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Étude des interactions entre des bactéries pathogènes et Dictyostelium discoideum : analyse de la résistance et de l'enrobage

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Étude des interactions entre des bactéries pathogènes

et Dictyostelium discoideum : analyse de la résistance

et de l’enrobage

Mémoire

Myriam Ouellet

Maîtrise en microbiologie

Maître ès sciences (M. Sc.)

Québec, Canada

© Myriam Ouellet, 2014

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(3)

iii

RÉSUMÉ

Les amibes se nourrissent principalement de bactéries. Certaines bactéries pouvant résister à la digestion dans la voie phagocytique amibienne s’y retrouvent enrobées et sécrétées dans l’environnement par la suite. Cet enrobage augmente la résistance bactérienne à différents stress. Les bactéries enrobées pourraient favoriser la propagation de maladies infectieuses, mais aucune donnée n’est disponible à ce sujet. Les bactéries pathogènes Escherichia coli O157:H7, Salmonella typhimurium et Pseudomonas

aeruginosa sont capables de résister à la digestion amibienne, mais leur capacité à être

enrobée est inconnue. L’étude de la résistance de ces bactéries face à l’amibe Dictyostelium

discoideum et l’analyse de la viabilité de cette dernière en présence des bactéries ont été

réalisées pour mieux cibler les souches bactériennes potentiellement enrobables. Des essais d’enrobage ont été tentés, mais aucune bactérie enrobée n’a été observée en microscopie électronique. D’autres analyses seront requises pour comprendre la propagation des maladies infectieuses via les bactéries enrobées.

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v

ABSTRACT

Amoebae mainly feed bacteria. Many bacteria are resistant to the digestion in the phagocytic pathway of amoebae. There they can be packaged and then secreted into the environment. Packaging increases the resistance of bacteria to different stresses. Packaged bacteria could improve the spread of infectious diseases, but no data is available regarding that so far. The pathogenic bacteria Escherichia coli O157:H7, Salmonella typhimurium and Pseudomonas aeruginosa are able to resist to digestion by amoeba digestion, but their ability to be packaged is unknown. The study of the bacteria resistance to the amoeba

Dictyostelium discoideum and the analysis of the viaibility of the latter in the presence of

bacteria were done to better target the bacterial isolates that can be packaged. Assays of packaging of bacteria were done, but no packaged bacteria were observed by electron microscopy. Other analyzes are required to understand the spread of infectious diseases by packaged bacteria.

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vii

TABLE DES MATIÈRES

RÉSUMÉ ... iii

ABSTRACT ... v

LISTE DES TABLEAUX ... ix

LISTE DES FIGURES ... xi

LISTE DES ABRÉVIATIONS ... xiii

REMERCIEMENTS ... xv

DÉDICACE ... xvii

CHAPITRE 1 - INTRODUCTION ... 1

1.1 Les protozoaires ... 1

1.2 Dictyostelium discoideum ... 2

1.3 La voie phago-endocytique chez D. discoideum ... 2

1.3.1 La dynamique de la voie phago-endocytique ... 5

1.3.2 Phagocytose versus macropinocytose ... 7

1.3.3 Les endosomes de recyclage ... 9

1.3.4 Les lysosomes ... 10

1.3.5 Les lysosomes tardifs ... 11

1.3.6 L’exocytose ... 12

1.4 Résistance à la prédation : Mécanismes de résistance et corps multilamellaires (CML) ... 12

1.5 Bactéries résistantes aux amibes ... 17

1.5.1 E. coli O157:H7 ... 17

1.5.2 S. typhimurium ... 17

1.5.3 P. aeruginosa ... 18

1.6 Problématique des bactéries enrobées ... 20

CHAPITRE 2 – HYPOTHÈSE ET OBJECTIFS SPÉCIFIQUES ... 21

CHAPITRE 3 – MATÉRIEL ET MÉTHODES ... 23

3.1 Cultures cellulaires et maintenance ... 23

3.2 Test de prédation ... 27

3.3 Test de lyse ... 28

3.4 Essai d’enrobage de bactéries ... 29

(8)

viii

3.6 Production de CML par d’autres amibes ... 30

CHAPITRE 4 - RÉSULTATS ... 33

4.1 E. coli O157:H7 ... 33

4.1.1 Test de prédation ... 33

4.2 S. typhimurium ... 35

4.2.1 Test de prédation ... 35

4.2.2 Essai de l’enrobage de bactéries ... 38

4.3 P. aeruginosa ... 39

4.3.1 Origine des isolats ... 40

4.3.1.1 RAPD ... 40

4.3.1.2 Formation de biofilm ... 42

4.3.1.3 Production d’élastase ... 44

4.3.2 Test de prédation ... 45

4.3.3 Test de lyse ... 48

4.3.4 Essai de l’enrobage de bactéries ... 51

4.4 Levure provenant d’une contamination ... 57

4.5 Production de CML par d’autres amibes ... 61

CHAPITRE 5 - DISCUSSION ... 63

5.1 E. coli O157:H7 ... 63

5.2 S. typhimurium ... 64

5.3 P. aeruginosa ... 65

5.4 Levure provenant d’une contamination ... 69

5.5 Production de CML par d’autres amibes ... 70

CHAPITRE 6 – CONCLUSIONS GÉNÉRALES ET PERSPECTIVES ... 71

(9)

ix

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1. Ensemble des bactéries connues pour être résistantes aux amibes et leurs

caractéristiques. ... 14 Tableau 2. Tableau descriptif des souches d'E. coli O157:H7 utilisées dans cette étude. .... 24 Tableau 3. Tableau descriptif des souches de S. typhimurium utilisées dans cette étude. .... 25 Tableau 4. Isolats cliniques de P. aeruginosa isolés de patients ayant la fibrose kystique et utilisés dans cette étude. ... 26 Tableau 5. Isolats environnementaux de P. aeruginosa provenant d'unités dentaires et utilisés dans cette étude. ... 27 Tableau 6. Résultats des tests de prédation pour E. coli O157:H7. ... 35 Tableau 7. Résultats des tests de prédation pour S. typhimurium. ... 37 Tableau 8. Différents milieux de culture testés pour les tests de prédation de S.

typhimurium. ... 38

Tableau 9. Résultats des tests de prédation pour P. aeruginosa. ... 47 Tableau 10. Lyse des cellules de D. discoideum exposées au surnageant des cultures des isolats de P. aeruginosa. ... 50 Tableau 11. Mise en commun des résultats des tests de prédation et des tests de lyse pour les isolats de P. aeruginosa pour déterminer ceux qui sont potentiellement enrobables. .... 52

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(11)

xi

LISTE DES FIGURES

Figure 1. Schéma décrivant la voie endocytique chez D. discoideum. ... 4

Figure 2. Les différents compartiments de la voie endocytique chez D. discoideum. ... 5

Figure 3. Cytosquelette d'actine. ... 6

Figure 4. Visualisation des endosomes de recyclage grâce à la protéine p25. ... 10

Figure 5. Cycle de multiplication intracellulaire de L. pneumophila dans une cellule eucaryote. ... 15

Figure 6. Bactéries L. pneumophila enrobées dans un corps multilamellaire produit et sécrété par A. castellanii. ... 16

Figure 7. Exemple de résultats obtenus avec le test de prédation pour les souches d'E. coli O157:H7. ... 34

Figure 8. Exemple de résultats obtenus avec le test de prédation pour les souches de S. typhimurium. ... 37

Figure 9. Microscopie électronique à transmission d'un essai d'enrobage pour la souche sauvage X3339 de S. typhimurium. ... 39

Figure 10. Pourcentage des patients atteints de fibrose kystique étant infectés par différents agents infectieux selon le groupe d'âge. ... 40

Figure 11. Dendrogramme obtenu suite à l'analyse informatique du RAPD des isolats cliniques et environnementaux de P. aeruginosa. ... 42

Figure 12. Diagramme de la capacité des isolats de P. aeruginosa à former un biofilm en fonction de leur groupe de similitude. ... 43

Figure 13. Diagramme de la production d'élastase par les isolats de P. aeruginosa. ... 44

Figure 14. Exemple de résultats obtenus avec le test de prédation pour les isolats de P. aeruginosa. ... 46

Figure 15. Lyse des cellules de D. discoideum exposées au surnageant des cultures de P. aeruginosa. ... 49

