Implication d'un motif dileucine de l'hélice VIII du récepteur de haute affinité du LTB[indice inférieur 4] dans la chimiotaxie du neutrophile dépendante de RhoA

Implication d'un motif dileucine de l'hélice VIII du récepteur de haute

affinité du L TB

4

dans la chimiotaxie du neutrophile dépendante de RhoA

Par Karine Lambert Service d'immunologie Département de pédiatrie

Mémoire présenté à la Faculté de Médecine et des Sciences de la Santé En vue de l'obtention du grade de

maître ès Sciences (M.Sc.) en Immunologie

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Table des Matières ... i

Illustrations et Tableaux ... .iii

Liste des abréviations ... .iv

Résumé ... vi

Introduction ... 1

Partie 1. Neutrophiles humains ... ! Partie 2. Chimiotaxie du neutrophile ... 7

2.1 Rôle physiologique ... 7 2.1.1 Implication de Gaj ... 9 2.1.2 Implication de RhoA ... 9 2.1.3 Implication de la kinase PBK ... 13 Partie 3. Leucotriène B4 (L TB4) ... 17 3 .1 Biosynthèse du L TB4 ... 17

3 .2 Rôle biologique du L TB4 chez le neutrophile ... 19

3.3 Rôle pathophysiologique du LTB4 ... 21

Partie 4. Récepteur de haute affinité du LTB4 (BLTI) ... .24

4.1 Clonage et caractérisation du BLTI. ... 24

4.2 Signalisation intracellulaire du BLTI.. ... 25

4.3 Élément structurels qui régulent l'expression et la signalisation du BLTI ... 26

Objectifs et Stratégies ... 29

Article ... 32

Discussion ... 80

Conclusion ... 86

Illustrations et Tableaux

Figure 1 Voies de signalisation impliquées dans la chimiotaxie du neutrophile ... 8 Figure 2 Biosynthèse du L TB4 ... 17 Figure 3 Représentation schématique du BL Tl ... 24

Liste d'abbréviations

BL Tl : high affinity leukotriene B4 receptor BLT2: low affinity leukotriene B4 receptor cPLA2: cytosolic phospholipase A2 DMSO: Dimethylsulfoxyde

FLAP: 5-lipoxygenase-activating protein tMLP: formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine GAP: GTPase-activating protein

GEF: Guanine nucleotide Exchange Factor GFP: protéine à fluorescence verte

GM-CSF: granulocyte macrophage colony-stimulating factor GPCR: G protein-coupled receptor

GRK: GPCR kinase IL-1

p:

Interleukin-1

p

IL-8: Interleukin-8 IL-10: Interleukin-10

LARG : leukemia-associated Rho GEF

LT~: Leukotriene ~

L TB4: Leukotriene B4 5-LOX: 5-lipoxygenase LPS: lipopolysaccharide

MCP-1: monocyte chemoattractant protein 1 MIP: macrophage inflammatory protein

Pl60-ROCK: Rho-associated kinase PAF: platelet-activating factor PBK: phosphatidylinositol-3 kinase PIP2: phosphatidylinositol-4,5-biphosphate PIP3: phosphatidylinositol-3 ,4,5-triphosphate PTX: Bordetella pertussis toxin

RANTES: regulated upon activation normally T-cell expressed and secreted RGS: regulator of G protein signaling

ROS: reactive oxygen species

SHIP: Src-homology 2 domain containing inositol polyphosphate phosphatase TNF-a: tumour necrosis factor-alpha

Résumé

La chimiotaxie des leucocytes implique plusieurs évènements structurels et biochimiques bien organisés. Nous avons étudié les voies de signalisation intracellulaires menant à la migration des neutrophiles impliquant le récepteur de haute affinité du L TB4, le BL Tl, ainsi que la relation structure-fonction de la huitième hélice alpha du récepteur dans la migration des neutrophiles. Des neutrophiles humains de même que la lignée cellulaire humaine pro-myéloide PLB-985 transfectée de façon stable avec l' ADNc du BL Tl humain (PLB-BLT) ou des mutants de substitution de l'hélice 8 du BLTl et différenciée en type neutrophile ont été utilisés lors de cette étude. Tous les récepteurs mutés étaient exprimés à la membrane plasmique à un niveau similaire au récepteur BLTl de type sauvage, déterminé par cytométrie de flux. Les réponses chimiotactiques vers le L TB4 étaient similaires pour les PLB-BLT différentiés et les neutrophiles. Cependant, les réponses chimiotactiques des mutants de l'hélice 8 du BLTl vers le LTB4 étaient significativement réduites. Le prétraitement des cellules PLB-BLT différenciées et des neutrophiles avec la toxine de pertussis ou les inhibiteurs pharmacologiques de la PI3K ou de p 160-ROCK réduisait leur migration vers le L TB4, indiquant l'implication de Ga.b PI3K et RhoA dans la chimiotaxie induite par le LTB4. Les neutrophiles et les PLB-BLT différenciés répondait au LTB4 en adoptant une morphologie polarisée, avec la F-actine dans un pseudopode situé au pôle avant et des complexes contractiles actine-myosine à l'arrière et aux côtés de la cellule. La stimulation de cellules PLB-BLT 2L(304-305)/A différentiées avec le L TB4 menait à une formation de multiples pseudopodes accompagnée par une perte de migration. Le phénotype de multiples pseudopodes se produisait aussi quand les cellules PLB-BLT étaient transfectées de façon transitoire avec

un dominant négatif de RhoA ou prétraitées avec l'inhibiteur de p160-ROCK, Y-27632. Le défaut de migration observé chez les cellules PLB-BLT 2L(304-305)/A était corrigé par la transfection transitoire avec une forme constitutivement active de RhoA. En résumé, nos résultats suggèrent un rôle essentiel du motif dileucine distal de l'hélice 8 du BLTl dans l'activation de RhoA et permettant la migration normale des neutrophiles induite par le L TB4.

Introduction

Partie 1: Neutrophiles humains

Les neutrophiles sont générés à partir des cellules pluripotentes hématopoïétiques de la moëlle osseuse. Ils sont abondants dans le sang. Ils sont caractérisés par un noyau multilobé et un cytoplasme composé de plusieurs granules.

Les neutrophiles jouent un rôle crucial dans la défense de l'hôte contre les infections microbiennes. Suite à l'exposition à certains produits dérivés de bactéries ou de médiateurs inflammatoires, les neutrophiles effectuent plusieurs fonctions spécialisées incluant la chimiotaxie, la phagocytose (Lee et al., 2003) et l'élimination du pathogène (Faurschou et Borregaard, 2003; Roos et al., 2003). Le recrutement des neutrophiles du sang aux tissus implique plusieurs molécules d'adhésion.

La phagocytose peut être divisée en plusieurs étapes. Premièrement, les phagocytes, y compris le neutrophile, possèdent des récepteurs sur leur surface qui lient le pathogène et qui comprenent les récepteurs Fey et les récepteurs du complément. Par exemple, les principaux récepteurs Fe sur les neutrophiles au repos sont FcyRIIA (CD32) et FcyRIIIb (CD16) tandis que le récepteur de haute affinité FcyRI (CD64) fonctionne de façon prédominante sur des neutrophiles qui ont été sensibilisés avec l'interféron (McKenzie et Schreiber, 1998). La liaison des récepteurs F cy initie l'extension vigoureuse des pseudopodes qm entourent finalement le pathogène (Greenberg et Grinstein, 2002).

