Plasticité de l’Empreinte du placeNta et de l’EndOmetre en lien avec la maturité du PorcElet - PENElOPE - Fiche Projet AAP GA 2014

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Plasticité de l’Empreinte du placeNta et de l’EndOmetre

en lien avec la maturité du PorcElet PENElOPE

-Fiche Projet AAP GA 2014

Agnès Bonnet

To cite this version:

Agnès Bonnet. Plasticité de l’Empreinte du placeNta et de l’EndOmetre en lien avec la maturité du PorcElet - PENElOPE - Fiche Projet AAP GA 2014. [Contrat] Institut National de la Recherche Agronomique (INRA); Génopole de Toulouse Midi-Pyrénées (Géno Toul); SIGENAE. 2014. �hal-02791831�

Formulaire de demande de crédits incitatifs 2014

Département de Génétique Animale

TITRE du PROJET : Plasticité de l’Empreinte du placeNta et de l’EndOmetre en lien avec

la maturité du PorcElet

Acronyme : PENElOPE

Champ Thématique :

Nom du porteur (partenaire 1) : Agnès Bonnet

Unité et équipe du porteur : UMR GenPhySE/ GENOROBUST

Partenaire 2 : P. Chavatte-Palmer (INRA Jouy-en-Josas; Biologie du Developpement et de la Reproduction ; PHASE ; équipe « Interactions mère-conceptus et conséquences à long terme »)

Partenaire 3 : L. Canario (MODGEN) ; J. Riquet (GenEpi) ; L. Liaubet, V. Voillet, A. Tircazes, 1 TR

(GENOROBUST) ; M. San-Cristobal (DYNAGEN) ;1TR UMR GenPhySE (séquençage Miseq)

Partenaire 4 : S. Maman (SIGENAE)

Plateformes impliquées : Plateformes Get-Plage, Get-Biopuces, SIGENAE

1) Contexte et Etat de l’art

La sélection pour la prolificité et la croissance maigre chez le porc s’est accompagnée d’une augmentation substantielle de la mortalité des porcelets. En particulier, l’augmentation de la mortalité néonatale s’explique en partie par un retard de maturité des porcelets à la naissance [1]. Les processus d’acquisition de cette maturité au cours du dernier mois de gestation, et leurs éventuelles variations en relation avec la génétique et l’environnement maternel utérin, jouent donc un rôle déterminant dans la mortalité précoce du porcelet. La survie des porcelets est, par exemple, corrélée positivement à l’efficacité placentaire [2].

Le placenta est l’organe central des échanges mère-fœtus ; il régule l’allocation des nutriments de la mère vers le jeune. L’allocation des ressources intra utérus influence la programmation métabolique des fœtus. La quantité de nutriments transmis au fœtus a des conséquences importantes sur sa croissance, sa santé tout au long de la vie et détermine en partie sa performance de production. Le placenta est aussi le siège d’un conflit parental entre le génome maternel (environnement utérin et demi génome fœtal) et le génome paternel (autre demi génome fœtal). La génétique maternelle est conditionnée pour repartir les ressources sur plusieurs portées et limiter la croissance fœtale en cas de compétition nutritionnelle, alors que les gènes paternels sont programmés pour favoriser le développement de la progéniture actuelle. Un dialogue entre gènes de l’endomètre, gènes placentaires, et gènes fœtaux va donc s’instaurer pour adapter le phénotype placentaire à la disponibilité en nutriments. Ces changements font intervenir, en particulier, des mécanismes épigénétiques.

La plupart des gènes à empreinte connus (environ une centaine de gènes chez les mammifères) sont exprimés dans le placenta et y sont indispensables. Une dérégulation de leur expression entraine des anomalies de développement du placenta et du fœtus [3]. Le statut d’empreinte des gènes dans le placenta n’est également pas toujours conservé entre les espèces. Il existe, par exemple, un plus grand nombre de gènes à empreinte dans le placenta de souris que celui de la femme. L’empreinte dans le placenta est aussi régulée en fonction de son développement et peut être limitée à une période précise de la gestation. Par exemple, l’expression du gène

mash2/ascl2 est bi-allélique chez la vache dans le trophoblaste avant l’implantation, et maternelle après

l’implantation. Enfin, il a été récemment montré chez la femme que l’empreinte placentaire est également sexe-spécifique. On dispose jusqu’à présent de peu de données d’expression globales et intégrées concernant l’endomètre et le placenta qui permettraient de mieux comprendre le rôle des interactions tissulaires dans la programmation métabolique et d’évaluer la plasticité de l’empreinte. La plupart des études se limite généralement à l’étude de quelques gènes.