(12)

xii

Figure 17. Invagination de la membrane du lysosome tardif. ... 55 Figure 18. Essai d'enrobage de bactéries pour l’isolat VD 706 de P. aeruginosa. ... 56 Figure 19. Corps multilamellaires vides produits par les isolats VD 706 et Chir D-144 de P.

aeruginosa. ... 57

Figure 20. Exemple de coculture triple permettant de confirmer qu'une bactérie est une ARB. ... 58 Figure 21. Isolement et identification partielle du microorganisme inconnu. ... 60 Figure 22. Surproduction de couches multilamellaires dans le lysosome tardif contenant une levure. ... 61 Figure 23. Production de CML par A. castellanii et H. vermiformis. ... 62

(13)

xiii

LISTE DES ABRÉVIATIONS

ABC : Cassette liant l’ATP (ATP-binding cassette)

ARB : Bactérie résistante aux amibes (Amoeba Resistant Bacteria) CML: Corps multilamellaire

CRIPA : Centre de recherche en infectiologie porcine et avicole Ctrl : Contrôle

DO : Densité optique

Gb3 : Globotriosyl céramide

LES : Souche épidémique de Liverpool (Liverpool epidemic strain) MET : Microscopie électronique à transmission

PCR : Réaction de polymérisation en chaîne (Polymerase Chain Reaction)

RAPD : Amplification aléatoire des polymorphismes de l’ADN (Random amplified

polymorphic DNA)

rpm : Rotation par minute

SPI1-T3SS : Îlot de pathogénicité 1 ou 2 du système de sécrétion de type 3 chez Salmonella (Salmonella pathogenicity island type 3 secretion system)

spp : Sous-espèce (Subspecies) SS : Système de sérétion

SST3 : Système de sécrétion de type 3 Tat : Twin Arginin Translocation

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REMERCIEMENTS

Tout d’abord, je tiens à remercier les différents organismes subventionnaires qui ont contribué au soutien financier pour la réalisation de ce projet, plus particulièrement le Centre de recherche en infectiologie porcine et avicole (CRIPA) pour l’obtention d’une bourse de voyage et d’une bourse de dépannage. J’aimerais aussi remercier les membres de mon comité aviseur pour m’avoir soutenu : Steve Charette (directeur de recherche), Caroline Duchaine (co-directrice), Jean Barbeau et Manon Couture.

Je tiens aussi à remercier Steve, mon directeur, pour toute l’aide et le support apportés. Tu as fait grandir mes connaissances et ma passion pour la science, mais tu m’as aussi fait grandir en tant qu’être humain. Merci de toute la confiance que tu m’as accordée, merci d’avoir cru en moi. Merci aussi d’avoir été autant disponible.

Maintenant, j’aimerais remercier mes collègues et amis qui m’ont côtoyée durant ma maîtrise. Premièrement, merci à Valérie, ma poule, d’être ma super acolyte de bactéries enrobées. Toute ton énergie, en synergie avec la mienne, a fait de nous une équipe du tonnerre! Faire mon tout premier stage à tes côtés a été vraiment plaisant! Depuis ce temps, tu m’as permis de m’épanouir en tant que microbiologiste, mais aussi en tant que femme « qui découvre le monde ». Merci à Geneviève, notre première maman du laboratoire. Ta bonne humeur et ton sens de l’humour étaient toujours les bienvenus! Je sais maintenant que je ne dois plus laisser traîner mon cellulaire, surtout durant les partys de Noël! Tu es une très bonne conseillère, autant au sujet du travail que de la vie en général. Merci à Stéphanie, la belle rousse, pour ta gentillesse et pour m’avoir fait découvrir et développer, avec les gars de bio-info, mon goût pour les bonnes bières. Merci à Alix pour ton sens de l’humour et nos nombreux délires. Merci à Katherine, Mélanie et Sabrina. J’ai moins eu la chance de collaborer avec vous, mais votre présence au laboratoire a été des plus agréables. Et merci Antony pour tes nombreux monologues et imitations!

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xvi

Un merci tout particulier à mon copain, Jean-Guillaume, qui a su être là pour me supporter dans les moments plus difficiles et plus stressants. Tu as été là pour m’encourager et pour me pousser toujours plus loin afin que je me surpasse. Tu as été généreux et patient avec moi. Tu es l’homme rêvé et je t’admire vraiment beaucoup dans tout ce que tu fais. Je t’aime mon amour! Tu me rends vraiment heureuse! Je te souhaite de réussir tout ce que tu entreprends dans la vie.

Merci aussi à mes parents, France et Bruno, et à ma sœur Sophie, pour leur soutien moral durant ces années d’étude. Depuis que je suis toute jeune, vous m’avez toujours dit : « On ne te demande pas de faire l’impossible, on te demande juste de faire de ton mieux ». Cette petite phrase, certains diront qu’elle est banale, mais elle signifie beaucoup pour moi. Ce n’est pas seulement qu’en obtenant les meilleurs résultats que je vais apprendre. C’est en faisant du mieux que je peux que la vie me rendra ce que j’ai semé. C’est valable autant en recherche que dans la vie. Merci à Sophie, ma petite Puce, pour ta complicité. Malgré que nous ne soyons plus des enfants, tu resteras toujours ma petite sœur que je protégerai.

Finalement, un merci un peu moins pertinent à ma « crème molle » du Chocolats Favoris bien méritée après mon dépôt initial. Tu as été ma motivation dans les derniers moments de rédaction.

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xvii

DÉDICACE

À mes parents si fiers de moi « On ne te demande pas de faire l’impossible,

(18)
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1

CHAPITRE 1 - INTRODUCTION

1.1 Les protozoaires

Les protozoaires sont des organismes eucaryotes unicellulaires ubiquitaires dans les environnements humides [1]. Leurs premières observations et descriptions ont été faites par Antoni van Leeuwenhoek en 1675. Les protozoaires possèdent les mêmes structures et organites que les autres cellules eucaryotes, mais avec quelques variations. Certains protozoaires possèdent un seul noyau, alors que d’autres en possèdent deux voire plusieurs. Il existe aussi différentes dimensions pour les protozoaires. Alors que les mononucléés font de quelques micromètres à des centaines de micromètres, les multinucléés peuvent faire une taille de plusieurs centimètres à plusieurs mètres. Les protozoaires se nourrissent par phagocytose, macropinocytose et certains font de la photosynthèse [2].

Sur la base de leur mode de locomotion, les protozoaires se divisent en quatre catégories, soit les ciliés, les amibes, les sporozoaires et les flagellés [3]. Parmi les différents groupes de protozoaires, différentes espèces sont utilisées comme modèle d’étude, dont les amibes Dictyostelium discoideum [4-6] et Acanthamoeba spp. [7] et

Tetrahymena spp. [8] chez les ciliés. Pour ce qui est des amibes, D. discoideum offre

plusieurs avantages que d’autres modèles amibiens n’offrent pas (voir la section 1.2). Par contre, d’autres amibes ont aussi permis différentes avancées scientifiques. Il y a, entre autres, les amibes libres Acanthamoeba castellanii et Hartmannella vermiformis qui ont déjà été utilisées pour étudier la réplication intracellulaire de Legionella pneumophila, une bactérie pathogène opportuniste responsable de la légionellose, une maladie respiratoire parfois mortelle [9-10].

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2

1.2 Dictyostelium discoideum

Comme mentionné précédemment, l’amibe D. discoideum est un modèle d’étude d’eucaryote unicellulaire souvent utilisé en science. Cet organisme a été découvert en 1933 [11], mais ce n’est que depuis les dernières décennies que son utilisation, surtout sous sa forme végétative, est plus courante. D. discoideum possède plusieurs caractéristiques faisant de cette amibe un bon modèle d’étude. Parmi celles-ci, il y a sa capacité d’internaliser les bactéries pour se nourrir, la facilité à la cultiver [5] et son génome entièrement séquencé [12]. D. discoideum offre aussi l’avantage que son utilisation n’est pas soumise aux contraintes éthiques et a un temps de génération beaucoup moins long que certains autres modèles d’étude [5, 13]. De plus, cette amibe permet l’étude des effets de différents composés ou mutations dans la formation des corps multilamellaires (CML) [14]. En effet, en présence de bactéries, D. discoideum produit et sécrète des CML [15]. La phagocytose étant un processus dynamique, l’internalisation de bactéries entraîne le déplacement de certaines protéines membranaires à l’intérieur de la voie phago-endocytique. Ces protéines sont aussi utilisées comme marqueurs moléculaires permettant d’identifier les différents compartiments de la voie phago-endocytique [16].

