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Etude épidémiologique et moléculaire des Norovirus dans les gastroentérites virales chez les enfants de moins de cinq ans au Maroc

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Texte intégral

(1)

Discipline : Biologie

Spécialité : Virologie- Biologie moléculaire N° d’ordre: 2745

THЀSE DE DOCTORAT

Présentée par

Maria EL QAZOUI Epouse BOUJENDAR

Titre: Etude épidémiologique et moléculaire des

Norovirus dans les gastroentérites virales chez les

enfants de moins de cinq ans au Maroc

Soutenue le: Vendredi 19 Décembre 2014 devant le Jury composé de :

Président:

Mr Saaid AMZAZI Professeur (PES) Doyen de la Faculté des Sciences de Rabat

Examinateurs:

Mr Youssef BAKRI Professeur (PES) Faculté des Sciences de Rabat

Mr Abdelkrim FILALI-MALTOUF Professeur (PES) Faculté des Sciences de Rabat

Mme Rajae EL AOUAD Professeur (PES) Faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat

Mr Pierre POTHIER Professeur (PES) Université de Bourgogne (Dijon- France)

Mr Taoufiq MESKINI Professeur (PES) Faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat

Mr Mohamed BENHAFID Docteur (Phd) Institut National d’Hygiène de Rabat

Faculté des Sciences, 4 Avenue Ibn Battouta B.P. 1014 RP, Rabat – Maroc Tel +212 (0) 37 77 18 34/35/38, Fax: +212 (0) 37 77 42 61, http://www.fsr.ac.ma

(2)
(3)

DEDICACES

Je dédie ce travail à la mémoire de mon père

À ma mère

À mon mari

À mes enfants, Ismail et Othman

À mes frères et sœurs

À ma belle-mère

À mes beaux- frères et belles-sœurs

À mes neveux et nièces

(4)

AVANT-PROPOS

Le présent travail a été réalisé en collaboration entre le laboratoire de

Biochimie-Immunologie de la Faculté des Sciences de Rabat, dirigé par le

Professeur Youssef BAKRI, le laboratoire de Virologie de l’Institut National

d’Hygiène, unité des virus entériques dirigé par le Docteur Mohammed

BENHAFID et le laboratoire de Virologie-Sérologie du Centre National de

Référence des virus entériques CHU de Dijon (France) dirigé par le Professeur

Pierre POTHIER.

(5)

REMERCIEMENTS

Je tiens à exprimer toute ma reconnaissance à mon directeur de thèse, Monsieur le Pr Saaïd

AMZAZI, Doyen de la Faculté des Sciences de Rabat et à Madame le Pr Rajae ELAOUAD,

Vice-présidente de l’Université Mohamed VI des Sciences de la Santé (Fondation Cheikh Khalifa), qui m’ont encadré lors de la réalisation de ce travail.

Je souhaite aussi exprimer toute ma gratitude à Monsieur le Pr Youssef BAKRI, Professeur à la Faculté des Sciences de Rabat et à Monsieur le Pr Taoufiq MESKINI, Professeur de pédiatrie à la Faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat, qui ont bien voulu consacrer du temps à la lecture et à la correction de ce travail et qui ont établit les rapports de cette thèse.

Je remercie vivement Monsieur le Pr Pierre POTHIER, responsable du Centre National de Référence des virus entériques au CHU de Dijon, pour m’avoir accueillie au sein de son laboratoire et pour m’avoir fait l’honneur d’assister à cette soutenance.

Je remercie infiniment Monsieur le Pr Abdelkarim Filali-Maltouf d’avoir accepté de siéger parmi les membres du jury malgré ses nombreuses responsabilités.

Je remercie également le Dr Mohamed BENHAFID, responsable de l’unité des virus entériques à l’Institut National d’Hygiène, pour les discussions scientifiques enrichissantes et ses conseils qui m’ont été d’une grande aide pour mener à bien ce travail.

Je tiens à exprimer tout particulièrement ma profonde gratitude au Dr Hicham OUMZIL, responsable du département de Virologie à l’Institut National d’Hygiène qui a grandement contribué à la réalisation de ce travail. Je lui suis reconnaissante et redevable de la patience, de la disponibilité, de l’amitié et de la complicité dont il a su faire preuve.

