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Universite de Sherbrooke
LA MEMANTINE, UN MEDICAMENT UTILISE DANS LA MALADIE D'ALZHEIMER, AMPLIFIE LA SIGNALISATION CALCIQUE DANS LES
CELLULES HEK293.
par
ALEXANDRE P. BLANCHARD
Departement de pharmacologie
Memoire presente a la Faculte de medecine et des sciences de la sante en vue de l'obtention du grade de
Maitre es Sciences (M. Sc.) en Pharmacologie
Aout 2008
Evaluateurs :
«Fais de ta vie un reve, et d'un reve, une realite.» Antoine de Saint-Exupery
«L'experience est le nom que Ton donne a la somme de nos erreurs» Antoine de Saint-Exupery
«La plus grande gloire n'est pas de ne jamais tomber, mais de se relever a chaque chute.»
Confucius
A mes parents, pour leur soutien tout au long de mes etudes.
A Karen, pour tout...
Aux professeurs Caroline Vincent et Jean Beauregard qui m'ont transmis la passion des sciences.
Table des matieres
LISTE DES TABLEAUX IV
LISTE DES FIGURES V
LISTE DES ABREVIATIONS VI
RESUME VIII
INTRODUCTION 1
LE CA2+ COMME SECOND MESSAGER 1
LA SIGNAL] SATION CALCIQUE 1
STORE-OPERATED CA2+ ENTRY (SOCE) 4
RECEPTOR-OPERATED CA2+ ENTRY (ROCE) 9
LES PROTEINES STIM1 ETORAI 10
LES PROTEINES TRP 11
LESIP3R 17
L E S S E R C A 19
LA MALADIE D' ALZHEIMER 21
LES PS, L ' A P P ET LES SEQUENCES PROTEOLYTIQUES 22
L'AP COMME CAUSE DE LA MALADIE ET SES CONSEQUENCES 27
LAPP2A 30
LAMEMANTINE 31
L'OBJECTIFDEL'ETUDE 31
ARTICLE - AVANT-PROPOS 34
MEMANTINE POTENTIATES AGONIST-INDUCED CA2+ RESPONSES IN HEK 293 CELLS. ...34
DISCUSSION 65
CONCLUSION 73
PERSPECTIVES 74
REMERCIEMENTS 77
Liste des tableaux
Tableau 1: Nombres de genes codant pour des TRP separes en fonction de leur
famille et de leur provenance. 13
Tableau 2: Proprietes des 7 membres TRPC. 13 Tableau 3: Medicaments utilises dans le traitement de la maladie d'Alzheimer. 33
Liste des figures
Figure 1: Signalisation calcique cellulaire induite par un agoniste. 3 Figure 2: Les trois principales hypotheses emises pour expliquer le mecanisme d'entree
capacitative du Ca2+. 6
Figure 3: Arbre phylogenetique de la superfamille des TRP. 14 Figure 4: Representation schematique des differentes families de TRP. 16 Figure 5: Representation schematique de ITP3R3. 18 Figure 6: Structure cristallisee de la SERCA liee avec son inhibiteur, la thapsigargine. 20 Figure 7: Les sequences proteolytiques de l'APP pour la formation de l'Ap. 25 Figure 8: L'hypothese p-amyloide. 28 Figure 9: Plaques amyloi'des et echeveaux neurofibrillaires dans un cerveau affecte par la
maladie d'Alzheimer. 29
Article
Figure 1: Memantine enhances CCh-induced Ca2+ responses in intact T6.11 cells. 43
Figure 2: Memantine regulates the Ca entry pathway independently of the Ca release
pathway. 47
Figure 3: The effect of memantine on Ca2+ entry is independent of its effect on Ca2+
release. 48
Figure 4: Memantine increases Ca content in intracellular store. 51 Figure 5: Memantine enhances SERCA activity. 52 Figure 6: Memantine does not modify the activity of IP3R. 54 Figure 7: Memantine enhances store-operated Ca entry. 55
Liste des abreviations
[Ca2+]i [Ca2+]RE AP: Ap40: Ap42: APP: ATP: CCh: CIF: EPSC: Fura-2 : GqPCR: GTP HEK293 HEK293T6.il IP3 IP3R kDA MAconcentration de calcium cytoplasmique
concentration de calcium dans le reticulum endoplasmique P-amyloTde
AP de 40 residus Ap de 42 residus
precurseur proteique de ramyloi'de adenosine triphosphate
carbachol
«Ca -influx factor»
courrant postsynaptique excitateur
l-[6-Amino-2-(5-carboxy-2-oxazolyl)-5-benzofuranyloxy]- 2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acide recepteur couple a une proteine Gq
guanosine triphosphate
lignee cellulaire ayant pour origine des cellules humaines de rein (« human embryonic kidney »)
lign6e cellulaire humaine de rein surexprimant de faQon stable TRPC6
inositol 1,4,5-trisphosphate
recepteur a l'inositol 1,4,5-trisphosphate kilodalton
MAF : maladie d'Alzheimer famihale mGlulR : NMDA: NMDA-R: PC12: PIP2: PLC: PP2A: PS: PS1 : PS2: RE: ROCE: sAPPa : SERCA : SOCC: SOCE: TG: TM: TRP: TRPC:
recepteur metabotropique glutamatergique 1 N-methyle-D-aspartate
recepteur N-methyle-D-aspartate
lignee cellulaire derivee d'un pheochromocytome provenant de la glande surrenale de rat
phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate phospholipase C proteine phosphatase 2A preseniline preseniline 1 preseniline 2 reticulum endoplasmique «receptor-operated Ca entry » APP soluble a
94-((sarcoplasmic endoplasmic reticulum Ca ATPase pump» ((store-operated Ca2+ channel»
9+
«store-operated Ca entry» thapsigargine
segment transmembranaire
((transient receptor potential» TRP de la sous-famille canonique
Resume
LA MEMANTINE, UN MEDICAMENT UTILISE DANS LA MALADIE D'ALZHEIMER, AMPLIFIE LA SIGNALISATION CALCIQUE DANS LES
CELLULES HEK293. Par : Alexandre P. Blanchard
Universite de Sherbrooke, Departement de pharmacologie Memoire presente a la Faculte de medecine et des sciences de la sante
en vue de l'obtention du grade de Maitre es Sciences (M. Sc.) en Pharmacologie
Mars 2008
Evaluateurs : Dr. Xavier Roucou, Dr. Pierre Lavigne, Dr. Gaetan Guillemette et Dr. Guylain Boulay
Le Ca2+ est un second messager versatile, ubiquitaire, et capital implique dans divers processus cellulaires incluant l'expression de genes, la secretion, la contraction, la croissance cellulaire, la differenciation/proliferation cellulaire, l'apoptose et la plasticite synaptique. L'element cle dans la signalisation calcique est l'activation d'un recepteur couple a une proteine Gq (GqPCR) qui active la phospholipase C-P ou d'un recepteur tyrosine kinase qui active la phospholipase C-y. La phospholipase C hydrolyse le phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate pour produire l'inositol 1,4,5-trisphosphate qui active son recepteur, un canal calcique situe sur le reticulum endoplasmique, ce qui cause une relache du Ca2+ vers le cytosol de la cellule. Cette relache de Ca2+ intracellulaire est suivie d'une entree soutenue de Ca2+ a travers la membrane plasmique. Dans certaines maladies, dont la maladie d'Alzheimer, un desequilibre de la signalisation du Ca + est implique dans le processus pathologique. II est important de constater que chacun des medicaments approuves pour le traitement de l'Alzheimer affecte la signalisation calcique, directement ou indirectement. Un de ces medicaments, la memantine, bloque
9+ • 9+
l'entree excessive du Ca via le recepteur-canal NMDA. Cette entree excessive de Ca cause l'excitotoxicite. La memantine est aussi connue pour bloquer d'autres canaux incluant les recepteurs-canaux 5-HT3, les recepteurs-canaux nicotiniques neuronaux et les canaux sodiques voltages dependants. Cette etude avait done pour but de verifier si la memantine pourrait influencer d'autres types de canaux impliques dans la regulation du Ca2+ dans les cellules non-excitables «human embryonic kydney» HEK293. Suite au traitement des cellules avec la memantine, la relache de Ca2+ et l'entree de Ca2+ ont ete mesurees par spectrofluorometrie. La memantine a amplifie la relache de Ca et l'entree
de Ca induites par le carbachol, un agoniste GqPCR. L'amplification de la relache de
Ca2+ etait due a l'augmentation de l'activite des pompes SERCA qui ont augmente le contenu en Ca2+ du reticulum endoplasmique. L'amplification de l'entree de Ca +etait due a une suractivation des canaux SOC «store-operated Ca2+ channel)) par un mecanisme independant du mecanisme responsable de l'amplification de la relache de Ca . Ces resultats montrent que la memantine augmente la sensibilite des cellules aux stimuli extracellulaires. Ces effets de la memantine sont possiblement benefiques dans la maladie d'Alzheimer ou il est bien connu que la reponse neuronale est grandement diminuee.