1.3 La voie phago-endocytique chez D. discoideum

La voie endocytique apporte à l’amibe les nutriments essentiels à sa survie [17-18]. Cette voie est composée de nombreux compartiments de nature différente. Ces compartiments sont des ensembles de vésicules de tailles et de formes différentes [19]. Ils peuvent ainsi avoir une taille variant entre 100 nm et plusieurs micromètres. Ils peuvent aussi adopter des formes rondes, ovales, voire même plus complexes comme la forme d’un fer à cheval [19]. Même si de nombreux échanges ont lieu entre ces différents compartiments, chacun conserve son identité et sa composition [20]. Pour maintenir cette composition unique, les divers compartiments sont dotés d’une très grande efficacité de triage [21]. Pour pouvoir être fonctionnels, les compartiments doivent recruter ce qui est nécessaire, entre autres, à leur formation, leur transport, leur attachement et leur fusion membranaire [22].

(21)

3 La voie endocytique chez D. discoideum peut être résumée à l’aide du schéma de la Figure 1. Une coupe phagocytique ou macropinocytique (tout dépendant s’il s’agit de particules solides ou de fluide) se forme à la surface cellulaire par réarrangement du cytosquelette d’actine de la cellule (étape 1) [23]. Lorsque la coupe se referme, cela forme le premier compartiment de la voie endocytique. Ce compartiment naissant est nommé phagosome lorsqu’il contient des particules solides [24] et macropinosome quand son contenu est un fluide (étape 2) [19].

Entre une à cinq minutes après l’internalisation, le phagosome/macropinosome perd son manteau d’actine, ce qui rend possible la fusion d’endosomes contenant des pompes H+-ATPase à ces compartiments [25]. Ces pompes à protons permettent l’acidification des phagosomes/macropinosomes [26]. Ces compartiments deviennent alors des lysosomes (étape 3). L’acidification permet la digestion du contenu du lysosome grâce à des enzymes lysosomales [27]. Le matériel non digérable est conservé et le lysosome mature en lysosome tardif (étape 4) [28]. Ce compartiment neutre [29] ne contient pas de pompe à proton [30]. Le contenu non digérable s’y retrouve et de nombreuses couches protéo-lipidiques peuvent s’y former, donnant naissance aux CML [14]. L’exocytose du lysosome tardif se fait par fusion de la membrane du compartiment avec celle de la membrane cellulaire. Cela crée un domaine d’exocytose provisoire à la surface de l’amibe (étape 5) [31].

Certaines protéines de la membrane plasmique de l’amibe se retrouvent internalisées lors de la formation de la coupe phagocytique ou macropinocytique. Pour garder un bon équilibre, certaines sont recyclées à la surface cellulaire via des endosomes de recyclage (étape 6) [31]. Une autre organelle de l’amibe, la vacuole contractile, possède certaines protéines, comme les pompes H+-ATPase qui pourraient être fournies à la voie endocytique pour en permettre l’acidification. La principale fonction de cette organelle est de contrôler la pression osmotique dans la cellule en évacuant le surplus d’eau (étape 7) [32]. Puisque la voie endocytique est un processus continu plutôt qu’une succession distincte de compartiments, il est difficile de déterminer combien il existe de compartiments exactement. Toutefois, certains changements durant la voie, comme expliqué plus haut,

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4

permettent de bien définir la présence des compartiments décrits. Une explication plus détaillée de chacun des compartiments sera faites dans les sections suivantes.

Figure 1. Schéma décrivant la voie endocytique chez D. discoideum.

Étape 1: Formation de la coupe phagocytique ou macropinocytique par réarrangement du cytosquelette d’actine. Étape 2: Fermeture de la coupe, formation du compartiment naissant (phagosome ou macropinosome) et perte du manteau d’actine. Étape 3: Fusion de vésicules lysosomales avec le compartiment naissant, acidification du compartiment qui devient un lysosome, activation des enzymes lysosomales et digestion du matériel digérable. Étape 4: Maturation du lysosome en lysosome tardif, augmentation du pH, formation de corps multilamellaires et formation du manteau d’actine. Étape 5: Fusion du lysosome tardif à la membrane plasmique et exocytose. Étape 6: Récupération de certaines protéines du compartiment naissant vers la surface cellulaire via les endosomes de recyclage. Étape 7: Vacuole contractile contenant des pompes H+-ATPase et servant à l’osmorégulation (figure provenant de S. Charette, comm. personnelle).

La Figure 2 montre une cellule de D. discoideum marquée à l’aide de trois anticorps différents reconnaissant trois protéines, soit les pompes H+-ATPase, p80 et Rh-50. L’image a été obtenue en microscopie confocale. Le marquage des pompes H+-ATPase permet de situer la membrane plasmique, la vacuole contractile et les compartiments acides, soit les lysosomes alors que le marquage de la protéine p80 montre la membrane plasmique et tous les compartiments de la voie endocytique [33]. Le marquage de la protéine Rh-50, quant à lui, sert à situer la vacuole contractile [34]. Ainsi, on peut voir sur la dernière image de la même cellule que les compartiments ayant un marquage plus prononcé sont des lysosomes tardifs, puisqu’ils ne contiennent aucune pompe H+-ATPase.

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5 Figure 2. Les différents compartiments de la voie endocytique chez D. discoideum. Microscopie confocale d’une cellule de D. discoideum. La cellule est marquée à l’aide de trois anticorps reconnaissant les protéines H+-ATPase (en rouge), p80 (en vert) et Rh-50 (en

bleu). La protéine H+-ATPase se retrouve dans la vacuole contractile et dans les compartiments acides (lysosomes). La protéine p80 se retrouve à la surface cellulaire (signal faible) et dans tous les compartiments de la voie endocytique. La protéine Rh-50 se retrouve dans la vacuole contractile. Les compartiments marqués d’un astérisque sont les lysosomes tardifs (protéine p80 fortement présente et absence de la H+-ATPase) (échelle à 5 µm) (figure provenant de S. Charette, comm. personnelle).

1.3.1 La dynamique de la voie phago-endocytique

Le cytosquelette d’actine est essentiel au bon fonctionnement de la voie endocytique, que ce soit par le réarrangement de la membrane plasmique [18], par l’organisation du cytosol, par le transport vésiculaire et dans le maintien de la morphologie cellulaire [35]. Pour qu’il y ait internalisation de milieu liquide ou de particules solides, il doit y avoir réarrangement du cytosquelette d’actine [23]. Il y a d’abord accumulation d’actine par sa polymérisation en périphérie de la cellule et qui provoque la formation de protrusions membranaires nommées pseudopodes [36], pour former la coupe phagocytique ou macropinocytique [37-38]. Le phénomène d’endocytose se produit à un rythme de 0,6 µL/106 cellules/heure, c’est-à-dire que 106 cellules ingèrent 0,6 µL à chaque heure [39]. L’endocytose représente ici, dans le cas de l’amibe D. discoideum, le phénomène général d’internalisation de particules solides ou de fluide, soit respectivement la phagocytose et la macropinocytose. Les filaments d’actine (F-actine) se désassemblent entre 16 et 20 secondes après leur formation [40-41] pour laisser place à l’assemblage de nouveaux

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6

filaments d’actine. Ce nouvel assemblage ne dure que quelques secondes [41]. Cette actine dirige le phagosome loin du cortex cellulaire [41-42]. Le cytosquelette d’actine aide ensuite à certaines des étapes suivantes de la voie endocytique dont la fusion et le transport des endosomes [43-44], mais aide aussi à prévenir la fusion avec d’autres endosomes dans les moments inappropriés [18]. Au dernier compartiment de la voie endocytique, soit le lysosome tardif, il y a de nouveau formation d’un manteau de F-actine [45] pour ensuite permettre l’exocytose [18, 46]. Toutefois, ni l’endocytose ni l’exocytose n’ont lieu à des sites fixes [28] (voir la Figure 3).

Figure 3. Cytosquelette d'actine.

