Recherche bioguidée de molécules antipaludiques d'une plante guyanaise : Piper hostmannianum var. berbicense

Année : 2007 N° d’ordre…

THESE

En vue de l’obtention du

DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE TOULOUSE

Délivré par l’Université Toulouse III - Paul Sabatier

Discipline : Chimie

Spécialité: Chimie – Biologie – Santé

Présentée et soutenue publiquement le 19 Octobre 2007 par

Bénédicte PORTET

RECHERCHE BIOGUIDEE DE MOLECULES

ANTIPALUDIQUES D’UNE PLANTE GUYANAISE

Piper hostmannianum var. berbicense

JURY

M. A. LATTES Professeur à l’Université de Toulouse III Président M. L. ANGENOT Professeur à l’Université de Liège Rapporteur M. F. TILLEQUIN Professeur à l’Université de Paris V Rapporteur Mme E. T. GOMES Professeur à l’Université de Lisbonne Examinateur M. G. MASSIOT Directeur de Recherche CNRS-Pierre Fabre, UMS 2597 Examinateur

Monsieur le Professeur Armand LATTES

Professeur de chimie, à l’Université Paul Sabatier de Toulouse.

Qu’il nous soit ici permis de vous remercier très sincèrement pour avoir jugé ce travail malgré vos nombreuses obligations.

Nous sommes particulièrement honorés de vous avoir vu assurer la Présidence de ce Jury de Thèse.

A notre Jury de Thèse,

Monsieur le Professeur Luc ANGENOT

Professeur de pharmacognoise, à l’Université de Liège.

Nous vous remercions vivement d’avoir accepté de juger ce travail.

Nous sommes très sensible à l’honneur que vous nous faites d’en être le rapporteur. Nous sommes très honorés d’avoir pu bénéficié de vos remarques éclairées et tenons à vous assurer de notre grande estime et de notre profonde gratitude.

Monsieur le Professeur François TILLEQUIN

Professeur de pharmacognosie, à l’Université de Paris V.

Qu’il nous soit ainsi permis de vous remercier très sincèrement pour avoir spontanément accepté de juger ce travail et d’en être le rapporteur.

Nous sommes très honorés d’avoir pu bénéficier de vos conseils et tenons à vous assurer de notre considération la plus respectueuse.

Nous vous remercions vivement d’avoir accepté de juger ce travail.

Nous avons été touché par votre gentillesse et par l’intérêt porté sur nos travaux de recherche.

Monsieur le Docteur Georges MASSIOT Directeur de recherche CNRS-Pierre Fabre

Vous avez, malgré vos obligations, accepté de juger ce travail.

Nous sommes très heureux d’avoir pu bénéficié de vos remarques et de vos conseils. Nous sommes particulièrement honorés de votre présence à notre Jury de Thèse.

Monsieur le Professeur Claude MOULIS

Professeur de pharmacognosie à l’Université Paul Sabatier de Toulouse.

Nous sommes très honorés d’avoir pu bénéficié de vos remarques et de vos compétences tout au long de ces trois années de thèse.

Nous tenons à vous présenter notre profonde reconnaissance et notre respect.

Nous garderons en mémoire vos grandes qualités, tant humaines, qu’intellectuelles, votre gentillesse et votre humour.

Madame le Professeur Isabelle FOURASTE

Professeur de pharmacognosie à l’Université Paul Sabatier de Toulouse.

Vous nous avez accueilli dans votre laboratoire avec la plus grande bienveillance. Vos encouragements et votre confiance nous ont guidé tout au long de ce travail. En témoignage de notre profonde gratitude, veuillez trouvez ici nos remerciements les plus sincères.

Abréviations

p1

Lexique de botanique

p4

I. Introduction

p6

II. Synthèse bibliographique

p8

A. Description de la plante étudiée p8

A. I. Données botaniques p8

A. I. 1 Les Piperaceae p8

Position systématique des Piperaceae p8

Caractères morphologiques généraux des Piperaceae p9

Quelques Piperaceae célèbres p10

A. I. 2 Piper hostmannianum var. berbicense p11

Le genre Piper p11

Piper hostmannianum var. berbicense (Miq) C.DC p12

Utilisation en médecine traditionnelle p13

Description anatomique p13

A. II. Données phytochimiques p16

A. II. 1 Données phytochimiques sur le genre Piper p16

Généralités p16 Les alcaloïdes p16 Les flavonoïdes p16 Les kawapyrones p16 Les stéroïdes p16 Les lignanes p17

B. I. 1 Définition, classification et biosynthèse des flavonoïdes p22

Définition p22

Classification p22

Biosynthèse p23

B. I. 2 Les chalcones et les dihydrochalcones p25

Définition p25

Activités biologiques p26

B. I. 3 Les flavanones p27

Définition p27

Activités biologiques p27

B. II Application de la spectrométrie de masse à l’étude de la fragmentation des

flavonoïdes minoritaires p29

B. II. 1 Travaux réalisés en ionisation électronique p29

B. II. 2 Ionisation par electrospray et ionisation chimique à pression atmosphérique (ESI

et APCI) p37

Ionisation par electrospray (ESI) p37

Ionisation chimique à pression atmostphérique (APCI) p42

C. Généralités sur le paludisme p45

C. I. Epidémiologie p45

Des chiffres alarmants p45

Répartition géographique p45

C. II. Le parasite et le vecteur p46

C. II. 1 Les parasites du genre Plasmodium p46

Classification p46

Cycle de reproduction p48

C. II. 2 Le vecteur : un moustique femelle du genre Anopheles p50

Classification p50

C. IV. Prévention et traitement du paludisme p52

C. IV. 1. Prévention du paludisme p52

La lutte anti-vectorielle p52

La chimioprophylaxie p52

C. IV. 2 Le traitement du paludisme p53

C. IV .2. 1 Les principaux antipaludiques p53

Les schizonticides p53

Les gamétocytocides p58

Phénomènes de résistance de P. falciparum aux antipaludiques p59 C. IV. 2. 2 Les remèdes traditionnels : une alternative ? p60

