© Thiéry De Serres-Bérard, 2019
Développement d'un modèle de peau reconstruite par
génie tissulaire à partir de cellules diabétiques pour
l'étude des plaies chroniques cutanées
Mémoire
Thiéry De Serres-Bérard
Maîtrise en biologie cellulaire et moléculaire - avec mémoire
Maître ès sciences (M. Sc.)
Développement d’un modèle de peau reconstruite
par génie tissulaire à partir de cellules diabétiques
pour l’étude des plaies chroniques cutanées
Mémoire
Thiéry De Serres-Bérard
Sous la direction de :
III
Résumé
Chez les patients diabétiques, plusieurs mécanismes intervenant dans la guérison de plaies sont affectés par l’hyperglycémie. Ainsi, ils sont plus à risque de développer des ulcères chroniques présentant un haut risque d’infection et pouvant même mener à une amputation des membres inférieurs. Les recherches menées sur les fibroblastes et les kératinocytes provenant de patients diabétiques humains sont principalement effectuées avec des cultures cellulaires monocouches peu représentatives de l’environnement in vivo, ce qui empêche la découverte de traitements efficaces. Notre hypothèse propose que l’intégration de cellules diabétiques dans un modèle de peau reconstruite tridimensionnelle pourrait permettre de mieux comprendre la pathogenèse des plaies chroniques. L’objectif du projet consiste à comparer les caractéristiques de peaux reconstruites diabétiques à des peaux reconstruites saines dans deux processus importants pour la guérison de plaies, soit l’angiogenèse et la reépithélialisation.
Nous avons extrait des fibroblastes, des kératinocytes et des cellules endothéliales microvasculaires à partir de biopsies de peau prélevées sur le membre amputé de patients diabétiques. Nous les avons ensuite ensemencés dans un biomatériau en chitosane et en collagène dans lequel les cellules endothéliales forment un réseau microvasculaire alors que les kératinocytes forment un épiderme stratifié. Grâce à ce modèle, nous avons observé que des cellules endothéliales saines cultivées avec des fibroblastes diabétiques formaient des réseaux microvasculaires moins développés qu’avec des fibroblastes sains. De plus, les kératinocytes diabétiques présentaient une très faible capacité de reépithélialisation suivant l’induction d’une plaie comparativement aux contrôles sains.
Nous avons mis au point le premier modèle de peau reconstruite endothélialisée diabétique et démontré qu’il reproduit in vitro des caractéristiques importantes associées aux ulcères de pieds diabétiques. Ainsi, ce modèle pourra permettre de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires altérés par le diabète dans la guérison cutanée et servir à cribler des molécules thérapeutiques pour le traitement des plaies chroniques.
IV
Abstract
Skin wound healing is severely compromised in patients with diabetes and can lead to ulcer formation requiring lower limb amputation. Previous studies using cells derived from diabetic patients have been mostly conducted in two-dimensional monolayer cultures, which do not reproduce at all the physiology or the structure of the skin and thus limit the discovery of effective treatments. We propose that a three-dimensional reconstructed skin model made with diabetic cells could be useful to better understand the mechanisms underlying diabetic foot ulcer. Our aim was to asses the efficiency of diabetic reconstructed skin in angiogenesis and reepithelialization, which are two crucial processes of wound healing that are impaired by diabetes.
We have extracted and cultured fibroblasts, keratinocytes and microvascular endothelial cells from skin biopsies taken on the amputated limb of diabetic patients. The cells were seeded on a biomaterial made of chitosan and collagen, which allowed the endothelial cells to form a capillary network and the keratinocytes to form a stratified epidermis. We have shown that coculture of healthy endothelial cells with diabetic fibroblasts in the model led to the formation of a less extensive vascular network compared to culture with healthy fibroblasts. Additionally, in diabetic reconstructed skins, keratinocytes formed a thinner epidermis with an altered histological aspect compared to healthy reconstructed skins. Following the induction of a wound in our model, diabetic keratinocytes were inefficient in achieving reepithelialization.
We have developed the first endothelialized diabetic reconstructed skin, which features important characteristics found in diabetic wounds like a deficiency in the angiogenesis and reepithelialization process. Therefore, this model could be a powerful tool to investigate the cellular and molecular mechanisms leading to chronic wounds and act as a platform to screen therapies to enhance wound healing.
V
Table des matières
Résumé ... III Abstract... IV Table des matières ... V Liste des tableaux ... VII Liste des figures ... VIII Liste des abréviations ... IX Remerciements ... XI Avant-propos ... XII
Introduction ... 1
1.1 La peau ... 1
1.1.1 La peau : la barrière protectrice de l’organisme ... 1
1.1.2 L’épiderme ... 2
1.1.3 Le derme ... 4
1.1.4 L’hypoderme ... 5
1.1.5 La vascularisation cutanée ... 6
1.1.6 L’innervation cutanée ... 7
1.2 La guérison de plaies cutanées ... 9
1.2.1 L’inflammation aiguë ... 9
1.2.2 La régénération des tissus ... 12
1.2.3 Remodelage et contraction de la plaie ... 14
1.3 Le diabète : de l’hyperglycémie à la formation de plaies chroniques ... 15
1.3.1 Le diabète de type 1 et de type 2... 15
1.3.2 Les problèmes vasculaires liés au diabète ... 16
1.3.3 La neuropathie diabétique ... 18
1.4 Les mécanismes altérant la guérison de plaie dans le diabète ... 21
1.4.1 L’inflammation chronique ... 21
1.4.2 La déficience de l’angiogenèse ... 22
1.4.3 Le dysfonctionnement des kératinocytes ... 23
1.4.4 La mémoire glycémique... 25
1.4.5 Les différents traitements possibles... 27
VI
1.5.1 Les modèles animaux ... 29
1.5.2 Les modèles in vitro en deux dimensions ... 32
1.5.3 La modélisation par génie tissulaire ... 33
1.6. Problématiques ... 36
1.7 Hypothèse de recherche ... 37
1.8 Objectifs ... 38
Chapitre 1: Modeling chronic cutaneous wounds with an endothelialized tissue-engineered skin made with diabetic patients-derived cells ... 39
2.1 Résumé ... 40
2.2 Abstract ... 41
2.3 Introduction ... 42
2.4 Method ... 45
2.4.1 Cells isolation and amplification ... 45
2.4.2 Preparation of endothelialized or innervated tissue-engineered dermis ... 46
2.4.3 Preparation of tissue-engineered skins and wound healing assay ... 47
2.4.4 Indirect immunofluorescence and histology ... 48
2.4.5 ELISA ... 49
2.4.6 Quantification of angiogenesis and wound closure ... 49
2.4.7 Statistical analysis ... 50
2.5 Results ... 52
2.5.1 Decreased support of angiogenesis by diabetic fibroblasts ... 52
2.5.2 Diabetic and healthy tissue-engineered dermis both display dense innervation ... 53
2.5.3 Alteration of the histological aspect of the epidermis in diabetic reconstructed skins ... 55
2.5.4 Impaired reepithelialization in diabetic reconstructed skins ... 57
2.5.5 Development of autologous diabetic endothelialized tissue-engineered skins ... 57
2.7 Conclusion ... 62 2.8 Acknowledgement ... 62 2.9 Disclosure Statement ... 62 2.10 References ... 63 2.11 Supplemental figures ... 66 Chapitre 2: Discussion ... 67 Conclusion et perspectives... 71 Références ... 73