Lorsque le neutrophile rencontre le pathogène, il l'englobe dans un phagosome qm subséquemment fusionne avec des granules intracellulaires pour former le phagolysosome. Dans le phagolysosome, l'élimination du pathogène se fait par deux

mécanismes. Le premier mécanisme dépend de l'oxygène et implique la formation d'espèces d'oxygène réactives (ROS) par la NADPH oxydase dans un processus appelé poussée respiratoire. La NADPH oxydase des leucocytes est constituée de plusieurs unités avec des composés liés à la membrane et d'autres solubles qui s'assemblent dans un complexe hétéromérique quand les cellules sont stimulées. L'enzyme NADPH oxydase convertit l'oxygène en anions superoxyde (02°). Les anions superoxyde ont un

faible potentiel bactéricide; ce ne sont pas les anions superoxyde eux-mêmes qui tuent les microbes, mais ils sont précurseurs d'autres espèces réactives d'oxygène très toxiques. Par exemple, à l'intérieur du phagosome, les anions superoxyde sont convertis enzymatiquement en peroxyde d'hydrogène par l'enzyme superoxyde dismutase. Le peroxyde d'hydrogène peut réagir avec plusieurs composés : soit, avec l'oxyde nitrique (NO) pour donner du peroxynitrite, soit avec un anion superoxyde pour donner un radical hydroxyl et un singulet d'oxygène, soit avec un ion chlore et avec la myéloperoxidase, un composé des granules azurophiles, pour donner un radical hypochloreux. Les radicaux hypochloreux et le peroxyde d'hydrogène sont des agents antimicrobiens très efficaces. Après la poussée respiratoire, le peroxyde d'hydrogène est dégradé en eau et oxygène par la catalase et les autres radicaux libres d'oxygène sont aussi dégradés. L'importance de ce mécanisme est soulignée dans une maladie appelée granulomatose chronique familiale où les patients sont susceptibles à des infections bactériennes et fongiques causées par un défaut du complexe NADPH oxidase amenant une inhabileté des neutrophiles à générer du superoxyde pour tuer les microorganismes producteurs de catalase, soit par exemple,

Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia, Serratia marcescens et les espèces

Le deuxième mécanisme ne dépend pas de l'oxygène et consiste en l'utilisation de plusieurs types de granules. Il y a quatre types ou catégories de granules, les granules primaires (ou azurophiles ), les granules secondaires (ou spécifiques), les granules tertiaires (ou gélatinases) et les vésicules sécrétoires. Brièvement, les granules azurophiles contiennent des protéines anti-microbiennes comme la myéloperoxidase (Klebanoff, 1999) et l'alpha défensine (Wimley et al., 1994). Les granules spécifiques participent aussi aux activités antimicrobiennes du neutrophile par la mobilisation de substances antimicrobiennes soit au phagosome ou à l'extérieur de la cellule (Jesaitis et al., 1990; Joiner et al., 1989). Les granules tertiaires sont un réservoir d'enzymes capables de dégrader la matrice et des récepteurs membranaires requis durant l'extravasation et la diapédèse du neutrophile (Mollinedo et al., 1997). Les vésicules sécrétoires, mobilisées en réponse à une grande variété de stimuli inflammatoires (Sengelov et al., 1993a), constituent un réservoir de récepteurs associés à la membrane, incorporés dans la membrane plasmique après l' exocytose et requis dans les premières phases de la réponse inflammatoire médiée par le neutrophile. Plus précisément, les membranes des vésicules sécrétoires sont riches en intégrine

P2

CD 11b/CD18 (Mac-1, CR3) (Sengelov et al., 1993b), le récepteur du complément 1 (CRI) (Sengelov et al., 1994), les récepteurs de peptides bactériens formylés (récepteurs fMLP) (Sengelov et al., 1994), le corécepteur pour le LPS (CD14) (Detmers et al., 1995) et le récepteur FcyRIII (CD16) (Detmers et al., 1995). Donc, les différents types de granules contenus dans le neutrophile constituent un important réservoir de protéines antimicrobiennes, de composé de la NADPH oxidase, mais aussi de plusieurs récepteurs membranaires pour les molécules d'adhésion endothéliales, les protéines de la matrice extracellulaire, les

produits bactériens et les médiateurs de l'inflammation. L'importance du mécanisme indépendent de l'oxygène est reflétée par deux maladies héréditaires très rares, soit la maladie de Chediak et la déficience en granules spécifiques. Les deux troubles sont caractérisés par des infections récurrentes et une espérance de vie réduite. Dans la maladie de Chediak, les neutrophiles contiennent des granules géantes résultant d'une fusion entre les granules spécifiques et azurophiles. La déficience en granules spécifiques est caractérisée par l'absence de granules spécifiques et de défensines. La sévérité des symptômes associée à ces deux maladies souligne le rôle fondamental des granules dans la défense de l'hôte.

Après avoir complété leurs fonctions, les neutrophiles meurent par apoptose, facilitant leur disposition par les macrophages sans la fuite de produits cytotoxiques. Plusieurs études récentes ont montré que la phagocytose initie une cascade d'évènements qui accélère l'apopotose des neutrophiles humains (Kobayashi et al., 2003a; Kobayashi et al., 2002; Kobayashi et al., 2003b). Ce processus permet aux neutrophiles d'éliminer les microorganismes étrangers en minimisant les dommages aux tissus de l'hôte. La phagocytose des neutrophiles apoptotiques par les macrophages inhibe la production de IL-Ip, IL-8, IL-10, GM-CSF, TNF-a, leucotriène C4 et thromboxane B2 par les macrophages humains (Fadok et al., l 998a; Fadok et al., 1998b) ce qui amène une résolution de l'inflammation.

Les neutrophiles sont donc des composantes essentielles de la réponse inflammatoire et la résolution d'une infection microbienne. Malgré l'existence de mécanismes de sûreté minimisant les risques de dommages à l'organisme (Roos et al., 2003), cette protection n'est pas absolue. En effet, certaines maladies accompagnant des

dommages aux tissus par les produits dérivés des neutrophiles comme la goutte, la bronchopneumopathie chronique obstructive, l'arthrite rhumatoïde, l'angéite autoimmune, et quelques formes de glomérulonéphrite peuvent se manifester (Weiss,

1989).

Étant donné que les neutrophiles ont une courte durée de vie, sont différentiés de façon terminale et réfractaires à la plupart des méthodes de transfection, quelques modèles cellulaires de type neutrophilique ont été utilisés ces dernières années pour étudier les activités cellulaires de cette cellule sanguine. Plus particulièrement, il s'agit, en autre, des lignées cellulaires suivantes : U93 7 (Snyder et al., 1985), HL-60 (Chaplinski et Niedel, 1982; Collins, 1987; Harris et Ralph, 1985; Langer et Pestka, 1985), PL-21 (Kubonishi et al., 1986) et PLB-985 (Tucker et al., 1987) différentiées en neutrophile par l'ajout d'un ou plusieurs agents de différenciation dans le milieu de culture. Les agents de différenciation utilisés sont le diméthylsulfoxyde, l'acide rétinoïque et la vitamine D3. En ce qui concerne ce travail de maîtrise, la lignée cellulaire PLB-985 différenciée avec le diméthylsulfoxyde a été utilisée. La lignée cellulaire PLB-985 a été établie à partir de cellules du sang périphérique d'une patiente souffrant de leucémie aiguë non lymphocytaire (Tucker et al., 1987). La culture de ces cellules en présence de DMSO induit la maturation granulocytaire, indiquée par la morphologie, la coloration histochimique, la production d'anions superoxyde et la production augmentée de granules. De plus, les cellules PLB-985 constituent un excellent modèle pour étudier la chimiotaxie des neutrophiles puisqu'elles se comportent comme les neutrophiles lorsqu'elles sont stimulées avec une concentration uniforme ou un gradient de chimioattractant (Servant et al., 1999). Donc, pour notre étude de chimiotaxie de

neutrophiles, les cellules PLB-985 ont été transfectées de façon stable soit avec del' ADN codant pour le récepteur de haute affinité du LTB4, le BLTI, soit avec del' ADN codant

pour le BL Tl muté de façon ponctuelle au niveau des motifs dileucine de la queue cytoplasmique. Ceci a permis d'avoir une expression du récepteur à la surface membranaire équivalente aux neutrophiles humains, d'avoir des réponses cellulaires comme la chirniotaxie et la chimiokinèse similaires aux neutrophiles humains en réponse au LTB4 et d'étudier la relation structure-fonction du BLTl en utilisant la mutagenèse

Partie 2 : Chimiotaxie du neutrophile

2.1 Rôle physiologique de la chimiotaxie du neutrophile

Les neutrophiles sont capables de se diriger à une vitesse de 20 µm par minute (Niggli, 2003) dans un gradient chimiotactique, lequel est produit lors d'une infection ou d'un dommage aux tissus. Plusieurs chimioattractants produits par l'endothélium des micro vaisseaux enflammés comme le PAF, le leucotriène (L T)B4 ainsi que certains

produits des microorganismes envahissants sont impliqués dans la régulation du recrutement des neutrophiles du sang aux tissus. Même si les facteurs chimioattractants peuvent être des lipides, des protéines, ou des peptides, la plupart d'entre eux exercent leur action en liant les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR). Ces récepteurs comme leur nom le suggère intéragissent avec des protéines G hétérotrimériques. Suite à

l'activation des GPCRs, les protéines G hétérotrimériques qui sont composées de sous-unités

a,p

et y subissent un changement de conformation qui mène à l'échange de GDP pour GTP lié à la sous-unité a. Cet échange mène à la dissociation des protéines G hétérotrimériques en sous-unité a liée à GTP et un complexe formé des sous-unités

py

(Arai et Charo, 1996). Chacune active ensuite des molécules effectrices différentes (Marinissen et Gutkind, 2001 ). La sous-unité a possède une activité GTPase intrinsèque qui mène à la forme inactive des protéines hétérotrimériques par l'hydrolyse de GTP à GDP, ce qui induit la réassociation de la sous-unité a avec le complexe

py

(Conklin et Bourne, 1993; Neer, 1995; Rens-Dorniano et Hamm, 1995).