C. V Généralités sur les cibles thérapeutiques p61

III. Résultats et discussion

p63

D. Etude phytochimique bioguidée de Piper hostmannianum var. berbicense p63

D. 1 Matériel végétal p63

D. 2 Travaux préliminaires : étude comparative des deux variétés de Piper

hostmannianum Guyanaises p63

D. 3 Extraction p67

D. 4 Purification p68

D. 4. 1 Purification de l’extrait hexanique issu du lot 1016 p69

D. 4. 1. 1 Purification de la fraction F1 p70

Purification de la fraction F1.2 p71

Purification de la fraction F1.3 p71

Purification de la fraction F1.4 p72

D. 4. 1. 2 Purification de la fraction F3 p72

D. 4. 2 Purification de l’extrait hexanique issu du lot 1016bis p72

D. 4. 2. 1 Purification de la fraction F4’ p73

D. 5. 1. 1 Détermination structurale du composé Host9 p79

D. 5. 1. 2 Détermination structurale du composé Host7 p82

D. 5. 1. 3 Détermination structurale du composé Host2 p88

D. 5. 1. 4 Détermination structurale du composé Host3 p92

D. 5. 1. 5 Détermination structurale du composé Host4 p94

D. 5. 1. 6 Détermination structurale du composé Host5 p95

D. 5. 1. 7 Bilan des molécules isolées de type dihydrochalcone p98

D. 5. 2 Détermination structurale des composés de type chalcone p100

D. 5. 2. 1 Détermination structurale du composé Host11 p100

D. 5. 2. 2 Détermination structurale du composé Host12 p104

D. 5. 2. 3 Détermination structurale du composé Host6 p106

D. 5. 2. 4 Bilan des molécules isolées de type chalcone p110

D. 5. 3 Détermination structurale des composés de type flavanone p112

D. 5. 3. 1 Détermination structurale du composé Host1 p112

D. 5. 3. 2 Détermination structurale du composé Host8 p117

D. 5. 3. 3 Détermination structurale du composé Host10 p119

D. 5. 3. 4 Détermination structurale du composé Host13 p121

D. 5. 3. 5 Détermination structurale du composé Host14 p124

D. 5. 3. 6 Détermination structurale du composé Host15 p126

D. 5. 3. 7 Détermination structurale du composé Host16 p129

D. 5. 3. 8 Bilan des molécules isolées de type flavanone p131

D. 6 Résultats des tests biologiques p133

D. 6. 1 Activités biologiques in vitro p133

D. 6. 2 Activités biologiques in vivo p135

D. 7 Bilan de l’étude phytochimique bioguidée de P. hostmannianum var. berbicense p137

E. Etude de la fragmentation des chalcones, dihydrochalcones et flavanones par

E. 2. 4 Bilan : clé d’identification des composés de type chalcone p144

E. 3 Etude de la fragmentation des dihydrochalcones par (-)-APCI p146

E. 3. 1 Fragments A ou B p148

E. 3. 2 Fragments obtenus suite à des pertes de neutres p148

E. 3. 3 Bilan : clé d’identification des composés de type dihydrochalcone p150

E. 4 Etude de la fragmentation des flavanones par (-)-APCI p151

E. 4. 1 Fragments A ou B p152

E. 4. 2 Fragments obtenus suite à des pertes de neutre p152

E. 4. 3 Bilan : clé d’identification des composés de type flavanone p154

E. 5 Comparaison de la fragmentation des dérivés chalcones et dihydrochalcones en APCI en

mode négatif p155

Comparaison des fragments A ou B obtenus p155

Comparaison des fragments obtenus suite à des pertes de neutres p155 E. 6 Comparaison de la fragmentation des chalcones/dihydrochalcones et flavanones par

APCI en mode négatif p156

Comparaison des fragments obtenus A ou B obtenus p156

Comparaison des fragments obtenus suite à des pertes de neutres p157 E. 7 Comparaison de la fragmentation des chalcones et des flavones en spectrométrie de

masse (techniques d’ionisation douces) p158

Comparaison des fragments obtenus A ou B obtenus p158

Comparaison des fragments obtenus suite à des pertes de neutres p158 E. 8 Conclusion de l’étude de la fragmentation des chalcones, dihydrochalcones et flavanones

par (-)-APCI p159

F. Etude par LC/DAD/(-)-APCI-MSn de l’extrait acétate d’éthyle de feuilles de Piper

hostmannianum var. berbicense p160

F. 1 Profil chromatographique p160

Composé de rapport m/z 327 à Tr 8.92 min p181

Composé de rapport m/z 327 à Tr 12.14 min p184

Composé de rapport m/z 341 à Tr 18.01 min p187

Composé de rapport m/z 341 à Tr 22.76 min p191

F. 3 Bilan de l’analyse par LC/DAD/APCI-MSn p194

IV. Conclusions et perspectives

p196

V. Matériels et méthodes

p200

G. Matériels et méthodes p200

G. 1 Matériel végétal et extraction p200

Identification de la plante p200

Préparation des échantillons p200

Extraction p200

-Extraction par l’ASE 100 Dionex® p200

-Extraction par lixiviation p201

G. 2 Méthodes chromatographiques analytiques p201

G. 2. 1 Chromatographie sur couche mince (CCM) p201

G. 2. 2 Chromatographie liquide haute performance (HPLC/DAD-UV) p202 G. 2. 3 Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse p203

G. 3 Méthodes chromatographiques préparatives p203

G. 3.1 Chromatographie sur colonne ouverte (CC) p203

G. 3. 2 Chromatographie liquide à moyenne pression (MPLC) p204 G. 3. 3 Chromatographie SPE sur cartouches de silice C18 (Vac Elut®) p204

G. 3. 4 Chromatographie liquide haute performance semi-préparative (HPLC semi-prep)

p205

Ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) p206

Spectrométrie de masse haute résolution p206

Ionisation par electrospray (ESI) p207

G. 4. 6 Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) p207

G. 4. 7 Diffraction aux rayons p208

G. 5 Tests biologiques p208

G. 5. 1 Tests réalisés sur P. falciparum p208

G. 5. 1.1 La culture in vitro p208

G. 5. 1. 2 La synchronisation p209

Principe p209

Mode opératoire p209

G. 5. 1. 3 Evaluation de l’activité antiplasmodiale p210

Principe p210

Mode opératoire p220

Détermination de la CI50 p210

G. 5. 2 Tests de cytotoxicité réalisés sur des cellule MCF-7 p211

Principe p211

Mode opératoire p211

G. 5. 3 Tests in vivo sur souris p211

VI. Références bibliographiques

p213

VII. Annexes

p222

Données spectroscopiques des composés étudiées p222

Spectres UV, IR, MS, RMN 1D et 2D du composé Host9 (dihydrochalcone) p238 Spectres UV, IR, MS, RMN 1D et 2D du composé Host12 (chalcone) p242 Spectres UV, IR, MS, RMN 1D et 2D du composé Host10 (flavanone) p246

(1), (2), (3) etc. :désignation des composés mentionnés dans la synthèse bibliographique.

[α]D : pouvoir rotatoire.

ACT : Artemisinin Combination Therapy. AcOEt : acétate d’éthyle.

APCI : ionisation chimique à pression atmosphérique (Atmospheric pressure chemical ionization).

APG : Angiosperm Phylogeny Group. ADN : Acide désoxyribonucléique. ARN : Acide ribonucléique.

ASE : Automatic Sampler Extractor. br s : singulet élargi (broad singulet).

CC : Chromatographie sur Colonne ouverte. CCM : Chromatographie sur Couche Mince.

CNRMI : Centre National de Références pour les Maladies d’Importation.

CoA : Coenzyme A.

CDCl3 : chloroforme deutéré.

CHCl3 : chloroforme.

CH2Cl2 : dichlorométhane.

CI50 : Concentration Inhibitrice à 50%, concentration nécessaire pour avoir

50% d’inhibition de croissance du parasite. COSY : Correlated SpectroscopY.

CQ : Chloroquine.

δ

δ

DE50 : Dose Efficace à 50%. Si on mesure la parasitémie, il s’agit de la

concentration qui permet de diminuer la parasitémie des souris de 50% par rapport aux souris témoins.

DTT : Dithiothréitol.

d : doublet.

dd : doublet dédoublé.

ddd : doublet de doublet dédoublé.

EI : ionisation électronique (electronic ionization). ESI : ionisation par électrospray (electrospray ionization). FAB : ionisation par bombardement d’atomes rapides

(Fast atom bombardment).

H2O : eau distillée.

Host1, Host2, etc : Désignation des composés isolés.

Hex : Hexane.

HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation. HPLC : High Pressure Liquid Chromatography.

HRMS : Spectrométrie de masse haute résolution (High Resolution Mass spectrometry).

HSQC : Heteronuclear Single Quantum Coherence.

Hz : Hertz.

IR : Infra-Rouge.

J : constante de couplage.

LC/MS :chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse (Liquid chromatography/Mass Spectrometry).

m : multiplet.

m/z : rapport masse/charge atomique. MDR : Multiple Drug Resistant.

MeOD : Méthanol deutéré.

MeOH : Méthanol.

MPLC : Chromatographie liquide moyenne pression (Medium Pressure Liquid chromatography).

RMN 1H : Résonance magnétique nucléaire du proton. RMN 13C : Résonance magnétique nucléaire du carbone.

s : singulet.

SPE : Solid Phase Extraction.

TIC : Total Ion Current (Courant ionique total).

Tol : toluène.

uma : unité de masse atomique.

UMR : Unité Mixte de Recherche.

UV : Ultra-violet.

WHO : World Health Organization.

XTT : 2,3-bis-(2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl)-2H-tetrazolium-5-carbonilide de sodium.

Actinomorphe : qualifie une corolle ayant plusieurs plans de symétrie (en étoile).

Albumen : tissu de réserve, généralement triploïde, résultant de la croissance de l’embryon accessoire obtenu lors de la double fécondation des Angiospermes, entre un gamète mâle et les deux noyaux centraux du sac embryonnaire.