VII
Liste des tableaux
Tableau 1.1. Comparaison des différents avantages et inconvénients des principaux modèles utilisés pour l’étude des plaies chroniques diabétiques ... 31
VIII
Liste des figures
Figure 1.1. La structure de la peau ... 1
Figure 1.2. La structure de l’épiderme ... 2
Figure 1.3 Les différents types de fibres nerveuses de la peau ... 8
Figure 1.4. Phases initiales de la guérison de plaie ... 10
Figure 1.5. La formation de nouveaux vaisseaux par angiogenèse ... 13
Figure 1.6. Ulcère de pied diabétique ... 20
Figure 1.7. Résumé des différents mécanismes menant aux plaies chroniques diabétiques 26 Figure 1.8. Développement de modèles 3-D pour l’étude des plaies diabétiques ... 35
Figure 2.1.9Effect of diabetic fibroblasts on angiogenesis in tissue-engineered dermis ... 51
Figure 2.2.0Effect of diabetic fibroblasts on innervation in tissue-engineered dermis ... 53
Figure 2.3.1Histological aspect of diabetic reconstructed skin ... 54
Figure 2.4.2Analysis by immunostaining of the differentiation of the epidermis ... 54
Figure 2.5.3Diabetic tissue-engineered skin potential in reepithelialization ... 56
Figure supplémentaire S1.4Capillaries covered by pericytes in a tissue-engineered dermis66 Figure supplémentaire S2.5Tissue-engineered skin with diabetic endothelial cells, fibroblasts and keratinocytes ... 66
IX
Liste des abréviations
ADN Acide désoxyribonucléique
AGE Produit de glycation avancée (de l’anglais Advanced glycation end-product)
ANGPT-1/2 Angiopoïétine-1, angiopoïétine-2
ARN Acide ribonucléique
ATP Adénosine triphosphate CGRP
DAG DFF/DFK
Peptide relié au gène calcitonine (de l’anglais Calcitonin gene-related peptide)
Diacylglycérol¸
Fibroblaste (DFF) ou kératinocyte (DFK) dérivés de pied diabétique (de l’anglais Diabetic foot-derived fibroblast / keratinocyte)
DFU Ulcère de pied diabétique (de l’anglais Diabetic foot ulcer)
DRG Ganglion de la racine dorsale (de l’anglais Dorsal root ganglion) EGF Facteur de croissance épidermique (de l’anglais Epidermal growth
factor)
FGF
HE/HF/HK
Facteur de croissance des fibroblastes (de l’anglais Fibroblast growth factor)
Cellule endothéliale (HE) / fibroblaste (HF) / kératinocyte (HK) sain (de l’anglais healthy endothelial cell / fibroblast / keratinocyte) HIF-1 Facteur induit par l’hypoxie-1
HUVEC Cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (de l’anglais Human umbilical vein endothelial cell)
IL-1 Interleukine-1
iPSC Cellule souche pluripotente induite (de l’anglais Induced pluripotent stem cell)
KGF Facteur de croissance des kératinocytes (de l’anglais Keratinocyte growth factor)
K1/5/6/10/14/16 Kératines 1, 5, 10, 14, 16
LM-3A32 Forme précurseur, non clivée de la laminine 332, anciennement appelée laminine 5
LM-332 Laminine 332, anciennement appelée laminine 5
MIP-2 Acronyme d’origine anglaise pour Macrophage inflammatory
protein-2
MMP Métalloprotéinase matricielle (de l’anglais Matrix metalloproteinase)
NF-κB Facteur nucléaire kappa B (de l’anglais Nuclear factor-kappa B) NGF Facteur de croissance des nerfs (de l’anglais Nerve growth factor) NG2 Antigène 2 neurone/glie ou sulfate de chondroïtine
NO Monoxyde d’azote
X
PDGF Acronyme d’origine anglaise pour Platelet-derived growth factor PlGF Facteur de croissance placentaire (de l’anglais Placental growth factor) PECAM-1 Acronyme d’origine anglaise pour Platelet endothelial cell adhesion
molecule (aussi appelé CD31)
PKC Protéine kinase C
RAGE Récepteur des produits de glycation avancés (de l’anglais Receptor for advanced glycation end-product)
ROS Dérivés réactifs de l'oxygène (de l’anglais reactive oxygen species)
SD Déviation standard
SEM Erreur type de la moyenne (de l’anglais Standard error of the mean) SMA-α Actine alpha 2 (de l’anglais α-smooth muscle actin)
STZ Streptozotocine
TGF-β1 Facteur de croissance transformant-β1 (de l’anglais Transforming growth factor-β1)
Tie2 Acronyme d’origine anglaise pour tyrosine kinase with
immunoglobulin and EGF homology domains
TNF- α Facteur de nécrose tumorale α (de l’anglais tumor necrosis factor alpha)
TRPV1 Acronyme d’origine anglaise pour Transient receptor potential
vanilloide 1
TUBBIII Beta-tubuline de classe III
VEGF Facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (de l’anglais
Vascular endothelial growth factor)
XI
Remerciements
J’aimerais tout d’abord remercier mon directeur de recherche, Dr François Berthod, qui m’a chaleureusement accueilli dans son laboratoire. Lors de mon parcours, il m’a toujours supporté et encouragé à poursuivre mes idées, ce qui m’a permis de développer mon potentiel
en recherche. Je suis très heureux d’avoir réalisé ma maîtrise dans son laboratoire. Je suis également très reconnaissant envers Sabrina Bellenfant, qui a m’a enseigné
tellement de choses en culture cellulaire et tissulaire. Elle était toujours là pour répondre à mes questions ou me donner un coup de main. Ce fut vraiment plaisant d’avoir un mentor aussi amical pour m’apprendre à travailler en laboratoire. J’aimerais aussi remercier Marie-Josée Beaudet, qui m’a supporté tout le long de ma maîtrise, tant au niveau personnel que professionnel. Je l’admire grandement pour sa grande capacité d’écoute, sa volonté de venir en aide et son esprit scientifique aiguisé qui me donnaient le courage d’avancer dans les moments les plus difficiles. Ma maîtrise n’aurait pas été aussi agréable sans la présence d’Aurélie Louit et d’Alexane Thibodeau, que ça soit pour les fous rires dans le bureau ou à chaque dîner. Je suis chanceux d’avoir eu des amies comme elles dans mon équipe. Merci aussi à tous les autres membres de l’équipe : Rémy Pépin, Todd Galbraith et Chantal Fauvel. L’esprit d’entraide et la bonne humeur qui anime l’équipe me motivait à chaque jour. Je remercie également le Dr Yvan Douville pour ses encouragements et son intérêt envers le projet, lequel n’aurait pas pu être réalisé sans sa précieuse collaboration. Je remercie également le Dr François Gros-Louis et son équipe, en particulier Lydia Touzel Deschênes et Vincent Roy, dont la bonne humeur et la générosité éclairaient mon quotidien.
J’aimerais également remercier ma famille, spécialement ma mère et mon père, Claire Bérard et Jean De Serres, qui continuent à me supporter au quotidien. Merci aussi à mon amoureuse, Lydia Guay, qui m’a accompagné autant pour les beaux moments que pour les défis que j’ai traversés, et qui m’apporte beaucoup de bonheur à chaque jour.
Je remercie aussi le Dr Lucie Germain et le Dr François Auger, qui ont permis le développement du centre de recherche LOEX. Enfin, merci à toute l’équipe du LOEX, qui m’a offert un environnement de travail stimulant et agréable lors de ma maîtrise.
XII
Avant-propos
L’étude présentée dans le cadre de ce mémoire visait à développer un nouveau modèle tridimensionnel de peau reconstruite pour mieux comprendre comment le diabète altère la guérison de plaie. Grâce à une collaboration avec le chirurgien vasculaire Yvan Douville, il a été possible d’extraire des cellules provenant de biopsies de peau prélevées sur le membre amputé de patients diabétiques pour produire les premiers substituts cutanés diabétiques endothélialisés, qui pourraient éventuellement permettre le criblage de nouvelles thérapies.