Je remercie le Dr Larbi BAASSI, responsable de l’unité de coordination du règlement sanitaire international au bureau des laboratoires à l’Institut National d’Hygiène et le Dr Mohammed YOUBI, responsable du service d’Epidémiologie et de Veille Sanitaire à l’Institut National d’Hygiène, pour leur aide dans l’approche statistique des résultats de ce travail.

A mes collègues du laboratoire de virologie et du laboratoire de référence de la Grippe de l’Institut National d’Hygiène, j’exprime mes sincères remerciements.

Et enfin, à toutes les personnes qui ont participé, de près ou de loin, à l’élaboration de ce travail, j’exprime ma profonde gratitude.

Je laisse dans ces quelques remerciements une trace de cette collaboration scientifique qui j’espère s’inscrira dans le temps.

(6)

PRODUCTIONS SCIENTIQUES

Publications :

- El Qazoui M., Oumzil H., Baassi L., El Omari N., Sadki K., Amzazi S., Benhafid M and El Aouad R. Rotavirus and Norovirus infections among acute gastroenteritis children in Morocco. BMC Infectious Diseases 2014; doi: 10.1186/1471-2334-14-300.

-El Qazoui M., -El Omari N., -El Idrissi-Azzouzi M.,Amzazi S., Benhafid M.and El Aouad R.. Les Norovirus: Principale cause de gastroentérite aiguë chez les enfants de moins de cinq ans au Maroc. Annales de Biologie Clinique (publication prévue pour janvier 2015) http://www.sfbc.asso.fr/sites/default/files/ePostersMicrobiologie1.pdf

- Benhafid M., Rguig A., Trivedi T., El Qazoui M., Teleb N., Mouane N., Filali-Maltouf A., Parashar U., Patel M., El Aouad R. Monitoring of Rotavirus vaccination in Morocco: Establishing the baseline burden of Rotavirus disease. Vaccine, 2012.30:6515-6520. - Benhafid M., Elomari N., El Qazoui M., Azzouzi Idrissi M., Rguig A., Filali-Maltouf A.,

El Aouad R. Diversity of Rotavirus strains circulating in children under 5 years of age admitted to hospital for acute gastroenteritis in Morocco, June 2006 to May 2009. J. Med. Virol. 85:354–362, 2013.

Congrès Internationaux:

- Participation aux Premières Journées Franco-Maghrébines de Virologie par une présentation orale intitulée : « Une année de surveillance des gastroentérites à Norovirus et à Rotavirus chez les enfants de moins de cinq ans au Maroc » à Marrakech, du 23 au 25 Octobre 2013.

- Participation aux Journées Internationales de Biologie par une présentation en ligne intitulée : «Les Norovirus: Principale cause de gastroentérites chez les enfants de moins de cinq ans au Maroc» à Paris, du 7 au 10 Octobre 2014.

(7)

RÉSUMÉ:

La Gastroentérite aiguë est une cause sérieuse de mortalité et de morbidité infantile dans les pays à ressources limitées. Les Rotavirus et les Norovirus sont rapportés comme étant les principaux agents pathogènes viraux. Les données épidémiologiques sur les Norovirus sont inexistantes au Maroc. L'objectif de cette étude est de remédier à ce manque de données sur les gastroentérites associées aux Rotavirus et aux Norovirus chez les enfants de moins de 5 ans, notamment après l’introduction du vaccin contre le Rotavirus, dans le Programme National d’Immunisation, en Octobre 2010.

Cinq cent vingt deux (522) enfants âgés de moins de 5 ans hospitalisés ou ayant consultés pour des symptômes de gastroentérite ont été prélevés, de Janvier 2011 à Décembre 2012 (335 en 2011 et 187 en 2012) et ce, dans 4 régions du Maroc. Tous les prélèvements de selles ont été testés pour rechercher les Rotavirus par une technique immuno-enzymatique et par la technique PCR en temps réel pour la recherche des Norovirus. Le génome des Norovirus a été partiellement séquencé au niveau de la protéine de capside pour déterminer les génotypes et effectuer l’analyse phylogénétique.