Microscopie confocale d’une cellule de D. discoideum. La cellule est marquée à l’aide d’un anticorps reconnaissant la protéine p80 (en vert) et d’une molécule se liant à l’actine, la phalloïdine couplée au Texas Red (en rouge). L’élément 1 montre une coupe macropinocytique. À l’élément 2, l’actine est toujours présente sur le macropinosome nouvellement formé. L’actine disparaît à l’élément 3 (lysosome) et réapparaît à l’élément 4 (lysosome tardif) où on retrouve aussi une plus grande accumulation de p80. L’élément 5 montre un domaine d’exocytose de la cellule révélé par une forte présence de la protéine p80 (échelle à 5 µm). L’élément 6 est un pseudopode en formation à la surface de la cellule (figure provenant de S. Charette, comm. personnelle).

Les microtubules jouent un rôle crucial dans le transport vésiculaire. Par exemple, après la formation du phagosome, celui-ci est transporté par les microtubules [47-48] vers le centrosome [42]. Le transport peut se faire selon différents mouvements, soit par des directions inversées, en zig-zag [42], bidirectionnellement [19, 49] ou avec des sauts

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7 périodiques [50]. Le mouvement bidirectionnel se produit à une vitesse variant entre 0,5 et 2 µm/s [51]. La vitesse des sauts des petits endosomes est de 1,7 à 2,1 µm/s, alors que pour les gros endosomes, il s’agit de 0,7 à 1,0 µm/s [19].

La voie endocytique est un processus linéaire, ce qui signifie que tout le matériel ingéré traverse la voie endocytique, en partant de la phagocytose/macropinocytose, pour ressortir de la cellule par exocytose [36, 52]. Plusieurs études s’entendent pour dire que la voie endocytique se déroule au complet en 60 minutes [42, 53]. Toutefois, il y a une certaine homéostasie qui s’installe, pour créer un équilibre entre l’endocytose et l’exocytose [28, 54]. Par exemple, lorsque les nutriments ne sont pas assez abondants, la voie endocytique ralentie, c’est-à-dire que l’endocytose et l’exocytose sont beaucoup plus lentes [55].

1.3.2 Phagocytose versus macropinocytose

L’endocytose est le processus par lequel D. discoideum acquière les nutriments essentiels à sa survie [19, 56] par internalisation de fluide ou de macromolécules du milieu extracellulaire [33, 57]. L’internalisation de particules se nomme la phagocytose [24, 58], alors que l’internalisation de fluide se nomme la macropinocytose [19, 57]. Lorsque D.

discoideum se trouve dans son environnement naturel (c’est-à-dire le sol forestier), ses

principales sources de nutriments sont les bactéries [41, 59] et d’autres microorganismes qu’elle internalise par phagocytose.

Le processus de la phagocytose est essentiellement similaire à celui de la macropinocytose [36, 57] que ce soit morphologiquement [36, 60], biochimiquement [61] ou fonctionnellement [36]. Tous deux sont des moyens efficaces utilisés par la cellule afin d’ingérer des nutriments [16, 31]. Les deux processus nécessitent la présence de filaments d’actine (F-actine) [17, 57]. Toutefois, il existe certaines différences entre la phagocytose et la macropinocytose. La cellule utilise la phagocytose pour ingérer des particules ayant une taille de l’ordre du dixième de micromètre ou plus [52, 62]. Le processus débute par la liaison d’une particule à des récepteurs spécifiques de la surface cellulaire [62-63] suivie du réarrangement du cytosquelette d’actine tel que mentionné plus haut [64]. Un exemple de

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récepteurs spécifiques serait les protéines SadA [65] et SibA [66]. Aucun récepteur n’est connu pour la macropinocytose. Des pseudopodes sont générés et la coupe phagocytique est alors formée et s’étend autour des particules liées aux récepteurs [38, 67]. Les particules sont amenées à l’intérieur de la cellule grâce à l’action du cytosquelette d’actine [68]. Les particules se retrouvent alors dans un phagosome [69]. Dans ce compartiment, le pH est près de la neutralité [28].

Pour ce qui est de la macropinocytose, le processus débute par l’invagination en forme de V [18] de la membrane plasmique à l’aide du cytosquelette d’actine [18, 57], ce qui mène à la formation de pseudopodes [36]. De cette manière, une grande quantité de fluide est ingérée [57]. Lorsque la coupe macropinocytique se referme, le fluide ingéré se retrouve dans un compartiment nommé macropinosome [36, 57]. Celui-ci a, en général, une taille supérieure à 500 nm de diamètre [18]. Le macropinosome naissant se met ensuite à bouger de manière centripète afin d’avoir une forme circulaire [18].

Tout comme la présence de récepteurs spécifiques est observée seulement pour la phagocytose, il existe aussi une particularité pour la macropinocytose : le macropinosome peut se fragmenter en plusieurs petites vésicules (S. Charette, comm. personnelle). Ce phénomène n’est pas observé pour les phagosomes, puisque ceux-ci contiennent des particules solides.

Les étapes subséquentes de la voie endocytique, c’est-à-dire l’acidification du phagosome ou du macropinosome, se déroulent de la même façon pour les deux processus. L’internalisation de fluide ou de particules solides du milieu extracellulaire mène à la capture de protéines de la membrane plasmique. De ce fait, le triage des protéines dans ces compartiments précoces est un processus important pour conserver leur composition spécifique [70]. Le triage des protéines sera discuté plus profondément dans la section sur les endosomes de recyclage. Toutefois, certaines protéines sont exclues lors de la formation de la coupe phagocytique et macropinocytique [70].

(27)

9

1.3.3 Les endosomes de recyclage

Comme mentionné dans la section précédente, lors de la phagocytose ou de la macropinocytose, une partie de la membrane plasmique est internalisée [71]. Ainsi, un tri de plusieurs protéines membranaires est nécessaire pour en recycler certaines à la surface cellulaire via les endosomes de recyclage [16] afin de conserver la spécificité de la composition des compartiments [70] de même que celle de la surface cellulaire [72]. Une partie du triage se fait dans la coupe phagocytique/macropinocytique alors que le reste se fait dans le phagosome [70]. Les protéines H36 et PM4C4 sont des exemples de protéines recyclées dans la coupe phagocytique/macropinocytique avant sa fermeture [70]. Lors du triage dans le phagosome, les particules et le fluide ingérés passent à l’étape de la digestion lysosomale tandis que les protéines membranaires sont recyclées à la surface cellulaire par les endosomes de recyclage [22]. Une des protéines membranaires recyclées dans le phagosome est p25 [16]. La démonstration de l’existence des endosomes de recyclage chez

D. discoideum s’est faite grâce à la présence de cette protéine dans ces compartiments [16].

Cette protéine se retrouve à la surface de la cellule [33], dans la coupe phagocytique ou macropinocytique [70], dans le phagosome [33] et dans les endosomes de recyclage [16].

La Figure 4 montre une cellule de D. discoideum en microscopie confocale. Les protéines p80 et p25 sont marquées par immunofluorescence. Les endosomes de recyclage (en rouge) se situent à l’extérieur des compartiments (en vert) [16]. Le processus de recyclage des protéines se déroule pendant environ 10 minutes après l’internalisation des particules ou du fluide [16]. Les endosomes de recyclage se forment par bourgeonnement de petites vésicules tubulaires en provenance du phagosome [19].

(28)

10

Figure 4. Visualisation des endosomes de recyclage grâce à la protéine p25.

Microscopie confocale d’une cellule de D. discoideum. La cellule est marquée à l’aide de deux anticorps reconnaissant la protéine p80 (en vert) et la protéine p25 (en rouge). La protéine p80 est présente à la surface cellulaire et dans tous les compartiments de la voie endocytique. La protéine p25 est aussi une protéine membranaire se retrouvant dans les compartiments naissants (non montré sur cette image) et absente des compartiments de la voie endocytique (lysosomes et lysosomes tardifs). Chaque petit point rouge représente un endosome de recyclage (échelle à 5 µm) (figure provenant de S. Charette, comm. personnelle).

1.3.4 Les lysosomes

Le lysosome est le compartiment qui permet la digestion enzymatique du matériel ingéré par D. discoideum [17, 73]. Lors de la phagocytose comme de la macropinocytose, il y a dépolymérisation du manteau d’actine qui entoure le compartiment naissant [57]. Cela rend alors possible la fusion du compartiment avec des lysosomes déjà présents dans la cellule [74]. Cette dépolymérisation d’actine se fait rapidement, c’est-à-dire en quelques secondes tout au plus une minute [18, 47]. La fusion entre les compartiments naissants et les lysosomes est facilitée par le transport des endosomes via les microtubules (discuté dans la section 1.3.1). Cette fusion permet ainsi l’ajout de pompes H+-ATPase [25, 41]. L’abaissement du pH du lysosome se fait à l’aide du transfert de protons par les pompes H+-ATPase à l’intérieur du compartiment. Ces pompes sont des protéines

(29)

11 transmembranaires du lysosome [26, 75]. L’acidification débute environ cinq minutes après l’internalisation de fluide ou de particules solides [70].