L’introduction de ce mémoire vise à présenter pourquoi la complexité et l’aspect multifactoriel des ulcères diabétiques rendent cette pathologie aussi difficile à traiter et donne un aperçu sur les modèles actuellement utilisés pour l’étude de cette maladie. Cette partie abordera également la problématique qui nous a amené à émettre l’hypothèse selon laquelle un modèle de peau reconstruite à partir de cellules diabétiques serait un atout majeur pour l’étude des plaies chroniques. Le chapitre 1 présente un article de recherche original rédigé en anglais présentant des résultats obtenus lors de ma maîtrise ainsi que leurs analyses. Le manuscrit s’intitule « Modeling chronic cutaneous wounds with an endothelialized tissue-engineered skin made with diabetic patients-derived cells ». J’en suis le premier auteur et les autres sont, dans l’ordre, Sabrina Bellenfant, Marie-Josée Beaudet, Yvan Douville et François Berthod. Certaines expériences restent toutefois à faire avant de soumettre l’article à un journal de recherche évalué par les pairs. J’ai planifié le protocole de recherche sous la supervision de mon directeur de recherche François Berthod. J’ai aussi réalisé l’ensemble des expériences et effectué les analyses. Sabrina Bellenfant et Marie-Josée Beaudet m’ont fourni une assistance technique pour certaines expériences. Yvan Douville a opéré les patients diabétiques qui ont subi une amputation et a récolté les biopsies de peau qui ont servies aux expériences. Marie-Josée Beaudet et François Berthod ont révisé le manuscrit, dont la version finale a été approuvée par François Berthod. Le chapitre 2 est une discussion qui présente l’analyse des résultats obtenus en les mettant en contexte dans la littérature. Il présente également les forces et les limites de l’étude, ainsi que certaines perspectives qui seraient intéressantes pour le développement du projet.
1
Introduction
1.1 La peau
1.1.1 La peau : la barrière protectrice de l’organisme
La peau constitue la première barrière naturelle de l’organisme qui le protège de l’environnement extérieur, empêchant notamment l’infiltration de corps étrangers et limitant les pertes d’eau [1]. En raison de ce rôle primordial, cet organe est spécialisé pour
guérir rapidement en réponse aux différentes agressions auxquelles il est exposé.
Figure 1.1. La structure de la peau. La peau est constituée de trois couches soit l’épiderme, le
derme et l’hypoderme. Le derme peut lui-même être divisé en une couche papillaire et une couche réticulaire. La peau est vascularisée et possède deux plexus de vaisseaux sanguins, dont l’un est dermique et l’autre sous-papillaire. Cet organe est également innervé par des fibres sensorielles ayant des extrémités libres ou couplées à un mécanorécepteur. D’autres structures sont également annexées à la peau comme les poils, les glandes sébacées et les glandes sudoripares. Reproduit avec permission de Anatomie et physiologie humaine 5ème édition Pearson ERPI (Marieb Elaine, 2015).
2
La peau exerce également des fonctions importantes au niveau immunitaire en constituant une première ligne de défense contre les pathogènes et en participant à l’établissement de la tolérance immunitaire, qui permet de ne pas répondre agressivement à des antigènes inoffensifs [2]. Elle permet aussi de conserver la température corporelle, de percevoir l’environnement par l’intermédiaire de la sensation du toucher et de détecter les dangers potentielles grâce à la perception de la douleur. La peau est composée d’une superposition de plusieurs couches, soit l’épiderme, le derme et l’hypoderme, dans lesquelles s’insèrent des annexes cutanées comme les poils ou les glandes sudoripares (Figure 1.1).
1.1.2 L’épiderme
L’épiderme est la couche la plus superficielle de la peau. Elle est composée majoritairement de kératinocytes, qui forment un épithélium stratifié et kératinisé dans lequel on retrouve quatre couches distinctes : le stratum basale, le stratum spinosum, le stratum granulosum et le stratum corneum (Figure 1.2) [3].
Figure 1.2. La structure de l’épiderme. L’épiderme est constitué de plusieurs couches de
kératinocytes qui, en partant du derme, se nomment le stratum basale, le stratum spinosum, le stratum granulosum et le stratum corneum. Reproduit avec permission de [3], Copyright Association for Professionals in Infection Control and Epidemiology.
3
Au niveau du stratum basale, on retrouve une couche unique de kératinocytes qui sont liés à la membrane basale à la jonction du derme et de l’épiderme. Les cellules de cette couche basale sont prolifératives et se distinguent par l’expression de filaments intermédiaires de kératine spécifiques, comme les kératines 5 et 14 (K5 et K14). Au fur et à mesure que les kératinocytes se divisent, les nouvelles cellules générées sont poussées vers le haut où elles entament un processus de différenciation, perdant leur capacité proliférative dès la deuxième couche de cellules, au niveau du stratum spinosum. Les kératinocytes arrivant aux couches suprabasales diminuent l’expression de K5 et K14 et commencent plutôt à exprimer les kératines 1 et 10 (K1 et K10) [4]. Les kératinocytes du stratum spinosum ont
une forme plutôt cubique et commencent à produire certains précurseurs protéiques comme l’involucrine [5]. Les cellules du stratum granulosum, pour leur part, se distinguent par la
présence de grains de kératohyaline et de granules lamellaires, ainsi que par l’expression de marqueurs tardifs de différenciation comme la loricrine [6]. Au cours de la formation de la couche cornée, les kératinocytes perdent leur noyau, s’aplatissent et meurent, devenant ainsi des cornéocytes [7, 8]. Les grains de kératohyaline dispersent leur contenu dans le cytoplasme et libèrent un précurseur menant à la formation de filaggrine, qui participe à l’élaboration d’une matrice fibreuse dans les cornéocytes. Une enzyme appelée transglutaminase catalyse la formation de liaisons peptidiques entre des précurseurs précédemment produits comme l’involucrine et la loricrine, ce qui mène à la formation d’une enveloppe cornée autour des cornéocytes. Enfin, le contenu des granules lamellaires, constitué principalement de lipides, est déversé dans l’espace intercellulaire où il agit comme un ciment liant les cornéocytes. Ainsi, la différenciation des kératinocytes mène à la formation d’une couche cornée semi-perméable qui assure une protection physique efficace contre l’extérieur. Au fur et à mesure que les kératinocytes prolifèrent, les cellules mortes de la couche cornée desquament. La peau est donc un organe qui se renouvelle constamment, se regénérant complètement au bout d’environ 40 à 56 jours [9].
Les trois autres types cellulaires majoritairement présents dans l’épiderme sont les mélanocytes, les cellules de Langerhans et les cellules de Merkel. Les mélanocytes se retrouvent principalement au niveau de la couche basale et possèdent des granules pigmentés contenant de la mélanine, ce qui donne une coloration à la peau et permet de la protéger contre les rayons ultraviolets du soleil. Les mélanocytes peuvent d’ailleurs transférer la
4
mélanine aux kératinocytes adjacents [10]. Les cellules de Langerhans, pour leur part, constituent un sous-type de cellules dendritiques qui, à l’aide de prolongements, capturent et présentent des antigènes aux lymphocytes, jouant ainsi un rôle important dans le système immunitaire [11]. Enfin, les cellules de Merkel forment l’organe de Merkel, un mécanorécepteur sensible à la pression et participant au sens du toucher [12].
1.1.3 Le derme
Le derme est la couche de tissu conjonctif localisée juste au-dessous de l’épiderme. Cette zone peut elle-même être divisée en deux autres couches, soit le derme papillaire et le derme réticulaire (Figure 1.1). Le derme papillaire est situé directement en dessous de la membrane basale qui sépare le derme de l’épiderme. Il tire son nom dû au fait que sa surface forme des saillies qui s’imbriquent entre les prolongements de l’épiderme. Le derme papillaire est richement vascularisé et innervé. Il possède aussi une matrice plus lâche alors que le derme réticulaire, qui est situé plus profondément et qui est en contact avec l’hypoderme. Dans le derme, les cellules sont entourées de matrice extracellulaire, principalement des fibres de collagène de type I et III [13]. Le collagène compose d’ailleurs environ 70% du poids sec du derme et lui confère une certaine résistance mécanique. La présence de fibres élastiques comme les élastines ou des microfibrilles confère une bonne souplesse au derme, permettant ainsi à la peau de s’étirer dans une certaine mesure.