Introduction
Le Ca comme second messager
Le Ca est un second messager versatile, ubiquitaire, et capital pour la signalisation intracellulaire des cellules eucaryotes. II est implique dans une pleiade de processus cellulaires incluant l'expression de genes, la secretion, la contraction, la croissance cellulaire, la differenciation/proliferation cellulaire, Papoptose et la plasticite synaptique. Cette versatility est causee par des mouvements calciques specifiques pour une reponse cellulaire qui est caracterisee par 1'amplitude et la frequence des signaux
94-intracellulaires de Ca . Ces mouvements calciques se font a partir des reservoirs intracellulaires de Ca et/ou du milieu extracellulaire (Berridge, et al. 2000, Vennekens,
et al. 2002).
La signalisation calcique
Le developpement des sondes calciques fluorescentes par Grynkiewicz, et al. 1985, tel que le Fura-2, a permis de mesurer en temps reel les niveaux intracellulaires de Ca +. Ainsi, des etudes ont permis de demontrer que la concentration de Ca + cytosolique ([Ca2+]i) d'une cellule non-stimulee se situe entre 50 et 100 nM. La concentration de Ca + dans le reticulum endoplasmique (RE) ([Ca ]RE) et dans le milieu extracellulaire se situe entre 1 et 2 mM, soit 10 000 a 20 000 fois plus elevee que dans le cytosol (Vennekens, et
al. 2002). Ce gradient calcique est maintenu grace a Taction des pompes
membrane plasmique (PMCA). Lors de la stimulation d'une cellule, la [Ca ]; peut atteindre 1 uM.
Autant pour les cellules non-excitables que pour les cellules excitables (neurones et myocytes), 1'activation de la phospholipase C (PLC) provoque une augmentation du [Ca ]j. Pour ce faire, une hormone doit activer un recepteur couple a une proteine Gq (GqPCR) ou a un recepteur tyrosine kinase. Dans le cas du GqPCR, l'hormone provoque un changement conformationnel qui active la proteine heterotrimerique Gq qui active la PLCp. Pour ce qui est du recepteur tyrosine kinase, l'hormone cause la dimerisation et l'autophosphorylation du recepteur qui phosphoryle par la suite la PLCy, ce qui l'active. Les PLC (P et y) hydrolysent specifiquement le lipide membranaire phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) en inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) et en diacylglycerol (DAG). L'IP3 diffuse dans le cytosol pour aller activer son recepteur-canal, le recepteur a l'IP3 (IP3R), situe au niveau du reticulum endoplasmique (RE). Cette activation de TIP3R cause la relache du Ca2+ contenu dans le RE, ce qui represente la premiere phase de la reponse calcique cellulaire. La seconde phase implique une entree de Ca2+ du milieu extracellulaire vers le cytosol suite a l'activation des canaux situes sur la membrane plasmique. L'entree de Ca2+ est essentielle pour prolonger la reponse calcique et pour
94-remplir a nouveau les reserves calciques intracellulaires. L'entree de Ca est activee par deux m^canismes bien distincts. Le premier mecanisme est du a la depletion en Ca + du RE et est appele «store-operated Ca2+ entry» (SOCE). Le deuxieme mecanisme est independant de la depletion en Ca du RE, mais est dependant de l'activation d'un
2+
teur. Ce dernier mecanisme est appele «receptor-operated Ca entry»(ROCE) (Figure 1).
Store-operated Ca
2+entry (SOCE)
La [Ca +]RE est tributaire de trois phenomenes : le pompage du Ca2+ par les SERCA, la liaison reversible du Ca2+ a des proteines du RE pour son stockage et la fuite passive du Ca vers le cytosol. L'inhibition des SERCA par la thapsigargine (TG) cause done une fuite passive du Ca + vers le cytosol. II a ete remarque que dans les conditions ou le RE est deplete en Ca +, il se produit une entree de Ca + a travers la membrane plasmique. Ce phenomene a suggere l'existence d'un mecanisme d'entree de Ca2+ provoque par la vidange du reservoir intracellulaire. Putney 1986 a nomme ce phenomene « entree capacitative » et il a suggere qu'il se produisait via des canaux calciques dependants de la reserve intracellulaire «store-operated Ca2+ channel)) (SOCC). L'identite de ces canaux de meme que leurs mecanismes d'activation ont fait l'objet d'intenses efforts de recherche. L'identification des canaux debuta dans les annees 1990 avec la caracterisation de ICRAC- ICRAC qui vient de «Calcium-release-activated Ca current)) est un courant SOCE specialise tres selectif au Ca2+ dans les cellules T et les mastocytes (Hogan et Rao 2007). Ensuite, les «transient receptor potential canonical)) (TRPC) furent identifies (Cosens et Manning 1969, Montell et Rubin 1989, Venkatachalam et Montell 2007). Puis, tout recemment, un autre type de canal implique dans l'activation du SOCE, Orail, fut identified La diminution de l'expression d'Orail dans les cellules Drosophila S2 inhibe completement le SOCE (Feske, et al. 2006, Vig, et al. 2006b, Zhang, et al. 2006). Aussi, la diminution de l'expression de plusieurs TRPC a pour effet de diminuer le SOCE (Zagranichnaya, et al. 2005). Ces resultats demontrent que le canal Orail est obligatoire
pour la creation du SOCE et que les TRPC en font aussi partit, ce qui permet la creation de multiples formes de SOCE (Worley, et al. 2007).
Trois principales hypotheses ont ete emises pour expliquer le mecanisme d'entree capacitative du Ca (Figure 2) L'une des hypotheses suggere que la liberation d'un messager soluble, nomme «Ca -influx factor» (CIF), activerait les canaux membranaires. Ainsi, le CIF serait libere du RE suite a la diminution de la [Ca ]RE et diffuserait de fa9on passive dans le cytosol pour atteindre et activer les canaux de la membrane plasmique. Cette hypothese a ete emise par Takemura, et al. 1989 et les premieres evidences de son existence furent demontrees par Parekh, et al. 1993 et Randriamampita et Tsien 1993. Quoi qu'aucune identification formelle n'a ete realisee quant au CIF, il semble que ce dernier soit une molecule non-peptidique, anionique, phosphorylee et qui possede un poids moleculaire de moins de 500 Daltons (Clapham 1993). Cependant, l'existence en soi du CIF reste contestee.
La seconde hypothese enoncee d'abord par Irvine 1990 et developpee ensuite par Berridge 1995 suggere un couplage conformationnel entre P1P3R et les canaux de la membrane plasmique. Selon cette hypothese, ITP3R situe sur la membrane du RE ressentirait la diminution de [Ca2+]RE et activerait directement les canaux calciques sur la
membrane plasmique. Cette hypothese est supportee par au moins deux etudes differentes
realisees par Kiselyov, et al. 1998 et Boulay, et al. 1999. Kiselyov, et al. 1998 ont observe avec une approche de «patch clamp» que PIP3 augmente de fafon significative l'entree de Ca2+ dans les cellules HEK293 surexprimant TRPC3.