Lorsqu'un chimioattractant lie un GPCR exprimé sur les neutrophiles, il y a développement d'une polarisation avec une extrémité où des polymères d'actines sont synthétisés et s'accumulent vers l'avant tandis que la contraction par la myosine à

l'arrière facilite le décollement de la cellule du substrat et résulte en l'avancement de la cellule. Cette polarisation est le résultat d'un système très complexe de signalisation qui a été identifié chez le neutrophile (Bokoch, 1995; Firtel et Chung, 2000; Servant et al., 2000; Weiner et al., 1999; Wymann et al., 2000) par des approches pharmacologiques et des souris déficientes pour certains gènes (Lowell et Berton, 1999; Wymann et al., 2000). Brièvement, une étude récente a montré que la chimiotaxie des neutrophiles requiert deux voies divergentes impliquant différentes protéines G hétérotrimériques. La première voie est initiée par Gai et contrôle la formation d'un pseudopode par PIP3, Rac

et F-actine. L'autre voie est médié par Ga12 ou Ga13 et implique RhoA, pl60-ROCK, les

chaînes légères de myosine phosphorylées et la myosine activée (Xu et al., 2003).

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Figure 1 : Voies de signalisation impliquées dans la chimiotaxie du neutrophile (Bagorda et al. Thromb. Haemost. 2006.)

2.1.1 Implication de Gai

L'utilisation de la toxine de pertussis (PTX) a révélé que l'activation de Gi est essentielle pour la chimiotaxie. En effet, PTX ADP ribosyle la protéine Gai et inhibe le couplage récepteur-protéine Gi. Il a été démontré que l'utilisation de cette toxine supprime toutes les réponses de chimiotaxie testées chez les neutrophiles incluant l'activation de Rac et Cdc42 ainsi que la phosphorylation de PKB/Akt (« protein kinase B ou v-akt murine thymoma viral oncogene homolog ») (Bengtsson et al., 1986; Goldman et al., 1985; Molski et Sha'afi, 1987; Shefcyk et al., 1985; Spangrude et al., 1985). PTX empêche la formation d'un pseudopode normal mais n'interfère pas avec la formation d'un uropode normal en réponse au fMLP (Xu et al., 2003). Gaudreau et al. (1998) ont co-transfecté le BL Tl avec différentes sous-unités Ga dans les cellules COS-7 et ils ont trouvé que le BL Tl peut se coupler aux protéines Gi et Gq. La chimiotaxie des cellules RBL-BLTl et des cellules CHO transfectées de façon stable avec le BLTI humain était bloquée par PTX, démontrant que l'activation de Gi est essentielle pour la chimiotaxie induite par le récepteur BL Tl (Haribabu et al., 1999; Y okomizo et al., 1997).

2.1.2 Implication de RhoA

Les récepteurs de chimioattractants sont liés principalement à Gai et Ga12113 chez

les neutrophiles (Xu et al., 2003). Ga12 et Ga13 possèdent 67% d'identité d'acides aminés

entre eux. Pour ce qui est de l'identité d'acides aminés avec les sous-unités a des autres classes comme Gq, Gi. et G5, elle se situe à 35-44% (Strathmann et Simon, 1991).

L'effecteur de Ga12m est RhoA (Gohla et al., 1998; Klages et al., 1999; Plonk et al.,

1998). RhoA ainsi que Cdc42 et Rac sont des petites GTPases de la famille de Rho. L'activité fonctionnelle des petites GTPases est régulée étroitement in vivo par des

protéines qui contrôlent leur état actif (lié à GTP) ou leur état inactif (lié à GDP). La conversion de l'état inactif à l'état actif est faite par les GEFs (Guanine nucleotide Exchange Factor), tandis que la conversion de l'état actif à inactif est contrôlée par des GAPs (GTPase-Activating Protein) qui augmentent le taux intrinsèque d'hydrolyse de GTP des petites GTPases (Lamarche et Hall, 1994). Les petites GTPases de la famille Rho sont incluses dans la superfamille des Ras GTPases qui comprend environ 50 membres classés selon leur séquence primaire et leurs activités cellulaires (Boguski et McCormick, 1993; Boume et al., 1991; Hall, 1994). Quelques exemples d'activités cellulaires contrôlées par les petites GTPases de la famille de Rho incluent la morphologie, l'agrégation et la motilité des cellules (Hotchin et Hall, 1996; Narumiya, 1996; Narumiya et al., 1997), résumées brièvement par le contrôle de plusieurs aspects du cytosquelette (Hall, 1994). Lors du déplacement de neutrophiles, Rac et Cdc42 induisent la protubérance (pseudopode) basée sur l'actine à l'extrémité avant de la cellule (Glaven et al., 1996), tandis que Rho contrôle la contraction de l'uropode basé sur la myosine (Niggli, 2003). Les protéines Rho jouent aussi un rôle au niveau de la phagocytose, de !'endocytose et du transport de vésicules sécrétoires (Takai et al., 2001).

L'activation de RhoA par Ga.12113 implique l'interaction directe avec les protéines

Rho GEFs. Il y a au moins 4 GEFs connus pour interagir entre Ga et RhoA: Lsc/p115 RhoGEF (Glaven et al., 1996; Hart et al., 1998; Hart et al., 1996; Kozasa et al., 1998; Whitehead et al., 1996) , leukemia-associated Rho GEF (LARG) (Fukuhara et al., 2000; Reuther et al., 2001), PDZ-RhoGEF/GTRAP48 (Fukuhara et al., 1999) et Lbc (Dutt et al., 2004). LARG lie aussi Gq (Booden et al., 2002). Plusieurs GEFs des petites GTPases de la famille de Rho ont été découverts pour leur habileté de transformer des fibroblastes

murins suite à leur sur-expression (Whitehead et al., 1997). Ces protéines incluant dbl, ost, Ife, !be, vav, eet2, tim, et net partagent un domaine structurel d'environ 250 acides aminés, nommé domaine homologue à l'oncogène Dbl (Domaine DH), adjacent à un domaine homologue à la pleckstrin (domaine PH) (Whitehead et al., 1997). Le domaine DH facilite le relâchement de GDP (confère l'activité GEF) tandis que le domaine PH dirige la localisation de GEF intracellulaire et/ou régule le domaine DH (Erickson et Cerione, 2004; Schmidt et Hall, 2002). Certaines GEFs incluant PDZ-Rho-GEF, LARG et pl 15RhoGEF possèdent une caractéristique structurale unique soit la présence d'une région similaire au « regulator of G protein signaling » (RGS). La Ga12 peut reconnaître ce domaine similaire au RGS qui constitue un motif structurel par lequel la Ga12 peut se

lier. Ces protéines RGS fonctionnent comme GAPs pour les protéines Ga et augmentent le taux d'hydrolyse de GTP sur ces même protéines résultant à la régulation à la baisse du signal Ga (Berman et Gilman, 1998). Donc ces GEFs constituent un lien direct entre la

Ga12 ou Ga13 et RhoA. Lsc est un GEF qui lie Ga12 et Ga13 et est exprimé beaucoup dans les tissus hématopoïétiques. Le domaine DH de Lsc peut être stimulé par les protéines hétérotrimériques _Ga12 et Ga13 pour catalyser l'activation de RhoA (Hart et al., 1998) tandis que le domaine RGS de Lsc peut inhiber Ga12 et Ga13 (Kozasa et al., 1998; Wells et al., 2002). Une étude a démontré que Lsc est requis pour une polarisation normale, une migration et l'adhésion de neutrophiles stimulés avec fMLP (Francis et al., 2006).