Les fibres de collagène ou élastiques sont assemblées et déposées par les fibroblastes, qui représentent le principal type cellulaire du derme. En plus de synthétiser, dégrader et remodeler la matrice extracellulaire, les fibroblastes possèdent d’autres rôles assez diversifiés, intervenant par exemple dans la guérison de plaie et le maintien de l’homéostasie de la peau. Entre autres, les fibroblastes sont importants pour supporter la différenciation et la prolifération des kératinocytes par le maintien de la matrice extracellulaire, notamment au niveau de la membrane basale, et par la sécrétion de facteurs paracrines [14]. À cause de
l’absence de marqueurs spécifiques, les fibroblastes forment une famille très hétérogène composée de plusieurs sous-populations. Par exemple, les fibroblastes papillaires se distinguent des fibroblastes réticulaires au niveau de la sécrétion de matrice extracellulaire
5
ou l’expression de cytokines [15]. Une troisième sous-population de fibroblastes est associée
aux follicules pileux et est impliquée dans leur genèse.
En plus de réguler la croissance des poils, qui exercent une fonction de protection et contribue aux sensations tactiles, les follicules pileux constituent une niche pour les cellules souches de l’épiderme et jouent un rôle important lors de la régénération de la peau [16]. D’autres structures sont également insérées dans le derme comme les glandes sébacées ou sudoripares. Les glandes sébacées, qui sont annexées aux poils, sécrètent du sébum qui forme un mince film lipidique sur la peau et la protège du dessèchement, lubrifie les poils et participe à la défense contre les microorganismes par son action bactéricide [17]. Les glandes sudoripares exercent plutôt un rôle dans la sécrétion de sueur afin de contribuer à la thermorégulation du corps [18]. Enfin, le derme est également vascularisé et innervé, en plus
de constituer le lieu de résidence temporaire ou permanent de nombreuses cellules immunitaires.
1.1.4 L’hypoderme
L’hypoderme est la couche la plus profonde de la peau et est localisé juste en dessous du derme (Figure 1.1), reliant celui-ci à la membrane fibro-élastique qui recouvre les muscles et les os (le fascia) [13]. En fait, plusieurs auteurs ne considèrent pas l’hypoderme comme faisant partie intégrante de la peau [19], malgré le fait que sa délimitation avec le derme n’est pas évidente. L’hypoderme est composé de tissus conjonctifs aréolaires et de tissus adipeux richement vascularisés. Les adipocytes dans cette couche sont de petites tailles et forment des lobules permettant de faire des réserves de graisse. Ces cellules jouent donc un rôle important dans l’équilibre énergétique. Ils permettent aussi à l’hypoderme d’agir comme un coussin en amortissant les chocs. La perception des tissus adipeux a beaucoup changé au cours des dernières années, alors que leur rôle dans le maintien de l’homéostasie et la régénération des tissus se fait de plus en plus remarquer. Par exemple, les tissus adipeux ont été identifiés comme étant un acteur important pour la guérison des plaies, soit par la sécrétion de facteurs favorisant la prolifération des autres cellules ou en agissant comme une source de cellules souches [20, 21]. Les tissus adipeux remplissent également des fonctions
6
endocrines, par exemple par l’intermédiaire de la sécrétion de leptine, une hormone qui régule le métabolisme énergétique [22].
1.1.5 La vascularisation cutanée
Dans la peau, seul le derme et l’hypoderme sont vascularisés, alors que l’épiderme ne l’est pas. Ainsi, une plaie superficielle touchant seulement l’épiderme ne provoquera pas de saignement. Les artérioles acheminant le sang vers la peau forment deux plexus principaux, dont l’un est situé au niveau du derme papillaire alors que l’autre est situé près de la jonction entre l’hypoderme et le derme (Figure 1.1) [23]. À partir du plexus papillaire se forme des
boucles de capillaires qui se prolongent dans les papilles dermales afin de nourrir l’épiderme par imbibition. Les différents types de vaisseaux retrouvés dans la peau peuvent être distingués selon leur structure. Les artères et les artérioles dermiques sont composés de trois couches, soit l’intima, qui est la couche la plus interne et qui est constituée de cellules endothéliales, la media, qui est constituée de cellules musculaires lisses, et l’adventice, qui est constituée de fibroblastes et de fibres de collagène [24, 25]. Les veines et les veinules du derme possèdent une structure similaire, mais ils se distinguent par quelques différences morphologiques comme une paroi musculaire plus mince et la présence de valves prévenant le renflouement du sang.
Les capillaires ferment la boucle entre les artérioles et les veinules. C’est au niveau des capillaires que s’effectuent les échanges de nutriments et d’oxygène entre les organes et la circulation sanguine et c’est pourquoi ces vaisseaux sont plus minces et constitués que d’une seule couche de cellules endothéliales. Les cellules endothéliales des capillaires sont également entourées d’une membrane basale et par des cellules murales appelées péricytes. Les péricytes peuvent provenir de plusieurs sources, mais ils sont généralement d’origine mésenchymateuse et il a été montré qu’ils peuvent provenir de la transdifférenciation de fibroblastes dermiques recrutés au niveau des capillaires [26]. Ce type cellulaire remplie plusieurs fonctions contribuant à la régulation de la croissance et de la fonction des cellules endothéliales, jouant ainsi un rôle important au niveau du développement vasculaire. Les cellules endothéliales expriment la Platelet endothelial cell adhesion molecule (PECAM-1
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ou CD31) [27], ce qui permet de marquer spécifiquement les capillaires dans les tissus avec des anticorps afin de les observer en microscopie à fluorescence. Les péricytes, pour leur part, peuvent être marqués spécifiquement à l’aide de plusieurs marqueurs, dont le sulfate de chondroïtine (NG2) [28]. La peau contient aussi des capillaires lymphatiques, qui drainent le liquide interstitiel vers la circulation sanguine en plus de jouer un rôle dans la défense immunitaires en dirigeant les leucocytes et les antigènes vers les ganglions lymphatiques, contribuant ainsi au fonctionnement du système immunitaire adaptatif. La structure des capillaires lymphatiques se distingue des capillaires sanguins sur plusieurs plans, par exemple par une membrane basale moins développée et l’absence de péricytes [29].
1.1.6 L’innervation cutanée
Étant donné qu’elle est en contact avec l’environnement, la peau est un organe sensoriel important. L’innervation cutanée permet de percevoir les stimuli extérieurs grâce à la sensation du toucher et aussi d’éviter les blessures grâce à la perception de la douleur ou de la température. Les corps cellulaires des neurones sensoriels qui innervent l’ensemble de la peau sauf le visage sont situés dans les ganglions de la racine dorsale (DRGs) de la moelle épinière. Ceux-ci projettent des axones qui peuvent traverser l’hypoderme, le derme et même se rendre jusqu’à l’épiderme [30]. Dans le système nerveux périphérique, il existe quatre
principaux types de fibres nerveuses qui varient selon la taille et selon la présence d’une gaine de myéline [31]. Tout d’abord, il y a les fibres de type A⍺, qui sont myélinisées et ont
un large diamètre d’environ 13 et 20 μm. Les fibres de type A⍺ s’occupent d’acheminer les signaux concernant la proprioception des muscles squelettiques [32]. Les fibres de type Aβ,
qui ont un diamètre d’environ 6 à 12 μm, acheminent l’information du toucher, de la pression et de la vibration [33]. En effet, cette sous-classe de fibres est reliée à différents types de
mécanorécepteurs localisés dans le derme ou l’épiderme comme les corpuscules de Pacini, de Ruffini ou les disques de Merkel (Figure 1.3). Chaque type de mécanorécepteur se distingue par leur capacité d’adaptation à un signal ou par la taille de leur champs récepteur. Les fibres de type Aδ, d’environ 1 à 5 μm de diamètre, signalent la douleur et la température, tout comme les fibres de type C, qui ont toutefois un diamètre plus petit d’environ 0,2 à 1,5 μm. Autant les fibres de type Aδ et de type C possèdent des extrémités libres avec des senseurs multimodaux, c’est-à-dire qu’ils peuvent percevoir différents types de stimuli,
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autant chimiques que mécaniques. Toutefois, les fibres Aδ répondent rapidement à des douleurs aiguës, alors que les fibres C répondent un peu plus tardivement.