Apex : sommet.

Carpelles : définissent les organes reproducteurs femelles formant le pistil ou gynécée.

Drupe : fruit en partie charnu possédant le plus souvent un seul noyau (ex : cerise).

Epiphyte : qualifie des espèces de végétaux qui vivent sur les troncs, les branches, les feuilles

d’un autre végétal.

Glabre : dépourvu de poils.

Monoaperturé : se dit d’un pollen présentant un seul pore (ou fente de sortie).

Nucelle : tissu de réserve, diploïde, d’origine maternelle, il est en général transitoire et

disparaît lors de la croissance de l’embryon. S’il persiste dans la graine, il est alors appelé périsperme.

Oppositifolié : inséré du côté opposé d'où naît la feuille.

Ovaire supère : l’ovaire est insérée dans la fleur au dessus des pétales et sépales.

Périsperme : tissu de réserve, diploïde, d’origine maternelle qui est le nucelle.

Placentation : désigne la disposition des ovules à l’intérieur de l’ovaire. Une placentation

basilaire indique que les ovules sont fixés à la base des carpelles.

Pubescent : se dit d’une feuille, d’une tige qui est couverte de poils fins et courts.

Sessile : qualifie une fleur, un fruit ou une feuille sans pédoncule ou pétiole.

Endémie parasitaire majeure, le paludisme ou malaria sévit dans les régions tropicales et sub-tropicales de l’hémisphère sud. Plus de deux milliards de personnes sont susceptibles de contracter la maladie à travers le monde. Actuellement, malgré l’arsenal thérapeutique existant, peu de médicaments sont disponibles sur le marché et sont accessibles aux populations concernées. De plus, le développement de phénomènes de résistance du parasite aux traitements actuels renforce le besoin urgent de trouver de nouveaux antipaludiques.

Dans le monde, près de 80% de la population a recours aux plantes médicinales par manque d’accès aux médicaments prescrits mais aussi parce que les plantes ont pu démontrer une réelle efficacité. Deux antipaludiques actuels sont issus de plantes traditionnellement utilisées dans leur pays d’origine contre les fièvres et le paludisme. Il s’agit de l’écorce d’un arbre originaire des flancs de la cordillère andine (Cinchona calisaya et autres espèces de Cinchona) et d’une herbacée originaire de Chine, Artemisia annua. Ces découvertes encouragent la recherche de nouveaux antipaludiques au sein de la biodiversité végétale.

Le laboratoire de pharmacochimie des substances naturelles et pharmacophores redox, sous le label UMR-152 IRD-UPS, concentre une partie de ses recherches sur la découverte de substances naturelles bioactives et étudie, par leur intermédiaire, les mécanismes redox impliqués dans l'invasion érythrocytaire de Plasmodium. La sélection des plantes est réalisée par des chercheurs de l’IRD implantés en Amérique du Sud successivement en Bolivie, en Guyane et au Perou. Ce Laboratoire résulte de l’association d’une unité propre de l’IRD (UR 043) et d’une unité de l’Université Paul Sabatier (EA 3030).

En 2000, l’unité de recherche (R043) « Pharmacochimie des substances naturelles » s’est associée avec l’unité de service US 024 Biodival, le centre de recherche sur les substances naturelles (UMR CNRS/Pierre Fabre) et le laboratoire d’immunologie cellulaire des infections parasitaires (U511 Inserm) dans l’élaboration d’un projet de recherche intitulé « Recherche de molécules antipaludiques : criblage à haut débit de la faune et de la flore tropicale » pour répondre aux finalités du programme VIHPAL (devenu PAL+ en 2001) [VIHPAL, 1999-2000].

cibles pharmacologiques à haut débit au centre de criblage pharmacologique (UMR IPBS-CNRS/Pierre Fabre) à Toulouse, et sur culture de P. falciparum in vitro au sein de l’UR 043.

Parmi les extraits actifs testés sur une cible spécifique de P. falciparum (test d’activité sur une protéine kinase, la Pfnek-1* [Dorin et al., 2001]), l’extrait acétate d’éthyle des feuilles de Piper hostmannianum var. berbicense s’est avéré potentiellement actif. L’activité a été confirmée ultérieurement à l’UMR-152 par des tests in vitro sur des souches de P. falciparum révélant une CI50 de 8 µg/ml.

L’objectif de mon travail de thèse a consisté à rechercher par bioguidage les substances naturelles antiplasmodiales présentes dans les feuilles d’une Piperaceae, Piper hostmannianum var. berbicense.

Dans un premier chapitre, nous résumerons une étude bibliographique sur les connaissances botaniques et phytochimiques de la famille des Piperaceae et de l’espèce étudiée. Nous développerons également l’utilisation de la spectrométrie de masse comme outil d’analyse et d’identification de composés naturels et plus particulièrement de flavonoïdes (chalcones, dihydrochalcones et flavanones). Une présentation du paludisme et des remèdes actuels terminera cette synthèse bibliographique.

Le second chapitre sera consacré à l’étude phytochimique bioguidée de Piper hostmannianum var. berbicense. Nous détaillerons les étapes de fractionnement et nous décrirons l’identification des composés isolés avant de présenter les résultats des tests biologiques obtenus in vitro et in vivo.

Dans le troisième chapitre, nous présenterons le travail au cours d’un stage en spectrométrie de masse réalisé à l’UCL (Université Catholique de Louvain) à Bruxelles au sein du laboratoire d’analyse physico chimique des médicaments et pharmacognosie dirigé par le Pr. Joëlle Quetin-Leclercq. L’étude de la fragmentation en spectrométrie de masse des composés isolés sera présentée avant l’application de la LC/MSn dans l’étude approfondie d’un extrait brut de Piper hostmannianum var.

A. Description de la plante étudiée

A. I. Données botaniques

A. I. 1 Les Piperaceae

Position systématique des Piperaceae

La famille des Piperaceae comprend entre 1400 et 3000 espèces réparties en une dizaine de genres dont les deux principaux représentants sont le genre Piper et le genre Peperomia [Spichiger, 2000]. Ce sont des herbes, arbustes (Piper) ou arbres parfois grimpants ou épiphytes, aromatiques présents dans les régions tropicales et sub-tropicales de l’hémisphère sud et plus particulièrement en Amérique du Sud (voir Fig. 1).

Fig. 1 : Répartition mondiale des Piperaceae [Stevens, 2001].

Selon les classifications classiques pré-moléculaires [Cronquist, 1988], les Piperaceae sont des dicotylédones appartenant à l’ordre des Pipérales, ordre qui comprend également les Chlorantaceae et les Saururaceae (voir Tableau 1).

Classification Classique (Cronquist, 1988)

Règne Plantae

Sous-règne Tracheobionta (plantes vasculaires)

Embranchement Spermaphytes (plantes à graines)

Sous-embranchement Angiospermae (plantes à fleurs)

Classe Magnoliopsida (Dicotylédones)

Parmi les classifications basées essentiellement sur des critères morphologiques et anatomiques, celle de Cronquist est la plus utilisée.

En 1998, un groupe de chercheurs (Angiosperm Phylogeny Group, APG) élabore un nouveau système de classification basé sur des critères phylogénétiques. Il prend en compte tous les caractères héritables, depuis ce qui est visible (base des classifications traditionnelles) jusqu’aux séquences d’ADN, en passant par les protéines et les données de la paléontologie. Le séquençage de certaines parties du génome comme l’ADN des mitochondries ou l’ARN des ribosomes a permis au cours des dernières années de faire des progrès importants [Spichiger, 2000]. Aujourd’hui, il s’agit de la classification la plus utilisée : APG I 1998. Ainsi, au sein des Angiospermes, les Piperaceae sont des dicotylédones à pollen uni-aperturé présentées sous le terme de paléoherbes car elles partagent de nombreuses plésimorphies avec les Monocotylédones (voir Tableau 2)

Classification selon APG I Classification selon APG II

Division Angiospermes Angiospermes

Classe Angiospermes monoaperturés Angiospermes monoaperturés

Super-ordre / Magnoliides

Ordre Pipérales Pipérales

Famille Piperaceae Piperaceae

Tableau 2 : Place des Piperaceae selon les classifications phylogénétiques

APG I et APG II.