Le projet ANR PORCINET, débuté en 2010, est fondé sur l’utilisation des truies LW (Large White) et des truies MS (Meishan) inséminées avec un mélange de semences des 2 races (LW et MS) (Figure 1). Il avait pour objectif d’étudier l’acquisition de la maturité fœtale chez 4 génotypes de porcelets: les purs Large White (LW - lignée sélectionnée de façon intense) qui se caractérisent par une mortalité néonatale importante, les purs Meishan (MS - lignée rustique) qui ont une forte vitalité à la naissance et sont très peu sujets à la mortalité, ainsi que les croisés réciproques LWxMS et MSxLW. Une très importante banque de tissus a été générée. Une base de données regroupant des données phénotypiques et physiologiques, des profils métabolomiques (urine, plasma et liquide amniotique), protéomiques et transcriptomiques sur 6 tissus a été construite.

Nous disposons également des 2 tissus adjacents acteurs des interactions mère-foetus, le chorion (placenta) et

l’endomètre (utérus) en contact direct. Des phénotypes des placentas (vascularisation, efficacité (i.e., poids relatif au poids du fœtus ; Figure 2A) et densité des aréoles …) et des données métaboliques permettant de mener une approche intégrative sont également disponibles. La puissance de ce dispositif devrait nous permettre de mettre en évidence des expressions mono-allèliques et mono-parentales dans les deux tissus.

2) Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer le statut de l’empreinte chez le porc en fin de gestation (110j). Les premiers résultats de PORCINET montrent qu’on identifie un nombre important de gènes ayant une expression parentale préférentielle dans le muscle, dont certains sont connus pour être soumis à empreinte. Dans ce projet seront étudiés des gènes connus dans d’autres espèces (homme, souris) pour être soumis à empreinte dans le placenta et/ou l’endomètre ainsi que de nouvelles expressions géniques préférentielles mises en évidence dans l’étude du muscle (exemple Figure 2B).

L’identification de l’expression mono-allèlique et mono-parentale s’effectuera par sélection et analyse des SNP ; Dans un premier temps, les ADN des parents et des fœtus seront séquençés à haut débit en 3’ UTR de 40 transcrits. Le 3’ UTR est, en effet, une région possédant un polymorphisme de séquence similaire aux régions intergéniques. Les études précédentes ont détecté en moyenne 1 SNP tous les 500pb entre les deux races LW et MS qui sont de génotypes très différents. Le séquençage de 2kb en 3’UTR devrait nous permettre d’identifier au moins un SNP informatif par gène. Le séquençage de l’ADN des fœtus et des parents nous indiquera l’origine parentale et nous permettra de sélectionner les fœtus informatifs.

Dans un deuxième temps, le séquençage de l’ADNc fœtal identifiera l’expression mono ou bi-allèlique des gènes (10gènes).

3) Caractère novateur ou exploratoire du projet

Ce projet va permettre, grâce au dispositif génétique de production de fœtus purs et croisés au sein d’une même portée, d’obtenir une description précise de l’empreinte à la fin du développement fœtal simultanément dans les 2

tissus adjacents (chorion et endomètre) pour une sélection de gènes chez le porc.

Ces résultats pourront etre comparés aux données existantes chez les rongeurs et l’Homme. Ils permettront de préciser le plan expérimental et les questions scientifiques d’un futur projet ANR qui proposerait une image plus exhaustive de l’épigénome, de sa plasticité dans le placenta et l’endomètre et des interactions utero-placentaires par séquençage haut débit.

4) Plan de travail et calendrier :

5)

Sélection des gènes : les gènes d’expression allèle spécifique seront choisis en fonction de la littérature (40

gènes). De nouvelles expressions parentales préférentielles précédemment identifiées dans le muscle seront également étudiées. Cette sélection se fera en collaboration avec P. Chavatte-Palmer (BDR).