D’ailleurs, les fibres C représentent la classe dominante dans la peau et, contrairement aux autres classes, ne sont pas myélinisées, ce qui contribue à leur réponse plus lente. En effet, la gaine de myéline, qui est produite par les cellules de Schwann dans le système nerveux périphérique, permet d’isoler électriquement les axones. Ainsi, plus les fibres ont un large diamètre et plus elles sont myélinisées, plus elles conduisent le signal rapidement (Figure 1.3). Les réseaux de fibres nerveuses dans la peau peuvent être détectés grâce à un marquage avec une protéine spécifiquement exprimée par les neurones, la beta-tubuline de classe III [34].
Figure 1.3 Les différents types de fibres nerveuses de la peau. (A) Les fibres Aβ sont
principalement responsables du sens du toucher et sont reliés à des mécanorécepteurs comme les disques de Merkel. Les fibres de type Aδ et de type C, pour leur part, ont des terminaisons libres et sont principalement responsables de la perception de la douleur et de la température. (B) En général, plus les fibres nerveuses sont myélinisées et ont un diamètre large, plus elles conduisent le signal rapidement. Reproduits avec la permission de [31] et de [32]. Copyright European Union 2013 pour (A) et copyright Springer Nature pour (B).
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1.2 La guérison de plaies cutanées
1.2.1 L’inflammation aiguë
La guérison des plaies cutanées est un processus complexe et finement régulé dans le temps permettant à la peau de se régénérer rapidement à la suite d’une lésion afin de recouvrer sa fonction de barrière. De façon générale, on distingue trois étapes se chevauchant dans le temps et qui mènent à la guérison de la plaie, soit l’inflammation aiguë, la régénération des tissus et le remodelage de la plaie. L’inflammation aiguë permet au corps de réagir immédiatement à l’endommagement des tissus et de prévenir l’infection par des agents pathogènes. À la suite d’une lésion de l’épiderme, les kératinocytes en bordure de la plaie relarguent rapidement de l’interleukine-1 (IL-1), qui est produit à l’avance et contenu dans la cellule [35, 36]. Les kératinocytes sécrètent également le facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α) qui, de concert avec l’IL-1, va entraîner des cascades de réactions pro-inflammatoires activant les kératinocytes eux-mêmes ainsi que d’autres types cellulaires, comme les fibroblastes.
Le système nerveux est également un acteur important lors de la guérison de plaies, étant donné que les fibres nerveuses de types Aδ et C peuvent percevoir et signaler rapidement la douleur. Par exemple, les fibres peptidergiques de type C peuvent être activées à la suite de l’activation ou de la sensibilisation de certains récepteurs comme le transient receptor potential vanilloide 1 (TRPV1) en réaction à plusieurs substances libérées lors de l’endommagement des tissus comme la bradykinine, l’adénosine triphosphate (ATP) ou des ions H+ [37]. L’activation de ces récepteurs dans les fibres nerveuses va permettre l’entrée d’ions comme le Ca2+ et ainsi déclencher la dépolarisation du neurone sensoriel. Cela aura
pour effet de signaler la douleur au cerveau, mais va aussi entraîner la sécrétion de neuropeptides comme la substance P et le peptide relié au gène calcitonine (CGRP) par les terminaisons nerveuses dans la peau. Ces neuropeptides peuvent activer les cellules immunitaires et provoquer la vasodilation des vaisseaux sanguins, déclenchant un processus appelé inflammation neurogène [38].
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Figure 1.4. Phases initiales de la guérison de plaies. (A) Lorsque la peau est endommagée,
la fuite de sang par les vaisseaux sanguins va mener à la formation d’un caillot de fibrine, qui protège temporairement la plaie et forme une matrice permettant la migration des cellules. La première phase de la guérison de plaie est l’inflammation aiguë. D’abord les neutrophiles, puis les macrophages migrent sur le site de la plaie afin de combattre les agents pathogènes. Au jour 3, les macrophages sécrètent des facteurs de croissance et initient de cette façon la transition vers la deuxième phase de la guérison, la régénération des tissus. (B) Au jour 5, les fibroblastes sécrètent une matrice extracellulaire lâche qui forme un tissu de granulation, dans lequel des capillaires se forment par angiogenèse. Pendant ce temps, les kératinocytes initient le processus de reépithélialisation et migrent en dessous du caillot sanguin pour progresser sur le lit de la plaie. Reproduit avec permission de [39], Copyright Massachusetts Medical Society.
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En général, les lésions importantes provoquent des dommages aux vaisseaux sanguins et entraînent subséquemment une fuite de sang. Le clivage du fibrinogène contenu dans le sang par la thrombine résulte en la formation d’un réseau de protéines fibreuses, la fibrine, et d’un caillot sanguin (Figure 1.4, A) [40]. Ce caillot forme une première barrière
temporaire prévenant l’infiltration de contaminants additionnels sur le site de la plaie et procure une matrice favorisant la migration de cellules immunitaires. De plus, les plaquettes contenues dans le caillot vont dégranuler et sécréter de nombreuses cytokines et facteurs de croissances [39]. La combinaison de ce cocktail sécrété par les plaquettes et du signal provenant de cellules endommagées ou activées, comme les fibroblastes, va agir comme signal chimiotactique pour attirer les cellules immunitaires circulantes. Les neutrophiles constituent le premier type de leukocyte qui arrivent au site de la plaie afin de combattre rapidement les pathogènes qui se sont infiltrés en les phagocytant ou en relarguant des peptides anti-microbiens [41]. Ils s’infiltrent au niveau de la plaie grâce à un changement au niveau de l’expression de molécules d’adhésion à la surface des cellules endothéliales qui facilitent la diapédèse, c’est-à-dire l’insinuation entre les cellules endothéliales.
Les monocytes vont également migrer au site de la lésion et vont devenir la population de cellules migratrices dominante entre environ 2 et 4 jours suite à la blessure [41]. Sur le site de la lésion, les monocytes se différencient en macrophage, qui phagocytent activement les pathogènes restants ainsi que les débris. Durant les phases initiales de la guérison cutanée, les macrophages se polarisent principalement en type pro-inflammatoire M1 en réponse à des signaux associés aux pathogènes ou aux tissus endommagés [42]. Alors que la guérison progresse, les macrophages commencent à se polariser majoritairement en type M2, qui favorise plutôt la résolution de l’inflammation. Les macrophages de type M2 vont sécréter une grande quantité de facteurs de croissance, comme le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) et le platelet-derived growth factor (PDGF), qui initient la formation du tissu de granulation. Ainsi, les macrophages semblent être le pivot qui permet la transition vers la phase suivante de la guérison de plaie, soit la régénération des tissus.
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1.2.2 La régénération des tissus
L’épiderme et le réseau microvasculaire cutané sont deux composantes qui doivent se régénérer rapidement à la suite d’une lésion afin de restaurer la fonction protectrice de la peau et fournir l’apport en sang nécessaire à sa régénération. Environ 4 jours après la blessure, le tissu de granulation commence à se former [39]. Il est constitué d’une matrice extracellulaire lâche fournissant un support à la migration des cellules et dans lequel de nombreux capillaires se forment, lui donnant un aspect granuleux (Figure 1.4, B). Lors du processus de guérison de plaie, les nouveaux vaisseaux sanguins sont formés principalement par angiogenèse, c’est-à-dire par bourgeonnement à partir du réseau vasculaire préexistant. La blessure induit un état d’hypoxie dans la peau qui active le facteur induit par l’hypoxie-1 (HIF-l’hypoxie-1), un facteur de transcription qui mène à une augmentation de l’expression de VEGF
[43], entre autres chez les macrophages et les fibroblastes [44, 45]. Le VEGF, de concert avec
d’autres facteurs pro-angiogéniques, stimule la formation d’un réseau microvasculaire désorganisé ayant un nombre de capillaires encore plus élevé que dans la peau normale [46]. Par la suite, des facteurs de maturation comme le PDGF vont être produits, ce qui va favoriser la stabilisation des vaisseaux nouvellement formés, notamment par le biais du recrutement de péricytes. Les vaisseaux surnuméraires et non stables vont se défaire sous l’action de facteurs anti-angiogéniques produits plus tardivement, lorsque le tissu sera de nouveau en état de normoxie. Ainsi, l’angiogenèse est un processus complexe qui comprend à la fois la formation de nouveaux vaisseaux mais inclue aussi les étapes d’élagage et de maturation permettant la formation d’un réseau vasculaire fonctionnel (Figure 1.5) [46].