Cependant cette classification a été révisée en 2003 : APG II 2003 [Password, 2003]. Cela traduit les efforts faits en systématique pour tenir compte des dernières avancées en matière de biologie moléculaire.

Selon de nouvelles considérations phylogénétiques [Graham et Olmstead, 2000; Lee et al., 1999] le super-ordre des Magnoliides a été créé comprenant l’ordre des Laurales, des Magnoliades, des Pipérales et un nouvel ordre, les Canellales, regroupant deux familles, les Canellaceae et les Winteraceae. La place des Piperaceae selon ces nouveaux critères est présenté dans le Tableau 2.

forte et piquante. Les stipules sont absentes ou soudées au pétiole (parfois engainées dans le pétiole). Les inflorescences indéterminées sont des épis épais densément couverts de petites fleurs, terminales ou axillaires, souvent déplacées en position oppositifoliée suite au développement du rameau axillaire. Les fleurs actinomorphes, hermaphrodites ou unisexuées (plantes monoïques ou dioïques) sont minuscules, chacune à l’aisselle d’une bractée peltée largement triangulaire. Le périanthe est absent. Les étamines entre une et dix, souvent six, à filet généralement libre. Les grains de pollen sont monosulqués ou monoaperturés. Les carpelles, entre une et quatre, sont soudées. L’ovaire supère est à placentation basilaire. Les stigmates entre un et quatre sont capités, lobés ou plumeux. Il y a un ovule par ovaire. Les fruits sont habituellement des drupes, l’albumen est peu développé et complété par un périsperme. Les faisceaux conducteurs des tiges sont disposés en plusieurs anneaux concentriques ou dispersés dans un parenchyme comprenant des cellules sécrétrices à huile essentielle [Campbell et al., 2001].

Quelques Piperaceae célèbres

Au sein de la famille des Piperaceae, les plantes du genre Piper sont les plus célèbres et les plus utilisées. Plusieurs d’entre elles possèdent un intérêt alimentaire, médicinal et certaines sont devenues indispensables à l’homme.

- La plus connue est le poivrier commun ou Piper nigrum L. (Fig. 2). C’est l’une des épices les plus anciennement connues. Il est originaire du sud-ouest de l’Inde (côte de Malabar) et cultivé maintenant en Inde (Kerala), en Malaisie, au Sri Lanka mais aussi en Amérique du Sud (Brésil). Le fruit est une drupe de 4-8 mm de diamètre, passant du vert au rouge au cours de la maturation. Le poivre doit son odeur à la présence de 10 à 35 ml/kg d’huile essentielle riche en carbures terpéniques et sa saveur brulante à des amides (5-10%) [Bruneton, 1999].

- Nous pouvons aussi citer le betle ou Piper betle L. dont les feuilles sont utilisées comme stimulant, antiseptique et pour rafraîchir l'haleine. Elles sont également utilisées en infusion pour traiter l'indigestion, comme onguent ou en inhalation contre les maux de tête, comme traitement contre la constipation, comme décongestionnant et aide à la lactation. Dans la

alors l'alcaloïde, arécoline, qui favorise la salivation, la salive devenant teintée de rouge. On ajoute parfois du tabac à la préparation [Duke, 2002; Duriyaprapan, 2003].

- Le kava ou Piper methysticum Forst. est une Piperaceae originaire du Pacifique occidental. Il ne pousse que dans les îles du Vanuatu et quelques îles avoisinantes. Il est largement utilisé en médecine traditionnelle pour ses propriétés anesthésiantes. En Occident, le kava est utilisé en infusion pour lutter contre les symptômes du stress, de l'anxiété et de la dépression [Duke, 2002].

Fig. 2: Piper nigrum (http://mobot.mobot.org/cgi-bin/search_vast).

A. I. 2 Piper hostmannianum var. berbicense

Le genre Piper

Le genre Piper comprend plus de 1000 espèces réparties dans les régions tropicales et sub-tropicales (Fig. 3). Ce sont des arbres ou arbustes, rarement des lianes, fréquemment rencontrés dans les forêts humides des régions de l’hémisphère sud [Jaramillo et Manos, 1988].

Piper hostmannianum var. berbicense (Miq) C.DC

Piper hostmannianum var. berbicense est une plante originaire d’Amérique du Sud et plus particulièrement de Bolivie, Colombie, Brésil, Equateur, mais surtout du Venezuela et en Guyane (www.mobot.org). Il possède un autre synonyme : Arthante berbicensis (Miq) C.DC (International plant names index : www.ipni.org).

Quatre variétés de cette espèce sont signalées (www.mobot.org). Ainsi, nous distinguons :

- Piper hostmannianum var. hostmannianum.

- Piper hostmannianum var. berbicense (Miq) C.DC, 1869 (Fig. 4). - Piper hostmannianum var. glabrirameum Trel. & Yunck, 1950. - Piper hostmannianum var. ramiflorum C.DC, 1869.

En Guyane, les deux premières variétés sont présentes.

(a) (b)

Fig. 4 : (a) P. hostmannianum var. berbicense, photo prise en Guyane.

(b) Récolte de P. hostmannianum var. berbicense dans la forêt guyanaise.

Description morphologique des deux variétés de Piper hostmannianum guyanaises Piper hostmannianum (Miq.) C.DC (1869)

Arbuste rameux de 3 m de haut, ou liane rampante. Tiges pubescentes. Feuilles sans glandes, pétioles de 5 - 10 mm de long. Feuilles elliptiques ou ovales 13-22×6×10 cm. Présence de

centrale, partant de la nervure centrale à angle ouvert, ensuite se recourbant brutalement pour s’orienter presque parallèlement à la marge.

Epis dressés, 10-12 cm de long, de blanc verdâtre à jaune. Pédoncules de 10 mm de long, pileux, les bractées florales sont très découpées. Les fleurs présentent des stigmates sessiles. Les fruits (baies) oblongs ou en forme de trigone ont un apex glabre ou pubérulent. Floraison mai, août septembre, octobre. Fructification entre mai et septembre. Commun en zone lisière de forêt, en zones non inondées [Candolle, 1869; Mori et al., 2002].

Piper hostmannianum var. berbicense (Miq.) C. DC

Cette variété présente les mêmes caractéristiques morphologiques que la variété précédente mais le jeune bourgeon foliaire terminal présente une pubescence plus dense que P. hostmaniannum. De plus, on peut distinguer la présence de poils hirsutes de taille supérieure à 1 mm. Sommet des fruits (baies) velues [Candolle, 1869; Mori et al., 2002].

La distinction de ces deux variétés sur le terrain a été permise grâce aux descriptions précédentes.

Utilisation en médecine traditionnelle

En Guyane, la décoction des feuilles est utilisée comme anti-venin. Les feuilles peuvent être directement appliquées sur les morsures de serpents [Van Andel, 2000].

Description anatomique de Piper hostmannianum var. berbicense

Feuille : la section transversale de la feuille de Piper hosmannianum var. berbicense (Fig. 5) présente une nervure médiane légèrement incurvée à la face supérieure et fortement bombée à la face inférieure, plus ou moins marquée de côtes.

Nervure médiane : Colorée par le réactif carmino-vert aluné , la section transversale présente de la face supérieure à la face inférieure :

- L’ épiderme supérieur,

- Le système conducteur formé de faisceaux libéro-ligneux est disposé en arc (liber déchiré lors de la dessication).

- Des amas de collenchyme prés de l’épiderme inférieur font face à chaque faisceau libéro-ligneux. Ils sont délimités par une assise de cellules lignifiées.

