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Étude des réponses immunitaires humorales et cellulaires dirigées contre la protéine F du virus de l'hépatite C

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Academic year: 2021

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(1)

7

Université de Montréal

F

Etude des réponses immunitaires humorales et

cellulaires dirigées contre la protéine F du

virus de l’hépatite C

par

Ernilie Jalbert

Département de microbiologie et immunologie

Université de Montréal

Faculté de médecine

Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures

En vue de l’obtention du grade de Maîtrise en microbiologie et immunologie

/ Crd2 coniar co’.erdu

décembre 2005

.b AV. 6

(2)

V 1 2

n

(3)

Université

dh

de Montréal

Direction des bibliothèques

AVIS

L’auteur a autorisé l’Université de Montréal à reproduire et diffuser, en totalité ou en partie, par quelque moyen que ce soit et sur quelque support que ce soit, et exclusivement à des fins non lucratives d’enseignement et de recherche, des copies de ce mémoire ou de cette thèse.

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(4)

IDENTIFICATION DU JURY

Université de Montréal

Faculté des études supérieures

Ce mémoire intitulé:

r

Etude des réponses immunitaires humorales et

cellulaires dirigées contre la protéine F du

virus de l’hépatite C

présenté par:

Emilie Jalbert

a été évalué par un jury composé des personnes suivantes

Hugo Soudeyns,

PhD

Directeur de recherche

Lea Biakier-Gingias

PhD

Présidente du jury

Denis Leclerc PhD

Membre

du

jury

(5)

111

RÉSUMÉ

Introduction: La protéine F du virus de l’hépatite C (VHC) est encodée dans un cadre de lecture alternatif chevauchant la protéine de la capside. Sa fonction et son mécanisme de traduction par changement de cadre de lecture ne sont toujours pas complètement élucidés. Notre objectif est d’étudier la prévalence et les caractéristiques de la réponse immunitaire humorale et cellulaire dirigée contre la protéine F chez un groupe de patients co-infectés avec le VHC et le virus de l’immunodéficience humaine (VIR).

Matériel et méthodes: Plusieurs mutations silencieuses ont été introduites dans la région 5’ du gène de la capside du VHC-la, permettant l’expression de la protéine F en absence de la capside et sans changement de cadre de lecture. La protéine F pleine longueur et une version tronquée ont été produites dans E. cou et leurs séquences d’acides aminés ont été confirmées par spectrométrie de masse. La réactivité anti-F de sérums de patients infectés par différents sous-types du VHC a été testée par immunobuvardage. L’activité cytolytique F-spécifique a été mesurée utilisant un virus recombinant vaccinia-protéine F. La liaison de peptides dérivés de la protéine F à la molécule HLAA*O2O1 a été étudiée afin d’identifier des épitopes LIC.

Résultats: Les sérums de 23 des 39 patients infectés par divers génotypes du VHC ont reconnu la forme tronquée, incluant 13 des 25 patients co-infectés par le VIH- 1, ce qui indique une réactivité croisée. Ceci concorde avec la conservation de la protéine F à travers les différents sous-types du VHC. Des précurseurs LTC spécifiques à la protéine F à réactivité croisée ont été détectés chez 9 des 11 patients infectés par le VHC, incluant 7 des 9 patients co-infectés par le VHC et le VIH. Finalement, 3 nouveaux épitopes LTC présumés restreints par HLAA*O2O1 ont été identifiés.

Conclusion: Ces résultats démontrent qu’une réponse immunitaire cellulaire F-spécifique et une réactivité humorale croisée peuvent être détectées chez des patients co-infectés par le VIH-1 et le VHC et que ces réponses sont comparables à celles observées chez les patients qui ne sont infectés que par le VHC.

MOTS-CLÉS

Cadre de lecture alternatif; co-infection; réactivité croisée; lymphocytes T cytotoxiques; virus de l’hépatite C

(6)

ABSTRACT

Background: HCV f protein is encoded in an altemate reading frame overlapping the core protein region. Its precise sequence, biological function and mode of expression are

currently unclear. This study was conducted to examine the prevalence and

characteristics of host humoral and cell-mediated immune responses directed against F protein in patients coinfected with HCV and HIV- 1.

Methods: Mutations were introduced to allow expression of HCV-la f protein in

absence of core. This recombinant and a truncated form lacking the first 11 amino acid residues shared with core were expressed in E. cou and their amino acid sequences were verified by mass spectrometry. Vaccinia-F protein recombinants were used to test F protein-specific cytotoxic T cell (CTL) activity. Binding of F protein-derived peptides to HLAA*0201 was studied to identify putative CTL epitopes.

Resuits: Sera from 23 of 39 patients infected with various HCV genotypes recognized the truncated form, including 13 of 25 subj ects coinfected with HIV- 1, indicative of antigenic cross-reactivity and consistent with conservation of F protein coding sequences between HCV genotypes. Cross-reactive F protein-specific CTL precursors were detected in 9 of 11 HCV-infected subjects, including 7 of 9 patients coinfected with HCV and HIV-1. Finally, 3 novel putative HLAA* 0201 -restricted CTL epitopes were identified. Conclusion: These resuits indicate that patients co-infected with HCV and HIV-1 can mount immunoglobulin and CTL responses directed against HCV f protein that are fully comparable in scope and magnitude to those observed in subjects infected with HCV alone.

KEYWORDS

alternate reading frame protein; co-infection; crossreactivity; cytotoxic T lymphocytes; hepatitis C virus.

(7)

TABLE DES MATIÈRES

RÉSUMÉ EN FRANÇAIS ET MOTS-CLÉS

iii

ABSTRACT

iv

TABLE

DES

MATIÈRES

y

LISTE DES

TABLEAUX

vii

LISTE DES FIGURES

viii

LISTE DES ABRÉVIATIONS

ix

REMERCIEMENTS

xi

CHAPITRE I

-

REVUE DE LITTÉRATURE

1

1- Épidémiologie du virus de l’hépatite C (VHC)

2

1.1- Contexte

2

1.1.1-Historique 2

1.1.2- Transmission 2

1.1.3- Distribution mondiale 3

1.1.4- Co-infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) 4

1.1.5- Traitement 5 2- LeVHC 6 2.1- Structure du VHC 6 2.1 .1- Organisation génomique 6 2.2- Variabilité du VHC 7 2.2.1- Génotypes et sous-types 7 2.2.2- Quasi-espèces $ 2.3- Etude du virus 9 2.3.1- Modèle animal 9 2.3.2- Système de réplicon 9 2.4- Réplication du VHC 10 2.4.1- Cycle de réplication 10 2.4.2- Cellules cibles 11 2.5- Protéines du VHC 11 2.5.1- Protéines structurales 12 2.5.2- Protéines non-structurales 13 2.6-Protéine F 14 2.6.1- Historique 14 2.6.2- Mode d’expression 15 2.6.3- Activités 17

(8)

3- Immunité 1$

3.1- Persistance versus clairance 18

3.2- Immunité humorale et cellulaire 19

3.2.1- Immunité humorale 19

3.2.2- Immunité cellulaire 20

3.3-Vaccin 22

OBJECTIFS

25

CHAPITRE II

-

ARTICLE

27

Contribution personnelle au travail

55

CHAPITRE III

-

DISCUSSION

56

1- L’immunodominance

58

2- Vecteurs viraux

64

(9)

vii

LISTE DES TABLEAUX

Tableau I Probabilité du développement de cirrhose selon l’âge et

la durée d’infection par le VHC. 18

Tableau II: Activité cytotoxique dirigée contre la protéine f chez les

patients infectés par le VHC. article tableauI 49

Tableau III: Conservation à travers différents sous-types des épitopes présumés restreintspar HLAA*O2O1 provenant des

(10)

LISTE DES FIGURES

Figure 1: Prévalence géographique du VHC 4

Figure 2 : Arbre phylogénique montrant les génotypes principaux du VHC 7

Figure 3 Distribution géographique des génotypes et sous-types du VHC $

Figure 4 Cycle de réplication du VHC 10

Figure 5 Représentation schématique du génome du VHC 11

Figure 6 Modèle de la réponse immunitaire au VHC 22

Figure 7 Expression et production de la protéine F recombinante

du VHC article figure 1 51

Figure $ Réponse d’anticorps spécifiques à la protéine F chez des sujets infectés par le VHC et chez des patients co-infectés

avec le VIH article figure2 52

Figure 9 Fréquence des précurseurs de LTC spécifiques à la protéine F du VHC chez des sujets infectés par le VHC et chez des

patients co-infectés avec le VIH article figure3 53

(11)

ix

LISTE DES ABRÉVIATIONS

Ac Anticorps

AdHu Adénovirus de sérotype humain

ADN Acide désoxyribonucléique

ALT Alanine aminotransférase

ApAd ARN polymérase ARN dépendante

ARFP Alternate Reading frame Prote in (protéine dans un cadre de lecture alternatif)