Figure 2: Les trois principales hypotheses emises pour expliquer le mecanisme d'entree capacitative du Ca . (D'apres Rosado, et al. 2005)
A) La liberation d'un messager soluble, nomme «Ca -influx factor», activerait les canaux membranaires. B) L'IPsR situe sur la membrane du RE ressentirait la diminution de [Ca2+]RE et activerait directement les canaux calciques sur la membrane plasmique. C) Les SOCC seraient presents a la surface de vesicules intracellulaires et 1'augmentation de Ca dans le cytosol aurait pour effet de les faire fusionner avec la membrane plasmique, menant ainsi a 1'insertion des SOCC. Legende : CIF, «Ca2+-influx factor»; G (GqPCR), recepteur couple a une proteine Gq; IP3, inositol 1,4,5-trisphosphate; IP3R, recepteur a
9-4-l'IP3; PLC, phospholipase C; RE, reticulum endoplasmique; SOCC, «store-operated Ca channel».
D'autres resultats appuyant cette hypothese sont verms de l'etude de Boulay, et al. 1999 qui ont demontre des regions d'interaction entre I'IPSR et TRPC3. lis ont observe que l'expression de fragments des regions d'interactions, module l'entree de Ca dans les cellules HEK293.
La troisieme hypothese implique un modele ressemblant a la secretion. Les SOCC seraient presents a la surface de vesicules intracellulaires semblables a des vesicules de secretion. L'augmentation de Ca2+ dans le cytosol aurait pour effet de faire fusionner ces vesicules a la membrane plasmique, menant ainsi a l'insertion des SOCC a la membrane plasmique. Cette hypothese fut emise par Fasolato, et al. 1993 lorsqu'ils ont observe que des analogues non-hydrolysables du GTP etaient capables de diminuer de facon dose-dependante le SOCE dans les mastocytes RBL-2H3. Selon eux, la modulation du SOCE pourrait impliquer une proteine liant le GTP comme une petite proteine G qui est generalement responsable du routage des vesicules. Cette etude fut appuyee par celle de Yao, et al. 1999 qui ont demontre qu'un dominant negatif du «soluble NSF attachment receptor» (SNARE), une proteine impliquee dans la fusion vesiculate, induisait une reduction du SOCE dans les oocytes de Xenopus. De plus, Patterson, et al. 1999 ont demontre que le traitement des cellules DDTiMF-2 et A7r5 avec la jasplakinolide ou la calyculine A diminuait le SOCE. Comme la jasplakinolide et calyculine A causent une accumulation de filaments d'actine sous-jacents a la membrane plasmique, ils ont suggere que la fusion des vesicules contenant les SOCC avec la membrane plasmique etait ainsi bloquee.
Une etude provenant de notre laboratoire, a demontre que la TG et le CCh (un agoniste des recepteurs muscariniques) causent une augmentation de la quantite de TRPC6 a la surface des cellules HEK293 (Cayouette, et al. 2004). Cette etude a aussi demontre une interaction directe entre TRPC6 et PIP3R. Enfin, l'etude a demontre que la presence de ITP3R dans les caveoles etait dependante de l'expression de TRPC6. Ces resultats suggerent une association possible entre les mecanismes d'activation par couplage conformationnel et par secretion vesiculate. En resume, les diverses etudes effectuees jusqu'a maintenant sur les mecanismes d'entree du Ca ont tendance a suggerer que le SOCE est du a une combinaison de ces trois mecanismes d'activation.
Receptor-operated Ca2* entry (ROCE)
L'existence du ROCE a ete demontree par la surexpression, dans les cellules d'insecte Sf9, d'un canal (Trp-like) provenant de la drosophile. Ce canal a produit une entree de Ca2+ suite a l'activation d'un GqPCR. Ce canal n'etait pas active suite a la vidange du RE par la TG (Dong, et al. 1995). Ainsi, depuis la decouverte de ce canal Trp-like, divers mecanismes d'activation du ROCE ont ete suggeres. Le plus connu est celui de l'activation des canaux TRPC3/6/7 par le diacylglycerol forme lors de l'hydrolyse du phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate par la PLC. D'autres TRPC pourraient aussi etre responsables du ROCE.
Les proteines STIM1 et Orai
Grace a la recherche bioinformatique de genes ayant des fonctions probables de canaux ioniques ou de signalisation, il a ete possible de predire un nombre restreint de proteines qui pourraient etre impliquees dans le mecanisme d'entree du Ca . Par la suite en criblant au moyen de la methode de l'ARN interferant, Liou, et al. 2005 et Roos, et al. 2005 ont identifie la proteine STIM1 dont la reduction de son expression se traduit par une diminution de l'amplitude du SOCE en reponse a une depletion du RE par la TG. Ces resultats ont suggere que STIM1 pourrait etre la proteine qui detecte la diminution de la [Ca2+]RE. Le gene de STIM1 est situe sur le chromosome 11 et code pour une proteine de 90 kDA, qui contient un seul segment transmembranaire, et dont 1'expression est ubiquitaire. Le N-terminal de STIM1 est situe dans la lumiere du RE et possede un domaine EF-hand qui permet de lier le Ca . Le N-terminal possede aussi un domame SAM qui, en combinaison avec le domaine EF-hand, controle la translocation de STIM1 du RE vers la membrane plasmique. La diminution de la [Ca ]RE ou la modification des acides amines de la pochette de liaison du Ca + du domaine EF-hand de STIM1 resulte en la perte de liaison du Ca2+, et en sa translocation a la membrane plasmique ou il active les SOCC produisant ainsi le SOCE (Dziadek et Johnstone 2007).
Une deuxieme proteine, nomme Orail ou CRACM a ete identified recemment en criblant tout le genome de la drosophile puisqu'elle n'a aucun domaine de signalisations ou d'homologies avec des canaux connues (Feske, et al. 2006, Vig, et al. 2006b, Zhang, et
al. 2006). Une analyse de la sequence de Orail permet de predire que cette proteine a
quatre segments transmembranaires (TM) avec les extremites N- et C-terminale
cytoplasmiques. Elle est localisee principalement a la membrane plasmique. Lorsque Orail est coexprime avec STIM1, le SOCE est augmente de 50 a 100 fois. II existe 3 genes codant pour Orai, soit Orail, Orai2, et Orai3. Une mutation dans le gene codant pour Orail est a l'origine d'une maladie rare du systeme immunitaire, soit l'immunodeficience severe combinee. Dans cette maladie, le SOCE specialise ICRAC» qui est tres selectif aux Ca , est absent dans les lymphocytes T provenant de ces malades (Feske, et ah 2006, Prakriya, et al. 2006, Vig, et ah 2006a, Yeromin, et ah 2006, Zhang,
et ah 2006). Ce sont des evidences tres fortes pour suggerer que Orail fait partie de la
composition de
ICRAC-Les proteines TRP
Les proteines «transient receptor potential», ou TRP, furent identifies grace a des etudes genetiques chez la mouche a fruit Drosophila melanogaster. Chez la drosophile, la signalisation intracellulaire de la vision sous-tend a l'activation d'une proteine Gq et des mouvements calciques subsequents. Suite a l'observation d'une reponse alteree du systeme de transduction visuel de drosophiles mutantes (Cosens et Manning 1969), l'analyse genetique a permis d'identifier le gene mutant, soit le gene codant pour TRP qui a pour consequence de diminuer la reponse ionique soutenue. Le clonage et le sequencage par Montell et Rubin 1989 du gene codant pour le TRP de la drosophile fut la premiere etape dans 1'identification des membres de l'entree du Ca2+. L'implication des TRP dans l'entree de Ca2+ suite a l'activation d'un GqPCR ou d'un recepteur tyrosine kinase fut demontree pour la premiere fois par Vaca, et ah 1994. L'expression des TRP dans des
cellules d'insecte Sf9 produit un influx calcique ayant des proprietes similaires a 1'influx cause par l'activation d'un GqPCR.