Epiderme inférieur

Parenchyme palissadique

Cellule sclérifiée Cellules

à huile essentielle Vaisseau de bois Espace correspondant au liber Epiderme supérieur Poil tecteur Collenchyme Cellules fibreuses Epiderme inférieur Parenchyme palissadique

Cellule sclérifiée Cellules

à huile essentielle Vaisseau de bois Espace correspondant au liber Epiderme supérieur Poil tecteur Collenchyme Cellules fibreuses

Fig. 5 : Section transversale de la feuille

(grossissement × 40 et pour les agrandissements ×400)

- L’épiderme inférieur (Fig. 6) présente des poils tecteurs et des poils sécréteurs. La cuticule s’interrompt au niveau des stomates. Au niveau des poils tecteurs, il y a interruption de la cuticule ce qui n’est pas le cas pour les poils sécréteurs.

Cuticule Chambre sous-stomatique Poil sécréteur (Face inférieure) Poil tecteur (Face inférieure) Cuticule Chambre sous-stomatique Poil sécréteur (Face inférieure) Poil tecteur (Face inférieure)

En passant en lumière polarisée, nous pouvons voir des cristaux en forme d’aiguilles (Fig. 7) d’oxalate de calcium [Souza L.A., 2004] dans les cellules du parenchyme à proximité des faisceaux libéro-ligneux.

A B

A B

Fig. 7: Cristaux en aiguilles d’oxalate de calcium. A : en lumière normale, B : en lumière

polarisée (grossissement × 400)

Limbe : (Fig. 8) de la face supérieure à la face inférieure se distinguent : - L’ épiderme supérieur constitué de cellules allongées,

- L’ hypoderme supérieur constitué d’une assise de cellules allongées à parois cellulosiques,

- Le mésophylle hétérogène asymétrique constitué de parenchyme palissadique et de parenchyme lacuneux . Il renferme des cellules à huiles essentielle,

- L’ hypoderme inférieur constitué d’une à deux assises de cellules allongées à parois cellulosiques,

- L’ épiderme inférieur possédant des poils tecteurs.

Epiderme inférieur Hypode rme Hypode rme Epiderme supérieur Parenchyme palissadique Parenchyme lacuneux Cellule à huile essentielle

A. II. Données phytochimiques

A. II. 1 Données phytochimiques sur le genre Piper

Généralités

L’étude phytochimique des plantes du genre Piper a largement été étudié ces dernières années faisant l’objet de revues générales [Parmer et al., 1997, 1998; Sengupta et Ray, 1987]. L’ensemble des composés isolés et identifiés est très hétérogène. Ainsi, Les constituants les plus rencontrés sont des alcaloïdes, des flavonoïdes, des kawapyrones, des stéroïdes et des lignanes dont nous allons donner quelques exemples de structures (Fig. 9).

Les alcaloïdes

Ce sont des alcaloïdes de type amides. Ces composés sont les plus rencontrés dans le genre Piper. Parmi les amides, nous pouvons distinguer des isobutylamides et des amides de type pyrrolidine ou pipéridine. Le plus connu est la pipérine (1) (Fig. 9) isolée des feuilles de Piper nigrum reconnue pour ces propriétés antipyrétique et antiinflammatoire [Lee et al., 1984; Tunmann, 1918].

Les flavonoïdes

Les flavonoïdes rencontrés sont essentiellement des chalcones, des dihydrochalcones, des flavanones et quelques flavones. Les chalcones et dihydrochalcones isolées ont généralement le cycle B non substitué sauf dans le cas de l’asébogénine 2 et des flavokawaïnes A (3) et C (4) (Fig. 9) respectivement identifiées dans les feuilles de Piper aduncum [Orjala et al., 1994] et Piper methysticum [Som, 1983].

Les kawapyrones

Ce sont des δ-lactones possédant un substituant styryle ou dihydrostyryle. La majorité des composés a été isolé dans P. methysticum dont le plus connu est la methysticine (5) (Fig. 9). Ces composés sont des antagonistes de la strychnine [Kretzschmar et al., 1970].

Les lignanes

Ce sont des composés dont le squelette résulte de l’établissement d’une liaison entre les carbones

β

β

O O N O 1 O OH OH O OH 2 O O OH O R2 R1 3 R1=H; R2=OCH3 4 R1=H; R2=OH O O O O O 5 O _O O O O 6

Fig. 9 : Quelques molécules isolées du genre Piper.

Les plantes du genre Piper et plus généralement les Piperaceae sont des plantes à huile essentielle. L’huile essentielle est généralement stockée dans les feuilles (présence de poils sécréteurs et de cellules sécrétrices) ou dans le péricarpe des fruits ou des graines [Bruneton, 1999]. Elles sont riches en terpènes et plus particulièrement en sesquiterpenes (hydrocarbonés ou oxygénés) [Dos Santos et al., 2001; Mundina et al., 1998; Vila et al., 2001]. La Fig. 10 présente quelques structures de sesquiterpènes rencontrés dans les huiles essentielles de plantes du genre Piper.

O O O O H H 7

Fig. 10 : Exemple de sesquiterpènes présents dans les huiles essentielles du genre Piper.

Molécules antipaludiques isolées dans le genre Piper

Quatre espèces de Piper ont été étudiées pour leurs propriétés antipaludiques. Il s’agit de : - P. hispidum Sw.

- P. sarmentosum Roxb. - P. chaba Hunter.

- P. polysyphonum C.DC .

Jenett-Siems et al. [1999] ont étudié l’activité antipaludique de quatorze plantes d’Amérique du Sud utilisées en médecine traditionnelle. Les extraits lipophiles de cinq d’entre elles dont P. hispidum s’avèrent être actifs suite à des tests in vitro sur deux souches de P. falciparum (PoW : souche chloroquino-sensible et Dd2 : souche chloroquino-résistance). Le fractionnement bioguidé de l’extrait lipophile des feuilles de P. hispidum a conduit à l’identification de trois composés (Fig. 11).

O O _O OH O OH OH HO

Le fractionnement bioguidé des extraits hexanique et méthanolique des feuilles de P. sarmentosum a permis l’identification de deux alcaloïdes de type amides (Fig. 12) avec des activités respectives de CI50= 18.9 µ g/ml et 6.5 µ g/ml sur la souche chloroquino-résistante K1

de P. falciparum. N O N O O O NO NO Fig. 12

Rukachaisirikul et al. [2002] ont isolé des racines de Piper chaba Hunter un alcaloïde de type amide présentant une structure dimérique (Fig. 13) avec une CI50 de 2.7 µg/ml sur la souche

chloroquino-résistante K1 de P. falciparum. O N O O N O O O Fig. 13

Un néolignane, la polysiphorine (Fig. 14) déjà isolée de P. polysiphonum [Ma et al., 1991], a été identifiée dans les feuilles de Rhapidophora decursiva (Araceae) [Zhang et al., 2001] suite à un fractionnement antiplasmodial bioguidé. Elle présente une CI50 de 4.04 µg/ml et de 3.68

µg/ml respectivement sur les souches D6 (souche chloroquino-sensible) et W2 (souche chloroquino-résistante) de P. falciparum. O O O O H

A. II. 2 Données phytochimiques sur Piper hostmannianum var. berbicense

Bien que cette variété n’a fait l’objet d’aucune publication à ce jour, nous vous présenterons ici les travaux phytochimiques réalisés sur P. hostmannianum C. DC.

Etude de la composition de l’écorce

La composition de l’écorce a été étudié par Diaz et al. [1987] et a fait l’objet d’une publication. En plus du linalol et du sitostérol, deux chromènes ((8) et (9), Fig. 27), deux esters benzoïques ((10) et (11), Fig. 15) et trois flavanones ((12), (13) et (14), Fig. 15) ont été isolés et identifiés de l’extrait hexanique.

O O O O O O 8 9 O O R1O OR2 10 R₁=R₂=H 11 R1=R2=Ac O O OR1 R2 R3O R4

12 R1=H R2=Me R3=Me R4=Me

13 R1=Ac R2=Me R3=Me R4=Me

14 R1=H R2=Me R3=H R4=H

Fig. 15 : Composés isolées de l’écorce de P. hostmannianum C.DC.