Lors de l’acidification, le pH atteint une valeur inférieure à 3,5 [76]. Cette acidification active les enzymes lysosomales présentes dans le compartiment, comme des protéases, des nucléases, des lipases et des glycosidases [77]. Une fois activées, ces enzymes vont dégrader le matériel digérable. D. discoideum peut digérer jusqu’à 1000 bactéries par génération [1].

1.3.5 Les lysosomes tardifs

Après la digestion enzymatique, le pH du lysosome augmente pour devenir presque neutre, soit de 6,0 à 6,2 [29, 77]. Cette augmentation dure environ 20 à 25 minutes [77]. Les enzymes lysosomales et les pompes à protons sont récupérées du lysosome tardif via des vésicules de recyclage [17, 30]. Ces vésicules servent possiblement à acidifier les nouveaux phagosomes subséquents [17].

Le lysosome tardif est le dernier compartiment avant l’exocytose. C’est aussi à cette étape qu’il y a formation de corps multilamellaires (CML) [78]. Cependant, cette production de CML est observée seulement quand les cellules sont cultivées en présence de bactéries comme source de nutriments et non lorsque cultivées dans un milieu de culture liquide [14-15]. Vraisemblablement, les CML se forment par invagination répétée de la membrane du lysosome tardif pour former des couches protéo-lipidiques provenant de l’amibe [14]. Le matériel non digéré par les lysosomes se retrouve dans les lysosomes tardifs avant d’être exocyté hors de l’amibe [28, 42]. Le matériel non digéré peut être du fluide ou des particules solides [19, 79].

Autour du lysosome tardif, il y a polymérisation d’un manteau de filaments d’actine [45, 53]. Ce manteau est d’ailleurs nécessaire à l’exocytose (discuté dans la section 1.3.6) [18] et prévient les interactions et fusions entre les lysosomes tardifs [80]. Il y a aussi une

(30)

12

présence plus importante de la protéine p80 à la surface de la membrane du compartiment [33].

1.3.6 L’exocytose

L’exocytose est la dernière étape de la voie endocytique. Elle consiste en la sécrétion hors de l’amibe de tout le matériel non digéré/accumulé contenu dans le lysosome tardif [31, 53]. Le processus d’exocytose nécessite la présence accrue de filaments d’actine [18, 45]. La protéine p80 est aussi présente de façon plus importante que pour le reste de la voie endocytique. L’exocytose se fait par fusion du lysosome tardif avec la surface cellulaire [28, 31]. L’exocytose dure quelques secondes seulement [17, 47]. Les CML se retrouvent ainsi dans le milieu extracellulaire [78]. Même si certaines enzymes lysosomales sont récupérées lors du passage au lysosome tardif, une fraction de celles-ci est aussi sécrétée dans le milieu extracellulaire lors de l’exocytose [81-82]. Le processus d’exocytose permet à la membrane plasmique qui a été internalisée au début de la voie lors de la formation de la coupe phagocytique ou macropinocytique d’être récupérée à la surface cellulaire [36]. Lorsque tout le contenu du lysosome tardif est à l’extérieur de la cellule, le signal d’actine disparaît [18]. L’exocytose a lieu de 60 à 90 minutes après le début de la voie, soit l’internalisation de fluide ou de particules solides [83-84].

1.4 Résistance à la prédation : Mécanismes de résistance et corps multilamellaires (CML)

Certaines bactéries ont développé des mécanismes de résistance à la phagocytose par les protozoaires [85]. Chez les amibes, on nomme ces bactéries des ARB (amoeba

resisting bacteria, bactéries résistantes aux amibes). Plusieurs bactéries sont connues pour

être ARB (Tableau 1). Certaines sont des pathogènes extracellulaires et d’autres sont des pathogènes intracellulaires obligatoires ou facultatifs [85]. Puisque certaines bactéries pathogènes pour l’humain telles les légionelles ou les mycobactéries résistent aussi à la prédation par les amibes comme Dictyostelium [86], il est important de comprendre la

(31)

13 relation entre les ARB et les amibes dans la propagation des maladies infectieuses. La prédation inclue les processus de phagocytose et de digestion.

Il existe trois grands mécanismes de résistance à la prédation. Il y a la lyse amibienne, l’évitement de la phagoctyose et l’enrobage de bactéries. La résistance de certaines bactéries a déjà été étudiée. C’est le cas de L. pneumophila, un pathogène intracellulaire qui se laisse internaliser par les phagocytes, mais qui empêche sa digestion pour ensuite profiter des nutriments de l’hôte pour sa multiplication [86]. Ce phénomène n’est pas unique aux amibes puisque certaines bactéries en font de même chez les macrophages [1, 87]. L. pneumophila est l’agent infectieux responsable de la légionellose, une maladie pulmonaire parfois mortelle [88]. Cette bactérie contourne la voie phagocytique de certaines amibes en recrutant des protéines du réticulum endoplasmique de la cellule hôte. Ce recrutement est réalisé à l’aide de toxines sécrétées par le système de sécrétion de type 4 de la bactérie. De cette manière, cette dernière n’est pas reconnue par la cellule et peut donc profiter des nutriments offerts par celle-ci afin de se multiplier. À la fin de son cycle de multiplication, la bactérie est sécrétée dans le milieu extracellulaire soit suite à la lyse cellulaire [85, 89-90], soit par exocytose (Figure 5) [91]. Dans le dernier cas, il peut y avoir formation de CML dans lesquels sont enrobées les bactéries (Figure 6) [10]. Donc, deux des mécanismes de résistance à la prédation peuvent être utilisés par

(32)

14

Tableau 1. Ensemble des bactéries connues pour être résistantes aux amibes et leurs caractéristiques.

(33)

15 Figure 5. Cycle de multiplication intracellulaire de L. pneumophila dans une cellule eucaryote.

a. Liaison de L. pneumophila à la cellule hôte et formation d’une vacuole autour de la bactérie; b. Évitement de la dégradation lysosomale; c. Sécrétion de toxines effectrices par la bactérie et recrutement de protéines du réticulum endoplasmique de la cellule hôte; d. Maturation de la vacuole de réplication; e. Multiplication intracellulaire; f. Sortie des bactéries par lyse cellulaire ou exocytose (figure tirée de Hubber et Roy, 2010) [91].

(34)

16

Figure 6. Bactéries L. pneumophila enrobées dans un corps multilamellaire produit et sécrété par A. castellanii.

Échelle à 1 µm (figure tirée de Berk, 1998) [10].

Le phénomène d’enrobage de bactéries est encore peu connu. Cet enrobage est sous forme de CML. Comme mentionné dans la section 1.3.5 portant sur la voie endocytique, les CML sont formés par l’invagination répétée de la membrane du lysosome tardif pour former des couches protéo-lipidiques provenant de l’amibe [14]. Il s’agit d’un phénomène dépendant de l’amibe et non de la bactérie internalisée [92]. Une caractérisation des lipides des CML montre que ceux-ci sont principalement d’origine amibienne [15]. Toutefois, il y a certaines variations morphologiques des CML dépendant de la bactérie digestible sur laquelle croît les amibes [92]. Chez D. discoideum, les CML sont produits même s’il n’y a pas de matériel non digérable présent. Par contre, la présence de bactéries digérables est requise pour stimuler leur production. Une simple culture des amibes en milieu axénique ne suffit pas à la production de CML [15]. D’autres amibes sont aussi connues pour produire des CML telle A. castellanii [92]. La production de CML contenant des bactéries par les amibes pourrait augmenter la transmission des ARB [92].

(35)

17

1.5 Bactéries résistantes aux amibes

Différents types d’ARB seront considérés dans la présente étude afin d’évaluer leur interaction avec l’amibe D. discoideum (voir le chapitre 2). Les espèces bactériennes considérées dans cette étude sont toutes des agents pathogènes infectant les humains. Il s’agit d’Escherichia coli, de Salmonella typhimurium et de Pseudomonas aeruginosa. Une brève description de leurs caractéristiques est donnée ci-dessous.