L'identification de l'implication de TRP dans l'entree de Ca2+ chez la mouche a intensifie l'engouement pour la recherche d'homologues chez les mammiferes. Plusieurs homologues de TRP furent decouverts. Tous les TRP partagent des traits caracteristiques incluant six TM, les extremites N- et C-terminal cytosoliques, une homologie dans la sequence d'acides amines, et une permeabilite aux cations. Toutefois, ils different grandement par leur diversite de selectivity aux cations et par leurs mecanismes d'activation. Par homologie de sequence avec les TRP de la drosophile, plus de 25 genes (Tableau 1) codant pour des homologues ont ete identifies. Les TRP sont classes en deux groupes (1 et 2) selon leurs differences de sequence et d'homologie (Figure 3 et 4). Ainsi, le groupe 1 possede les membres qui ont la plus forte homologie de sequence avec ceux de la Drosophile et est subdivise en 5 sous-families: TRPC (canonique), TRPV (vanilloide), TRPM (melastatine), TRPA (ankyrine) et TRPN (NOMPC). Le groupe 2 est forme de 2 sous-families nominees TRPP (polycystine) et TRPML (mucolipine) (Venkatachalam et Montell 2007).
Les differents canaux les plus apparentes au TRP de la drosophile on ete classes dans la sous-famille TRPC (Tableau 2). Cette sous-famille compte sept membres chez les mammiferes nommes TRPC1 a TRPC7 en ordre de leur decouverte. Cependant, TRPC2 est un pseudogene chez l'humain (Wes, et al. 1995). Les TRPC sont exprimes un peu partout, mais presque tous les TRPC exprimes chez l'humain montrent leur plus haut niveau d'expression au cerveau (Venkatachalam et Montell 2007).
Figure 3: Arbre phylogenetique de la superfamille des TRP. (D'apres Venkatachalam et
Montell 2007)
Ce dendrogamme montre le niveau d'apparente des proteines TRP provenant principalement de l'humain, mais aussi de la souris, de la drosophile, de C. elegans et du poisson zebre. Legende : TRP, «transient receptor potential)); TRP A, ankyrine; TRPC, canonique; TRPM, melastatine; TRPML, mucolipine; TRPN, NOMPC; TRPP, polycystine; TRPV, vanillo'ide; ot*, C. elegans; W, drosophile; Jktm^, souris; « • • • , poisson zebre.
Les canaux TRPC sont des canaux non selectifs actives suite a la stimulation d'un GqPCR ou d'un recepteur tyrosine kinase. Le fait que les TRPC peuvent fonctionner comme des SOCC et/ou des ROCC reste controverse avec des evidences pour et contre, pour chacun des canaux.
Les IP
3R
LTP3R est un recepteur canal calcique situe au niveau du RE (Berridge 1993). II existe 3 differents types d'n^R qui doivent se tetrameriser en homo- ou heteromere pour former un canal fonctionnel (Patel, et al. 1999). Chacun des homo- ou heterotetrameres possede des affmites differentes pour l'IP3. Pour ce qui est des homotetrameres, le type 2 possede la meilleure affinite et le type 3 la plus faible (Newton, et al. 1994, Sudhof, et al. 1991). Pour causer l'ouverture du canal, chacun des monomeres doit etre lie par une molecule d'IP3. Toutefois, cette liaison est cooperative, c'est-a-dire que la liaison d'un premier IP3 sur son recepteur favorise la liaison du second et ainsi de suite, jusqu'au quatrieme (Dawson 1997). Les monomeres d'H^R a un poids moleculaire variant entre 220 et 260 kDa, dependamment du type (Chadwick, et al. 1990). Les IP3R1 a 3 sont exprimes dans toutes les cellules a differents niveaux (Wojcikiewicz 1995). Les IP3R (Figure 5) ont, entre eux, une forte homologie de sequence variant entre 74 et 78 %. Les IP3R ont en commun six TM, un pore entre le cinquieme et sixieme TM ainsi qu'un N- et un C-terminal cytoplasmique. L'IPsR se divise en 3 domaines fonctionnels : le domaine de liaison a ITP3, situe entre les acides amines 226 et 578 pour ITP3RI de rat (Yoshikawa,
lieu de phosphorylation par diverses kinases et de liaison au Ca et a diverses proteines accessoires (Patel, et al. 1999); le domaine canal, situe dans la region C-terminal et dont, les acides amines 2547 a 2550 constituent un flltre de selectivity pour le Ca (Patterson,
et al. 2004).
Les SERCA
La pompe calcique ATPase SERCA est formee d'un seul polypeptide de 110 kDA et est situe sur le RE (Periasamy et Kalyanasundaram 2007). Elle utilise l'energie derivee de l'hydrolyse d'une ATP pour transporter deux Ca2+ contre le gradient de concentration afin de sequestrer le Ca cytoplasmique dans le RE (Inesi, et al. 2005). Elle aura done un double role : diminuer le [Ca2+]j et remplir a nouveau le [Ca +]RE. Chez les vertebres, les SERCA sont encodees par trois genes (SERCA1 a 3) (Periasamy et Kalyanasundaram 2007). Les SERCA des mammiferes possedent une homologie de sequence en acides amines de 70 % avec celles des invertebres (Wuytack, et al. 2002). II existe differents epissages alternatifs pour chacun des trois genes et qui sont exprimes en fonction de l'age et du tissu (Periasamy et Kalyanasundaram 2007). Par exemple, la SERCAla (994 residus) est exprimee a l'age adulte dans les muscles squelettiques a contraction rapide, alors que la SERCAlb (1011 residus) est exprimee dans les memes muscles chez le foetus. De nombreuses etudes sur la SERCAla ont permis de determiner sa structure. C'est une proteine possedant 10 segments transmembranaires et trois domaines cytoplasmiques : un domaine A (actionneur) qui est implique dans la transmission des changements de conformation lors du transport du calcium, un domaine P (phosphorylation) et un domaine N qui lie l'ATP (Figure 6).
A l'etat non active, les sites de liaison du Ca2+ sont accessibles seulement du cytosol et non de la lumiere du RE. Cependant, l'hydrolyse de l'ATP par la pompe cause sa phosphorylation et initie une serie de modifications confoimationnelles qui change la conformation de ses helices transmembranaires. Cette nouvelle conformation donne acces aux Ca2+ lies a la lumiere du RE et lui fait perdre son acces au cytosol aboutissant alors au transport du Ca2+ dans le RE (Periasamy et Kalyanasundaram 2007).
La maladie d'Alzheimer
La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodegenerative chronique et progressive qui atteint plus de 20 millions de personnes dans le monde. Le risque de developper la MA augmente avec Page pour atteindre pres de 30 % a 85 ans et plus (Brunkan et Goate 2005) et il est predit que la prevalence devrait augmenter avec le vieillissement de la population (Newman, et al. 2007). Le deroulement de la maladie est insidieux et les patients peuvent vivre jusqu'a 20 ans apres le diagnostic initial bien que la survie moyenne est de 5 a 10 ans (LaFerla et Oddo 2005, Walsh, et al. 1990). C'est le psychiatre allemand Alois Alzheimer qui fut le premier en 1907 a decrire le syndrome clinicopathologique d'une patiente de 51 ans du nom de Auguste D. par la presence de lesions cerebrales et des symptomes de perte progressive de la memoire, d'illusions et d'hallucinations auditives (Small et Cappai 2006). A ce jour, la MA est caracterisee par des pertes de memoire, des difiicultes de jugement, de raisonnement et d'accomplissement des taches quotidiennes ainsi que des changements dans les capacites de communication, dans rhumeur et dans le comportement (Vas CJ 2004).
II existe deux formes de la MA : la forme familiale (MAF) et la forme sporadique. La majorite des patients atteints de la MA ont la forme sporadique, done de cause indeterminee. Pour la MAF, elle ne compte que pour 10 % des cas de la MA et elle differe de la forme sporadique en raison de son debut precoce, generalement avant 65 ans (Blennow, et al. 2006, LaFerla 2002, LaFerla et Oddo 2005). Jusqu'a present, quatre genes ont ete impliques dans la pathogenese de la MA, soit le precurseur proteique de l'amyloifde (APP), la preseniline 1 (PS1) et 2 (PS2) de meme que 1'allele £4 de l'apolipoproteine E (Selkoe 2001). En 2007, des chercheurs de partout dans le monde ont mis au jours 27 mutations de l'APP, 157 mutations de PS1 et 10 mutations de PS2 qui ont presque 100 % de penetrance pour causer la MAF (Newman, et al. 2007). De ces genes, 90 % des cas de la MAF sont dus aux mutations des PS (Shen et Kelleher 2007).