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Figure 1.5. La formation de nouveaux vaisseaux par angiogenèse. À la suite de
l’endommagement du tissu, des facteurs pro-angiogéniques sont relargués et facilitent la perte de péricytes ainsi que le bourgeonnement de nouveaux vaisseaux à partir du réseau vasculaire existant. Plus tard, les vaisseaux surnuméraires et moins fonctionnels s’effondrent sous l’effet de facteurs anti-angiogéniques, alors que les autres deviennent matures et se stabilisent, par exemple via le recrutement de péricytes. Reproduit avec permission de [46], Copyright Uzoagu A. Okonkwo et Luisa A. DiPietro.
Parallèlement au processus d’angiogenèse, les kératinocytes entreprennent le processus de reépithélialisation environ 12 heures après l’induction de la plaie [47]. Suivant leur activation par l’IL-1, le TNF-a et aussi par le facteur de croissance épidermique (EGF), les kératinocytes en bordure de la plaie perdent leur adhésion à la membrane basale grâce au désassemblage des hémidesmosomes ainsi qu’aux autres cellules à cause du désassemblage des desmosomes [35]. Les kératinocytes activés pour la migration expriment la paire de kératine 6 (K6) et kératine 16 (K16). Un changement au niveau de l’expression de protéines de la famille des intégrines module leur adhésion à la matrice extracellulaire et leur permet de migrer sur le lit de la plaie [48]. Les kératinocytes sur le bord de l’épiderme lésé sécrètent une forme précurseur de la laminine 332 (LM-3A32) qui est clivée rapidement dans le milieu extracellulaire pour devenir une forme courte (LM-332) à laquelle l’intégrine α6β4 des kératinocytes peut se lier pour leur permettre de s’ancrer à la membrane basale et progresser sur le lit de la plaie [49]. L’expression de protéases dégradant la matrice comme les
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matrice du caillot sanguin afin de pouvoir migrer en dessous (Figure 1.4, B) [40]. L’innervation cutanée pourrait potentiellement directement favoriser la prolifération et la migration des kératinocytes par la sécrétion de neuropeptides comme la substance P et le CGRP et ainsi contribuer à la reépithélialisation des plaies [50, 51]. Lorsque les kératinocytes ont refermé la blessure, ils recommencent à suivre leur programme de différenciation classique visant à reformer une couche cornée.
1.2.3 Remodelage et contraction de la plaie
Environ une semaine après la formation de la lésion, la plaie est envahie par des fibroblastes qui, sous l’effet de molécules présentes dans le milieu comme le facteur de croissance transformant-β1 (TGF-β1) et des forces mécaniques résultant d’une augmentation de la rigidité de la matrice, vont se différencier en myofibroblastes [52]. Les myofibroblastes
sont souvent comparés à des cellules musculaires, car ils expriment l’actine alpha 2 (SMA-α) et ils sont capables de générer une force contractile. Ils participent ainsi activement à la contraction du derme, qui permet de rapprocher les bordures de la plaie [40]. Une fois que la
plaie est fermée et qu’elle devient une cicatrice, les myofibroblastes disparaissent du tissu, probablement en mourant par apoptose [53]. Une activité trop grande ou persistante des myofibroblastes peut mener à une fibrose ou une cicatrice hypertrophique. Les fibroblastes sécrètent à la fois des protéases comme les MMPs qui dégradent la matrice provisoire produite au début de la guérison et synthétisent une nouvelle matrice. Ainsi, l’ancienne matrice du tissu de granulation, qui avait une plus grande proportion de collagène de type III, est remodelée et remplacée graduellement par une matrice qui contient plus de collagène de type I bien organisé en faisceau et formant beaucoup de liens croisés entre les fibres [54]. L’étape du remodelage permet au tissu d’avoir une plus grande résistance mécanique ainsi qu’une matrice plus semblable à celle retrouvée dans la peau intacte. Le processus de remodelage de la matrice peut prendre une période de temps relativement longue, allant jusqu’à plusieurs semaines.
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1.3 Le diabète : de l’hyperglycémie à la formation de
plaies chroniques
1.3.1 Le diabète de type 1 et de type 2
Le diabète sucré, souvent appelé simplement diabète, est une maladie métabolique qui se caractérise par une incapacité à réguler le niveau de glycémie dans le sang et par une sécrétion anormale d’insuline. Cette hormone peptidique a pour fonction principale de favoriser l’absorption du glucose du sang par les organes, en particulier les cellules musculaires et les tissus adipeux, et de contrôler le métabolisme des lipides, des glucides et des protéines. Le relargage de l’insuline entreposé dans les granules des cellules β localisées dans les îlots de Langerhans du pancréas permet de réguler et de répondre à une augmentation rapide en glucose dans le sang, par exemple suite à l’ingestion de nourriture [55].
Le mécanisme de la régulation du niveau de glucose sanguin est altéré dans les deux formes de diabète les plus fréquentes, soit le diabète de type 1 et de type 2. Dans les deux cas, l’hyperglycémie est la principale source de complications pour le patient, mais les causes sont différentes. Le diabète de type 1 est causé par la destruction des îlots de cellules β du pancréas, la plupart du temps par des mécanismes auto-immunitaires [56]. Le diabète de type 2 est plutôt causé par une résistance de l’organisme à l’insuline ainsi que par des anomalies variables de la sécrétion d’insuline par le pancréas [57]. En général, au début de la maladie, le pancréas va sécréter de plus en plus d’insuline pour contrer la résistance périphérique à cette hormone, ce qui a pour effet de contribuer à la prise de graisse. Plus tardivement, les cellules des îlots β vont s’épuiser et dégénérer, menant à une diminution de la production d’insuline
[58]. Les mécanismes menant au développement du diabète de type 1 et de type 2 ne sont pas
encore totalement élucidés, mais résulteraient d’interactions complexes entre des facteurs génétiques et environnementaux [59]. Dans la plupart des cas de diabète de type 1, il y a une
forte composante génétique avec une prévalence familiale qui rend les individus susceptibles de développer la maladie à la suite de l’exposition à certains facteurs environnementaux [56]. Pour sa part, le développement du diabète de type 2 est favorisé de façon assez importante
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par certains facteurs comme un mode de vie sédentaire, l’inactivité physique et l’obésité [60]. Cette forme de la maladie est d’ailleurs la plus fréquente, comptant pour environ 90,4 % des cas alors que le type 1 constitue environ 9,5% des cas, selon une étude menée au Royaume-Unis [61]. Le changement du style de vie accompagnant la modernisation de la société au cours des dernières années a contribué à donner des proportions pandémiques au diabète, qui touche présentement environ 415 millions de personnes dans le monde [62]. Le principal moyen de traiter le diabète consiste à réguler de façon assidu la glycémie dans le sang, idéalement le plus tôt possible dans le développement de la maladie. La metformine est un médicament oral souvent utilisé pour diminuer la résistance à l’insuline chez les diabétiques de type 2 [63], alors que le diabète de type 1 est principalement traité par l’injection régulière d’insuline pour compenser la déficience de la sécrétion endogène [64].