ARN Acide ribonucléique

A$T Aspartate aminotransférase

BVDV Bovine viral diarrhea virus]

CD Cluster 0fDfferentiation (groupe de différentiation)

CI Confidence Interval (interval de confiance)

CMH Complexe majeur d’histocompatibilité

CPA Cellules présentatrices d’antigènes

51Cr Chrome 51 (isotope radioactif)

CSFV Classical Swine fever Virus

CTL Cytotoxic T Lymphocyte (lymphocyte T cytotoxique— LTC)

DNA Deoxyribonucleic Acid (acide désoxyribonucléique—ADN)

E Enveloppe

ELISA Enzyme-L inked Immunosorbent Assay

ELISpot Enzyme-L inked Immunospot Assay

EMCV EncephaÏomyocarditis Virits

fDA food and Drug Administration

RAT Hépatite associée à la transfusion

HAART HighÏy Active Antiretroviral Therapy (thérapie antirétrovirale à activité élevée)

HCV Hepatitis C Virus (virus de l’hépatite C— VHC)

HIV Human Immunodeficiency Virus

(12)

HLA Human Leukocyte Antigen (antigène de leucocyte humain)

HNANB Hépatite non-A non-B

HSP Heat-Shock Protein

HVRT Hypervariable Region J (région hypervariable 1)

IfN-y Interféron gamma

IL Interleukine

IRES Internai Ribosome EntiySite (site interne d’entrée ribosomale)

IRF Inteiferon Regulatory factor (facteur de régulation de l’interféron)

LTC Lymphocytes T cytotoxiques

MHC Major HistocompatibiÏity Complex

(complexe majeur d’histocompatibilité— CMH)

NK Natural killer (tueuses naturelles)

NS Protéine non structurale

OMS Organisation mondiale de la Santé

PBMC Peripherat BoodMononuclear Ceils (cellules mononuclées du sang

périphérique)

PCR Polymerase Chain Reaction (réaction polymérase en chaîne)

PKR RNA-dependent Protein Kinase (protéine kinase ARN-dépendante)

RE Réticulum endoplasmique

RNA Ribonucleic Acid (acide ribonucléique—ARN)

TCR T Ccii Receptor (récepteur de la cellule T)

Th THelper (cellules T auxiliaires)

TNF-Œ Turnor Necrosis Factor a (facteur de nécrose Œ)

Treg T régulatrices

UDI Utilisateurs de drogues injectables

VHA Virus de l’hépatite A

VHB Virus de l’hépatite B

VHC Virus de l’hépatite C

VIH Virus de l’immunodéficience humaine

VLP Virus-L ike ParticïtÏes (pseudo particules virales)

(13)

xi

REMERCIEMENTS

«Ça prend tout un village pour élever un enfant»

Ce proverbe afiicain englobe bien ce que je ressens puisque c’est une mosaïque de personnes qui m’ont permis de me rendre jusqu’ici.

Je tiens premièrement à remercier mes parents, Maureen et Jacques, mon frère Vincent, ma soeur Rachel, mon copain Nick, ma tante Rita ainsi que les autres membres de ma famille qui ne cessent de m’encourager dans tous mes projets. Votre support m’a fourni la confiance et la détermination nécessaires pour réaliser les entreprises qui me tiennent à coeur.

Merci à mon directeur de recherche, Hugo Soudeyns, pour avoir fait preuve de confiance en m’offrant ce projet ainsi que le support financier et académique me permettant de le réaliser.

Merci à mes collègues Myriam Troesch, Sandra Akouamba et Sophie Canobio pour les discussions, explications, support moral, mais surtout pour l’amitié développée durant ces deux années.

Merci à Pascal Lapierre, Stéphane Pinsonneault et Isabelle Slight pour avoir répondu à mes questions techniques incessantes sans perdre patience. Merci aussi à Martine Cathy, Kathie Béland et Réginald Renous pour leur aide tellement appréciée.

Merci à tous mes collègues étudiants du centre de recherche de l’hôpital Ste-Justine et du département d’immunologie et microbiologie, aux professeurs et au personnel que j’ai eu l’honneur de côtoyer.

(14)
(15)

1- Épidémiologie du VHC

1.1- Contexte 1.1.1- Historique

Le développement durant les années 70 de tests sérologiques pouvant identifier le virus de l’hépatite A (VHA) ainsi que le virus de l’hépatite B (VHB) a permis d’établir qu’approximativement 25% des cas d’hépatite associée à la transfusion (RAT) étaient dus au VHB et qu’aucun n’était relié au VHA. Conséquemment, 75% des cas de RAT ont été classifiés conmie hépatite non-A non-B (RNANB) (Alter et al., 1972). Des études chez le chimpanzé ont démontré que l’HNANB était le résultat d’un agent transmissible (feinstone et al., 1975; Alter et al., 197$; Tabor et al., 197$; Bradley et al., 1979). C’est seulement en 1989, grâce aux progrès technologiques en biologie moléculaire, que l’agent responsable de l’HNANB a pu être cloné, séquencé puis classifié comme étant le virus de l’hépatite C (VRC) (Choo et al., 1989).

1.1.2- Transmission

La transmission du virus se fait par exposition au sang contaminé. Plusieurs formes d’exposition existent: transfusions sanguines, transplantations d’organes provenant de donneurs infectés, pratiques médicales dangereuses, exposition occupationnelle, partage d’aiguilles chez les utilisateurs de drogues injectables, transmission mère-enfant, relations sexuelles avec une personne infectée, exposition ménagère et possiblement par voie intra nasale chez les cocaïnomanes.

La transmission par produits sanguins ainsi que par transplantations d’organes fût virtuellement éliminée dans les pays industrialisés grâce à l’introduction de méthodes de détection plus sensibles durant les années 90. La route principale actuelle se trace chez les utilisateurs de drogues injectables (UDI), responsables pour plus de 60% des nouveaux cas (Alter, 2002; Dore et al., 2003).

La transmission par voie sexuelle demeure controversée. Cependant, des études récentes suggèrent que cette voie n’est pas efficace (Alary et al., 2005; Tahan et al., 2005), puisqu’il n’y a pas d’évidences que le virus puisse se retrouver dans les sécrétions

(16)

biologiques. L’infection par cette voie se ferait plutôt par un contact sanguin lors des relations sexuelles par l’intermédiaire de coupures, ulcérations génitales, menstruations, etc. La transmissionpar contact ménager serait possiblement due à un contact sanguin via le partage de brosses à dents ou de rasoirs.

L’acquisition du VHC par voie périnatale se produit chez environ 5-10% des nouveaux-nés issus d’une mère infectée par le VHC (Thomas et al., 1998b; Tajiri et al., 2001; Ferrero et al., 2003), la transmission se produisant probablement plus souvent au moment de l’accouchement. Ce taux est plus élevé lorsque la mère est co-infectée par le VIH (Thomas et al., 199$a).

1.1.3- Distribution mondiale

L’infection par le VHC a pris des proportions épidémiques, l’Organisation mondiale de la Santé tOMS) estimant le taux d’infection par le VHC à plus de 3% de la population mondiale, soit 170 millions de personnes (Alter, 1997; Alter et al., 1999; Perz JF, 2004). Le VHC se retrouve dans toutes les régions du monde, suggérant que le virus a fait sont apparition il y a plusieurs siècles, voire plusieurs millénaires (Simmonds, 2004). Les pays affichant le plus grand taux de prévalence sont situés en Afrique et en Asie, tandis que les pays à faible prévalence regroupent les nations industrialisées de l’Amérique de Nord, l’Australie et l’Europe du Nord et de l’Ouest (Shepard et al., 2005). La prévalence géographique du VHC à travers le monde est représentée par la figure 1 (WHO, 1997). Certaines régions, comme l’Égypte et quelques villages du Japon et d’Italie, possèdent des taux d’infection très élevés, notamment chez les personnes âgées de plus de 50 ans. Ceci laisse croire qu’il y aurait existé une pratique courante facilitant l’infection d’une proportion considérable de la population locale, pratique qui aurait été abandonnée depuis un certain temps, expliquant la diminution du taux d’infection chez les jeunes (Kiyosawa et al., 1994; Guadagnino et al., 1997; Okayama et al., 2002).