1.5.1 E. coli O157:H7

La bactérie à Gram négatif E. coli existe sous différents sérotypes. La majorité d’entre eux fait partie de la flore gastrointestinale de l’humain. Toutefois certains sérotypes sont des formes pathogènes de la bactérie. C’est le cas d’E. coli O157:H7, une souche qui a acquis certains facteurs de virulence. Ces facteurs se retrouvent sur des plasmides, des transposons, des bactériophages et des îlots de pathogénicité [93]. E. coli O157:H7 est un agent pathogène responsable de diarrhées sanguignolantes dont la première description a été faite en 1982 [94-95]. Aux États-Unis, elle cause de grandes pertes économiques totalisant une somme annuelle de 405 millions de dollars [96]. Cette bactérie pathogène se transmet principalement par la consommation d’eau et d’aliments contaminés [97]. Cependant, il existe aussi une autre voie de transmission potentielle : les aérosols [98]. Sachant qu’E. coli O157:H7 se retrouve dans les environnements humides, tout comme les amibes, et que cette bactérie est capable de survivre et de se répliquer à l’intérieur de certaines amibes, celles-ci pourraient favoriser la transmission de cette bactérie pathogène [99].

1.5.2 S. typhimurium

S. typhimurium, dont le nom exact est S. enterica sérotype typhimurium, est une

bactérie pathogène intracellulaire facultative. Dans certains cas, cette bactérie a la capacité de se multiplier à l’intérieur d’une cellule hôte. S. typhimurium est le principal agent

(36)

18

responsable de gastroentérites d’origine alimentaire chez les animaux et les humains. Elle infecte les cellules épithéliales de l’intestin [100-101]. Cette maladie peut entraîner des problèmes sanitaires et économiques majeurs. Par exemple, aux États-Unis, 550 décès liés à ce type de gastroentérites sont recensés en moyenne par année [102]. S. typhimurium possède un système de sécrétion de type 3 encodé par deux îlots de pathogénicité : le SPI1-T3SS et le SPI2-SPI1-T3SS (Salmonella pathogenicity island type 3 secretion system). Ces deux types d’îlots de pathogénicité ont des fonctions différentes lors de la phagocytose de

S. typhimurium par des amibes ou des macrophages. Le SPI1-T3SS stimule la phagocytose

pour que la cellule hôte internalise la bactérie, tandis que le SPI2-T3SS favorise l’établissement d’une niche de réplication par sécrétion de plusieurs protéines effectrices à l’intérieur de la cellule [103-104]. Le SPI2-T3SS contrôle aussi la virulence de la bactérie [105-106]. Puisque les différents types d’îlots de pathogénicité ont des fonctions jouant un rôle sur la phagocytose par des amibes, il serait intéressant de vérifier leur impact sur le processus d’enrobage de bactéries.

1.5.3 P. aeruginosa

P. aeruginosa est une bactérie à Gram négatif qui est un pathogène opportuniste.

C’est une bactérie ubiquitaire dans les environnements humides, les sols et l’eau, ainsi que chez les plantes et les animaux [107-109]. C’est aussi un contaminant fréquent dans les environnements humains comme les cabinets dentaires [110]. Elle a la capacité de former des biofilms et elle possède plusieurs systèmes de sécrétion qui permettent la production de facteurs de virulence [111-112]. Elle produit, entre autres, l’exotoxine A, des protéases, la pyocyanine, la pyocine et des rhamnolipides [111, 113]. P. aeruginosa possède trois systèmes de régulation de l’expression de ces gènes nommés quorum sensing : las, PQS et

rhl [111]. L’expression des gènes de virulence de P. aeruginosa est régulée par les

systèmes du quorum sensing. Outre l’atteinte d’un niveau seuil d’individu, les systèmes nécessitent la présence de stimuli environnementaux pour permettre l’expression des gènes de virulence de façon adéquate. Les facteurs environnementaux influençant les systèmes du

quorum sensing sont, notamment, le fer et l’azote disponibles, la température, l’osmolarité

(37)

19

P. aeruginosa possède plusieurs systèmes de sécrétion. Certains de ces systèmes de

sécrétion produisent des facteurs de virulence à différentes fins, que ce soit pour capturer des ions essentiels comme le fer, pour se nourrir ou pour se défendre contre des cellules hôtes eucaryotes ou d’autres bactéries [116]. Dans le dernier cas, les bactéries infectent l’hôte en sécrétant des facteurs de virulence afin de diminuer la défense de l’hôte, de bouleverser les signaux de la cellule pour bénéficier de celle-ci ou de l’utiliser pour se répliquer [117].

Selon le type de système de sécrétion, il existe différents facteurs de virulence. Il existe deux mécanismes distincts dans les systèmes de sécrétion. Il y a le mécanisme en une étape et celui en deux étapes. Le mécanisme de sécrétion en une étape permet la translocation des protéines du cytoplasme de la bactérie directement à la surface cellulaire [116]. Le mécanisme en deux étapes, quant à lui, permet la transition des protéines dans le périplasme avant d’être transloquées au travers de la membrane externe [116].

Les systèmes de sécrétion qui fonctionnent selon le mécanisme de sécrétion en deux étapes utilisent soit la voie Sec-dépendant [118], soit Tat-dépendant (Tat : Twin Arginin

Translocation) [119] pour la première étape de translocation. Cette première translocation

du cytoplasme de la bactérie vers le périplasme est indépendante du système de sécrétion [116]. Les substrats Sec-dépendants sont transloqués dans le périplasme sous une forme non repliées, alors que les substrats Tat-dépendant ont une forme repliée [116]. Après la première translocation, les protéines convergent vers leurs systèmes de sécrétion respectifs, soit les types II et V. Les systèmes de sécrétion fonctionnant selon le mécanisme de sécrétion en une étape sont, quant à eux, ceux de types I, III et VI. Étant donné la présence de P. aeruginosa dans plusieurs environnements humides et même dans les installations humaines et sa capacité d’être virulente par la formation de biofilm ou par la production de facteurs de virulence, l’étude de l’interaction de cette bactérie avec des amibes serait intéressante afin de mieux cibler l’impact des facteurs de virulence sur l’enrobage de bactéries.

(38)

20

1.6 Problématique des bactéries enrobées

L’enrobage de bactéries procure certains avantages aux bactéries présentes à l’intérieur des CML. Ainsi, il y a une augmentation de la résistance à différents stress environnementaux [10, 120-121]. Ceux-ci sont, entre autres, les cycles de gel-dégel, les biocides et les antibiotiques [10, 122-123]. Certaines études proposent que les humains pourraient être infectés par inhalation de CML contenant des bactéries comme les légionelles [88, 120] pourvu que les bactéries contenues dans les CML supportent plus facilement le stress de l’aérosolisation que les bactéries qui ne sont pas enrobées. En effet, les particules aérosolisées qui sont respirables sont celles ayant une taille inférieure à 3,5 µm de diamètre [124]. Puisque les bactéries enrobées par les protozoaires ont une taille entre 2 et 6 µm [10, 120], celles-ci auraient la taille adéquate pour être respirées par les humains et se retrouver dans les alvéoles pulmonaires [10]. Les bactéries enrobées pourraient donc favoriser la propagation des maladies infectieuses via l’aérosolisation.

(39)

21

CHAPITRE 2 – HYPOTHÈSE ET OBJECTIFS SPÉCIFIQUES

Hypothèse

Étant donné que certaines bactéries pathogènes se retrouvent dans les environnements occupés par les humains et sachant que les amibes se retrouvent dans ces mêmes environnements, j’émets l’hypothèse que ces bactéries pourraient se faire enrober par les amibes. Ce projet de maîtrise permettrait de mieux comprendre le phénomène d’enrobage de bactéries par les amibes et, ultimement, vérifier si cet enrobage favorise la propagation de maladies infectieuses via l’aérosolisation. Pour aider à répondre à l’hypothèse formulée ci-dessus, trois objectifs spécifiques ont été poursuivis au cours de cette maitrise.