Les PS, l'APP et les sequences proteolytiques
Les PS1 et 2 sont des proteines membranaires de 467 (57 kDa) et 448 (55 kDa) acides amines, respectivement, ayant une homologie de 67 %. Le gene codant pour la PS1 est situe sur le chromosome 14 alors que celui de la PS2 est situe sur le chromosome 1 (Dewji 2005). Les PS se retrouvent principalement dans le RE et l'appareil de golgi, mais on en retrouve aussi a la surface cellulaire (Brunkan et Goate 2005, Dewji 2005). A l'heure actuelle, la structure des PS est controversee quant aux nombres de TM que possede la proteine. Selon l'analyse Kyte-Doolottle, les PS ont jusqu'a 10 segments hydrophobes pouvant former un TM. Presentement, le modele le plus accepte propose 8 TM avec les extremites N- et C-terminal cytoplasmiques (Brunkan et Goate 2005, Dewji 2005). La PS est la sous-unite catalytique de 1'activite y-secretase. Cependant, pour etre
fonctionnelle, elle doit etre associee avec trois cofacteurs proteiques membranaires : la nicastrine, P«anterior pharynx-defective phenotypel» (Aphl) et la «PS enhancer 2» (PEN2) (Wolfe 2007). La fonction la mieux connue des PS est son activite aspartyle protease qui cause le clivage intramembranaire de nombreuses proteines telles que Notch, les cadherines et l'APP (Brunkan et Goate 2005, Shen et Kelleher 2007).
L'APP est une proteine ubiquitaire qui ressemble a un recepteur a cause de son couplage finement regule a des adaptateurs intracellulaires qui controle la signalisation de la cellule (Russo, et al. 2005). Toutefois, la recherche d'un ligand extracellulaire activant cette voie n'a pas encore donne de resultats. L'APP est impliquee dans l'adhesion cellulaire, le developpement neuronal, la synaptogenese, la croissance des neurites, la neuroprotection et la stimulation de la proliferation des cellules progenitrices neuronales (Shaked, et al. 2006). II y a 3 isoformes majeures de l'APP soit de 695, 751 et 770 residus. La forme epissee de 695 residus est celle majoritairement exprimee dans les neurones (Selkoe 2001). Le gene codant pour l'APP est situe sur le chromosome 21. L'APP possede 1 TM, une petite queue C-terminale ainsi qu'un large domaine N-terminale extracellulaire faisant plus de 85 % de la masse totale de la proteine (Neve, et
al. 2000). Le clivage de l'APP par les PS est un evenement normal qui se produit dans
toutes les cellules neuronales et non-neuronales de tout le corps (Newman, et al. 2007). II existe deux types de sequences proteolytiques soit la voie non-amyloi'dogenique et la voie amyloi'dogenique. La voie non-amyloi'dogenique debute avec le clivage de l'APP dans l'ectodomaine par l'oc-secretase entre les residus lysine 16 et leucine 17 du domaine de la P-amyloi'de (AP) liberant ainsi, dans le milieu extracellulaire, l'APP soluble a (sAPPa).
Le fragment de 83 residus en C-terminal qui est toujours lie a la membrane est ensuite clive dans le domaine transmembranaire par la y-secretase pour liberer le fragment p3 (Dominguez, et al. 2004). Le fragment sAPPa est neuroprotecteur et neurotrophique, en plus d'etre un important regulateur des processus d'apprentissage et de memorisation (Mattson et Chan 2003). Le sAPPa protege les neurones contre les dommages induient par la privation du glucose et contre l'ischemie, la toxicite au glutamate et va supprimer la formation de radicaux libres (Goodman et Mattson 1994). Sa diminution est considered comme un joueur important dans les dysfonctions cognitives des le debut de la MA (Turner, et al. 2003). La sequence proteolytique de l'APP par la voie amyloi'dogenique debute par Taction de la p-secretase qui clive l'APP dans l'ectodomaine a 28 residus de la region transmembranaire (Figure 7). II en resulte un fragment extracellulaire, l'APP soluble p et un fragment de 99 residus en C-terminal lie a la membrane. Ce dernier doit subir un second clivage par la y-secretase afin de former l'Ap. L'Ap peut avoir differentes longueurs allant de 37 a 46 acides amines, dont la forme principale de 40 residus (Ap4o) est constitutivement produite au cours du metabolisme normal des cellules (Blennow, et
al. 2006).
Les mutations dans les PS et l'APP menant aux MAF ont en commun de favoriser la formation d'agregat d'Ap. Pour leur part, les mutations des PS vont augmenter le ratio d'AP de 42 residus (AP42) sur l'AP4o alors que les mutations de l'APP vont augmenter selectivement soit TAP42 ou les proprietes agregatives de l'Ap (Wolfe 2007). Comparativement a l'AP4o, FAP42 est beaucoup plus sujette a l'agregation en feuillet p a cause de l'augmentation de son hydrophobicite (Selkoe 2001).
Figure 7: Les sequences proteolytiques de l'APP pour la formation de l'Ap. (D'apres Mattson 2004)
II existe deux types de sequences proteolytiques : la voie non-amylo'i'dogenique et la voie amyloidogenique. La voie non-amylo'i'dogenique debute avec le clivage de l'APP par l'a-secretase liberant ainsi l'APP soluble a. Le fragment de 83 residus en C-terminal qui est toujours lie a la membrane est ensuite clive par la y-secretase. Alors que la sequence proteolytique de l'APP par la voie amyloidogenique debute par Taction de la P-secretase formant ainsi l'APP soluble P et un fragment de 99 residus en C-terminal lie a la membrane. Ce dernier est ensuite clive par la y-secretase afin de former l'Ap. Legende : APP, precurseur proteique de l'amyloi'de (vert: domaine N-terminal, rouge : domaine de l'Ap, brun : domaine C-terminal); sAPPa, fragment soluble de l'APP forme du clivage par l'a-secretase; sAPPp, fragment soluble de l'APP forme du clivage par la P-secretase; C83, fragment forme des 83 derniers residus en C-terminal; C89, fragment forme des 89 derniers residus en C-terminal.
L'augmentation de son agregation va ainsi favoriser la formation d'oligomeres solubles et de plaques avec les fibrilles insolubles (Blennow, et al. 2006). L'A(3 cause des dommages neuronaux de meme que la diminution de l'activite neuronale par affaiblissement de la transmission synaptique (depression synaptique) (Kamenetz, et al. 2003, Wu, et al. 2004).
L'A/3 com me cause de la maladie etses consequences
La theorie la plus largement acceptee comme la cause de la MA, met de l'avant le fragment d'Ap. Dans cette hypothese (Figure 8), Paccumulation et l'oligomerisation de TAP cause tous les changements phenotypiques caracteristiques a la MA : soit la formation des plaques seniles (Figure 9) et echeveaux neurofibrillaires (Figure 9), la deregulation calcique, la dysfonction des synapses et la mort des neurones (Bell et Claudio Cuello 2006).
Dans le processus de la MA, la perturbation de la signalisation calcique intracellulaire semble etre responsable de la modification de l'equilibre entre l'activite des kinases et des phosphatases. Parmi les proteines affectees, on retrouve Tau, qui se retrouve hyperphosphorylee. Tau est une proteine associee aux microtubules via un domaine de liaison specifique (Billingsley et Kincaid 1997). Sa fonction normale est de promouvoir l'assemblage et le maintien des structures des microtubules. Son hyperphosphorylation, comme dans la MA, cause le desassemblage des microtubules (Li,
et al. 2004) et son agregation, sous forme de neurofilaments de dimeres (Billingsley et
Kincaid 1997). L'accumulation de ces filaments forme les echeveaux neurofibrillaires, une caracteristique de la MA.