(17)

4

Figure 1- Prévalence géographique du VHC

<1% 1-24% 2,5-4,9% 5% 10% Pas dispomble Prévalence du VHC, 1997 Source: (WBO, 1997)

1.1.4- Co-infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIII)

On estime qu’un tiers des personnes infectées par le VIII en Europe et aux États-Unis sont co-infectées par le VHC (Sherman et al., 2002; Rockstroh et Spengler, 2004). Ce

taux élevé est imputable aux voies de transmission similaires pour les deux virus. Le VIII accélère les maladies hépatiques causées par le VHC, notamment lorsqu’il y a progression de l’immunodéficience (Benhamou et al., 1999; Mohsen et al., 2003). L’amélioration de la condition des patients infectés par le VIH grâce à l’administration de I{AART (highly active antiretroviral therapy) fait en sorte que la morbidité et la mortalité chez les personnes co-infectées sont de plus en plus souvent attribuables aux

maladies hépatiques causées par le VHC (Anderson et al., 2004; Fuster et al., 2004). Ce

(18)

1.1.5- Traitement

Il n’existe pas de vaccin pouvant prévenir l’infection par le VHC. Le seul traitement disponible est l’administration d’interféron-Œ pegylé seul ou en combinaison avec un analogue de nucléoside, la ribavirine. Cette thérapie non spécifique est coûteuse et associée à plusieurs effets secondaires tels que douleurs musculaires et arthritiques, maux de tête, fièvre et dépression sévère. Même si cette thérapie permet la diminution de la charge virale chez 90% des patients infectés avec le génotype 2 ou 3, le taux de succès est seulement de 45% chez les patients infectés par le génotype 1, ce dernier étant le plus prévalent aux États-Unis et en Europe (Zein et al., 1996). Le développement de thérapies plus efficaces a été retardé par l’absence d’un système de culture permettant la réplication du VHC. Tout récemment, quelques groupes sont parvenus à produire des particules infectieuses du VHC en culture, ce qui est très prometteur pour l’étude d’antiviraux (Lindenbach et al., 2005; Wakita et al., 2005; Zhong et al., 2005).

(19)

6

2- Le VHC

2.1- Structure du VHC

2.1.1- Organisation génomique

Le VHC est un membre de la famille des Flaviviridae à cause l’organisation génomique similaire aux autres membres de cette famille. Celle-ci comprend trois genres: les flavivirus, les pestivirus et les hepacivirus. Quelques exemples de flavivirus incluent le virus du Nil occidental, le virus de la fièvre jaune et le virus de la dengue. Plusieurs flavivirus infectent les humains, par contre, la majorité de ceux-ci nécessitent un vecteur arthropode (moustique, tique). Les pestivirus n’infectent pas les humains, ce groupe incluant le BVDV (Bovine viral diarrhea virus 1) et le CSFV (Classical Swine Fever Virus). Le VHC est suffisamment différent pour former un nouveau genre dont il est le seul membre à date : les hépacivirus. Une des grandes différences distinguant le VHC des autres membres de la famille est sa capacité de causer une infection persistante. Du côté morphologique, les flavivirus et les pestivirus possèdent des projections en surface du virion qui ne sont pas présentes chez le VHC (ICTVdB).

Le VHC est un virus enveloppé contenant un génome d’ARN simple brin de polarité positive d’environ 9,6 kb. La traduction de l’ARN viral se fait directement par les ribosomes cellulaires qui se lient à l’IRES (internal ribosome binding site) situé dans la portion 5’ non-traduite du génome. La majorité des protéines sont encodées dans un même cadre de lecture, produisant une polyprotéine d’environ 3000 acides aminés qui est clivée de manière co- et post-traductionnelle par un ensemble de protéases cellulaires et virales pour donner naissance à 10 protéines virales.

Récemment, une nouvelle protéine ne faisant pas partie de la polyprotéine a été découverte. Sa séquence est située dans un cadre de lecture alternatif, en position +1, dans la région 5’ du gène de la capside. Cette protéine porte le nom ARFP (Alternate Reading frame Prote in) ou, simplement, protéine F (frameshfting).

(20)

2.2- Variabilité du VHC

2.2.1- Génotypes et sous-types

Le VHC est divisé en six génotypes et en plus de 50 sous-types selon la diversité nucléotidique du génome (figure 2) (Simmonds, 2004; Simmonds et al., 2005). Les différents génotypes ne semblent pas affecter la pathogénicité, le cours clinique de la maladie ou le résultat de l’infection. Cependant, la distribution géographique (figure 3) ainsi que la résistance à l’interféron alpha sont directement reliées au génotype.

Figure 2-Arbre phylogénique montrant les génotypes principaux du VIIC

a

OE050

C

a

b

.

a

3

b

.

a

a

a

Source: (Simmonds, 2004)

(21)

$

Figure 3- Distribution géographique des génotypes et sous-types du VUC

2.2.2- Quasi-espèces

Le VHC se réplique très rapidement. De plus, la polymérase virale (NS5B), qui permet la réplication du génome du VHC, ne possède pas de système de correction d’erreur. Il

s’ensuit donc un taux d’insertion élevé de mutations dans le génome des virions

nouvellement synthétisés. La combinaison de ces deux phénomènes fait en sorte que lorsqu’un individu est infecté, il y a développement rapide d’une population de virus apparentés, mais distincts les uns des autres. Cette quasi-spéciation est alors responsable

de la sélection de virus ayant des mutations qui échappent à la surveillance immunitaire

(Weiner et al., 1995; Erickson et al., 2001). Cependant, le degré de mutation n’est pas constant à travers le génome. il existe des régions hypervariables et des régions plus conservées, selon les restrictions conformationnelles et/ou fonctionnelles de la région en

question.

(22)

2.3- Étude du virus 2.3.1- Modèle animal

Le VHC se révèle être un virus difficile à étudier. Premièrement, il possède une infectivité limitée, ne se répliquant que chez l’humain et le chimpanzé, l’humain étant le seul hôte naturel du VHC. L’absence d’un petit modèle animal infectable augmente considérablement les coûts et la difficulté d’étudier ce virus in vivo. Il a été possible «d’humaniser» le foie de souris immunodéficientes en leur injectant, en bas âge, des hépatocytes humains, ce qui a donné lieu à la souris AÏb-uPA (Mercer et al., 2001). Cette souris peut être infectée par le VHC. Cependant, le taux de mortalité et les coûts associés à l’utilisation de cette souris n’ont pas suffisamment facilité l’étude du VHC et une alternative est toujours recherchée.

2.3.2- Système de réplicon

Jusqu’à tout récemment, l’absence d’un système de culture cellulaire représentait un des plus grands obstacles à surmonter afin de faire avancer l’étude de ce virus. Ce besoin a conduit au développement du système de réplicon. Brièvement, le génome du VHC est modifié afin de permettre la réplication de l’ARN dans des lignées cellulaires (sans formation de particules virales). Ceci est réalisé en enlevant des régions qui ne sont pas nécessaires pour la réplication (protéines structurales), puis en insérant un IRES provenant d’un autre virus (EMCV- encephaïomyocarditis virus) ainsi qu’un gène de sélection. Cependant, la découverte récente d’un système de culture produisant des particules virales infectieuses du VHC (Lindenbach et al., 2005; Wakita et al., 2005; Zhong et al., 2005) répond à un besoin pressant. Ce système est prometteur et aidera certainement à élucider le cycle viral et à découvrir des drogues antivirales plus efficaces.

(23)

10

2.4- Réplication du VHC 2.4.1- Cycle de réplication

Comme tout virus ayant un génome d’ARN de polarité positive, les étapes majeures du cycle de réplication impliquent des membranes cellulaires. Dans le cas du VHC, la formation du complexe de réplication se fait via la membrane du RE. Malheureusement, les détails du cycle de réplication du VHC sont encore obscurs. Une version simplifiée de ce cycle peut se résumer en 6 étapes (figure 4).

1- Attachement du virus à la cellule cible et pénétration. 2- Décapsidation et relâche de l’ARN viral dans le cytoplasme.

3- Traduction par les ribosomes cellulaires et clivage de la polyprotéine par les enzymes cellulaires et virales.

4- Réplication de l’ARN génomique de polarité positive. 5- Encapsidation de l’ARN et formation de particules virales.

6- Maturation du virion et relâche de nouveaux virus de manière non-cytolytique. Figure 4- Cycle de réplication du VRC

(24)

11

2.4.2- Ce]]ules cibles

La cellule hôte primaire supportant la réplication du VHC est l’hépatocyte (Negro et al.,

1992; Nouri-Aria et al., 1995). L’infection des cellules lymphoïdes est controversée

(Boisvert et al., 2001), malgré plusieurs études supportant ce fait (Manzin et al., 1994; Moldvay et al., 1994; Moldvay et al., 1995; Kao et al., 1997; Radkowski et al., 199$;

Sansonno et al., 1998; Maggi et al., 1999; Crovaffo et al., 2000; Rodriguez-Inigo et al., 2000). Le lymphotropisme du VI-IC expliquerait le titre génomique élevé retrouvé dans les nodules lymphatiques des patients infectés. De plus, la corrélation entre l’infection par le VHC et les maladies reliées à la lymphoprolifération (prévalence élevée d’auto

anticorps, cryoglobulinémie mixte, lymphome de type non Hodgkinien) supporte cette hypothèse (Agnello et al., 1992; Bichard et al., 1994; Franzin et al., 1995; Sansonno et

al., 1996; Dammacco et al., 199$).