Objectifs spécifiques

1- Déterminer, parmi plusieurs souches d’espèces bactériennes différentes, celles qui sont résistantes à la prédation par l'amibe D. discoideum

2- Déterminer si les bactéries résistantes affectent la viabilité des amibes

3- Vérifier si les bactéries résistantes à la prédation et non cytotoxiques se font enrober par

(40)
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23

CHAPITRE 3 – MATÉRIEL ET MÉTHODES

3.1 Cultures cellulaires et maintenance

La maintenance des amibes D. discoideum DH1-10 [125], souche utilisée au laboratoire, a été faite à raison de deux passages par semaine dans du milieu de culture frais pour éviter la confluence des amibes. Le milieu utilisé était le HL5 (14,3 g/L de bactopeptone (Oxoid L37), 7,15 g/L d’extrait de levure, 18 g/L de D-(+)-maltose monohydrate, 0,641 g/L de Na2HPO4•2H2O et 0,490 g/L de KH2PO4 pour 1 L d’eau

distillée et un pH final d’environ 6,5) [6] additionné de tétracycline (15 µg/mL). La maintenance des amibes a été faite dans des Pétris stériles en polystyrène (100 mm x 15 mm, Fisherbrand) dans 12 mL de milieu HL5 et incubée à 21°C. La densité optimale pour l’utilisation des amibes se situe à environ 1 x 106 cellules/mL [6].

Pour les cultures cellulaires bactériennes, le milieu de culture majoritairement utilisé était le milieu LB-agar (10 g/L de bactopeptone, 5 g/L d’extrait de levure, 10 g/L de NaCl et 12 g/L de bactoagar) (EMD). Pour E. coli O157:H7, P. aeruginosa et S. typhimurium, les cultures ont été faites à 37°C [126-127] avec agitation à 200 rpm lorsque cultivées en milieu LB liquide (même recette que le LB-agar, mais sans bactoagar) (EMD). Étant donné le caractère pathogène des bactéries utilisées, les manipulations ont été faites dans une enceinte de biosécurité de classe II type B2 dans un laboratoire de niveau de confinement de classe 2.

Les neuf souches d’E. coli O157:H7 (Tableau 2) ont été fournies par le laboratoire de la Dre Josée Harel de l’Université de Montréal. Les sept souches de S. typhimurium (Tableau 3) ont été fournies par le laboratoire de la Dre France Daigle de l’Université de Montréal. Les 29 isolats de P. aeruginosa (isolats cliniques et environnementaux) ont été fournis par le laboratoire de Dr Jean Barbeau. Les isolats cliniques ont été isolés à partir de patients atteints par la fibrose kystique à l’hôpital de Sainte-Justine (Montréal, Qc). Les patients étaient âgés entre 4 et 18 ans (Tableau 4). Les ioslats environnementaux ont été

(42)

24

isolés des unités dentaires de la Faculté de médecine dentaire (Université de Montréal) (Tableau 5).

Tableau 2. Tableau descriptif des souches d'E. coli O157:H7 utilisées dans cette étude. Nom de la

souche Type de souche Description Références

EDL933 Souche sauvage Isolée d'une épidémie de la maladie du hamburger au Michigan en 1982 [94]

EDL933 +

pKen2-GFP Souche sauvage contenant le plasmide pKen2-GFP

Souche sauvage EDL933 exprimant la GFP

Le plasmide pKen2-GFP est un phagemide à haute copie contenant une GFP mutée s'excitant de 20 à 35 fois plus intensément que la GFP sauvage à 488 nm

[128]

EDL933

∆stx1-stx2

Mutant ne possédant pas les Shiga toxines stx1 et stx2

La cytotoxité de cette souche est grandement diminuée

comparée à la souche sauvage EDL933 [129] EDL933 ∆stx1-stx2 + pKen2-GFP Mutant de la souche

sauvage EDL933 possédant le plasmide pken2-GFP, mais ne possédant pas les Shiga toxines stx1 et stx2

La cytotoxité de cette souche est grandement diminuée

comparée à la souche sauvage EDL933

Version GFP de la souche EDL933

∆stx1-stx2

[129-130]

EDL933 ∆stx1 Mutant ne possédant pas la Shiga toxine stx1

Souche moins cytotoxique pour l'amibe A. castellanii que la souche sauvage EDL933

[129-130] EDL933 ∆phoB Mutant ne possédant pas le gène phoB Ne régule plus la réponse face à la limitation du phosphate [131-132] EDL933

∆pstCAB Mutant ne possédant pas le gène pstCAB

Activation constitutionnelle du régulon Pho

Diminution de la virulence bactérienne

[132-133] EDL933 ∆escN Mutant ne possédant pas le gène escN Système de sécrétion de type 3 non fonctionnel [134] EDL933 ∆eae Mutant ne possédant pas le gène eae

Perte de l'intimine

Perte de la capacité d'attachement de la bactérie aux cellules épithéliales (in vitro)

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25 Tableau 3. Tableau descriptif des souches de S. typhimurium utilisées dans cette étude.

Nom de la

souche Type de souche Description Références

X3339 Souche sauvage SL1344 Souche sauvage virulente [137]

DEF208

Mutant de SL1344 ne possédant pas

invA

Mutant du système de sécrétion de type III dans l'îlot de pathogénicité 1 chez Salmonella (SPI-1) avirulent chez la souris [138] DEF458 Mutant de SL1344 ne possédant pas sseB

Mutant du système de sécrétion de type III dans l'îlot de pathogénicité 2

chez Salmonella (SPI-2) [139]

X8298

Mutant de SL1344 ne possédant pas

phoP

Mutant de la composante phoP du système phoP/Q

Ne permet pas la réplication

intracellulaire de S. typhimurium dans les macrophages

[140]

UK-1 Souche sauvage Souche sauvage virulente isolée d'un

cheval [141]

LT2 Souche sauvage X3000 Souche sauvage virulente [142]

14028 Souche sauvage

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26

Tableau 4. Isolats cliniques de P. aeruginosa isolés de patients ayant la fibrose kystique et utilisés dans cette étude.

Nombre Sexe du patient naissance Date de Ville d'échantillonnage Date

279 Femme 09-04-69 Montréal Nord 17-05-88

297 Femme 25-08-80 Saint-Pie-de-Bagot 01-06-88

358 Femme 28-11-80 Laprairie 04-10-88

359 Femme 10-03-75 Répentigny 04-10-88

392 Homme 16-11-84 Saint-Roch-de-l'Achigan 24-11-88

403 Femme 19-04-74 Trois-Rivière 10-01-89

E-500 Femme 24-02-76 Mont Laurier 26-09-89

506 Femme 26-08-75 Saint-Blaise 10-10-89

578-A Homme 25-09-73 Montréal Nord 31-06-90

578-B Femme 15-06-75 Mont Laurier 31-06-90

585 Femme 18-07-72 Saint-Jean sur Richelieu 21-08-90

VD 171 Femme 04-11-75 McMasterville 27-10-87

VD 329 Femme 04-11-75 McMasterville 23-08-88

VD 706 Femme 04-11-75 McMasterville 17-10-89

VD 564 Femme 04-11-75 McMasterville 15-05-90

(45)

27 Tableau 5. Isolats environnementaux de P. aeruginosa provenant d'unités dentaires et utilisés dans cette étude.

Section de clinique dentaire Abréviation de la section Numéro de l'unité dentaire Prothèse partielle/fixe PPF 1 2 7 13 18 19 20 21 Urgence Urg 5 7 Orthodontie Ortho 1 Chirurgie Chir D-144 D-144 assistante 3.2 Test de prédation

Le test de prédation a été utilisé afin de déterminer le niveau de résistance des bactéries à la prédation par les amibes selon des concentrations variables de ces dernières [144]. Le test a été fait trois fois pour chaque souche bactérienne afin d’en confirmer le résultat. Les souches ont été cultivées dans du milieu LB liquide. Ces précultures toujours initiées à partir de bactéries congelées et faites dans des tubes Snapcap, ont été incubées pendant 24 heures à 37°C avec une agitation de 200 rpm. Ensuite, un volume de 300 µL de la préculture a délicatement été étalé sur l’ensemble de la surface d’un Pétri de 10 cm contenant 35 mL de milieu de culture gélosé afin d’obtenir un tapis bactérien uniforme. Les milieux de culture utilisés étaient le HL5-agar (même recette que le HL5 liquide, mais avec 20 g/L de bactoagar) pour les souches d’E. coli O157:H7, de milieu SM-agar (10 g/L de bactopeptone, 1 g/L d’extrait de levure, 2,2 g/L de KH2PO4, 1 g/L de K2HPO4, 1 g/L de

(46)

28

MgSO4•7H2O et 20 g/L de bactoagar pour 950 mL d’eau distillée additionné, après

autoclavage, de 50 mL de glucose 20 g/100 mL filtré stérilement) [6] pour les souches de

S. typhimurium et de milieu SM-agar dilué 1/10 pour les isolats de P. aeruginosa. Les Pétri

ont par la suite été séchés dans une hotte à flux laminaire.