La PP2A
La phosphorylation de Tau est effectuee par diverses kinases incluant la PKA, la PKC, la CaMK et les MAPK alors qu'elle est dephosphorylee, entre autre, par la proteine phosphatase 2A (PP2A) (Billingsley et Kincaid 1997). Dans la MA, 1'augmentation de l'expression de l2PP2A, un inhibiteur endogene de PP2A, diminue l'activite de la PP2A d'environ 20 % (Gong, et al. 1993, Chohan, et al. 2006). La PP2A est une serine/threonine phosphatase majeure dans les cellules eucaryotes formees de deux sous-unites, la sous-unite catalytique (PP2Ac) et la sous-unite regulatrice nomme PR65 ou A. Dans certaines conditions et/ou regions et types cellulaires, une troisieme sous-unite, nominee B, peut s'associer a ce complexe. La sous-unite B permet une meilleure regulation de l'holoenzyme puisqu'elle controle l'activite et la specificite de l'enzyme. De plus, elle permet de la cibler a different compartiment cellulaire. II existe deux isoformes de PP2Ac, deux isoformes de PR65/A et plus de 20 isoformes de B. II y aurait done, theoriquement, plus de 50 holoenzymes de trois sous-unites. D'autre part, des resultats ont demontre que les differentes isoformes de la sous-unite B ont des fonctions differentes, ce qui explique la nature multifonctionnelle de la PP2A. II est connu que la PP2A dephosphoryle Tau (Chohan, et al. 2006, Janssens et Goris 2001, Lechward, et al. 2001, Millward, et al. 1999). Recemment, il a ete demontre que la memantine, un medicament utilise dans la MA, active la PP2A dans les cellules derivees d'un pheochromocytome provenant de la glande surrenale de rat (PC 12) et les tranches d'hippocampe. Cette activation est probablement responsable du renversement de l'hyperphosphorylation et de l'agregation de Tau de meme que la neurodegeneration qui y est associee (Chohan, et al. 2006, Li, et al. 2004).
La memantine
La memantine est un antagoniste non-competitif des recepteurs-canaux N-methyle-D-aspartate (NMDA-R) qui se lie au site de liaison du Mg , un bloqueur endogene du NMDA-R. Tout comme ce dernier, la memantine est expulsee du canal en fonction du potentiel membranaire, evitant ainsi le blocage irreversible du recepteur. Le NMDA-R, hautement permeable au Ca2+, est capital pour la plasticite synaptique lors de l'apprentissage et de la memoire (Schmitt 2005). Dans la MA, le NMDA-R est suractive de facon chronique menant a une entree excessive de Ca2+ qui cause des dommages et de la mort neuronale. Ce phenomene est appele l'excitoxicite (Wenk, et ol. 2006, Witt, et ah 2004). La memantine, utilisee dans les cas moderes a severes de la MA, a comme mecanisme d'action de bloquer cette excitotoxicite. Toutefois, sachant l'importance de ce recepteur et le peu d'effets secondaires repertories du systeme nerveux central, la tolerance de la memantine a ete expliquee par sa forte dependance au potentiel membranaire et a sa cinetique rapide de dissociation du canal, ce qui a pour effet de permettre la signalisation physiologique tout en bloquant la signalisation pathologique (Witt, et al 2004).
Uobjectif de I'etude
La signalisation calcique regie de nombreux et de tres importants processus cellulaires. Sa dyshomeostasie est impliquee dans diverses maladies, dont les maladies neurodegeneratives. Une de ces maladies est la MA pour laquelle le Ca semble etre un
element implique dans la cause de la maladie. Fait interessant, il est important de constater que chacun des medicaments approuves pour le traitement de la maladie affecte la signalisation calcique, directement ou indirectement. II en existe deux classes (Tableau 3) : les inhibiteurs de l'acetylcholinesterase et les antagonistes du NMDA-R, qui contient un seul membre, soit la memantine. Tout d'abord, les inhibiteurs de l'acetylcholinesterase ont pour effet de diminuer la degradation de 1'acetylcholine, ce qui amplifie la signalisation cholinergique muscarinique et nicotinique (Musial, et al. 2007). Chacune de
9-4-ces voies affecte le Ca a sa maniere : les recepteurs muscariniques puisqu'ils sont des GqPCR et les recepteurs nicotiniques puisqu'ils sont des recepteurs canaux qui font entrer du Na et du Ca dans la cellule. Pour ce qui est du role de la memantine dans la MA, elle bloque physiquement le pore du NMDA-R qui est responsable de Pexcitotoxicite puisqu'il fait entrer dans la cellule un exces de Ca2+ (Wenk, et al. 2006, Witt, et al. 2004). La memantine est aussi connue pour bloquer d'autres canaux incluant les recepteurs-canaux 5-HT3 (Reiser, et al. 1988, Rammes, et al. 2001), les recepteurs-recepteurs-canaux nicotiniques neuronaux (Masuo, et al. 1986, Tsai, et al. 1989, Buisson et Bertrand 1998, Maskell, et al. 2003, Aracava, et al. 2005) et les canaux voltage dependant sodique (Grossmann, et al. 1976, Grossmann et Jurna 1977, Klee 1982, Netzer et Bigalke 1990, McLean 1987). Cette etude avait done pour but de verifier si la memantine pourrait influencer d'autres types de canaux impliques dans la regulation du Ca . Pour ce faire, nous avons choisi de caracteriser ses effets sur la signalisation calcique induite par un agoniste dans les non-excitables «human embryonic kydney» 293 (HEK293). Les HEK293 ont ete choisies au lieu de neurones puisque les composantes impliquees dans la signalisation calcique lors de l'activation d'un GqPCR y sont bien caracterisees. Aussi, ce
Article - Avant-propos
Statut de V'article : soumis
Reference : Alexandre P. Blanchard, Gaetan Guillemette, and Guylain Boulay.
Memantine Potentiates Agonist-Induced Ca2+ Responses in HEK 293 Cells.
Apport: J'ai participe activement a Pelaboration de cette etude en planifiant et fournissant
100 % des resultats presenters dans cet article. De plus, j'ai ecrit le premier jet du manuscrit.
Abstract
Background/Aims: The Alzheimer drug memantine (l-amino-3,5-dimethyl-adamantane) blocks the pore channel of the NMDA receptor. Since memantine also blocks the 5-HT3 receptor, neuronal nicotinic receptor, and voltage-activated Na+ channels, the purpose of our study was to verify whether memantine could influence other types of channels involved in the regulation of Ca .
Methods: Free intracellular Ca concentrations in whole cells and in saponin-permeabilized cells were monitored spectrofluorometrically in HEK-293 cells stably expressing TRPC6.
Results: Memantine decreased the basal level of intracellular Ca , increased the content
94-of the intracellular Ca store, which in turn increased the agonist-induced intracellular Ca2+ release, and increased the store-operated Ca2+ entry.
Conclusion: In addition to blocking the NMDA receptor, memantine also decreases the basal level of intracellular Ca2+ and increases the sensitivity of cells to extracellular stimuli. All these effects may be of benefit in the treatment of Alzheimer's disease.
Introduction
Alzheimer's disease (AD) is a chronic, progressive neurodegenerative disorder leading to dementia. The characteristic features of AD are senile plaques, neurofribrillary tangles, intracellular Ca2+ dysregulation, disruption of synapses, and loss of neurons [1, 2]. Perturbations in Ca + homeostasis have been observed in cells from Alzheimer patients and in cells from animal models of the disease. Every gene associated with an increased susceptibility to AD (apolipoprotein E4, amyloid precursor protein, presenilin 1 and 2)
94- • 94- •
modulates some aspects of Ca signaling [1]. Ca is a ubiquitous and versatile intracellular messenger that plays a crucial role in regulating many cellular activities, including gene expression, secretion, cell growth, proliferation, apoptosis, and synaptic plasticity. Various combinations of spatial and temporal release of Ca + from the
94- •
intracellular pool and the influx of Ca from the extracellular space may explain this versatility.