2.5- Protéines du VNC

Les protéines du VHC sont divisées en 2 catégories: les protéines structurales, situées

dans la portion N-terminale de la polyprotéine, et les protéines non structurales (N$),

occupant la portion centrale et 3’ du cadre de lecture.

FigureS- Représentation schématique du génome du VUC

NS4A

5’NC

C El JE2

1p71

NS2 NS3 NS4B NS5A NS5B 13’NC

(IRES)

_ Protéines Protéines non structurales structurales

O

peptidase signal cellulaire

f

= clivage autoprotéolytique NS2/NS3 =Clivage NS3

(25)

12

2.5.1- Protéines structurales

La protéine de la capside ainsi que les deux glycoprotéines de l’enveloppe (El et E2) forment le groupe des protéines structurales. Ces trois protéines sont les constituants majeurs de la particule virale.

Cap side

Cette protéine basique se lie à l’ARN et forme la nucléocapside virale. La protéine de la capside interagit aussi avec plusieurs protéines cellulaires afin d’influencer la réponse immunitaire. Quelques-uns des rôles attribués à cette protéine sont la suppression d’activation et de prolifération des cellules T (Kittlesen et al., 2000; Soguero et al., 2002), la modulation de l’apoptose des cellules T et des hépatocytes (HaIm et al., 2000; Zhu et al., 2001) ainsi que l’interférence avec la fonction des cellules dendritiques (Sarobe et al., 2002).

El etE2

Ces deux protéines sont extensivement glycosylées et forment un complexe non covalent. La structure de ce complexe n’est pas counue, mais il serait responsable de l’attachement viral ainsi que de l’entrée de la particule virale dans la cellule hôte. E2 possède une région dans sa portion N-terminale ayant un niveau très élevé de variabilité d’acides aminés nommée HVR1 (hypervariable region 1). Ceci suggère qu’il y aurait une pression immunitaire exercée sur cette portion de la protéine, obligeant le virus à muter afin d’éviter la reconnaissance. Puisque E2 peut se lier au récepteur CD81 (Flint et al., 1999) ainsi qu’à DC-SIGN (Pohlmann et al., 2003), il est possible que ces protéines cellulaires participent au mécanisme d’entrée virale dans la cellule (Cormier et al., 2004a; Cormier et al., 2004b). Cependant, cette interaction a d’autres conséquences, telles l’interférence avec la fonction des cellules dendritiques ainsi que l’inhibition de la cytotoxicité et de la production de cytokines anti-inflammatoires par les cellules NK (NaturaÏ Kitters) (Crotta et al., 2002; Tseng et Klimpel, 2002).

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2.5.2- Protéines non structurales p7

La petite protéine hydrophobe p7 a été identifiée comme étant un canal ionique (Pavlovic et al., 2003). On pense que p7 est une viroporine responsable du flux d’ions calciques du réticulum endoplasmique au cytoplasme. Cependant, le rôle de cette protéine dans le cycle viral demeure inconnu.

N$2

NS2 est clivée de la polyprotéine à son côté N-terminal par une peptidase cellulaire. Le côté C-terminal est clivé par une protéase virale formée par NS2 et le domaine N-terminal de NS3, dégageant NS2 et NS3 (Grakoui et al., 1993; Hijikata et al., 1993). Même si son mode d’action n’est pas complètement élucidé, des évidences suggèrent que c’est une cystéine-protéinase activée via l’interaction de la chaperonne cellulaire H$P90 (heat shockprotein) (Waxman et al., 2001). Le rôle de NS2 dans le cycle viral n’est pas clair. C’est une protéine hydrophobe localisée dans la membrane du RE, ayant son côté C-terminal vers le cytoplasme et son côté N-terminal vers le lumen du RE. Il est possible que NS2 joue un rôle lors de l’assemblage viral puisqu’elle co-précipite avec les protéines de l’enveloppe (Dubuisson et al., 1994).

NS3

NS3 encode une activité sérine protéase, responsable du clivage des protéines non-structurales 3!4A, 4A/4B, 4B/5A et 5A!5B. Cette activité joue un rôle essentiel dans le cycle viral. NS3 possède quelques résidus conservés dans le site catalytique (Chambers et al., 1990), cibles de choix pour le développement de drogues antivirales. De plus, les sites de clivage par NS3 contiennent aussi des résidus conservés. Des activités NTPase et

ARN hélicase sont associées à NS3, mais elles sont moins bien caractérisées.

L’holoenzyme NS3/4 bloque l’accumulation d’IRF-3 phosphorylé (interferon regulatory factor-3), empêchant sa translocation au noyau, et par conséquent prévient l’expression

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14 NS4

NS4 contient deux protéines nommées N$4A et NS4B. NS4A est hydrophobe à son extrémité N-terminale et est hydrophile à son extrémité C-terminale. Elle sert de co facteur pour l’activité sérine protéase de NS3, probablement comme agent stabilisateur. NS4B est très hydrophobe, mais sa fonction demeure inconnue.

NS5

NS5 est clivée en deux protéines, NS5A et NS5B. NS5A est une phosphoprotéine. Son rôle précis n’est pas connu, des études comparatives lui prédisant un rôle dans la réplication de l’ARN. NS5A est surtout connue pour son interaction avec la protéine cellulaire PKR (Gale et al., 1997) affectant la sensibilité à l’IFN-Œ, cause principale de l’inefficacité de ce traitement chez les patients infectés par le VHC de génotype 1. NS5B est une phosphoprotéine associée à la membrane et possède une activité ApAd (ARN polymérase ARN dépendante). La structure cristalline de NS5 a été récemment publiée (Tellinghuisen et al., 2005).

2.6- Protéine F

2.6.1- Historique

Afin de découvrir de nouvelles cibles pour des drogues antivirales, telles que des éléments de régulation ou d’autres éléments génétiques cryptiques, Walewski et al. (2001) ont comparé huit différentes séquences du VHC pour trouver des régions conservées. Ils recherchaient plus particulièrement une conservation au niveau de la troisième position des codons, ce qui est indicatif d’une contrainte additionnelle en plus de la contrainte séquentielle d’acide aminé. Par exemple, le 11ièmecodon de la protéine de la capside encode une thréonine. Cette thréonine est hautement conservée à travers les différentes séquences du VHC, probablement parce qu’elle joue un rôle important à cet endroit de la protéine. La thréonine peut être encodée de 4 manières: ACC, ACA, ACG et ACU. Cependant, toutes les séquences analysées avaient ACC comme leme codon, ce qui est extrêmement rare à moins qu’ il y ait une contrainte supplémentaire, comme la présence à cet endroit d’un élément génétique important. Vingt-deux autres codons conservés à la troisième position ont été repérés dans la région de la capside, suggérant

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fortement l’existence d’un cadre de lecture alternatif. Une analyse plus poussée a montré que la vaste majorité des séquences du VHC retrouvées dans GenBank possédaient un cadre de lecture en +1. L’immuno-réactivité de peptides synthétiques dérivés de l’ARFP

fut évaluée pour la première fois. Il a été montré que ce cadre de lecture s’exprimait chez les patients infectés et qu’il suscitait une réponse immunitaire spécifique.

Le groupe de Gojobori ainsi que celui composé de Smith et Simmonds avaient aussi remarqué ce haut niveau de conservation dans la région de la capside (ma et al., 1994; Smith et Simmonds, 1997). Ils ont toutefois mis de côté le cadre de lecture alternatif puisqu’il ne possède pas les éléments conventionnels permettant son expression. Notamment, les codons AUG retrouvés en +1 dans cette région sont tous suivis d’un codon STOP (Ina et al., 1994).

2.6.2- Mode d’expression

Le mécanisme de traduction de la protéine F est controversé. Le groupe de 1.-H. Oufut le premier à démontrer que la protéine en question peut être exprimée par changement de cadre de lecture programmé (frameshfting) d’où son nom original: protéine F (Xu et al., 2001). Une région riche en A située autour du codon 11 de la protéine de la capside serait responsable du changement de cadre de lecture. La traduction de la protéine commencerait avec le codon AUG de la polyprotéine, mais changerait de cadre de lecture aux alentours du codon 11 pour générerune protéine hybride ayant les li premiers acides aminés en commun avec la protéine de la capside. Cependant, la séquence glissante contenant 10 adénines consécutives (1OA) utilisée par ce groupe n’est retrouvée que chez

unetrès faible proportion des personnes infectées (2 de 721 séquences disponibles dans la base de donnée Hepatitis Virus Database: hftp://s2asO2.genes.nig.ac.jp/ (Baril et Brakier-Gingras, 2005)). Puisqu’il est estimé qu’environ 60% de la totalité des patients infectés possèdent des anticorps dirigés contre la protéine F (Komurian-Pradel et al., 2004), le mécanisme de changement de cadre de lecture à cette position ne suffit pas à expliquer ce phénomène, ce qui laisse supposer que la protéine F produite par le changement de cadre de lecture n’est pas le produit principal du cadre de lecture alternatif. En effet, Baril et Bralder-Gingras (2005) ont démontré que le changement de