Une fois les tapis bactérien séchés, différentes concentrations d’amibes DH1-10 ont été déposées sur le tapis bactérien sous forme de gouttes de 5 µL. Les concentrations d’amibes étaient de 50 000 cellules/5 µL à 0 cellule/5 µL. Les amibes utilisées dans ces expériences provenaient de cultures n’ayant pas plus de 60% de confluence. Une fois les gouttes séchées, les Pétri étaient incubés à 21°C. La présence de plages de phagocytose a été observée après sept jours d’incubation.

3.3 Test de lyse

Le test de lyse a été utilisé afin de déterminer si les isolats de P. aeruginosa sécrètent des produits ayant la capacité de lyser les cellules de D. discoideum [145]. Le test a été fait dans une plaque 24 puits stérile en polystyrène. Dans chaque puits, 500 µL de milieu HL5 contenant 500 000 cellules de D. discoideum ont été déposés pendant un minimum d’une heure à 21°C. Les amibes pour ces expériences provenaient de cultures n’ayant pas plus de 60% de confluence.

Le jour précédent l’expérience, une préculture bactérienne de chaque isolat de

P. aeruginosa a été incubée pendant 24 heures à 37°C avec une agitation à 200 rpm dans 2

mL du milieu LB. Par la suite, la préculture bactérienne a été centrifugée à 3220 g pendant 10 minutes. Le surnageant a été recueilli et filtré avec un filtre stérile en polyethersulfone de 0,2 µm fixé sur une seringue. Ensuite, le milieu HL5 contenu dans le puits a doucement été enlevé et délicatement remplacé par le surnageant filtré d’un des isolats de

P. aeruginosa. En utilisant une caméra Moticam Pro 252A montée sur un microscope

inversé et le logiciel Motic Images Advanced 3,2, des images des mêmes cellules amibiennes ont été prises à 0 minute et 10 minutes. Cette procédure a été répétée avec le surnageant de chaque isolat au moins quatre fois dans des expériences distinctes. La

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29 disparition de la réfringence des amibes est associée à leur lyse [145]. Le pourcentage de la lyse cellulaire a été déterminé. La souche PAO1 a été utilisée comme contrôle positif et les images ont été prises à 0 minute et 5 minutes étant donné la cytotoxicité importante du surnageant de cette souche [145]. Cette souche a initialement été isolée en 1955 à Melbourne, en Australie, à partir d’une plaie [109].

3.4 Essai d’enrobage de bactéries

La stimulation de l’enrobage a permis de déterminer si les bactéries sélectionnées étaient enrobables. La stimulation nécessitait une coculture de trois microorganismes différents : des amibes, des bactéries Klebsiella aerogenes et des bactéries résistantes à la prédation et non cytotoxiques pour les amibes. L’ajout de K. aerogenes dans la coculture avait pour but de favoriser l’activité de la voie endocytique des amibes et la production de CML [15].

Une préculture liquide des bactéries résistantes à la prédation et non cytotoxiques a été incubée en milieu LB liquide à 37°C pendant 24 heures avec agitation à 200 rpm. Les

K. aerogenes ont seulement été cultivées sur milieu LB-agar et resuspendues en milieu

liquide lors des manipulations. Au moment de l’expérience, la densité optique (DO à 600 nm) des bactéries devait être de 1,0, ce qui correspond à 1 x 109 cellules/mL. Les amibes provenaient d’une culture n’ayant pas plus de 60% de confluence. Pour la coculture, la concentration d’amibes souhaitée était de 1 x 106 cellules/mL. La coculture d’amibes, de

K. aerogenes et de bactéries ARB a été faite dans des tubes Snapcap contenant un milieu

sans nutriment, le tampon Soerensen 1X (Solution stock 50X : Na2HPO4•2H2O à 100 mM

et KH2PO4 à 735 mM, additionné de 500 mL d’eau et le pH est ajusté à 6,0 une fois la

solution 1X faite) [146]. Un milieu sans nutriment était nécessaire afin d’éviter que les bactéries enrobées stimulées ressortent de leur enrobage et se remettent à croître. Différents ratios ont été testés. Par exemple, un ratio de 1 amibe pour 1000 bactéries digérables (K.

aerogenes) et 10 ARB correspond à 1 : 1000 : 10. En termes de quantités, cela représente

1 million d’amibes pour 1 milliard de bactéries digérables et 10 millions d’ARB. Les quantités d’amibes utilisées parmi les différentes concentrations variaient entre 1 million et

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30

5 millions d’amibes. Celles des K. aerogenes variaient entre 100 millions et 1 milliard et celles des ARB entre 10 et 100 millions. Le volume final des cocultures devait être d’environ 2 mL. Les cocultures ont été incubées à 21°C pendant 24 heures avec agitation à 200 rpm. L’observation de la présence de bactéries enrobées a été faite par microscopie électronique à transmission.

3.5 Microscopie électronique à transmission (MET)

La biomasse produite après la stimulation de l’enrobage de bactéries a été centrifugée une première fois à 200 g pendant 5 minutes afin de sédimenter les amibes. Le culot d’amibes a été conservé et le surnageant a par la suite été recueilli pour subir une deuxième centrifugation à 4000 g pendant 1 minute afin de sédimenter les résidus extracellulaires comme des bactéries enrobées ou des bactéries libres. Ce culot a par la suite été mélangé au culot résultant de la première centrifugation et le mélange des deux culots a été fixé pendant 3 heures dans 0,1 M de tampon cacodylate de sodium à pH 7,3. Ce tampon contient de la glutaraldéhyde à 2% et du tétroxyde d’osmium à 0,3%. Après trois lavages avec le tampon cacodylate de sodium, il y a eu déshydratation des échantillons dans différentes concentrations d’éthanol, soit respectivement de 5 minutes dans l’éthanol 30%, 5 minutes dans l’éthanol 50%, 5 minutes dans l’éthanol 70%, 10 minutes dans l’éthanol 95% et une heure dans l’éthanol 100%. Par la suite, les échantillons ont été enrobés dans de la résine Epon et incubés toute la nuit à 37°C, puis pendant trois jours à 60°C. Après cette incubation, de très fines tranches de l’échantillon ont été coupées (entre 60 nm et 80 nm) et colorées à l’aide de citrate de plomb à 0,1% pendant 8 minutes suivi de 5 minutes à l’aide d’acétate d’uranyl à 3%. L’observation des échantillons a été faite au microscope électronique à transmission JEOL JEM-1230 à 80 kV.

3.6 Production de CML par d’autres amibes

La production de CML a aussi été vérifiée pour d’autres amibes, soit A. castellanii et H. vermiformis. Puisque les amibes produisent des CML seulement en présence de

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31 bactéries, des K. aerogenes ont été utilisées ici aussi afin de stimuler la production de CML. Ainsi, une préculture liquide de cette bactérie a été incubée à 37°C pendant 24 heures avec agitation à 200 rpm dans du LB liquide. Par la suite, 300 µL de cette préculture a été légèrement étalée sur un milieu SM-agar dans des Pétri de 15 cm. Une fois le tapis bactérien séché, quatre gouttes d’une suspension d’amibes de 5 µL ont été déposées. Les Pétri ont ensuite été séchés, puis incubés à 21°C. L’apparition de plages de phagocytose a été observée et lorsque leur croissance était adéquate, le pourtour des plages a été prélevé à l’aide d’un embout stérile. L’échantillon a été resuspendu délicatement dans 1 mL de PBS 1X (0,262 g/L de NaH2PO4•H2O, 1,442 g/L de Na2HPO4•2H2O et 9,00 g/L de NaCl,

ajouter 900 mL d’eau, ajuster le pH entre 7,2 et 7,4, puis compléter à 1 L d’eau) pour ne pas faire éclater les amibes. La présence de CML a par la suite été observée en microscopie électronique à transmission (voir section 3.5 pour les détails de la MET).

(50)

Figure

Figure 1. Schéma décrivant la voie endocytique chez D. discoideum.
Figure 3. Cytosquelette d'actine.
Figure 4. Visualisation des endosomes de recyclage grâce à la protéine p25.
Tableau 1. Ensemble des bactéries connues pour être résistantes aux amibes et leurs  caractéristiques
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