1.3.2 Les problèmes vasculaires liés au diabète
Le diabète contribue au développement de nombreuses complications au niveau systémique, dont les plus importantes sont microvasculaires ou macrovasculaires [65]. En effet, parmi les complications les plus fréquentes et les plus graves causées par le diabète figurent la rétinopathie, la néphropathie et les complications cardiovasculaires. La rétinopathie diabétique consiste en une augmentation anormale de la perméabilité des vaisseaux sanguins de la rétine, ce qui entraîne la formation d’œdèmes, des lésions à la rétine et une baisse de la vision [66]. Les rétinopathies diabétiques sont souvent considérées comme la plus grande cause de cécité [67]. Pour sa part, la néphropathie diabétique est l’une des plus
grande cause d’insuffisance rénale chronique [68]. L’hyperglycémie provoque des dommages
à la barrière de filtration des glomérules du rein et nuit à sa fonction de filtration du sang, ce qui se traduit, par exemple, par une quantité élevée de protéines dans l’urine [69]. Malgré la
gravité des rétinopathies et des néphropathies diabétiques, ce sont les complications cardiovasculaires, comme les accidents vasculaires cérébraux ou les maladies coronariennes, qui sont la principale cause de mortalité et de morbidité dans les deux types de diabète [70]. Ces problèmes macrovasculaires se développeraient souvent plus tôt dans la maladie alors que le seuil de glycémie est encore bas [71], et semblent associés de façon majeure à des facteurs autres que l’hyperglycémie. Par exemple, la résistance à l’insuline dans le diabète de type 2 augmente le relargage d’acide gras dans le sang par les tissus adipeux [72]. Ce
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phénomène appelé dyslipidémie contribue à l’athérosclérose, soit l’apparition de plaques dans les vaisseaux sanguins qui favorisent les accidents vasculaires.
Au contraire, les problèmes microvasculaires associés au diabète semblent majoritairement influencés par le niveau et la durée de l’hyperglycémie, révélant un rôle plus pondérant de ce facteur dans ce type de complication [73]. L’hyperglycémie peut en effet mener à une dysfonction endothéliale en perturbant le métabolisme de plusieurs façons. Par exemple, une concentration plus élevée en sucre dans le sang accélère une réaction naturelle et non-enzymatique appelée glycation, qui entraîne la formation de liens croisés entre des sucres réducteurs et le groupement amine de protéines, d’acides nucléiques ou de lipides. Ce processus mène à la formation de produits délétères appelés produits de glycation avancée (AGEs) qui altèrent la fonction des cellules endothéliales en favorisant l’activation de voies de signalisation inflammatoires comme la voie du facteur nucléaire kappa B (NF-κB), par l’induction de stress oxydatif et en augmentant la perméabilité vasculaire [74-77]. Ces effets
peuvent être causés par une perte de la fonction des protéines glyquées ou encore être le résultat de l’activation du récepteur des AGEs (RAGE). La glycation de la matrice extracellulaire peut également augmenter la rigidité de la paroi des vaisseaux sanguins [45, 78]. De plus, l’hyperglycémie favorise l’activation d’autres voies biochimiques comme la voie des polyols ou celle de la protéine kinase C (PKC). La voie des polyols provoque la réduction du glucose en sorbitol grâce à l’enzyme aldose réductase. La suractivation de cette voie lors de l’hyperglycémie pourrait provoquer des dommages aux cellules endothéliales en menant à une accumulation de sorbitol et en causant un stress oxydatif [79]. L’hyperglycémie accroit la production de diacylglycérol (DAG) dans les tissus vasculaires, ce qui mène à une augmentation de l’activité de la PKC. La suractivation de cet enzyme chez les diabétiques aurait des conséquences très variées comme une augmentation de l’épaisseur de la membrane basale des vaisseaux ainsi qu’une augmentation de leur perméabilité [80]. Enfin, les réactifs oxydatifs produits par l’hyperglycémie entraineraient une dégradation accrue ou l’inactivation du monoxyde d’azote (NO), un gaz sécrété par les cellules endothéliales afin de relâcher les muscles lisses et permettre la dilatation des vaisseaux. Ainsi, les cellules endothéliales en contexte diabétique aurait de la difficulté à induire une vasodilatation efficace lorsque cela est nécessaire [81]. Les effets multiples et complexes de l’hyperglycémie
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ne sont pas encore bien élucidés, mais les cellules endothéliales sont définitivement l’un des types cellulaires le plus affecté par ces mécanismes, peut-être à cause de leur contact direct avec le sang et sa concentration élevée en glucose lors du diabète.
1.3.3 La neuropathie diabétique
La déficience du réseau microvasculaire est considérée comme l’un des principaux facteurs menant au développement d’une neuropathie périphérique, c’est-à-dire une diminution de l’innervation cutanée. Par exemple, il a été observé dans des biopsies de nerf provenant de patients diabétiques souffrant de neuropathie que la membrane basale des vaisseaux sanguins étaient plus épaisse et que leur lumen était plus petit, ce qui pourrait contribuer à une plus faible capacité à diffuser l’oxygène ainsi qu’à induire un état d’hypoxie défavorable pour les nerfs [82]. Chaque regroupement de fibres nerveuses est entouré d’une
enveloppe protectrice, le périnèvre. Seulement quelques vaisseaux sanguins traversent cette enveloppe et forment un réseau microvasculaire plus clairsemé, ce qui pourrait expliquer pourquoi les nerfs sont plus vulnérables à l’ischémie que d’autres parties du corps [83].
Les neurones semblent également affectés par les mêmes mécanismes induits par l’hyperglycémie qui nuisent à la fonction des cellules endothéliales. Par exemple la glycation, la voie des polyols et la voie de l’activation de la PKC, qui sont tous favorisées par l’hyperglycémie, altèrent la capacité d’oxydoréduction des cellules et induit la formation de dérivés réactifs de l'oxygène (ROS), pouvant entraîner l’apoptose des neurones ou des cellules de Schwann [84]. Enfin, le diabète pourrait contribuer au développement de la neuropathie en causant une déficience en neurotrophines au niveau de la peau, dont le facteur de croissance des nerfs (NGF), qui joue un rôle important pour la survie et le maintien des neurones [85, 86]. La neuropathie diabétique se développe le plus souvent au niveau des membres inférieurs et se traduit par une perte de la sensation de douleur ou, à l’inverse, des douleurs neuropathiques, c’est-à-dire une sensation de douleur sans cause véritable. Ainsi, cette diminution des perceptions au niveau du pied augmente considérablement le risque de blessure ou peut contribuer à aggraver une blessure déjà présente [87]. C’est pourquoi la
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neuropathie périphérique est la principale cause d’apparition de plaies chroniques chez les patients diabétiques.
1.3.4 Les ulcères de pieds diabétiques
L’hyperglycémie et les problèmes vasculaires favorisent le développement d’une neuropathie périphérique chez les patients diabétiques, entraînant du même coup un plus grand risque de blessure. Or, plusieurs mécanismes intervenant dans la guérison de plaies sont altérés par le diabète, entre autres à cause du dysfonctionnement des cellules endothéliales qui peut rendre les plaies ischémiques. Lorsque la peau guérit trop lentement et ne remplit plus sa fonction de barrière, la plaie s’infecte et peut mener à la formation d’un ulcère (Figure 1.6). Étant donné que ces blessures surviennent la plupart du temps au niveau des membres inférieurs, cette pathologie est souvent désignée par le terme pied diabétique. Avec l’augmentation croissante du taux de diabète de type 2, les ulcères du pied diabétique sont devenus un problème très fréquent, dont la prévalence est estimée à environ 6,3% dans le monde [88]. L’Amérique du Nord semble être la région la plus touchée, avec une prévalence
estimée de 13.0%. Les ulcères diabétiques représentent une grande source de morbidité pour les patients et sont même considérés comme étant la plus grande cause d’amputation non-traumatique des membres inférieurs [89, 90]. Les plaies chroniques nécessitent également de
nombreux soins sur une grande période de temps, notamment pour gérer la blessure et éviter qu’elle ne s’aggrave. Les coûts engendrés par ce problème sont donc très importants, étant estimés entre 9,1 et 13,2 milliards de dollars aux États-Unis à chaque année [91]. Les ulcères du pied diabétique représentent un grand fardeau autant pour la qualité de vie des patients que pour le système de santé et l’économie. En conséquence, de nombreux efforts sont investis depuis plusieurs années en recherche afin de trouver un traitement pour favoriser la guérison de plaie.