The key elements involved in Ca2+ signaling include activation of Gq protein-coupled and tyrosine kinase receptors that activate phospholipases C (~P or -^/), which hydrolyze phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate to produce inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) and diacylglycerol (DAG). IP3 activates its receptor (IP3R), a Ca2+ channel on the
94- • •
endoplasmic reticulum and causes the first phase of intracellular Ca mobilization [3]. The second phase involves less pronounced but sustained Ca2+ entry through the plasma membrane via two distinct mechanisms referred to as store-operated Ca entry (SOCE) [4, 5] and receptor-operated Ca2+ entry (ROCE) [6]. Ca2+ signaling is terminated by sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase (SERCA) and plasma membrane Ca2+
ATPase (PMCA), which pump Ca back into intracellular stores and out of the cell, respectively.
Interestingly, all the drugs that have been approved for the treatment of AD, directly or indirectly, modify Ca2+ homeostasis. One such drug, memantine, an antagonist of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor, produces its neuroprotective effect [7] by blocking the excitotoxicity resulting from the overactivation of the high permeability Ca NMDA channel receptor [8-10]. Since memantine also blocks 5-HT3 [11, 12], neuronal nicotinic receptor [13-17], and voltage-activated Na+ channels [18-22], we hypothesized that memantine might influence other types of channels involved in the regulation of Ca +.
In the study presented here, we showed that memantine decreased the basal level of intracellular Ca , increased the Ca content of the intracellular store and thus agonist-induced Ca2+ release from the ER, and increased the entry of Ca2+ into the cell. In addition to its known ability to protect against glutamate receptor-mediated excitotoxicity in the treatment of AD, our results suggest that memantine might also exert a beneficial effect
9-4-via a mechanism that potentiates agonist-induced Ca responses.
Materials and methods: Materials
Cell culture media, fetal bovine serum (FBS), geneticin (G-418 sulfate), Hepes, penicillin G, streptomycin sulfate, and trypsin were purchased from GIBCO/Invitrogen (Burlington, ON, Canada). Fura-2, Fura-2/AM, ionomycin, okadaic acid, carbachol (CCh), and thapsigargin (TG) were from Calbiochem (San Diego, CA, USA). IP3 was
from Alexis Biochemicals (San Diego, CA, USA). Bovine serum albumin (BSA) was from Roche Applied Science (Laval, QC, Canada). Protein A-sepharose CL-4B was from GE Healthcare (Baie d'Urfe, QC, Canada). Mouse anti-actin antibody was from Chemicon International (Temecula, CA, USA). Unless otherwise stated, all other reagents were from Sigma-Aldrich (Oakville, ON, Canada).
Cell culture and memantine treatment
Stably transfected mTRPC6 HEK 293 cells (T6.ll) [23] were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% FBS, 400 fig/ml of G418, 100 U/ml of penicillin G, and 100 ug/ml of streptomycin sulfate at 37°C in a humidified 5 % CO2 atmosphere. When required, the cells were treated for 72 h with 100 uM memantine.
Cell lysis and immunoprecipitation
T6.ll cells were washed with ice-cold PBS (10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4, 137 mM NaCl, 3.5 mM KC1, 0.9 mM CaCl2, 1 mM MgCl2) and solubilized for 30 min at 4°C with gentle agitation in 0.75 ml of ice-cold radioimmune precipitation assay buffer (RIPA: 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P40, 0.5% deoxycholate, 5 mM EDTA, 0.1 % SDS, 1 |j.g/ml of soybean trypsin inhibitor, 5 u^/ml of
leupeptin, 100 |aM phenylmethylsulfonyl fluoride). Cells extract were cleared by
centrifugation. For the immunoprecipitation step, the supernatants were incubated overnight at 4°C with recommended dilutions of specific antibodies and with 50 ul of protein A-sepharose CL-4B beads (50%> slurry pre-equilibrated in RIPA). The immune
complexes were harvested by centrifugation, washed three times with RIP A buffer, and solubilized in Laemmli buffer [24] for 30 min at 60 °C before SDS-PAGE fractionation and immunoblotting.
Immunoblots
Proteins were fractionated by standard SDS-PAGE and transferred to a 0.2-um nitrocellulose membrane (Bio-Rad) in 150 mM glycine, 20 mM Tris-base, and 20 % methanol (350 mA, 3 h, 4°C or 150 mA, overnight, 4°C). The blots were stained with Ponceau S to visualize the marker proteins, destained with TBST (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 137 mM NaCl, 0.3% Tween 20), and blocked for either 1 h at room temperature or overnight at 4°C in TBST containing 3% (w/v) BSA. The blots were then incubated for 3 h at room temperature or overnight at 4°C with primary antibodies [mouse anti-SERCA2 (clone IID8, dilution 1:2,500), rabbit anti-SERCA3 (dilution 1:1,500), or mouse anti-actin (dilution 1:10,000)]. After three TBST washes, the blots were incubated with a peroxidase-conjugated secondary antibody (donkey anti-rabbit, dilution 1:20,000 or sheep anti-mouse, dilution 1:10,000) for 1 h at room temperature in TBST. The blots were washed three times with TBST, and the immune complexes were visualized with the ECL Plus detection system (Amersham Biosciences). When required, the bands were quantified with the Bio-Rad Gel Doc system using Quantity One software.
Cytosolic Ca measurements
Treated T6.ll cells (12 x 106) were detached by a brief trypsin/EDTA treatment, resuspended in complete DMEM, washed by centrifugation for 3 min at 100 x g, and
incubated with 10 uM Fura-2/AM in an extracellular-like medium (ECM: 15 mM HEPES, pH 7.4, 140 mM NaCl, 5 mM KC1, 1 mM MgCl2, 10 mM dextrose, 1.8 mM CaCl2, and 0.1% BSA) for 20 min at 37°C in the dark. After a wash by centrifugation, the cells were resuspended in ECM and incubated for 20 min at 37°C to ensure complete hydrolysis of the Fura-2/AM. They were centrifuged again and resuspended in 2 ml of ECM or nominally Ca2+-free ECM, which was identical to ECM except for the absence of CaCb. The cell suspension was gently stirred in a quartz cuvette maintained at 37°C and the fluorescence was monitored using a Hitachi F-2000 spectrofluorometer (Hitachi Scientific Instruments, Inc., Hialeah, FL, USA) with alternative excitation wavelengths of 340 and 380 nm and an emission wavelength of 510 nm. Drugs were added in small volumes (<20 ul) of concentrated stocks (dissolved either in water or dimethylsulfoxide). At the end of each recording, the maximal fluorescence (Rmax) and minimal fluorescence (Rmin) ratios were determined by adding 0.1% Triton X-100 and 65 mM EGTA successively to the cell suspension. When required, the free Ca concentration was calculated according to Grynkiewicz et al. [25].
IP3-induced Ca2+ release
Treated T6.ll cells (70 x 106 cells) were permeabilized in 2 ml of a cytosol-like buffer (ICM: 20 mM Tris HC1, pH 7.4, 10 mM NaCl, 110 mM KC1, 2 mM MgCl2, 5 mM KH2P04,) supplemented with 35 ug/ml of saponin, 0.5 uM Fura-2 acid, 20 U/ml of creatine kinase, and 10 mM phosphocreatine. Fura-2 fluorescence was monitored at 37°C using a Hitachi F-2000 spectrofluorometer (Hitachi Scientific Instruments, Inc.) with alternative excitation wavelengths of 340 and 380 nm and an emission wavelength of 510
nm. The amount of Ca released by IP3 was calculated based on the fluorescent signal
94-obtained with an exogenously added Ca standard (4 nmol CaC^). At the end of each recording, the maximal fluorescence (Rmax) and minimal fluorescence (Rmin) ratios were determined by adding 2 mM Ca and 65 mM EGTA successively to the cell suspension. When required, the free Ca concentration was calculated according to Grynkiewicz et al. [25].
Data analysis
Graphs and curve fits were generated using Prism (Graphpad Software, San Diego, CA, USA). Data are presented as the means ± SD of values obtained in at least three independent experiments. Data were analyzed using Student's t test. Results were considered statistically significant (*) when p < 0.05.
Results
1+
Memantine enhances the Ca responses of T6.ll cells.