La plupart des effets de Rho-GTP sur le cytosquelette des cellules HL-60 et d'autres types cellulaires (Ishizaki et al., 1997) sont médiés par la kinase dépendente de Rho, c'est-à-dire p160-ROCK. Cette dernière inactive la phosphatase des chaînes légères

de myosine via la phosphorylation (Riento et Ridley, 2003; Xu et al., 2003). De plus, suite à l'activation de récepteurs de chimioattractant, p160-ROCK active une kinase (Myosin light chain kinase MLCK) et augmente ainsi, indirectement, la phosphorylation des chaînes légères de myosine, résultant en l'activation de la myosine (Niggli, 1999). Plus précisément, p 160-ROCK contrôle la phosphorylation des chaînes légères de myosine dépendante de fMLP sur le résidu sérine 19 (Xu et al., 2003). Les principales fonctions de RhoA et p160-ROCK chez les neutrophiles migrants concernent donc la contraction, la dé-adhésion et la rétraction de l'uropode. RhoA est distribué dans le cytoplasme des cellules HL-60 différentiées et non stimulées, mais est exclu des pseudopodes. Lorsque les cellules sont stimulées avec fMLP, RhoA est redistribué à

l'uropode, tel que déterminé par l'immunofluorescence de RhoA (Xu et al., 2003). L'inhibition de Ga12, Ga13, ou RhoA par un dominant négatif mène à la formation de pseudopodes multiples distribués sur toute la surface des cellules HL-60 différentiées et stimulées au fMLP. En d'autres mots, les cellules ne sont pas capable de former un seul pseudopode dominant (Xu et al., 2003). De plus, l'inhibition de p160-ROCK par l'inhibiteur pharmacologique Y-27632 mène également à la formation de pseudopodes multiples chez les cellules HL-60 (Xu et al., 2003). Le phénomène de pseudopodes multiples est aussi observé chez les neutrophiles provenant de souris déficientes pour Lsc, lorsque stimulés par le fMLP (Francis et al., 2006). Ces résultats montrent que Lsc lie les récepteurs de fMLP à la signalisation de Rho requise pour former un pseudopode dominant chez les neutrophiles (Francis et al., 2006). L'application de blebbistatin, un inhibiteur de la myosine II, résulte aussi en la formation de pseudopodes multiples comme ceux observés par l'utilisation d'un dominant négatif de Ga12, Ga13 et RhoA

ainsi que l'inhibiteur pharmacologique de p160-ROCK (Xu et al., 2003). Il a été suggéré que le phénomène de pseudopodes multiples pourrait résulter de la formation altérée de l'uropode (Xu et al., 2003). Des études ont montré que Rho était requis pour le détachement de l'uropode (Albias et al., 2001; Liu et al., 2002; Yoshinaga-Ohara et al., 2002). Ces résultats suggèrent que Rho promeut la formation de l'uropode, résultant, indirectement, en l'inhibition de formation inappropriée de pseudopodes menant à un seul pseudopode dominant.

2.1.3 Implication de PB K

Il y a trois classes de PB kinase (PB K) groupées selon leur structure et la spécificité de leur substrat (Fruman et al., 1998). La classe I de PBK est subdivisée en deux classes soit la classe IA et IB. lesquelles sont composées de protéines hétérodimériques avec une sous-unité catalytique et une autre régulatrice. La sous-unité catalytique pl 10 possède quatre isoformes reconnues soit pl 10-a, p, y et ù . La classe IA comprend pl 10-a,p,ù qui s'associent de façon prédominante avec la sous-unité régulatrice p85a ou p85p. (p55a et p50a sont des sous-unités régulatrices moins communes). pllOa et p sont exprimés dans plusieurs tissus, tandis que pllOù est exprimé principalement chez les leucocytes (Koyasu, 2003). La classe Is possède une sous-unité catalytique pl lüy qui lie une sous-unité régulatrice plül (Fruman et al., 1998). pl lüy est régulé par Gpy (Leopoldt et al., 1998) et la fonction de la sous-unité régulatrice est d'augmenter l'efficacité de la kinase (Krugmann et al., 1999; Maier et al., 1999). pl lüy est principalement exprimé chez les leucocytes (Koyasu, 2003). Les neutrophiles expriment les isoformes a,p,y et ù de la PBK. Les protéines G hétérotrimériques régulent l'activité de la PBKy (Stephens et al., 1993; Weiner et al., 2002), tandis que les autres

isoformes sont régulées par des tyrosine kinases et peuvent être activées par exemple par l'engagement d'intégrines (Axelsson et al., 2000). Chez les neutrophiles murins et humains, la PI3Ky semble être !'isoforme principale responsable de la production de PIP3 induite par les facteurs chimiotactiques (Hirsch et al., 2000; Li et al., 2000; Naccache et al., 2000; Sasaki et al., 2000). Les classe II et III de PI3K sont exprimées de façon ubiquiste.

La première évidence de l'implication des PI3K dans la migration induite par des chimiokines provient d'études utilisant des cellules T. Ces études ont démontré que la chimiotaxie des cellules T médiée par RANTES était inhibée par l'utilisation d'inhibiteurs de PI3K comme la wortmannin ou le LY294002 (Turner et al., 1995). La wortmannin est un métabolite fungique qui se lie sélectivement sur le résidu Lys802 de la sous-unité pl 10 (Wymann et al., 1996) et inhibe son activité (Beeton et al., 2000). Ensuite, des études subséquentes ont démontré l'importance de la PI3K dans la chimiotaxie médiée par MIP, MCP-1 et IL-8 chez d'autres types cellulaires comme les éosinophiles, les THP-1 et les neutrophiles (Knall et al., 1997; Sullivan et al., 1999). Par ailleurs, des études utilisant des souris déficientes pour le domaine catalytique de la PI3Ky, c'est-à-dire des souris déficientes pour pl IOy, ont révélé des défauts de chimiotaxie chez les neutrophiles et les macrophages (Hirsch et al., 2000; Sasaki et al., 2000). La sous-unité pl IOy est la sous-unité majeure de PI3K activée suite à une stimulation avec les chimioattracant fMLP et IL-8 chez les neutrophiles humains (Naccache et al., 2000). Suite à l'exposition au chimioattractant, l'enzyme PI3K catalyse la phosphorylation de PIP2 en PIP3. L'accumulation de PIP3 au niveau de l'extrémité

l'utilisation de domaines PH, avec étiquette GFP, qui liait sélectivement PIP3 et PIP2

ainsi que par l'utilisation d'anticorps spécifique pour PIP3 (Rickert et al., 2000). Donc, les neutrophiles dérivés de souris déficientes en PI3Ky souffrent de problèmes relatifs à la localisation de PIP3 au niveau de l'extrémité protubérante et à une chirniotaxie déficiente dans un gradient de tMLP (Hannigan et al., 2002; Hannigan et al., 2004). L'accumulation de PIP3 à l'extrémité protubérante corréle avec la polarisation des récepteurs de chimiokines (Sanchez-Madrid et del Pozo, 1999). De plus, l'addition de PIP3 exogènes aux neutrophiles humains (Niggli, 2000) et aux cellules HL-60 différentiées en neutrophiles (Servant et al., 2000; Wang et al., 2002) mène à l'accumulation de PIP3 endogène sélectivement dans les membranes de l'extrémité protubérante, un développement de polarité, une formation de pseudopode riche en F-actine et finalement la migration en l'absence de chimioattractant. Ces effets sont complètement bloqués par l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques de Pl3K et de toxines qui inhibaient l'activité de Rho GTPases, indiquant qu'ils dépendent de l'activation de la synthèse de PIP3 endogène et de Rac par les lipides additionnés de façon exogène. Plusieurs protéines cytosoliques avec des domaines PH peuvent lier PIP3, menant à leur activation, incluant les protéines serine thréonine kinase PKB/Akt et Rac (Cantley, 2002). L'activation de ces protéines influence plusieurs processus cellulaires comme la synthèse de protéines, la polymérisation de l'actine et la survie de la cellule. La régulation de la polymérisation de F-actine dépend de l'activation de PI3K et de la génération de PIP3 et implique aussi l'activation de PK.BI Akt et de deux GTPases de la famille de Rho soit Cdc42 et Rac2 (Katanaev, 2001; Pollard et al., 2000). Cdc42 et Rac2 forment des complexes avec les protéines de la famille W ASp et W A VE pour promouvoir la formation de « free barbed

ends» (Zhelev et Alteraifi, 2002). Ces derniers initient des embranchements de la F-actine (Cory et Ridley, 2002). En conclusion, l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques de PI3Ks a démontré que PIP3 joue un rôle essentiel dans la formation de polymères d'actine et la formation de pseudopodes chez le neutrophile et les cellules HL-60 (Servant et al., 2000; Srinivasan et al., 2003; Wang et al., 2002; Weiner et al., 2002) par l'activation des GTPases de la famille de Rho, plus précisément Cdc42 et Rac (Benard et al., 1999), ce dernier (Rac) étant connu pour stimuler l'accumulation de PIP3 (Srinivasan et al., 2003; Wang et al., 2002) et pour promouvoir la réorganisation des filaments d'actine (Ridley, 2001; Tapon et Hall, 1997). Finalement, il a été démontré que la production de PIP3 stimulée par fMLP dépendait de l'activation de Gi (Xu et al., 2003).