Les molécules nouvelles sont le chromène (8) et l’ester benzoïque (10). C’est la première fois que des flavanones C-méthylées ((12) et (13) Fig. 15) sont isolées dans le genre Piper.

Etude de la composition des feuilles

O OH RO O O O =R =R =R 15 16 17 O O OH OH OH 18 Fig. 16

Les auteurs ont également étudié l’activité anti-fongique des molécules isolées sur Cladosporium cladosporioides et C. sphaerospermum. La quantité totale nécessaire pour inhiber à 100% la croissance de ces champignons est de 5 µ g et de 0.5 µg sur CCM pour le chromène (8) et l’ester benzoïque (18), les autres molécules étant inactives.

Après cette première partie consacrée à la description de la plante étudiée en terme de caractères botaniques et phytochimiques, la seconde partie traite des flavonoïdes (et plus particulièrement des chalcones, dihydrochalcones et flavanones) et des critères d’identification établis pour les identifier en spectrométrie de masse.

B. Flavonoïdes et spectrométrie de masse

B. I Généralités

B. I. 1 Définition, classification et biosynthèse des flavonoïdes

Définition

Le terme « flavonoïde » désigne une très large gamme de composés naturels appartenant à la famille des polyphénols. Ils sont considérés comme les pigments quasiment universels des végétaux. Tous les flavonoïdes (plus de 4000) possèdent le même élément structural de base, à savoir l’enchaînement 2-phénylchromane (Fig. 17) [Bruneton, 1999].

O

A

B

C

Fig. 17 : 2-phénylchromane.

C’est chez les Angiospermes que la diversité structurale des flavonoïdes est maximale. Ils sont de façon très générale localisés dans les feuilles (dans l’épiderme ou entre l’épiderme et le mésophylle), dans les fleurs (cellules épidermiques) ou encore dans les fruits (tégument externe) [Bruneton, 1999].

Classification

Ils peuvent être regroupés en une douzaine de classes selon le degré d’oxydation du noyau pyranique central, lequel peut-être ouvert et recyclisé en un motif furanique (dihydrofuranone). La Fig. 18 illustre les principales classes de flavonoïdes.

O O O O OH O O O O OH O OH OH O O OH Flavones Flavonols Flavanones Dihydroflavonols Flavan-3,4-diols

Chalcones Aurones Anthocyanidols

O O OH Flavan-3-ols 1 2 3 4 5 6 7 8 1' 2' 3' 4' 5' 6' 1 2 3 4 5 6 1' 2' 3' 4' 5' 6' α β O

Fig. 18 : Les principales classes de flavonoides [Bruneton, 1999].

De façon générale, les flavonoïdes peuvent être hydroxylés en position 3, 5, 7, 3’, 4’, 5’et/ou 6’ (suivant la numérotation présentée pour les flavones, Fig. 18). Un ou plusieurs de ces groupes hydroxyles sont fréquemment méthylés, acétylés, prénylés ou sulfatés. Dans les plantes, les flavonoïdes peuvent être présents sous forme C-ou O-glycosylés. Les formes libres, sans sucres attachés sont appelés les génines ou aglycones [Bruneton, 1999].

Les « flavonoïdes minoritaires » sont représentés par les chalcones , les dihydrochalcones, les aurones, les flavanones, les dihydroflavonols et les anthocyanidols (structures encadrées dans la Fig. 18) [Harborne, 1993].

Biosynthèse des flavonoïdes (Fig. 19)

L’étape clé de la formation des flavonoïdes est la condensation de trois molécules de malonyl-CoA avec un ester du coenzyme A et d’un acide hydroxycinnamique, en règle générale le 4-coumaroyl-CoA, pour obtenir la 4, 2, 4’, 6’-tetrahydroxychalcone (réaction catalysée par la chalcone synthase). Dans les conditions physiologiques normales, cette chalcone tend à s’isomériser en flavanone sous l’action de la chalcone isomérase qui induit une fermeture

HO O O CoAS 3 + OH O CoAS malonylCoA 4-coumaroylCoA O OH HO OH OH Chalcone CS O OH HO OH Aurones CI O O OH OH HO Flavanones O O OH OH HO Flavones F3H O O OH OH HO 3-OH-Flavanones OH R R O O OH HO Isoflavones OH R R IFS O OH OH OH HO Flavan-3,4-diols OH R R DFR O O OH OH HO Flavonols OH R R O OH OH HO OH R R 3-OH-Anthocyanidines Flavan-4-ols 3-déoxycyanidines O OG OG HO OH R''' R''' Anthocyanines Flavan-3-ols polymérisation Proanthocyanines (tannins condensés)

Fig. 19 : Biosynthèse des flavonoïdes.

CS : chalcone synthase ;CI : chalcone isomérase ; F3H : Flavanone 3-hydroxylase ; IFS : isoflavone synthase ; DRF : dihydroflavonol reductase ; FS : flavonol synthase ; AS :

Remarque : cas particulier des flavonoides C-méthylés

D’après Vederas et al. [Vederas et Leeper, 2000], la biosynthèse des chalcones C-méthylés s’expliquerait par la présence d’ une méthylchalcone synthase qui catalyserait la réaction de condensation entre un méthymalonylCoA et le 4-coumaroyl-CoA pour donner la chalcone méthylée correspondante qui par suite des réactions présentées Fig. 19 conduirait aux autres flavonoides C-méthylés. L’existence d’une telle enzyme constitue un des thèmes de recherche de Schröder et al. [1998]. Néanmoins en septembre 2007, ce groupe de chercheurs n’a pas encore isolé cette enzyme.

B. I. 2 Les chalcones et les dihydrochalcones

Définition

Les chalcones et par défaut les dihydrochalcones sont uniques au sein de la famille des flavonoïdes. Dépourvus du cycle C central, les deux cycles A et B sont reliés par une chaîne tricarbonée cétonique

α

β

Fig. 20 : Numérotation du squelette chalcone (a) et flavanone (b).

La présence d’une double liaison conjuguée confère aux chalcones une couleur jaune. En conséquence, les dihydrochalcones sont généralement incolores. La configuration de la double liaison est généralement E dans les chalcones naturelles [Harborne, 1993]. Ces composés sont rarement substitués sur le cycle B.

De manière équivalente aux autres flavonoïdes, les positions 2’, 4’ et 6’ du cycle A peuvent

des substituants méthyles, prényles ou géranyles (Fig. 21) [Harborne, 1993]. Les flavonoïdes C-alkylés sont présents au niveau de la cuticule foliaire et cela concerne surtout les plantes des régions arides ou semi-arides, souvent pourvues de structures sécrétrices comme les Piperaceae [Bruneton, 1999]. O OH O O O HO O OH OH O OH HO HO OH O O O OH OH O OH HO HO OH O OH O HO OH

Fig. 21 : Exemples de structures de chalcones et dihydrochalcones

glycosylées ou alkylées .

Activités biologiques des chalcones et dihydrochalcones

Les chalcones et les dihydrochalcones ont été étudiées pour leurs propriétés anticancéreuses [Anto et al., 1995; Go et al., 2005], antiinflammatoires [Go et al., 2005; Nowakowska, 2006], antioxydantes [Anto et al., 1995], antimicrobiennes [Nowakowska, 2006] et antiparasitaires [Nowakowska, 2006].

Parmi les chalcones naturelles antipaludiques, la licochalcone A est la plus célèbre. Isolée de la réglisse (Glycyrrhiza glabra), elle est particulièrement active in vitro avec une CI50 de 0.5

µg/ml sur les deux souches chloroquino-sensible (3D7) et résistante (Dd2) de P. falciparum [Chen et al., 1994]. De plus, une étude in vivo sur des souris infectées par P. yoeii montre que 100% d’inhibition de parasitémie est obtenue après 3 à 6 jours de traitement [Kharazmi, 1997]. En ce qui concerne les dihydrochalcones, la plus connue est la Phloridzine (Fig. 22) qui est une dihydrochalcone glycosylée isolée de Micromelum tephrocarpum (Rutaceae), utilisée en médecine traditionnelle dans le traitement du paludisme. D’après Kutner et al. [1987] qui se sont intétéssés à son mode d’action, le composé agirait au niveau de la

Fig. 22 : La licochalcone A et la phloridzine.