T6.11 cells were treated for 72 h with 100 uM memantine or with vehicle, loaded
9+
with Fura-2/AM, and incubated in nominally Ca -free ECM. A typical trace (Figure 1 A)
9-4-shows that, under control conditions, 5 uM CCh caused a robust elevation of [Ca ]; from a basal value of approximately 95 nM to a peak value of approximately 210 nM. Because the extracellular medium was nominally Ca2+-free, the CCh-induced Ca2+ elevation was due to Ca2+ released through channels located on the intracellular stores. Once [Ca +]j had returned to its basal level, the addition of 1 mM extracellular Ca2+ caused a rapid increase of [Ca2+]i to 250 nM. This second phase of the Ca2+ response was caused by Ca2+ entry
Figure 1. Memantine enhances CCh-induced Ca responses in intact T6.ll cells.
T6.11 cells were pre-treated for 72 h with vehicle (panel A) or with memantine (panel B). They were then loaded with Fura-2/AM and bathed in a Ca2+-free extracellular medium. Representative recordings of intracellular Ca + levels upon stimulation with 5 |^M CCh and re-addition of 1 mM Ca2+ to the external medium. Panel C shows the average Ca2+ responses (means ± SD, *p < 0.05) obtained from three independent experiments done in duplicate. Average dose-response curves (means ± SD of 3 experiments done in duplicate) for CCh-induced Ca2+ release (panel D) and Ca2+ entry (panel E), in cells pre-treated with vehicle (solid square) or with memantine (open triangle). Panels F and G show the same results of panels D and E respectively, but expressed as percent of maximal response.
When the same protocol was repeated with cells pre-treated with 100 uM memantine (Figure IB), the CCh-induced Ca release (peak value of 285 nM) and the subsequent Ca entry (peak value of 310 nM) were both potentied. Figure 1C shows that memantine significantly increased CCh-induced Ca + release and subsequent Ca + entry into T6.ll cells. It must be noted that, in these experiments, the basal level of intracellular Ca before stimulation with CCh was consistently lower after the memantine treatment (81.4 ± 4.9 nM) compared to the basal level under control conditions (93.6 ± 7.5 nM). Using the same experimental protocol, the potentiating effect of memantine was observed at all the CCh concentrations used. The concentration-response curves indicated that memantine potentiated the maximal effect of CCh on Ca release (Figure ID) without affecting its apparent affinity (Figure IF). The threshold effects were obtained with approximately 1 (aM CCh, the maximal effects (384 ± 12 nM under control conditions; 721 ± 28 nM after the memantine treatment) were obtained with 1 mM CCh, and the half-maximal effects (EC50) were obtained with 13 uM CCh. Memantine also potentiated the maximal effect of CCh on Ca2+ entry (Figure IE) without affecting its apparent affinity (Figure 1G). Again the threshold effect on Ca2+ entry was obtained with approximately 1 uM CCh, EC50 was obtained with 4 uM CCh, and the maximal responses (227 ±11 nM under control conditions; 351 ± 9 nM after the memantine treatment) were obtained with approximately 100 nM CCh. Basal levels recorded during the concentration-response experiments revealed that the basal level of Ca2+ was 95 ± 9 nM under control conditions and 83 ± 7 nM of Ca2+ after the memantine treatment (p < 0.05). These results suggest that memantine reduced the basal level of intracellular Ca2+ and potentiated the agonist-induced Ca2+ release and Ca2+ entry activities in T6.ll cells. Ca2+ entry into these cells occurs via two distinct mechanisms that are dependent on the activity of store-operated
Ca2+ channels (SOCC) and receptor-operated Ca2+ channels (ROCC). The degree of activation of SOCC is dependent on the extent to which the intracellular store of Ca is depleted. Ca + entry through SOCC is thus proportional to agonist-induced intracellular Ca release. Figure 2 shows that, at different CCh concentrations, the correlation curves for agonist-induced Ca2+ release and agonist-induced Ca2+ entry of control cells and memantine-treated cells are different. As mentioned above, this suggests that memantine regulates the Ca2+ entry pathway independently of the Ca2+ release pathway.
The effect of memantine on Ca + entry is independent of its effect on Ca + release. We investigated the reversibility of the effect of memantine on Ca release and entry activities. Figure 3A shows that a 72 h pretreatment with memantine potentiated both CCh-induced Ca2+ release (from 108 ± 21 nM Ca2+ to 218 ± 13 nM Ca2+) and CCh-induced Ca2+ entry (from 101 ± 12 nM Ca2+ to 190 ± 19 nM Ca2+). The potentiating effect on CCh-induced Ca2+ release remained unchanged after removing the memantine (235 ± 18 nM Ca2+) whereas the potentiating effect on Ca2+ entry was significantly reduced by about 46% (149 ± 20 nM Ca2+). These results suggest that the effect of memantine on Ca2+ entry is independent of its effect on Ca + release. Interestingly, after removing the memantine, a one-hour treatment with okadaic acid further reduced the potentiating effect of memantine on Ca2+ entry by about 69% (from 203 ± 27 nM Ca2+ to 140 ± 13 nM Ca2+) (Figure 3B). These results suggest that PP2A is involved in the potentiating effect of memantine on CCh-induced Ca2+ entry in T6.ll cells. Okadaic acid did not modify the potentiating effect of memantine on CCh-induced Ca2+ release (245 ±38 nM Ca + vs. 244 ± 26 nM Ca2+).
Figure 3. The effect of memantine on Ca entry is independent of its effect on Ca release.
T6.ll cells were pre-treated for 72 h with vehicle (filled bar) or with memantine (empty
94-bar). They were then loaded with Fura-2/AM and bathed in a Ca -free extracellular medium, before stimulation with CCh. Panel A: Average values for CCh-induced Ca release and Ca2+ entry in cells pre-treated with vehicle or with memantine. Grey bar represents the response of cells that were pre-treated for 71 h with memantine and that were incubated for 1 h in the absence of memantine before the stimulation with CCh. Panel B: Average values for CCh-induced Ca2+ release and Ca2+ entry in cells pre-treated with vehicle (filled bar), with okadaic acid (hatched grey bar), or with memantine (empty bar). Grey bar represents the response of cells that were pre-treated for 71 h with memantine and that were incubated for 1 h in the absence of memantine and in the presence of okadaic acid before the stimulation with CCh.. Results are the means ± SD of three independent experiments done in triplicate (*p < 0.05).
While these results do not explain the mechanism by which memantine potentiates
CCh-74-
9-f-induced Ca release, they do suggest that the effect of memantine on Ca entry is independent of its effect on Ca + release.
Memantine enhances SERCA activity.
The potentiating effect of memantine on CCh-induced Ca2+ release may be due to an increase in IP3R activity, which would release more Ca2+, or an increase in the intracellular Ca2+ store, which would provide more Ca2+ to be released through IP3R. Figure 4 shows that 2 uM ionomycin caused a significantly higher release of Ca from
1+
the intracellular store of cells pre-treated for 72 h with memantine (766 ±120 nM Ca ) than from the intracellular store of control cells (412 ± 56 nM Ca2+). This suggests that memantine potentiates the activity of the SERCA pump in T6.11 cells, thus increasing the Ca2+ content of the intracellular store. To directly verify this hypothesis, we looked at the
74-rate at which 4 nmol exogenous Ca was taken up by saponin-permeabilized cells. Cells
74-pre-treated for 72 h with memantine showed a faster initial rate of Ca uptake (8.3 nmol/min) than control cells (6.6 nmol/min) (Figure 5A). Under our experimental
7+
conditions, the initial rate of Ca uptake by memantine-treated permeabilized cells was consistently faster (1.3 ±0.1 times faster) than that of control cells (p < 0.05). HEK 293 cells endogenously express SERCA2b and SERCA3 [26]. Figures 5B and 5C show that a 72 h pre-treatment with memantine did not modify the level of expression of SERCA2B and SERCA3 in T6.ll cells, suggesting that the increased Ca2+content of the intracellular store in memantine-treated cells was due to a positive regulation of SERCA pump activities.