Chez les neutrophiles, Pl3K influence plusieurs fonctions autres que la chimiotaxie comme la production de superoxyde et la phagocytose (Hannigan et al., 2004), mais aussi la survie des cellules, la mitogenèse, le routage à la membrane et le transport de glucose (Vanhaesebroeck et al., 2001). En effet, il a été rapporté que la production de ROS chez les neutrophiles humains stimulés au fMLP était diminuée par l'utilisation d'inhibiteurs de PI3K (Fuhler et al., 2003). L'utilisation d'inhibiteurs de Pl3K soit la wortmanin et Ly294002, a révélé que la PI3K est importante pour la phagocytose puisque ces inhibiteurs bloquent l'extension de la membrane et la fusion avec la particule (Cox et al., 1999).

La dégradation de PIP3 est médié par les protéines tyrosine phosphatases SHIP-1

Partie 3 : _{Leucotriène B4 (L TB4)} 3.1 Biosynthèse du LTB4

Le leucotriène B4 (acide 5(S), 12 (R)-dihydroxy-6, 14-cis-8,

10-trans-eicosatetraenoïque) a été découvert par Borgeat et Samuelsson (Borgeat et Samuelsson, 1979) et constitue un puissant médiateur lipidique de l'inflammation synthétisé à partir de l'acide arachidonique libéré des phospholipides membranaires (Y okomizo et al., 2001 ), sous l'action de la phospholipase A2 cytosolique (cPLA2). Ensuite, deux autres enzymes

sont nécessaires pour mener à _{la biosynthèse du L TB4, soit la 5-lipoxygénase (5-LOX) et}

la LT A4 hydrolase (Minami et al., 1987). (Figure 2).

Degradation of LT84 fl-Oxidatioo /

~ ,/

Biosynthesis of LT84 LTB( 12·HD (IHIEDH) LTB4 20-hydroxylase ~ _ ,,...,.. (u>-Oxidation) " ....,,-· ·· · 12·keto-LTB •

~

1

Aed~tase?

w-Oxidation

~

1 20-0H LTB4 T

~~

!....,~. 10-HOTE

Aeduciase? 20-COOH· 12-Kete>-LTB, 8-COOH LTB, LTB• 20-carooxytase ~~ "'~ ' (w-Oxidatioo) P·Oxidation~ ~H lv-~~ ~~ 20-COOH LTB, ~-10, .11, 14~ 15-retrahydro-12-keto-LTB,

La 5-LOX catalyse les deux premières étapes de conversion de l'acide arachidonique en acide 5-hydroxyeicosatetraenoïque et en leucotriène

Ai

tandis que la L T

Ai

_{hydrolase catalyse la dernière étape, soit la conversion de L T A4 à L TB4. La 5-LOX} est présente principalement chez cellules hématopoïétiques, telles le neutrophile, par exemple. Cependant, l'expression de la 5-LOX a été détectée chez d'autres types cellulaires tels les kératinocytes de la peau chez l'humain (Janssen-Timmen et al., 1995), les cellules de Langerhans (Spanbroek et al., 1998) et les cellules épithéliales du côlon (Battu et al., 1997). L'expression de la LTA,i hydrolase est plus ubiquiste, se retrouvant dans plusieurs tissus incluant les poumons, les reins, la rate et le tractus gastro-intestinal (Ohishi et al., 1990). L'activité de la 5-LOX est facilitée par une autre protéine appelée la

« 5-lipoxygenase-activating protein » (FLAP) qui agit comme une protéine de transfert, ou de présentation, de l'acide arachidonique à la 5-LOX (Dixon et al., 1990). La localisation cellulaire de la cPLA2 et de la 5-LOX se situent au niveau du cytosol mais lorsqu'elles sont activées, elles transloquent à la membrane nucléaire (Brock et al., 1997; Brock et al., 1995; Hirabayashi et al., 1999; Rouzer et Samuelsson, 1985). Contrairement à la cPLA2 et la 5-LOX, la FLAP n'a pas besoin d'être activée pour transloquer à la membrane nucléaire puisqu'elle se retrouve de façon constitutive au niveau de celle-ci (Woods et al., 1993). Conséquemment, la biosynthèse du LTB4 se situe principalement à la membrane nucléaire. De plus, le L TB4 n'est produit que dans certains types cellulaires, en particulier, les cellules de la lignée myéloide comme les monocytes/macrophages (Fels et al., 1982) et neutrophiles (Crooks et Stockley, 1998) suite à une provocation par une variété de stimuli incluant le L TB4 lui-même (McDonald et al., 1992). Finalement, le L TB4 est métabolisé par les leucocytes et hépatocytes en agents biologiquement moins

actifs comme le 20-hydroxy et 20-carboxy L TB4 (Mayatepek et Hoffmann, 1995). Les enzymes du cytochrome P450 sont responsables de cette dégradation du L TB4• Il peut y

avoir une plus grande dégradation des sous-produits du L TB4 par les phénomènes de ~ et m-oxydation qui les rendent biologiquement inactifs.

3.2 Rôle biologique du LTB4 chez le neutrophile

Le L TB4 joue un rôle important dans la réponse immunitaire et les mécanismes de défense de l'hôte (Denzlinger, 1996; Samuelsson et al., 1987) en stimulant une variété de fonctions en particulier chez le neutrophile humain.

Le LTB4 est un des plus puissants chimioattractants connus, avec l'IL-8, pour les neutrophiles et ce, à des concentrations aussi faibles que 10-9 _{et 1}

o-

10_{M (Palmblad et al.,}

1981; Palmer et al., 1980). Le L TB4 mène aussi à la chimiokinèse du neutrophile à des concentrations subnanomolaires (Ford-Hutchinson et al., 1980; Mayatepek et Hoffmann, 1995).

L'extravasation des leucocytes est un processus comportant plusieurs étapes (Kunkel et al., 2003). Par exemple, le recrutement des leucocytes (incluant le neutrophile) au site d'infection requiert plusieurs étapes successives. Premièrement, il y a la margination c'est-à-dire que les leucocytes qui sont éloignés de l'axe central s'accumulent en périphérie des vaisseaux. Ensuite, il y a le roulement des leucocytes qui est médié par les sélectines et leurs ligands. Le roulement est une étape importante puisqu'elle permet aux leucocytes de détecter des changements au niveau de l'endothélium ( chimioattractants) qui permettraient l'adhésion ferme grâce à l'activation d'intégrines sur la surface des leucocytes. Finalement, il y a la transmigration des

leucocytes. La migration des leucocytes dans l'espace extravasculaire s'effectue sous l'influence de stimuli chimiotactiques dont le LTB4 fait partie.

L'adhésion ferme dans les vaisseaux sanguins est le prérequis pour la migration des neutrophiles dans les tissus et il a été démontré que le L TB4 induit une activation rapide des intégrines menant à l'arrêt ferme des neutrophiles (Tonnesen, 1989). Une étude subséquente a démontré que le L TB4 régulait à la hausse l'expression de l' intégrine CDl lb/CD18P2 chez les neutrophiles (van Pelt et al., 1997).