Détection du polymorphisme, identification de l’origine parentale des allèles fœtaux et selection des fœtus

: L’ADN en 3’ UTR de 40 gènes (2kb en 3’UTR du gène =4 PCR de 550 pb) des 26 parents et 128 fœtus sera séquencé sur séquenceur haut débit (Miseq, Illumina) afin de détecter un polymorphisme de séquence. Ce séquençage sera effectué sur la plateforme Génomique (génopole Midi Pyrénées). Une piste de séquençage permet de fournir environ 20 millions de séquences (300pb en paired-end). Le multiplexage des 154 ADN devrait donc nous permettre d’atteindre une profondeur de lectures suffisante (800 X par fragment de 550 pb) pour sélectionner des SNP informatifs. Ces SNP permettront d’identifier l’origine parentale des allèles sur une sélection de fœtus (~10 fœtus*4G) et pour au moins 10 gènes.

Extraction des ARN et synthèse des ADNc : Les ARN tissulaires des fœtus sélectionnés seront extraits et les

ADNc synthétisés (1 stade de développement, 2 tissus, 4 génotypes et 10 animaux mâles par condition (des variabilités intra groupes sont attendues)).

Détection de l’expression mono-allélique et mono-parentale : L’expression mono-allélique sera recherchée

pour 10 gènes par séquençage haut débit (Miseq) des ADNc des 80 échantillons.

Analyses bioinfomatique et statistique : Les séquences seront assemblées, annotées et la recherche de SNP

se fera avec la plateforme Galaxy, disponible sur la plateforme bioinformatique du génopole Midi Pyrénées en collaboration avec S. Maman. La sélection des SNP informatifs et des animaux se fera en collaboration avec J. Riquet. Les analyses statistiques se feront en collaboration avec M. San-Cristobal et V. Voillet.

5) Résultats déjà acquis et résultats complémentaires attendus :

Ce projet s’appuie sur les résultats du projet PORCINET pour l’efficacité placentaire (Figure 2A) et l’identification de gènes d’expression parentale préférentielle chez les croisés réciproques dans le muscle fœtal (Figure 2B). Le dispositif expérimental de PORCINET est favorable à la mise en évidence d’une expression différentielle des gènes dans le chorion et l’endomètre puisque la littérature souligne que les fœtus MS qui se développent dans un environnement maternel MS bénéficient d’une plus grande efficacité placentaire et d’une croissance plus homogène que des fœtus LW issus d’un environnement maternel LW. Les résultats phénotypiques montrent que chez les fœtus mâles comme les fœtus femelles, il n’existe pas de différence entre les purs et les croisés au sein des truies MS et des truies LW. Chez les truies MS, l’efficacité placentaire est supérieure à 110j par rapport à 90j

(P<0.01), aussi bien chez les fœtus purs que chez les croisés. La différence d’efficacité placentaire entre 90j et 110j n’est pas significative chez les truies LW.

6) Bibliographie (max 3 références) :

1. Canario L et al: Influences génétiques ‐ Large White et Meishan ‐ sur la fin du développement de foetus purs et croisés de la même portée. In., vol. 46: Journées de la Recherche Porcine; 2014: 25-30.

2. Leenhouwers JI et al: Fetal development in the pig in relation to genetic merit for piglet survival. J Anim Sci 2002, 80(7):1759-1770.

3. Lim AL, Ferguson-Smith AC: Genomic imprinting effects in a compromised in utero environment: implications for a healthy pregnancy. Semin Cell Dev Biol 2010, 21(2):201-208.

7) Justification budgétaire (remplissez aussi le fichier Excel) : 14050 €

Demande de financement répartie comme suit :

- Broyage des tissus, extraction ARN et synthèses ADNc (80 extractions) et contrôles : 1615 € - Séquençage des ADN fœtaux et parentaux (40 gènes ; 154 individus : Miseq) : 8200 € - Séquençage des ADNc fœtaux (10 gènes ;80 échantillons : Miseq) : 3240 €

- Frais de fonctionnement : 995 €