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16

cadre de lecture observé par Xu et al. est causé artificiellement in vitro par cette séquence 1 OA. Le groupe de J. H. Ou a aussi décrit un triple décodage par changement de cadre de lecture progranmté en -21+1 et en -1/+2 au même endroit (Choi et al., 2003). Par contre, ils ont utilisé cette même séquence contenant 1OA consécutifs, ce qui n’est pas représentatif. Plusieurs autres protéines encodées dans ce cadre de lecture alternatif ont été découvertes au cours des dernières années (révisé par Branch et al. (2005)). Puisque la nomenclature de ces protéines n’est pas encore établie, elles portent toutes le nom d’ARFP (Alternate Reading frame Protein). Une version de l’ARFP découverte par le groupe de J. P. Lavergne requiert deux événements de changement de cadre de lecture (au codon 42 et codon 144) pour donner lieu à une protéine dont les deux extrémités sont encodées par la protéine de la capside (Boulant et al., 2003). Par contre, ces études ont été faites en exprimant la séquence de la capside dans Escherichia cou. Le site de changement de cadre de lecture au codon 42 est AGG, celui-ci étant rare chez les

bactéries, mais pas chez les humains (Codon Usage Database:

http://www.kazusa.or.jp/codonl (Baril et Brakier-Gingras, 2005)). Ceci pourrait expliquer le changement de cadre de lecture observé dans E. cou. De plus, le codon 144 (UAG) est un codon STOP faible, donc susceptible de forcer le ribosome à faire une pause, sans toutefois arrêter la traduction. Cette pause du ribosome pourrait être associée aux événements de traduction anormaux observés dans cette région. Le groupe de L. Brakier Gingras a montré que la traduction de la protéine F ne nécessite pas un changement de cadre de lecture. Elle se ferait plutôt par liaison directe du ribosome dans le cadre de lecture +1 via le codon en position 26 (+1) (Baril et Brakier-Gingras, 2005). Ce codon est soit GUG ou GCG selon le variant viral. Ce modèle de traduction de la protéine f est le plus vraisemblable. De plus, Vassilaki et Mavromara (2005), ont rapporté qu’une forme de l’ARFP peut être exprimée en cellules sans la séquence glissante et en absence du codon AUG de la polyprotéine, suggérant que l’initiation de la traduction se fait via un codon AUG situé aux alentours du codon $0.

Il est possible que plusieurs formes de l’ARFP soient produites lors de la réplication du VHC in vivo. Cependant, il serait important de déterminer l’impact de chacune de ces

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formes afin de distinguer les produits majoritaires, dotés de rôles précis, des artéfacts de traduction.

2.6.3- Activités

La protéine f est associée au RE (Xu et al., 2003), mais sa fonction n’est pas claire. Puisque la protéine f est encodée dans la même région que la protéine de la capside, on pounait supposer que certaines des fonctions attribuées à la protéine de la capside sont en fait dues à la protéine F. On a récemment démontré que la protéine F ne module pas l’activité des promoteurs de c-myc, hTERT et p53 (Basu et al., 2004), contrairement à la protéine de la capside (Ray et al., 1996; Chang et al., 199$; Moriya et al., 199$; Ray et al., 199$; $hrivastava et al., 1998; Marusawa et al., 1999; Tsuchihara et al., 1999). Cependant, la protéine F diminue l’expression de p21, sans toutefois parvenir à inhiber l’apoptose médiée par TNF-Œ. Ceci démontre que la protéine F ne partage pas les mêmes fonctions que la protéine de la capside, mis àpartson effet surp21 (Basu et al., 2004).

L’expression de la protéine F est estimée à 2% comparativement à la polyprotéine (Baril et Brakier-Gingras, 2005). Un bas niveau d’expression est souvent associé à des produits viraux qui jouent un rôle important dans le cycle viral. La protéine F n’est pas requise pour la réplication du génome viral puisque le système de réplicon parvient à répliquer le génome viral en absence de la protéine F. Toutefois, la similarité d’expression de la protéine f décrite par Baril et Brakier-Gingras (2005) à celle de la protéine L* du virus d’encéphalomyélite murine de Theiler laisse croire que ces deux protéines partageraient la même fonction, la protéine L* étant essentielle pour la persistance virale.

L’emplacement de protéines dans des cadres de lecture alternatifs constitue une stratégie courante chez les virus (tel le VIH ou le virus de l’hépatite B (VHB)), soit en raison des contraintes de taille génomique, ou encore d’un besoin de régulation de la traduction de la protéine. De plus, la grande majorité des séquences VHC retrouvées dans les bases de données contiennent un cadre de lecture ouvert en position +1 (Walewski et al., 2001), confirmant la conservation et l’importance de cette séquence.

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1$

3- Immunité

3.1- Persistance versus clairance

Dans la majorité des cas, soit environ 75% (GBHCWG, 2004), le système immunitaire ne parvient pas à éliminer le VHC et l’infection devient persistante, dû en grande partie à la quasi spéciation.

À

long terme, l’infection mène à l’hépatite chronique pouvant progresser vers la cirrhose du foie ou le carcinome hépatocellulaire (Saito et al., 1990). Dans ce dernier cas, un des seuls traitements possibles est la transplantation. En effet, l’infection par le VHC est une des causes principales de transplantation du foie aux États-Unis (OPTN/SRTR, 2004).

Tableau I- Probabilité du développement de cirrhose selon l’âge et la durée d’infection par le VHC Après 20 Après 40 années années d’infection d’infection Personnes infectées avant 5% 20%

Développement l’âge de 40 ans

de cirrhose Personnes

infectées après 20% 40%

l’âge de4O ans Estimations selon (GBHCWG, 2004).

L’infection par le VHC est divisée en deux phases : la phase aigu et la phase chronique. La phase aigu est définie arbitrairement conmie étant les six premiers mois de l’infection. C’est au cours de cette période critique que la réponse immunitaire déterminera si l’infection sera résolue ou deviendra persistante ($houkry et al., 2004). La probabilité de développer une réponse immunitaire protectrice après cette période est très basse, voire inexistante chez la majorité des patients.

Le chimpanzé est le seul modèle animal infectable par le VHC. Il est par contre plus efficace que l’humain pour éliminer le virus, son taux de clairance se situant autour de 80% (Shoukry et al., 2003) comparativement à 25% chez l’homme. L’étude de la réponse

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immunitaire chez le chimpanzé a fourni de l’information extrêmement précieuse quant aux éléments clés définissant la persistance ou la clairance, notamment durant la phase aigu. Cette phase est difficile à étudier chez l’homme puisqu’elle s’avère souvent asymptomatique, les personnes infectées ignorant le fait qu’elles sont porteuses du virus.

3.2- Immunité humorale et cellulaire

Le système immunitaire se défend contre les virus de plusieurs manières. La première ligne de défense est l’inmunité innée. Celle-ci est constituée de cellules NK, d’interférons et de cytokines qui attaquent de manière non spécifique les corps étrangers (Katze et al., 2002; Su et al., 2002). Même si cette réponse est très importante, elle n’est pas suffisante à elle seule pour combattre le VHC. L’immunité acquise joue un rôle de premier plan en ciblant spécifiquement des portions de protéines du virus de deux manières : avec des anticorps qui se lient directement à la particule virale (immunité humorale), ou en détruisant les cellules infectées (immunité cellulaire).

3.2.1- Immunité humorale

Les patients avec une infection chronique possèdent des anticorps (Ac) contre l’enveloppe du VHC, indiquant une réponse humorale continue (Cerino et al., 1997). La contribution de ces Ac demeure inconnue. Contrairement à l’immunité observée lors de l’infection par le VHB, où la présence d’Ac neutralisants contre l’enveloppe est fortement corrélée avec la guérison, les Ac contre le VHC n’offrent pas cette protection. En effet, l’injection du VHC à un chimpanzé ayant déjà éliminé le virus et possédant un taux élevé d’Ac anti-VHC ne bloque pas la réinfection (f arci et al., 1992).

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20

3.2.2- Immunité cellulaire Lymphocytes T CD4+

Devant la protection limitée offerte par l’immunité humorale, le rôle de l’immunité cellulaire s’avère critique dans la défense contre le VHC. Les lymphocytes T CD4+ sont très importants puisqu’ils dirigent l’immunité cellulaire vers une réponse soit de type Thi ou Th2. Une réponse de type Thl est nécessaire afin d’activer les cellules CD$+ cytotoxiques qui détruiront les cellules infectées. Cependant, une réponse de type Th2 va favoriser la production d’Ac neutralisants. Il est important de noter que les cytokines de type Th2 (IL-10, IL-4) antagonisent l’effet d’activation des cytokines de type Thl (IL-2, IFN-’y). Lors de la phase aigu de l’infection par le VHC, l’activation d’une réponse de type Th2 est associée au développement de chronicité (Tsai et al., 1997). De plus, une proportion élevée de patients avec une infection chronique présente un niveau élevé de cytokines de type Th2 (Reiser et al., 1997). Une autre étude révèle que le nombre de PBMC (Peripheral bood mononuclear ceils - cellules mononuclées du sang périphérique)

exprimant des cytokines de types Thi est inférieur chez les patients avec une infection chronique en comparaison avec des patients ayant éliminé l’infection (Lechmann et al.,

1999).