B. I. 3 Les flavanones

Définition

Ces molécules sont caractérisées par l’absence de double liaison en 2, 3 et par la présence d’un centre d’asymétrie en 2. Chez les flavanones naturelles, le carbone 2 est normalement de configuration S. Elles existent sous forme libre ou sous formes glycosylées. Sous forme libre, les carbones en position 5 et 7 sur le cycle A peuvent être hydroxylées ou méthoxylées. Le cycle B peut aussi être substitué en position 3’, 4’, 5’ et 6’. Les dérivés C-alkylés sont relativement courants, surtout les dérivés prénylés ou géranylés (Fig. 23). Les dérivés C-méthylés sont fréquemment rencontrés chez les Myrtaceae [Wollenweber et al., 2000]. Ce type de composé a déjà été isolé des racines de P. hostmannianum [Diaz et al., 1987] (Fig.

15). O O HO OH 4 R=OH 5 R=OCH3 R OH O O OH O

Fig. 23 : Exemples de flavanones C-alkylées.

Activités biologiques des flavanones

Les flavanones étant plus répandues dans le règne végétal que les chalcones et dihydrochalcones, leurs activités biologiques ont particulièrement été étudiées. Ainsi on leur attribue des propriétés antioxydantes [Stevens et al., 2003], antimicrobiennes, anticancéreuses

Parmi les flavanones naturelles antiplasmodiales les plus actives, Kim et al. [2004] ont isolé des flavanones prénylées relativement actives des feuilles d’Artemisia indica avec des CI50

comprises entre 4 et 7 µM sur la souche K1 chloroquino-résistante de P. falciparum (Fig. 24).

O O OH HO OR1 R2O 1 : R1=R2=CH3 2 : R1=R2=H 3: R1=H, R2= CH3 4: R1=CH3, R2=H O O RO OH HO 5 : R=CH3 6 : R=H OH

B. II Application de la spectrométrie de masse à l’étude de la fragmentation

des flavonoïdes minoritaires

La spectrométrie de masse reste la technique privilégiée pour la détermination de la masse des molécules. Différentes techniques d’ionisation existent dont les plus récentes sont les techniques d’ionisation douces que sont l’électrospray (ESI : electrospray ionization) et l’ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI : atmospheric pressure chemical ionization). Les flavonoïdes ont été largement étudiés en spectrométrie de masse en particulier les dérivés glycosylés [Hvattum et Ekeberg, 2003; Stobiecki, 2000]. Ces études ont permis d’établir des schémas de fragmentation de ces composés dans le but de pouvoir les identifier dans un extrait brut sans avoir à les isoler [Lee et al., 2005; Ye et al., 2005; Zhou et al., 2006].

Ainsi, l’introduction de la LC/MSn dans l’analyse des extraits de plante représente une étape importante dans l’identification des produits naturels [Justesen et al., 1998; Lee et al., 2005; Wolfender et al., 2000]. C’est la technique de choix pour caractériser rapidement sans séparation chimique les éléments d’un mélange de composés naturels pour savoir s’ils sont connus ou non.

Cette partie sera consacrée à la synthèse bibliographique des principales études en spectrométrie de masse des chalcones, dihydrochalcones et flavanones en EI (ionisation électronique), ESI et APCI. Cette synthèse nous permettra de comprendre précisément les fragmentations de ces composés dans le but d’étudier et d’identifier par LC/MSn des molécules de même génine dans l’extrait acétate d’éthyle de P. hostmannianum var. berbicense (ce travail vous sera présenté dans la partie résultats de ce manuscrit).

B. II. 1 Travaux réalisés en ionisation électronique (EI)

Le premier spectre de masse de chalcones a été enregistré par Beynon en 1960 [Beynon, 1960]. En 1966, Audier [1966] montre pour la première fois que les 2’-hydroxychalcones présentent une fragmentation spécifique dont le spectre de masse est identique à celui des

[Itagaki et al., 1966; Van De Sande et al., 1972]. Cet équilibre existe aussi en solution en milieu acide ou basique [Arcus et al., 1992; Old et Main, 1982].

O OH O O H O O 2'-hydroxychalcone flavanone H H

Fig. 25: Mécanisme possible d’isomérisation entre

2’hydroxychalcone ↔ flavanone dans la source d’ionisation du spectromètre [Van De Sande et al., 1972].

Van De Sande et al. [1972] ont comparé pour la première fois la fragmentation des chalcones et des flavanones. Dans le cas de la génine chalcone, les ions fragments majoritaires sont les ions m/z 130, m/z 104 et m/z 78 qui proviennent respectivement du clivage entre le cycle A et la fonction carbonyle, la fonction carbonyle et le carbone α, et entre le carbone

β

Pour l’ion m/z 130, Van De Sande et al. [1972] ont ainsi proposé une structure cyclique (Fig.

26) provenant d’un réarrangement avec un proton en position ortho sur le cycle A, les auteurs

O A B α β H O A m/z 130 B m/z 104 A m/z 78

Fig. 26 : Schéma de fragmentation du squelette chalcone par EI proposé par

Van de Sande et al. [1972].

En présence de substituants sur les cycles (Fig. 27), des ions fragments additionnels sont obtenus, par exemple dans le cas d’une substitution par un groupement méthyle ou un groupement méthoxyle : O A B α β CH2 H C O m/z 118 - CO _C 7H6 m/z 90 2'-methylchalcone O A B α β O O C O m/z 130 - CO m/z 92 2'-methoxychalcone C O - CO C5H4 m/z 118 - C2H2 _C 9H8 C7H7 + m/z 92 m/z 91 m/z 64

La Fig. 28 représente les fragmentations caractéristiques du squelette flavanone. La 2’-hydroxychalcone correspondante (représentée Fig. 25) présente les mêmes ions fragments.

O O A B O O A m/z 145 O C O m/z 130 - CO m/z 92 C O - CO C5H4 m/z 64 B m/z 104 m/z 78 C4H4+ m/z 52 -C2H2 -C2H2

Fig. 28 : Schéma de fragmentation du squelette flavanone par EI proposé par

Van de Sande et al. [1972].

Les schémas de fragmentation des chalcones établis jusqu’à présent ont tendance à se contredire en ce qui concerne la structure des ions fragments. Ainsi, Ardanaz et al. [1991] s’intéressent plus particulièrement à l’ion m/z 130 (issu du squelette chalcone) dont deux structures ont été proposées jusqu’à présent. Une structure cyclique proposée par Van de Sande et al. [1972] et une structure linéaire proposée par Rouvier [1976] (Fig. 29).

O A B A O+ B

En utilisant des dérivés deutérés et des chalcones substituées par des méthyles et des halogènes, ils montrent que les deux hypothèses sont fausses et ils établissent alors la structure de l’ion fragment m/z 130 présenté Fig. 30. L’ion ainsi formé provient de la perte du radical phényl B et d’un radical Hβ•.

O A B O A + m/z 130

Fig. 30 : Structure de l’ion m/z 130 proposé par Ardanaz et al. [1991].

Jusqu’à présent les différents auteurs considèrent que l’identité virtuelle des spectres de masse des 2’-hydroxychalcones et des flavanones isomères serait due à l’existence d’une espèce intermédiaire instable de structure incertaine (voir Fig. 31). Ainsi, Guidugli et al. [1992] étudient plus particulièrement la structure de l’ion moléculaire [M-H]+.Dans ce but, ils s’intéressent aux ions minoritaires m/z 181 et m/z 152 obtenus pour le squelette flavanone et le squelette 2’-hydroxychalcone et ils établissent des schémas de fragmentation basés sur des expériences de marquage au deutérium (Fig. 31).

