’un de l’autre, menant à la défaillance de la valve.

Ainsi, suite à ces projets exploitant la méthode d’auto-assemblage, des résultats encourageants furent obtenus, mais le rêve de fabriquer des valves aortiques biologiques par génie tissulaire ne se réalisa pas, à cause des problèmes de performance des valves fabriquées et du long temps de fabrication nécessaire.

1.4 Décellularisation

Comme la géométrie des feuillets d’une valve aortique est très complexe et que son organisation structurelle est très difficile à reproduire, plusieurs chercheurs sont plus enclins à utiliser des tissus explantés afin de fabriquer des valves biologiques. Toutefois, un défi majeur par rapport à cette stratégie provient du fait que les tissus exogènes ou allogènes contiennent des composants cellulaires étrangers à l’hôte qui provoquent généralement des réactions immunitaires, une détérioration précoce et la calcification accélérée de l’implant [34, 35]. Cette complication a éventuellement mené à l’émergence d’une stratégie visant à éliminer complètement le contenu cellulaire de ces tissus, soit la décellularisation. Idéalement, cette technique serait en mesure de conserver la géométrie exacte d’une valve native ainsi que la majorité de son contenu en ECM, tout en éliminant toutes traces de contenu génétique.

Plusieurs stratégies de décellularisation ont été développées au fil des années. D’abord, il a été démontré que l’utilisation de la trypsine et de l’acide éthylène-diamine-tétra-acétique (EDTA) est une manière efficace pour détruire complètement le contenu cellulaire tout en préservant les fibres de collagène [36], mais que cela provoque une détérioration des propriétés biomécaniques [37]. Sinon, d’autres utilisent différents détergents afin de décellulariser des tissus explantés. L’avantage de cette stratégie est que le contenu cellulaire est encore une fois efficacement détruit et que l’ECM est bel et bien conservée. De plus, les propriétés mécaniques de ces tissus ne sont pas affectées par la décellularisation par détergent [38, 39, 40], mais des effets cytotoxiques résiduels sont toutefois présents [41, 42]. Un certain compromis doit donc être atteint entre