Les patients qui développent une infection chronique ont deux patrons d’activation des cellules T CD4+ durant la phase aigu (Gerlach et al., 1999). Le premier patron montre

une absence de réponse VHC spécifique par les cellules T CD4+. Le deuxième patron présente initialement une forte réponse CD4+ corrélant avec l’élimination de l’ARN viral dans le sérum. Cependant, cette population de cellules T CD4+ se rétracte avant le retour de la virémie, menant à la chronicité. Le contrôle temporaire de la virémie observé dans le deuxième patron suggère que le prirning et l’expansion des CD4+ ne sont pas défectueux chez tous les sujets, mais que la réponse n’est pas soutenue pour des raisons encore inconnues. Cependant, l’inactivation de cellules T CD4+ est un trait commun des infections persistantes et serait peut-être une fonction intrinsèque de ce groupe de cellules (Brooks et al., 2005).

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La transition de la phase aiguè à la phase chronique est associée à une perte substantielle de cellules T CD4+ VHC spécifiques (Gerlach et al., 1999). Par conséquent, l’activité des cellules T CD8+ est grandement affectée, celles-ci n’étant pas efficaces sans l’aide des cellules T CD4+ (Figure 6).

Lymphocytes T CD8+

Les lymphocytes T CD8+ sont extrêmement importants durant la phase aigu. Leur présence dans le sang et dans le foie est chronologiquement associée au contrôle de la virémie chez le chimpanzé et chez l’humain. En effet, la majorité des patients qui réussissent à éliminer le virus ciblent plusieurs épitopes durant la phase aigu (Gruner et al., 2000). Au contraire, les chimpanzés (Cooper et al., 1999; Thimme et al., 2002) ou les humains (Gruner et al., 2000; Lechner et al., 2000) qui développent une infection chronique reconnaissent peu ou pas d’épitopes du VHC lors de la phase aigu.

Cellules T CD$+ mémoire

Lors d’une première infection, les chimpanzés qui parviennent à éliminer le virus le font en l’espace de 3-4 mois. Ce délai correspond à l’apparition de cellules T CD4+ et CD8+ VHC spécifiques. Une fréquence élevée de cellules T mémoire ciblant plusieurs protéines du VHC est conservée plusieurs années post-infection. Lors d’une réinfection, les chimpanzés réussissent à éliminer le virus beaucoup plus rapidement (environ 14 jours). Ce contrôle immédiat de la deuxième infection est lié temporellement à l’activité cytolytique de cellules T CD$+ cytotoxiques situées dans le foie, ainsi qu’à l’expansion de cellules CD4+ et CD$+ mémoire dans le sang ($houkry et al., 2003). Cependant, s’il y a déplétion de cellules T CD8+ mémoire avant de provoquer une troisième infection, la réplication du virus continue même en présence de cellules T CD4+ mémoire. L’élimination du virus se fait seulement lorsqu’il y a rétablissement de la population de cellules T CD$+ VHC-spécifiques dans le foie. Ces expériences démontrent bien le rôle essentiel des cellules T CD8+ mémoire dans la protection contre la réinfection. Un vaccin efficace devrait donc déclencher la production de telles cellules.

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22

Figure 6- Modèle de la réponse immunitaire au VHC proposé par Shoukry et al. (2004)

B. Réponse immunitaire inefficace

3.3- Vaccin

Chez le chimpanzé, l’élimination du virus ne protège pas contre la réinfection (f arci et al., 1992; Prince et al., 1992). Par contre, des études ont montré que les chimpanzés ayant éliminé une infection ou ayant reçu un vaccin avaient un certain niveau de protection lors d’une infection subséquente (Foms et al., 2000; Bassett et al., 2001). En effet, la sévérité de l’infection ainsi que l’incidence de persistance virale étaient grandement diminuées. Cette même observation a été faite chez un groupe d’utilisateurs de drogues injectables (Mehta et al., 2002). Dans cette étude, les personnes ayant éliminé une infection par le VHC étaient 12 fois moins susceptibles de développer une infection chronique lors d’une réinfection en comparaison avec les personnes infectées pour la première fois. De plus, ce même groupe de chercheurs a subséquemment montré que les chimpanzés ayant éliminé une infection par le VHC de génotype 1 étaient protégés contre l’infection par le VHC de

A. Réponse immunitaire efficace

Cellules T CD8+

Mémoire à long terme

Cellules T CD$+ défectueuses

Perte de cellules T CD4+

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différents génotypes ayant une divergence

j

us qu’ à 30% au niveau des acides aminés (Lanford et al., 2004). Cette protection a été attribuée notamment à la conservation d’épitopes entre ces génotypes et à la réponse cellulaire visant un large spectre d’antigènes, empêchant l’apparition de mutations d’échappement (Cooper et al., 1999; Gruner et al., 2000; Leclmer et al., 2000; Thimme et al., 2001; Thimme et al., 2002). Toutes ces études démontrent le grand potentiel de la vaccination contre le VHC.

Le besoin de développer un vaccin contre le VHC est pressant. Afin d’être efficace, ce vaccin devrait éliciter une forte réponse CD$+ cytotoxique ciblant plusieurs épitopes dans le but d’éviter la chronicité. Toutefois, l’un des obstacles majeurs à surmonter est la grande hétérogénicité des variants du VHC. Une stratégie possible consiste à cibler les régions conservées du génome. La protéine de la capside est très conservée, cependant, ses caractéristiques immuno-modulatrices (Ray et al., 1996; Chang et al., 199$; Moriya et al., 199$; Ray et al., 199$; $hrivastava et al., 199$; Marusawa et al., 1999; Tsuchihara et al., 1999) sont indésirables au sein d’un vaccin. La découverte de la protéine F, encodée dans cette même région conservée et ne partageant pas les fonctions négatives de la protéine de la capside, est très intéressante. De plus, la protéine F a possiblement d’autres fonctions qui méritent d’être étudiées, notamment, son rôle potentiel dans la régulation virale. Aussi, la protéine F serait possiblement produite tôt dans l’infection puisque sa traduction est indépendante de celle de la polyprotéine. Tous ces éléments font de la protéine F un excellent candidat en tant qu’immunogène.

En effet, Zhang et al. (2004) ont récemment démontré le pouvoir immunogène de la protéine F. Des souris immunisées avec un adénovirus contenant 99 acides aminés de la protéine F étaient complètement protégées contre l’infection parun adénovirus contenant le gène de la capside, El et E2. Ceci laisse croire que la quantité, la stabilité et le mode de présentation des peptides de la protéine F forment un produit très immunogène. Ceci va de pair avec l’intérêt croissant pour les épitopes non traditionnels provenant de cadres de lecture alternatifs comme constituants efficaces de vaccins (Malarkannan et al., 1999; Cardinaud et al., 2004).

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24

Puisque les patients infectés avec le VIH formeraient une proportion importante des récipients d’un vaccin contre le VHC, il est impératif de déterminer si ces patients immunosupprimés sont capables de mobiliser une réponse immunitaire contre la protéine F.

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26

Caractériser la réponse immunitaire humorale et cellulaire dirigée contre la protéine F du VHC chez des patients infectés par le VHC ou co-infectés par le VHC et le VIH afin d’évaluer le potentiel de la dite protéine en tant qu’imniunogène dans le contexte du développement d’un futur vaccin multivatent.

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2$

CHARACTERIZATION 0F HUMORAL AND CELL-MEDIATED IMMUNE

RESPONSES DIRECTED AGAINSI 11CV F PROTEIN IN SUBJECTS

COINFECTED WITH 11CV AND 111V-1.

Running head: F protein-specific immunity in coinfected subjects.

Myriam Troesch”2, Emilie Jalbert”2, $ophie Canobio”2, M. Rachid Boulassel3, Jean-Pierre Routy3, Nicole F. Bernard3, Julie Bruneau4, Normand Lapointe5’6, Marc Boucher5’7, Hugo Soudeyns”2’6.

‘Unité d’ immunopathologie virale, Centre de recherche de 1’ Hôpital Sainte-Justine; 2Department of Microbiology & Immunology, Université de Montréal; 3McGill University Health Center; 4CHUM-Hôpital Saint-Luc; 5Centre maternel et infantile sur le SIDA, Hôpital Sainte-Justine; Departments of 6Pediatrics and 7Obstetrics & Gynecology, Université de Montréal; Montreal, Canada. Present address: Program in Infectious Diseases, Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, Washington, USA.