En résumé, le LTB4 joue un rôle essentiel dans l'inflammation par le recrutement de neutrophiles au site inflammatoire en dirigeant les neutrophiles mais aussi en convertissant le roulement des neutrophiles sur l'endothélium en une adhésion ferme. Lorsque les neutrophiles atteignent le site inflammatoire, le LTB4 stimule d'autres fonctions essentielles du neutrophile comme la génération d'espèces d'oxygène réactives (Sumimoto et al., 1984), le relâchement d'enzymes contenues dans les granules (Rae et Smith, 1981) et la phagocytose. En effet, une étude a démontré que la phagocytose de Klebsiella pneumoniae était réduite chez les neutrophiles qui n'étaient pas capable de produire des leucotriènes provenant de souris déficientes en 5-LOX, de même que par l'inhibition pharmacologique de la 5-LOX chez les neutrophiles du sang périphérique humain (Mancuso et al., 2001). De plus, la réduction de phagocytose est aussi observée chez les neutrophiles humains prétraités avec un antagoniste du récepteur du L TB4. Ces résultats suggèrent donc l'implication du LTB4 dans la phagocyotse de bactéries chez les neutrophiles (Mancuso et al., 2001 ).

D'autres part, le LTB4 stimule l'agrégation des neutrophiles (Ford-Hutchinson et al., 1980), et a un effet anti-apoptotique sur les neutrophiles (Hébert et al., 1996).

3 .3 Rôle pathophysiologigue du L TB4

Comme il a été décrit précédemment, le L TB4 stimule la chimiotaxie des neutrophiles au site inflammatoire ainsi qu'améliorer l'interaction entre les neutrophiles circulants et les cellules de l'endothélium permettant l'installation d'une réponse inflammatoire essentielle au site d'agression. Par contre, un recrutement excessif de neutrophiles et leur activation peuvent engendrer des dommages aux tissus et contribuer de façon significative à la perpétuation et la progression de pathologies inflammatoires.

L'instillation intra-trachéale de L TB4 induit le recrutement de neutrophiles dans les voies respiratoires (Martin et al., 1989). Cette étude démontre qu'il existe une relation directe ou indirecte entre le LTB4 et certaines pathologies pulmonaires telle que l'asthme (Nicosia et al., 2001) . Par contre, l'implication du L TB4 dans l'asthme est bien plus modeste que celle des cystéinyl-leucotriènes, car il ne mène pas directement au phénomène de broncho-constriction. Cependant, il semble jouer un rôle dans le recrutement de lymphocytes T mémoire (Gelfand et Dakhama, 2006). Le L TB4 peut aussi jouer un rôle dans d'autres pathologies du poumon comme la maladie pulmonaire obstructive chronique (Williams et Jose, 2001) en agissant sur les neutrophiles recrutés au poumon et en leur permettant de relâcher des espèces oxygénées réactives et des protéases contenues dans leurs granules.

Le L TB4 est aussi reconnu pour son implication dans le développement de l'ostéoarthrite. En effet, la régulation de la prolifération des ostéoblastes dépendrait de ce médiateur inflammatoire (Ren et Dziak, 1991 ).

Il a été démontré que le liquide synovial de patients atteints d'arthrite rhumatoïde contenait du LTB4 (Davidson et al., 1982, 1983). De plus, une corrélation directe existe

entre l'index arthritique et les concentrations de L TB4 dans le liquide synovial de patients arthritiques (Ahmadzadeh et al., 1991; Griffiths et al., 1995).

Par ailleurs, le L TB4 joue aussi un rôle dans les pathologies inflammatoires du rein. En effet, il a été démontré que les rats ayant développés une glomérulonéphrite présentaient des taux plus élevés de L TB4 dans leurs glomérules (Rahman et al., 1988). De plus, l'infusion de LTB4 de façon intra-rénale chez des rats amenait plus de neutrophiles présents dans le glomérule, accompagné d'un flot de plasma réduit et des ₁ taux de filtration glomérulaire réduits (Yared et al., 1991).

Il a été rapporté que les lésions de la peau chez les patients atteints de psoriasis aigü ou chronique contenait du L TB4 à un niveau plus élevé (Brain et al., 1982; Camp et al., 1984; Fogh et al., 1989; Ruzicka et al., 1986) comparativement à la peau saine. Des études ont montré que l'injection sous cutané de LTB4 induisait le recrutement de neutrophiles au niveau de la peau chez l'homme (Camp et al., 1983; Soter et al., 1983). En fait, la présence accrue de neutrophiles au niveau de l'épiderme constitue une caractéristique importante du psoriasis.

Le LTB4 est aussi impliqué au niveau d'affections abdominales inflammatoires incluant la rectocolite hémorragique et l'entérite régionale (maladie de Crohn). Le LTB4 peut être sécrété par les cellules épithéliales du côlon (Dias et al., 1992) et peut donc favoriser le recrutement des neutrophiles au niveau de l'intestin (Cole et al., 1996). En effet, des concentrations plus importantes de L TB4 étaient trouvées dans la muqueuse du côlon de patients atteints de rectocolite hémorragique ou de la maladie de Crohn (Hawthorne et al., 1992; Sharon et Stenson, 1984) comparativement aux sujets sains, suggérant un rôle du L TB4 dans le développement de la pathologie.

Par ailleurs, des niveaux élevés de L TB4 ont aussi été retrouvés dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire de patients atteints de fibrose kystique (Konstan et al., 1993). Une étude a permis de quantifier les cellules inflammatoires incluant les neutrophiles dans la muqueuse des voies respiratoires de patients atteints de fibrose kystique et a démontré une présence abondante ou considérable des neutrophiles dans cette pathologie (Hubeau et al., 2001 ).

Partie 4: Récepteur de haute affinité du LTB4 (BLTl) 4.1 Clonage et caractérisation du BL Tl

Le L TB4 est le ligand de trois différents récepteurs, soit deux récepteurs membranaires et un récepteur nucléaire. Les récepteurs membranaires peuvent être de haute affinité appelés BL Tl ou de basse affinité nommés BLT2. Le récepteur nucléaire du L TB4 est le PP ARa (Devchand et al., 1996). Pour les études de ce projet de maîtrise, l'accent a été mis sur le récepteur de haute affinité du LTB4, le BLTI. Suite à plusieurs essais infructeux effectués durant plusieurs années, le BLTl fut finalement cloné en 1997 par Y okomizo et al. à partir de cellules de la lignée myéloide HL-60 différenciées avec de l'acide rétinoïque (Y okomizo et al., 1997). L'expression de ce récepteur se limite presque uniquement aux cellules leucocytaires (Yokomizo et al., 2001). La figure 3 représente un modèle du BLTl qui fait partie de la grande famille des récepteurs à sept domaines transmembranaires associés aux protéines G (G-protein-coupled receptor,

Après le clonage du BLTl, des études ont été faites sur les événements transcriptionnels qui régulent l'expression leucocytaire du BLTI. La structure du gène encodant le BLTl est typique des gènes encodant pour un GPCR puisque, par exemple, elle contient un site de liaison pour le facteur de transcription Sp 1 qui semble essentiel à l'expression du récepteur (Kato et al., 2000). En effet, la transcription du BL Tl est éliminée si le site de liaison pour Sp 1 est muté. De plus, ce groupe a voulu déterminer la raison qm expliquerait pourquoi le BLTl semble être seulement exprimé chez les leucocytes. Ils ont découvert une séquence en proximité du site de liaison Sp 1 qui est riche en nucléotides CpG. Ces sites riches en CpG sont méthylés dans les cellules non-myéloides et ce serait cette méthylation qui empêcherait la transcription du gène chez ces cellules. Une autre étude sur l'expression du BLTl a mené à la découverte d'une séquence de cadrant de lecture ouvert présent dans la séquence du promoteur du BLTI. Ce cadre de lecture ouvert code pour le récepteur de basse affinité du L TB4, soit le BL T2 (Y okomizo

et al., 2000). Le BL T2 est exprimé de façon plus ubiquiste que le BL Tl. 4.2 Signalisation intracellulaire du BL Tl

Notre groupe et ensuite le groupe de Masuda et al. (Masuda et al., 2003) ont montré que le BL Tl peut être couplé aux protéines G de sous-unités Gao et Gai . L'utilisation de la toxine de Bordetella pertussis (PTX) peut dans certains cas inhiber la signalisation du BLTl, venant confirmer l'implication des protéines Gailo dans la signalisation du BLTI. Par contre, les deux groupes diffèrent sur le possible couplage du BLTl à la sous-unité Ga16. Toda et al. (Toda et al., 2002) ont montré que la signalisation

catalytiques de l'adénylate cyclase et par conséquent, mène à une diminution del' AMP cyclique.