O O A B -H O+ O -C2H2O O+ m/z 181 m/z 152 m/z 223 m/z 224

Ardanaz et al. [1998] s’associent par la suite et étudient attentivement la fragmentation de la génine chalcone en utilisant les techniques de MS2 et de marquage au deutérium et au carbone 13 en se focalisant sur la formation et la structure des ions m/z 192 et m/z 193 [Ardanaz et al., 1998] provenant d’une perte respective de 15 uma (perte du radical CH3•) et de 16 uma (perte

de méthane) par rapport à l’ion moléculaire du squelette chalcone. Pour expliquer ces pertes inattendues, il proposent les schémas de fragmentation suivant (Fig. 32 et 33).

O

A

B

O O

m/z 208 m/z 208

Fig. 32 : Réaction de contraction de cycle de l’ion moléculaire du squelette chalcone par EI

selon Ardanaz et al. [1998].

Ainsi, il proposent un réarrangement de l’ion moléculaire suivant une réaction de contraction de cycle pour aboutir à un ion moléculaire de structure tricyclique (m/z 208) avec un méthyle en position α de la fonction carbonyle. A partir de cette structure, ils déduisent aisément la formation de l’ion fragment m/z 193 en affirmant que celui-ci proviendrait de la perte d’un radical méthyle (Fig. 33).

Dans le cas de la formation de l’ion m/z 192, le schéma de fragmentation reste très incertain car il y a perte successive de deux radicaux.

O m/z 208 O O -CH3 -H O -CH3

.

_.

.

L’étude en spectrométrie de masse des flavonoïdes prénylés a fait l’objet d’une revue en 1992 par Takayama et al. [1992]. Ils étudient les schémas de fragmentation dus à la dégradation des groupements prénylés par EI et FAB/MS. Les spectres obtenus par EI présentent des fragments caractéristiques dûs à la position du groupement prényle sur les cycles. En effet pour les flavanones 6 ou 8 prenylées, nous retrouvons généralement les fragments [M-15]+, [M-43]+et [M-55] + dont les schémas d’obtention sont présentés dans la Fig. 34. Dans le cas des flavanones et des chalcones isomères, ils obtiennent des spectres similaires dus à l’isomérisation thermique des flavanones en 2’hydroxychalcones.

O O m/z 356 OH HO O O m/z 341 R O HO [M-15]+ OH OH R O O m/z 301 R OH+ HO [M-55]+ O O m/z 337 R OH+ HO [M-43]+ RDA O HO OH+ O m/z 165

Fig. 34 : Schémas de fragmentation d’une flavanone prénylée en position 6

(RDA : rétro Diels-Alder).

En 2002, Nowakowska [2002] s’intéresse à la fragmentation des bromoalkoxychalcones et des morpholinoalkoxychalcones par EI et masse haute résolution. L’ensemble des dérivés de chaque groupe présentent des fragmentations similaires. Les ions fragments issus de l’étude des dérivés bromoalkoxychalcones sont présentés Fig. 35.

Suivant la coupure de la chaîne alkyle, il est facile d’identifier la chalcone correspondante. Nous retrouvons la coupure en α de la double liaison et nous pouvons voir qu’un simple clivage Csp3-O est à l’origine de la perte du radical (CH2)n-Br.

O C H CH O H2 C _n Br O C H CH O + H2C Br n + + [M-77]+ +_O m/z 105 -CO m/z 77 O C H CH m/ z 207 m/z 223

Fig. 35 : Schéma de fragmentation des alkoxyhalogénochalcones.

La dernière publication qui traite de l’étude de la fragmentation par EI date de 2004 [Nowakowska, 2004]. Les auteurs s’intéressent à la fragmentation des chalcones substituées sur le cycle B par des groupements hydroxyles, thiols ou carbamates. La Fig. 36 présente les différents ions fragments obtenus quelque soit le substituant. Les clivages préférentiels ont lieu en position α de la double liaison et au niveau de la liaison reliant le substituant au cycle B. O A B R m/z 77 -C2H2 C4H3+m/z 51 O+ m/z 105 -CO O m/z 207 -CO m/z 179 m/z 102

Fig. 36 : Schémas de fragmentation de chalcones substitués sur le cycle B

B. II. 2 Ionisation par electrospray et ionisation chimique à pression atmosphérique (ESI et APCI)

Ionisation par electrospray (ESI)

Deux publications récentes traitent de l’analyse par ESI de flavanones et de dihydrochalcones glycosylées [Hvattum et Ekeberg, 2003; Zhou et al., 2006]. Zhou et al. [2006] utilisent la LC/MS pour détecter des flavonoïdes glycosylés dans un extrait par ESI en modes positif et négatif. Les fragmentations des flavonoïdes glycosylées les plus rencontrés respectent le schéma présenté Fig. 37. La nomenclature a été établi Ma et al. [1997].

O O OH O O O O OH OH OH OH OH OH OH 0 1 2 3 4 1,3 B0 1,3 A0 Z0 Y0 B2 O,2 X0 0,2 A2 Z₁ Y1 B1 0,2 A1 0,2 X1 A B

Fig. 37 : Nomenclature des ions obtenus après fragmentation en mode positif de

flavanones O-diglycosylées.

Dans le spectre de masse enregistré en ESI en mode positif de l’hespéridine (voir structure

Fig. 37, l’ion m/z 303 correspond à la génine [Y0+H]+.

Composé R1 R2 R3 Masse

Naringine Néohespéridose H OH 580

Hespéridine Rutinose OH OCH3 610

Neohespéridine Néohespéridose OH OCH3 610

O R₂ R3 O R1 A B C

Fig. 39 : Schéma de fragmentation en mode positif par ESI de l’hespéridine.

L’expérience MS2 sur ce fragment a permis d’observer les ions suivants : m/z 177, m/z 153, m/z 285 et m/z 179 dont les schémas d’obtention sont représentés Fig. 39. Les ions majoritaires sont les ions présents à m/z 177 et m/z 179 qui correspondent respectivement à une réaction de rétro Diels-Alder et une perte du cycle B. Cette dernière fragmentation a l’avantage de pouvoir déterminer le type de substituants sur le cycle A. Dans le cas de la naringine, le même type de spectre de masse est obtenu en mode positif.

En mode négatif, les auteurs obtiennent des différences de fragmentation entre le couple hespéridine/neohespéridine et naringine/isonaringine qui sont des couples d’isomères qui diffèrent seulement par la liaison intersucre (Fig. 38). En effet, dans le cas de l’hespéridine,

Ainsi, le mode négatif a l’avantage d’aboutir à des fragmentations caractéristiques facilitant leur identification par LC/MS dans un extrait.

Hvattum et Ekeberg [2003] s’intéressent à la fragmentation des flavonoïdes glycosylés (quelque soit le noyau aglycone) et plus particulièrement au clivage homolytique des liaisons O-sucres qui génèrent des radicaux aglycones stables en mode négatif. Ils constatent que dans le cas particulier des flavanones et des dihydrochalcones glycosylées (Fig. 40), aucun ion résultant de la fragmentation du radical aglycone n’est obtenu après avoir réalisé une expérience MS2 sur l’ion [M-H]+. Les auteurs concluent que la présence d’une double liaison entre les carbones 2 et 3 est nécessaire. Cette observation a l’avantage de pouvoir alors déduire une génine dihydrochalcone ou flavanone dans le cas de l’identification de flavonoïdes glycosylés inconnus présentant ce type de spectre dans un extrait par LC/MS.

OH O OH HO O O HO HO OH OH O O O O OH OH O O O OH HO HO HO HO OH Fig. 40: Phloridzine et hespéridine.

Fabre et al. [2001] ont étudié précisément la fragmentation des noyaux aglycones des flavonoïdes de type flavone, flavonol et flavanone par ESI en mode négatif.

De façon générale, les fragments obtenus suivent le schéma de fragmentation présenté Fig.

41. La nomenclature adoptée est celle de Ma et al [1997]. Les notations i,jA- et i,jB- sont utilisées pour désigner les ions produits contenant les cycles, respectivement A et B et les notations i,j concernent les liaisons qui ont été scindées.