*To whom correspondence should be addressed at: Unité d’imrnunopathologie virale, Centre de recherche de l’Hôpital Sainte-Justine, 3175 Côte Sainte-Catherine, room 6735, Montréal (Québec), H3T 1C5, Canada. Tel.: (514) 4931 ext. 3907. Fax: (514) 345-4794. e-mail:

Word count: Text: 3486 words; Abstract: 241 words.

Sources of support: This research was supported by the Canadian Network for Vaccines and Immunotherapeutics (CANVAC) and by Valorisation-Recherche Québec (VRQ).

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ABSTRACT

Background: HCV F protein is encoded in an altemate reading frame overlapping the core protein region. Its precise sequence, biological ftinction and mode of expression are

currently unclear. This study was conducted to examine the prevalence and

characteristics of host humoral and cell-mediated immune responses directed against F protein in patients coinfected with HCV and HIV- 1.

Methods: Mutations were introduced to allow expression of HCV-la F protein in

absence of core. This recombinant and a truncated form lacking the first 11 amino acid residues shared with core were expressed in E. cou and their amino acid sequences were verified by mass spectrometry. Vaccinia-F protein recombinants were used to test F protein-specific cytotoxic T ceil (CTL) activity. Binding of F protein-derived peptides to HLAA*O2O1 was studied to identify putative CTL epitopes.

Resuits: Sera from 23 of 39 patients infected with various HCV genotypes recognized the truncated form, including 13 of 25 subjects coinfected with HIV-1, indicative of antigenic cross-reactivity and consistent with conservation of F protein coding sequences between HCV genotypes. Cross-reactive F protein-specific CTL precursors were detected in 9 of 11 HCV-infected subjects, including 7 of 9 patients coinfected with HCV and HIV-1. Finally, 3 novel putative HLAA*O2O1restricted CTL epitopes were identified. Conclusion: These resuits indicate that patients co-infected with HCV and HIV-1 can mount immunoglobulin and CTL responses directed against HCV F protein that are fully comparable in scope and magnitude to those observed in subjects infected with HCV alone.

KEYWORDS

Hepatitis C; cytotoxic T lymphocytes; cross-reactivity; altemate reading frame protein; coinfection.

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INTRODUCTION

Cell-mediated immune responses comprised of CD4+ T helper (Th) and CD$+ cytotoxic T lymphocytes (CTL) constitute the main mechanisms by which hepatitis C virus (HCV) replication can be controlled in the host, though innate immunity, including NK celis, interferons, and chemokines are also involved in protective responses [1-7]. Due to overlapping transmission routes and target populations, a large proportion of chronic HCV carriers are also infected with HIV-1, which markedly worsens the prognosis of HCV disease in adults [8,9]. The pathology of HCV-HIV coinfection is complex but resuits at least in part ftom inhibition of HCV-specific humoral and celi mediated immunity by HIV-1 [10-12]. Cryptic epitopes generated from translation of viral or cellular gene products using alternate reading frames are known to elicit such responses and were recently shown to represent an important source of tumour-specific antigens in certain forms of human cancer [13,14]. Various RNA and DNA viruses of bacteria, plants and animals use overlapping open reading frames (ORF) to compensate for size limitations imposed on viral genomes and/or to regulate viral protein expression. Likewise, HCV encodes an altemate 144-162 amino-acid, 17 kDa polypeptide termed f protein or altemate reading frame protein (ARFP) from the 5’ moiety of the core gene

[15-17]. The function and biological significance of F protein are unclear [15-19]. It is expressed in transfected ceils [20] and can be recognized by sera and T cells isolated from HCV-infected patients, suggesting that it is produced in vivo [16,17,21,22]. Here we explore the prevalence and characteristics of host immune responses directed against F protein in patients coinfected with HCV and HIV- 1.

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MATEfflALS AND METHODS

Study subjects and clinical parameters.

For studies of humoral immune responses, 39 female patients were selected among the participants of the Centre maternel et infantile sur te SIDA (CMIS) mother child-cohort (Hôpital Sainte-Justine, Montreal, Canada). Mean age was 29.6+1-5.75 years (range20.1-41.3 years). HCV infection was confirmed by ELISA and recombinant immunoblot assays. in accordance with clinical practice and diagnostic algorithms used in the Province of Quebec. Mean HCV RNA level (COBAS Amplicor HCV Monitor assay version 2.0, Roche Diagnostics, Montreal, Canada) was 5.37 log IU/ml plasma (range2.7$-7.09 log IU/ml plasma). HCV genotyping was performed by sequence analysis of the 5’ non-coding region [23]. Co-infection with HIV-1 was confirmed by ELISA and non-quantitative PCR in 25 ofthese 39 subjects. In coinfected patients, mean CD4 celi count, measured using flow cytometry, was 509+1-243 cells/mm3 (range=33-1287 cells/mm3), and mean HIV-1 viral load (Versant HIV RNA version 3.0 assay, Bayer, Pittsburgh, Pennsylvania) was 2.81 log RNA copies/ml plasma (range=1 .70-4.73 log RNA copies/ml plasma). Nineteen of these 25 subjects were treated with antiretroviral therapy, including single agent (n3), double combination therapy (n=6), and triple combination therapy (n11). Reported HIV risk categories included injection drug use (n=22), probable heterosexual transmission (n=7), as well as surgical procedures and/or transfusions performed in an HIV-endemic region (n=3). for studies of ccli rnediated immunity, patients were selected among participants to the St-Luc intravenous drug user cohort (CHUM-Hôpital St-Luc, Montreal, Canada) (n=7; HND, HTM, and PSL codes) or from the CMIS cohort (n=4; TVC codes). Clinical characteristics of subjects in this second study group are summarized in Table 1. Alanine transaminase (ALT) and aspartate transaminase (AST) levels were assayed on a Synchron LX2O system (Beckman Coulter, Palo Alto, California). None of the subjects in either group had been treated with anti-HCV therapy at the time of the study. Full informed consent was obtained from all study participants. Counseting and appropriate medical treatment were provided. Ibis research protocol was approved by the Ethics Review Board of The Montreal Chest Institute, CHUM-Hôpital Saint-Luc, and Hôpital Sainte-Justine, Montreal, Canada, where patients were enrolled and the study was conducted.

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32

11CV F protein gene cloning and mutagenesis

Viral genomic RNA was isolated from 500 tl of serum obtained from a subject (TVC33) infected with 11CV-la, and was reverse transcribed and amplified using the QIAamp procedure (Qiagen, Mississauga, Ontario) with primers HCV la 1-16 (5’-GCC AGC CCC CTG ATG 3’) and 11CV 98$-970 (5’GCC TCG TAC ACA ATA CTC G-3’) (Alpha DNA, Montreal, Canada). RT-PCR conditions were 50°C/30 mm, 95°C/15 min denaturation, 40 cycles of 94°C/30 sec, 55°C/l mm, and 72°C/l mm, followed by a 72°C/10 min extension cycle, in a T3 thermal cycier (Biometra, Goettingen, Germany). The amplicon was cloned into the Sif I site of pCRScript Amp SK+ (Stratagene Cloning Systems, La Joua, California) (pCorela33). Core sequences were then modified by mutagenesis to a) force-shifi translation into the (+2) reading frame; and b) lock translation by introducing tbree suent mutations within the frameshifl-associated slippery-like sequence (frnut$). This was done by first inserting the Aat II-Not I fragment from pCorela33 into the pSCllss vaccinia transfer vector [24] cieaved with Stit I and Not I (pSC1 lssf 16). pCorela33 was reamplified using primers Fmut S Sal (5’-GAC CGT CGA CCA TGA GCA CGA ATC CTA AAC CTC AGA GGA AGA CCC CAA ACG TAA-3’) and Fmut AS Kpn (5’-AAG GGT ACC CGG GCT GAG CCC AGG TCC TGC CCT CGG G-3’). PCR conditions were 94°C/3 mm, 25 cycles of 94°C/30 sec, 60-72°C/1 mm, and 72°C/1 mm, foilowed by 72°C/1 5 min extension, in a TGradient thermal cycier (Biometra). The amplicon was then cut with $al I and Kpn I, and was shuffled into pSCllssf 16 to form pSCllssFmut$. A truncated form of the F protein lacking the 11 first N-terminal amino acids shared with core (fmut$A1 1) was similariy generated using primers HCV1a Sal I (5’-TCA AGT CGA CCC AAA CGT AAC ACC AAC CG-3’) and pCRS1 (5’-GGA AAC AGC lAI GAC CAT GAI TAC GCC AAG C-3’). PCR conditions were 25 cycles of 94°C/30 sec, 53°C/1 mi and 72°C/1 mm, followed by 72°C/15 min extension. Lastly, fmut$ and Fmut8Al I were also subcloned into $aÏ I-Not I-digested pET-30e and pET-30b, respectively (Novagen, Madison, Wisconsin), for inducible, N-terminal His-tagged expression in E. coiL The structure of ail constructs was verified by automated DNA sequencing.