Lorsque le LTB4 lie le BLTI, il y a activation des protéines G hétérotrimériques

composées de sous-unités a-,

P-

et y- et échange de GDP pour GTP lié au sous-unité alpha. Cet échange mène à la dissociation du complexe Gapy en sous-unités Ga-GTP et Gpy. Ga-GTP et Gpy stimulent différentes molécules effectrices comme la phospholipase C qui va convertir PIP2 en IP3 et DAG. L'IP3 diffuse à travers le cytosol et

interagit avec les canaux calciques localisés dans la membrane du réticulum endoplasmique causant le relâchement de Ca++. Ce relâchement de Ca++ médie différentes réponses cellulaires (Marinissen et al., 2001 ).

4.3 Éléments structurels qui régulent l'expression et la signalisation du BLTI

Des études ont été faites par notre groupe en vue de déterminer et de comprendre les éléments structurels qui sont impliqués dans la régulation de l'expression et de la signalisation du BLTI.

Premièrement, la désensibilisation du récepteur a été étudiée. La désensibilisation des GPCRs peut comprendre un élément de phosphorylation au niveau des résidus sérine/thréonine localisés au niveau de la queue cytopla srnique du récepteur. Nous avons démontré que le BLTI peut être désensibilisé par différentes kinases de la famille « G-protein-coupled receptor kinase » (GRK), dont, GRK.2, GRKS et spécialement GRK.6 menant à la diminution de la production d'IP3 (Gaudreau et al., 2002). La

désensibilisation du BLTI par la GRK.6 concorde avec une phosphorylation plus marquée du récepteur. Le résidu thréonine à la position 308 du BL Tl a été identifié comme cible importante pour la désensibilisation du BLTI par la GRK.6 puisque sa substitution mène

à une réduction de la désensibilisation du récepteur. La réponse inflammatoire de souris déficientes en GRK.6 suite à l'application d'acide arachidonique était accrue, caractérisée par l'enflure et l'influx de neutrophiles au niveau des oreilles (Kavelaars et al., 2003). De plus, la chimiotaxie de neutrophiles provenant de ces souris vers le L TB4 est augmentée (Kavelaars et al., 2003).

Deuxièmement, la régulation de l'expression du BLTl à la surface membranaire a été étudiée. Notre groupe a montré l'importance du motif dileucine distal (L304-L305) dans cette régulation (Gaudreau et al., 2004). Grâce à la modélisation moléculaire en se basant sur la structure de la rhodopsine bovine, nous croyons que le motif dileucine distal est impliqué dans un centre hydrophobe qui inclue des interactions intra-hélicales à l'intérieur de l'hélice a VIII et des interactions inter-hélicales avec des résidus de l'hélice I (Gaudreau et al., 2004).

Troisièmement, les glucocorticoïdes favorisent l'apoptose des cellules inflammatoires comme les éosinophiles et les lymphocytes (Ohta et Yamashita, 1999; Walsh et Wardlaw, 1997). Par conséquent, ils ont un effet anti-inflammatoire lors de réponses immunes. Contrairement à l'effet pro-apoptotique des glucocorticoïdes chez les éosinophiles et les lymphocytes, le glucocorticoïde dexaméthasone mène à une survie prolongée des neutrophiles humains (Cox et Austin, 1997; Liles et al., 1995). Hébert et al. _{ont démontré que le L TB4 peut aussi mener au retardement de l' apopotose chez le}

neutrophile (Hébert et al., 1996). De ces faits, notre groupe a voulu étudier l'effet de la dexaméthasone sur l'expression du BLTl chez le neutrophile humain. La conclusion de cette étude est que la dexaméthasone mène à une expression accrue du BL Tl chez le

neutrophile qui pourrait être la cause du retardement de l'apoptose chez le neutrophile (Stankova et al., 2002).

Objectifs et Stratégies

Durant ce travail, nous avons voulu étudier le rôle potentiel des motifs dileucine du BLTl et de l'activation de RhoA dans le phénomène de chimiotaxie du neutrophile induit par le L TB4.

Pour nos études, un modèle cellulaire humain de type neutrophilique, soit les cellules PLB-985, sera utilisé pour trois raisons majeures. Premièrement, il est difficile de transfecter le neutrophile humain. Deuxièmement, le neutrophile humain a une courte durée de vie. L'effet global et problématique de ces deux raisons énumérées ci-dessus résulte au fait que nous aurions peu de neutrophiles vivants pour nos études. Troisièmement, le neutrophile humain exprime à sa surface les deux récepteurs de L TB4, le BL Tl et le BL T2.

Pour remédier aux difficultés quant à l'utilisation du neutrophile humain, nous

.

allons transfecter, par nucléofection, des cellules de la lignée humaine PLB-985 avec de l'ADNc codant pour le récepteur BLTl de type sauvage ou de l'ADNc codant pour le récepteur BL Tl muté aux motifs dileucine proximal et distal de la queue cytoplasmique. Nous allons sélectionner par cytofluorométrie de flux, les cellules exprimant de façon stable le récepteur BLTl de type sauvage ou muté aux motifs dileucine afin d'avoir un niveau équivalent d'expression. Nous allons déterminer si ce niveau d'expression du BL Tl chez le modèle cellulaire est comparable au neutrophile humain. Nous allons ensuite induire la différentiation de ces cellules pendant trois jours en présence de dimétylsulfoxide pour obtenir le phénotype neutrophilique nécessaire pour notre étude.

La génération de cellules PLB-985 exprimant le BL Tl de type sauvage (PLB-BL T) ou le (PLB-BL Tl muté aux motifs dileucine nous permettra de comparer ce modèle

cellulaire avec le neutrophile humain en ce qui concerne l'expression du récepteur de haute affinité du LTB4 (BLTl) (par cytofluorométrie de flux) ainsi que la chimiotaxie suite à une stimulation avec le L TB4. Plus précisément, nous pourrons ainsi évaluer le rôle des motifs dileucine localisés dans la queue cytoplasmique du BLTl dans la chimotaxie et la polarisation du neutrophile induites par le L TB4.

Deuxièmement, nous voulons étudier l'implication de différentes protéines cytosoliques (PI3K, Gai et RhoA) dans la chimiotaxie et la polarisation dépendantes du BLTI. Pour y arriver, deux stratégies seront utilisées. La première stratégie se résume en l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques. Plus précisément, nous feront des essais de chimiotaxie de cellules PLB-BLT différenciées et de neutrophiles humains prétraités avec différents inhibiteurs pharmacologiques : la wortmannin qui est un inhibiteur de la PI3K, Y-27632 qui est l'inhibiteur de p160-ROCK et la PTX qui est l'inhibiteur de la sous-unité Gai. Par la suite, nous observerons l'effet d'un prétraitement de cellules PLB-BLT différenciées avec certains inhibiteurs, visuellement (par immunofluorescence) suite à une stimulation par LTB4. La deuxième stratégie sera d'utiliser la transfection transitoire d'une protéine de type dominant négatif ou de type constitutivement actif de la GTPase RhoA chez les cellules PLB-BLT et PLB-BLT 2L(304-305)/A, respectivement.

Avant-propos de l'article

Les expériences présentées dans l'article suivant intitulé" A dileucine motif in helix VIII of the high-affinity leukotriene B4 receptor is essential for RhoA-dependent

neutrophil chemotaxis" ont été effectuées en totalité par Karine Lambert. L'écriture de l'article a été effectuée par Karine Lambert sous la supervision du Dr. Rola-Pleszczynski. Cet article sera soumis au Journal of Immunology.