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Figure 1.6. Ulcère de pied diabétique. Les plaies chroniques diabétiques se forment la
plupart du temps au niveau des membres inférieurs et manifestent souvent une neuropathie, une ischémie ainsi qu’une callosité en périphérie de la plaie, c’est-à-dire un épaississement et un durcissement de l’épiderme. Reproduit avec permission de [92], Copyright Anais Brasileiros de Dermatologia.
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1.4 Les mécanismes altérant la guérison de plaie dans le
diabète
1.4.1 L’inflammation chronique
L’hyperglycémie entraîne des effets multiples sur plusieurs composantes de la peau comme le système vasculaire, les nerfs, les cellules mésenchymateuses, l’épiderme et le système immunitaire. En conséquence, le processus de guérison de plaie est affecté à plusieurs niveaux et ne se déroule pas correctement. L’étape de l’inflammation aiguë, qui est normalement supposée durer seulement quelques heures, est prolongée sur plusieurs jours, ce qui nuit à l’initiation de l’étape de la régénération des tissus lors de laquelle l’angiogenèse et la reépithélialisation ont lieu [93]. Étant donné que les macrophages jouent un rôle important dans la transition entre ces deux phases, ils sont considérés comme étant les principaux responsables de l’inflammation chronique. L’infiltration initiale des cellules immunitaires sur le site de la plaie sert entre autres à éliminer rapidement les pathogènes qui se sont infiltrés, mais dans les plaies chroniques, on peut observer la présence prolongée de lymphocytes T et de macrophages sans qu’il y ait de nettoyage efficace par phagocytose [94,
95]. De plus, les macrophages dans les plaies diabétiques possèdent un phénotype
inflammatoire M1 soutenu qui se traduit par une sécrétion prolongée de facteurs pro-inflammatoires comme l’IL-1β, le TNF-α et la MMP-9 [96, 97]. Il a été montré dans un modèle de souris diabétique que les cellules myéloïdes progénitrices de la moelle osseuse étaient intrinsèquement disposées à devenir des macrophages de type M1 ou de type M2 hyperpolarisés et présentant des phénotypes plus extrêmes [98]. La même étude montre que
dans le microenvironnement des plaies chroniques, la polarisation des macrophages en type M2 favorisant la régénération est déficiente dans les stages tardifs de la guérison, résultant en une persistance de la présence de macrophages M1. Les mécanismes influençant la polarisation altérée des macrophages par le diabète ne sont pas encore bien compris, mais plusieurs facteurs causés par l’hyperglycémie ou le microenvironnement de la plaie chronique pourraient entrer en jeu. Par exemple, une étude a montré dans un modèle de souris diabétique que les AGEs favorisent la polarisation des macrophages en type M1 [99]. Il a aussi été montré que la substance P peut favoriser la guérison de plaies diabétiques en modulant
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les macrophages vers un type M2 [100]. Ainsi, il est possible que la neuropathie périphérique mène à une déficience de ce neuropeptide au niveau de la peau et contribue à la l’hyperpolarisation des macrophages en type M1. L’inflammation chronique au niveau des ulcères diabétiques résulte en le maintien d’une grande concentration de facteurs pro-inflammatoires dans le tissu comme l’ IL-1β, le macrophage inflammatory protein-2 (MIP-2) ou le TNF-α [101-103] ainsi que des protéases comme la MMP-9 ou des élastase [104, 105]. Cet environnement protéolytique contribue également à la diminution du niveau de facteurs de croissance au site de la plaie comme le PDGF, le TGF-β et le facteur de croissance des kératinocytes (KGF) et nuit donc à la prolifération cellulaire.
1.4.2 La déficience de l’angiogenèse
Comme cela a été mentionné précédemment, l’hyperglycémie entraîne un dysfonctionnement important au niveau des cellules endothéliales, ce qui mène à des microangiopathies. L’ischémie est, avec la neuropathie, considérée comme l’un des facteurs majeurs contribuant aux plaies diabétiques [106]. Toutefois, alors que les autres complications microvasculaires fréquentes associées au diabète comme la rétinopathie et la néphropathie sont caractérisées par la formation exagérée de nouveaux vaisseaux sanguins, les plaies diabétiques sont plutôt associées à une angiogenèse insuffisante. En effet, il a été observé que la densité des capillaires était moins élevée dans les biopsies de peau prélevées sur le pied de patients ayant un ulcère diabétique que sur le pied de patients sains [107]. Des études in vivo ont aussi montré que le niveau de VEGF est plus faibles dans les plaies de souris diabétiques comparativement aux contrôles sains et que cela correspond avec une déficience de l’angiogenèse dans le tissu de granulation [108]. Cette déficience en VEGF pourrait être
due à la polarisation insuffisante des macrophages en type M2 lors de la guérison, étant donné que ceux-ci représentent une source importante de VEGF lors de l’initiation de la phase de régénération des tissus [46]. Il a également été montré que les fibroblastes provenant de souris
diabétiques avaient une moins grande capacité à sécréter du VEGF [109]. D’ailleurs, la réponse
à l’hypoxie semble être altérée chez les souris diabétiques, ce qui se traduit par une diminution de l’expression de HIF-1α, qui régule l’expression de gènes pro-angiogéniques
[110]. Il en résulte que le stimulus pro-angiogénique normalement déclenché à la suite d’une
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De plus, le processus de maturation des vaisseaux sanguins nouvellement formés lors de l’angiogenèse, qui est important pour leur stabilisation et leur fonctionnalité, est également altéré par le diabète, bien que ce processus soit moins étudié. Par exemple, un niveau moins élevé de PDGF et de son récepteur a été observé dans les plaies de souris diabétiques, alors que ce facteur est important pour la survie et le recrutement des péricytes autour des vaisseaux sanguins [111, 112]. La perte de péricytes a été observée dans le cas de rétinopathie et au niveau de la peau en contexte diabétique, mais cela n’a pas encore été documenté au niveau des plaies diabétiques, bien qu’il s’agisse d’un facteur probable nuisant à l’angiogenèse [113]. Il a également été montré qu’il y avait une diminution du ratio
angiopoïétine-1 (ANGPT-1) / angiopoïétine-2 (ANGPT-2) dans les plaies diabétiques. Ces deux protéines sont reconnues pour avoir des rôles complémentaires, car elles agissent sur le même récepteur tyrosine kinase with immunoglobulin and EGF homology domains (Tie2) mais en ayant des effets inverses [114]. En effet, alors que ANGPT-1 favorise la maturation et le maintien des vaisseaux, ANGPT-2 les déstabilisent. Ainsi, la plus grande proportion de ANGPT-2 dans les souris diabétiques pourrait nuire à la maturation des vaisseaux et contribuer à une fermeture plus lente des plaies [115].
1.4.3 Le dysfonctionnement des kératinocytes
Les kératinocytes sont responsables de la reépithélialisation des plaies et une altération de leur fonctionnement par le diabète empêche donc la barrière protectrice de l’épiderme de se reconstituer et augmente grandement le risque d’infections. Des analyses immunohistochimiques effectuées sur des biopsies de peau prélevées sur des ulcères diabétiques permettent d’observer que les kératinocytes en bordure de la lésion semblent incapables de migrer sur le lit de la plaie, et ce malgré qu’ils expriment le marqueur K16, qui est exprimé normalement par les kératinocytes activés [116]. La même étude a aussi permis d’observer qu’il y avait une diminution marquée de LM-3A32 sur le bord des plaies chroniques diabétiques par rapport à des plaies normales, probablement à cause d’une incapacité des kératinocytes diabétiques à produire efficacement cette protéine ou parce qu’elle est dégradée rapidement par des protéases. Ainsi, le défaut de migration des kératinocytes pourrait être causé par leur incapacité à établir une membrane basale appropriée