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Production of recombinant F protein

pET-3OcFmut8 and pET-3ObFmut8All were expressed in E. cou BL21 celis and F protein was purified under denaturing conditions on Ni-NTA His-Bind resin (Novagen), followed by preparative polyacrylamide gel electrophoresis using a Mini Prep celi (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Califomia). The Fmut8Al 1 gene product was used to raise rabbit antiserum with no cross-reactivity against core protein. For mass

spectrometry (MS), Coomassie-stained protein gel bands were rehydrated and

trypsinized. Extracted peptides were then eluted from a nanoscale Cl $ reverse-phase HPLC capillary colunm and were subjected to electrospray ionization followed by MS

using an LCQ DECA ion-trap mass spectrometer (ThermoFinnigan, San Jose,

California). Protein identity was assessed by sequence comparison with protein or translated nucleotide databases with the use ofthe SEQUEST program [25].

F protein ELISA

Antigen (2 j.ig/ml Ni-NTA-purified fmut8Al 1) was incubated overnight at 4°C in flat-bottom 96-well polystyrene plates in 100 pi of 0.1 M NaHCO3 pH 8.6. Plates were blocked for 2 W4°C with 200 tÏ per weÏl of 5 mg/ml bovine serum albumin (BSA) in 100 mM NaHCO3 pH 8.6, and were washed 6 times with 10 mM tris base, 150 mM NaC1, 0.05% Tween-20 pH 7.4 (iX TBST). Dilutions ofpatient’s sera (1/50 to 1/6400 in 100 tl iX TBST) were then added and incubated for 2 h at room temperature with gentie shaking. Wells were washed 6 times with iX TBST and 100 pi/well of alkaline phosphatase-coupled anti-human IgG antibody (1/3000; Sigma, Saint Louis, Missouri) or anti-rabbit antibody (1/1000; Biosys, Compiegne, France) was added in iX TBST + 5

mg/ml BSA. Afier 1 hour incubation at room temperature with gentle agitation, wells were washed 6 times and antibody binding was revealed with 50 mM NaHCO3, 1 mI\4 MgC12, and 1 mg/ml p-nitrophenyl-phosphate. Afier 90 mm, optical density was measured at 410 mn in a MR7000 spectrophotometer (Dynatec, Chantilly, Virginia). Rabbit antisera raised against Fmut$A1 1 or purified core protein (kindly provided by D. Leclerc, Centre de recherche du CHUL, Quebec, Canada) were used as positive and negative controls.

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Preparation of recombinant Vaccinia virus

CV1 celis, maintained in Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM)

supplemented with 10% fetal bovine serum (f35) (Invitrogen, Burlington, Canada), were infected with the Western Reserve (WR) strain of vaccinia virus and were then transfected with pSC 11 ssFmut$ using CaC12 precipitation. Progeny virus was extracted by 3 freeze-thaw cycles, treatment with 0.25 mg/mÏ trypsin (Worthington, Lakewood, New Jersey) and sonication, followed by 3 rounds of plaque selection on HuTK-143B celis incubated in 2% w/v low melting point agarose (Invitrogen) supptemented with 2X DMEM, 0.05 rng/ml neutral red, 20 1iM bromodeoxyuridine (BrdU), and 400 jiM 5’-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-D-galactopyranoside (X-Gal) [24]. Tdentity and structure of plaque-purified vaccinia recombinants were verified by PCR and automated DNA sequencing.

Cytotoxic T lymphocyte assays

To serve as targets in cellular cytotoxicity assays, autologous 3-lymphoblastoid celi unes (BLCL) were derived from each of the study subjects by incubating patient peripheral blood mononuclear cells (PBMC) isolated on a Ficoll gradient (Amersham Biosciences, Mississauga, Canada) with supernatant from the B95-$ Epstein-Barr virus (EBV)-infected celi une in presence of 1 j.tM cyclosporine A (Sandoz, Vienna, Austria) [26]. For limiting dilution analysis (LDA), serial dilutions (500 cells per well-7 cells per well) of patient PBMC were replica-plated onto wells containing 200,000 inadiated (3000 rads) allogeneic feeders cells, and were cultivated for 21 days in RPMI media supplemented with 10% FBS, 1 tg/ml phytohemagglutinin (PHA) (Sigma) and $0 units/ml recombinant interleukin-2 (IL-2) (Hoffman-La Roche, Nutley, New Jersey; obtained through the NIH AIDS Research and Reference Reagents Program). Autologous BLCL, infected at a MOI of 10 with specific vaccinia recombinants, were labeled with 51Cr-sodium chromate (Amersham Biosciences) and the cytotoxic activity of cultured effectors was tested following a standard 5 h incubation [27]. Wild type vaccinia WR and vaccinia SC59 NNRd expressing amino acid residues 364-161$ (E2, p7, N52, and NS3) of HCV-la (obtained from M. Houghton, Chiron Corporation, Emeryville, California) [2$] were used as controls in these experiments. Percent specific lysis was defined as 100

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x (test release-spontaneous release)/(total release-spontaneous release), with significance threshold set at 2.67 standard deviations above negative control values. CTL precursor frequencies and 95% confidence intervals were computed using software kindly provided by Dr Spyros Kalams (Vanderbiit University, Nashville, Tennessee).

Peptide binding assay

37 overlapping peptides (15 amino acid residues with 10 residue overlaps) derived from F protein and 5 additional 15-mer peptides corresponding to alternative N-terminal frameshifi products of the core protein sequence were synthesized using Fmoc chemistry (SynPep, Dublin, California) based on the sequence of HCV-la F protein (GenBank accession n° M62321) [29], and were resolubilized in 25% w/v dimethyl sulfoxyde (DM$O) in 1 x HBSS. Peptides were diluted to 30, 100, and 200 j.tg/ml final concentration in DMEM supplemented with 3% w/v FBS, and were incubated with 100,000 serum-depleted (3% FB$ for 24h) T2 cells [30] for 16 h at 37°C in 5% C02. T2 celis were then stained (30 min at room temperature) for MHC class I molecules using fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated W6/32 monoclonal antibody (Sigma, Saint Louis, Missouri) and were analyzed on a FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, La Jolla, California) with live gating based on forward and side scatter.

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RESULTS

F protein-specific humoral immune responses.

Five synonymous nucleotide substitutions were introduced in the putative frameshift-associated slippery-like sequence to force expression of HCV- la F protein in the absence of core gene product (figure lA). This recombinant protein (Figure lB) and a truncated form lacking the first 11 amino acid residues shared with core (data flot shown) were expressed in E. cou and purified by nickel chelation chromatography. Because multiple transiational recoding events were reported to occur when f protein was produced in different expression systems [16,3 1,321, the amino acid sequences of Fmut8 and fmut8Al 1 were confirmed using MS, with peptide coverage of 87.0% and 68.2% by amino acid count for Fmut8 and Fmut8All, respectively (Figure 1C and data flot shown). Purified Fmut8Al 1 was used in fUSA to measure reactivity against F protein in sera derived from 39 patients infected with various HCV subtypes, including HCV-la (n=20), HCV-lb (n=9), HCV-3a (n7), HCV-4a (n1), HCV-4c (n1), and HCV-5a (n1). 0f these patients, 25 were also coinfected with HIV-1. Levels of ALT and AST were significantly higher in coinfected patients than in patients infected with HCV atone (p=0.0464 and p=O.00542, respectively, Student’s t test). Plasma HCV load was also larger in coinfected subjects, but this difference was not statistically significant (pO.O77$, Student’s ttest).

Overall, serum samples from 23 of 39 HCV-infected patients (59.0%) had positive reactivity to Fmut$z\1 1 at dilutions of 1:400 or greater (Figure 2A). These include 10 of 20 patients (50.0%) infected with HCV-la, 7 of 9 patients (77.8%) infected with HCV-lb, 4 of 7 patients (57.1%) infected with HCV-3a, 2 of 2 patients (100%) infected with HCV-4a or 4c, and O of 1 patient (0.00%) infected with HCV-5a. Humoral responses directed against F protein were only detected in HCV infected subjects (Figure 2A and data flot shown). Plasma HCV viral load, ALT and AST levels were not significantly different in subject with detectable versus undetectable antif antibody response (p=0.137, 0.112, and 0.105, respectively, Student’s t test). Furthermore, there was no correlation in linear regressiofi analysis between titers of anti-F antisera and HCV viral load, ALT, or A$T (r20.124, 0.134, and 0.125, respectively).

Figure

Figure 1- Prévalence géographique du VHC
Figure 2-Arbre phylogénique montrant les génotypes principaux du VIIC
Figure 3- Distribution géographique des génotypes et sous-types du VUC
Tableau I- Probabilité du développement de cirrhose selon l’âge et la durée d’infection par le VHC Après 20 Après 40 années années d’infection d’infection Personnes infectées avant 5% 20%
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