Article

A dileucine motif in helix VIII of the high-affinity leukotriene B

4

receptor is essential for RhoA-dependent neutrophil chemotaxis

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Karine Lambert*, Charles Thompson*, Jana Stankova* and Marek Rola-Pleszczynski 2'*

Running title : RhoA in L TB4-induced chemotaxis

*Immunology Division, Department of Pediatrics, Faculty of Medicine, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, QC, Canada

Corresponding author: Marek Rola-Pleszczynski Immunology Division, Department of Pediatrics, Faculty of Medicine, Université de Sherbrooke, 3001 N. 12th Avenue, Sherbrooke, Qc, JI H 5N4, Canada Tel: 819-346-1110, ext. 14851 Fax: 819-564-5215 e-mail: marek.rola-pleszczynski@usherbrooke.ca

Abstract

Leukocyte chemotaxis involves a number of well-orchestrated structural and biochemical events. Here, we investigated the intracellular signalling involved in neutrophil migration mediated by the high affinity leukotriene (LT)B4 receptor, BLTl, as well as the structure-function role of helix 8 of the receptor in neutrophil migration. Peripheral blood neutrophils as well as promyeloid PLB-985 cells, stably transfected with human BL Tl cDNA (PLB-BL T) or substitution mutants of dileucine motifs in helix VIII of BL Tl, and differentiated into a neutrophil-like phenotype were used throughout this study. All mutant receptors were efficiently delivered to the plasma membrane, to an extent similar to wild-type BLTl, as assessed by flow cytometry. Chemotactic responses toward LTB4 were similar for differentiated PLB-BL T and neutrophils. However, the chemotactic responses of mutants of helix VIII of BLTl toward L TB4 were significantly reduced. Pretreatment of differentiated PLB-BL T cells and neutrophils with pertussis toxin or pharmacological inhibitors of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) or p160-ROCK abrogated their migration toward L TB4, suggesting the involvement of Gai, PBK and RhoA in LTB4-induced chemotaxis. Neutrophils and differentiated PLB-BL T responded to LTB4 by adopting a polarized morphology, with F-actin in a single protruding pseudopod at the leading edge of the cells. Stimulation of PLB-BL T cells bearing a mutation in the distal dileucine motif (2L(304-305)/ A) with LTB4 led to the formation of multiple pseudopods accompanied by a loss of chemotaxis. The multiple pseudopod phenotype also appeared when PLB-BL T cells were transiently transfected with a dominant negative form of RhoA or pretreated with the pl60-ROCK inhibitor, Y-27632. Tue migration defect observed with the dileucine mutation was corrected by transient

transfection with a constitutively active form of RhoA. Taken together, our results suggest an essential role for the distal dileucine motif in helix VIII of BL Tl in activating RhoA and allowing normal neutrophil migration induced by L TB4•

Introduction

Leukotriene B4 (L TB4) is a powerful inflammatory lipid mediator derived from

membrane phospholipids by the sequential actions of cytosolic phospholipase A2, 5-LOX

et L T ~ hydrolase (1 ). L TB₄ plays important roles in host defense and inflammation, such as neutrophil chemotaxis (2), chemokinesis (3), aggregation (3) and degranulation ( 4, 5), as well as other immunomodulatory fonctions ( 6-8). L TB4 is synthesized

predominantly by cells of myeloid origin such as monocytes and neutrophils (9). It is the agonist for two plasma membrane G protein-coupled receptors (GPCR), namely a high-affinity receptor, BL Tl (10-15), and a low-high-affinity receptor, BL T2 (16-20), which share 45% identity. BL Tl is a small GPCR of 352 amino acids that is principally expressed on ce lis of the myeloid lineage such as monocytes (21) and on neutrophils (22, 23 ), but also on eosinophils (13), T cells (24) and dendritic cells (25).

Following the activation of GPCRs, the heterotrimeric G-proteins, which are composed of an a-,p- and y-subunit, undergo conformational changes that lead to the exchange of GDP for GTP bound to the a-subunit. This exchange leads to the dissociation of the heterotrimeric G-proteins into a Ga-subunit bound to GTP and Gpy-subunit complexes (26). Each of these then activates different effector molecules. (27). The Ga-subunit possesses an intrinsic GTPase activity that brings about the hydrolysis of the bound GTP to GDP, which promotes the re-association of the a subunit with the

Pr

<limer (28-30). The cytoplasmic tails of GPCRs have been shown to play important roles in receptor trafficking, desensitization, dimerization, and intracellular signalling (31-33). Dileucine motifs in the C-terminus of GPCRs are quite conserved and they are involved

in trafficking and membrane protein intemalization (34-36), as well as localization into specific compartments of the cell, such as the lysosome (37) or the basolateral surface (38). BLTl contains two dileucine motifs in its C-terminJs. We and others have shown that the distal 2L(304-305) motif, which is part of the eighth a helix (helix VIII) of the receptor, controls phospholipase C activation, receptor desensitization and intemalization (33, 39-41 ). A dileucine-containing motif in CXCR2 was also shown to be critical for cell migration in response to CXCL8 (36, 42), but mutation of an analogous region within the CCR5 C-terminus did not impair receptor-mediated cell migration (43). The mechanisms through which dileucine motifs may be involved in regulating chemotaxis, however, are unknown.

Neutrophil chemotaxis reqmres divergent pathways involving two receptor-activated heterotrimeric G-proteins. The one initiated by Gai controls the leading edge-generating pseudopod and involves phosphatidyl inositol-3,4,5-triphosphate (PIP3), the small GTPases Rac and Cdc42, and F-actin. Tue signalling pathways controlling the rear end of the polarized leukocyte is mediated by Ga12 and Gan and involves a Rho GTPase (RhoA), a Rho-dependent protein kinase (p160-ROCK), phosphorylated myosin light chains and activated myosin (44).

RhoA, Cdc42 and Rac belong to the Rho family of small GTPases. Tue functional activity of small GTP-binding proteins is tightly regulated in vivo by proteins that control their active (bound to GTP) state or inactive (bound to GDP) state. Whereas, the conversion of the inactive state to an active state is done by GEFs, GTPase-activating proteins increase the low intrinsic rate of GTP hydrolysis of small GTPases ( 45), leading

to conversion of active state to inactive state. The Rho GTPases are part of the Ras superfamily of GTPases, which contain approximatively 50 members divided according to their primary sequence as well as their cellular activities ( 46). The Rho GTPases control cell morphology, aggregation and motility (47-49), and are involved in regulating several aspects of cytoskeletal function (46). For example, RhoA is involved in the formation of actin stress fibers as well as in controlling the organization and dynamic remodeling of the actin-based cytoskeleton (50, 51 ). Rac participates in the formation of lamellipodia and membrane ruffling and in regulating F-actin polymerization (52). Thus, Rac and Cdc42 promote the F-actin-based protrusion at the front of the cell, while RhoA drives the myosin-based contraction at the rear.

Because neutrophils are short-lived, terminally differentiated cells and are not easily transfectable, we used, in this study, a human neutrophil-like cellular model, the human promyeloid leukemia PLB-985 cell line, in addition to human peripheral blood neutrophils, to define the mechanisms through which the dileucine motifs within the C-terminus of BL Tl can regulate chemotaxis. PLB-985 cells can be induced to differentiate and display histochemical, morphological and biochemical features of neutrophils in the presence of DMSO (53, 54).

Materials and Methods

Reagents

RPMI-1640 medium and Geneticin (G418) were from Invitrogen Canada Inc., Burlington, ON, Canada. Fetal bovine serum (FBS) was from Hyclone Media, Logan, UT. Bovine serum albumin (BSA) was from BIO MEDIA Canada Inc., Drummondville, QC, Canada. Dimethylsulfoxide (DMSO) and paraformaldehyde were from Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canada. Dextran, Ficoll-Paque PLUS were from Amersham Biosciences, Baie d'Urfé, QC, Canada. Leukotriene B4 (LTB4) were from Cayman Chemicals, Ann Harbor, ML Five-µm pore size polycarbonate filters were from Osmonics Inc. Minnetonka, MN. Fluorescein isothiocyanate-conjugated goat anti-mouse antibodies and fluorescein isothiocyanate-conjugated streptavidin were from Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA. Biotin-conjugated mouse anti-human BL Tl was from Serotec, Raleigh, NC. Hoechst and Texas Red phalloidin were from Molecular Probes, Eugene, OR. Wortmannin and Pertussis toxin were from BIOMOL, Plymouth Meeting PA. Y-27632 and Triton X-100 were from Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, ON, Canada.

Construction of Myc-tagged Wild Type (WT) and Mutant Receptors

The cloning of WT BLTl cDNA and the generation of the mutants 2L(292-293)/ A, 2L(304-305)/A, 4L(292-293, 304-305)/A, in which leucines were substituted with alanines, were previously described (39, 41) and are illustrated in figure 1. Ail constructions were subcloned into pcDNA3 expression vector (Invitrogen) and sequenced (University of Calgary, Alberta, Canada).