En 2011, les infections dues aux Rotavirus et aux Norovirus ont concerné respectivement 26.6% (89/335) et 16.1% (54/335) des enfants atteints de gastroentérite. L’infection mixte a concerné 2.7% d’entre eux (9/335). Le génogroupe GII est le plus prédominant avec 77.8% (42 de 54) des prélèvements positifs pour le NV, 20.4% (11 de 54) sont de génogroupe GI et 1.8% (1 de 54) est co-infecté par le génogroupe GI et GII. Quarante sur 54 prélèvements positifs (74%) ont été séquencés avec succès. Trente neuf prélèvements sont de génogroupe GII et un prélèvement est de génogroupe GI (génotype GI.3 Desert Shield). Le génotype GII.4 est largement représenté. En effet, 79.5 % (31/39) des souches de génogroupe GII sont de génotype GII.4. Les génotypes GII.3, GII.13 et GII.16 représentent chacun 5,1% (2/39) et les génotypes GII.2 et GII.17 représentent chacun 2.6% (1/39) des souches de génogroupe GII. En 2012, les taux d'infection par le Rotavirus et le Norovirus ont été respectivement de 13,4% (25/187) et 20,3% (38/187). Les infections virales mixtes ont été détectées dans 1.1% (2/187) des échantillons de selles. Le génogroupe GII a représenté 89.5% (34 de 38) et le génogroupe GI 10.5% (4 de 38) des infections à Norovirus.

Depuis l'introduction du vaccin contre le Rotavirus, le Norovirus est devenu la principale cause virale de gastroentérite aiguë chez les enfants marocains, mais d'autres virus entériques doivent être intégrés dans le système de surveillance pour se prononcer quand à leur étiologie. Mots clés : Norovirus, Rotavirus, Gastroentérite, Maroc

(8)

ABSTRACT:

Acute gastroenteritis is an important cause of child mortality and morbidity in resource-limited countries. Rotavirus and Norovirus are reported as the leading causative viral agents. Epidemiological data concerning Norovirus are lacking in Morocco. The aim of this study is to provide epidemiological data on Rotavirus gastroenteritis associated with Norovirus for children less than 5 years, especially after the introduction of the vaccine against Rotavirus in the National Immunization Program in October 2010.

From January 2011 to December 2012, 522 fecal specimens were collected from children aged less than 5 years who were hospitalized or required medical care for acute gastroenteritis (335 in 2011 and 187 in 2012) in 4 regions of Morocco. These stools were tested for Rotavirus and Norovirus using enzyme-linked immunosorbent assay and real-time RT-PCR respectively.

Partial sequences of the Norovirus were phylogenetically analyzed to determine the genotype. In 2011, Rotavirus and Norovirus affected respectively 26.6% and 16.1% of children with gastroenteritis. Mixed infection concerned 2.7% of them (9/335). The GII was the most predominant genogroup of Norovirus positives samples represented by 77.8% (42 of 54), 20.4% (11 of 54) were genogroup GI and 1.8% (1 of 54) was co-infected with both GI and GII genogroup. Fourty positives samples out of 54 positive samples (74%) were sequenced successfully. Thirty-nine strains were genogroup GII and one strain was genogroup GI (genotype GI.3 Desert Shield). The GII.4 genotype is largely represented. In fact, 79.5% (31/39) of genogroup GII strains were genotype GII.4, while GII.3, GII.13 and GII.16 represente each 5.1% (2/39) , GII.2 and GII.17 represented each 2.6% (1/39) of genogroup GII strains.

In 2012, the rates of Rotavirus and Norovirus infections were respectively 13.4% and 20.3%. Mixed viral infections were detected in 2 of 187 stool samples (1.1%). The GII genogroup represented 89.5% (34 of 38) and the GI genogroup represented 10.5% (4 of 38) of Norovirus infections.

Since the introduction of the Rotavirus vaccine, Norovirus has become the leading cause of acute viral gastroenteritis for Moroccan children, but further enteric viruses need to be integrated in the surveillance system for a better understanding of gastroenteritis’s etiology.

(9)

صخلم

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(10)

TABLE DES MATIЀRES

INTRODUCTION GÉNÉRALE ...1

CHAPITRE I : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE ...4

I- Rappel historique sur les Norovirus ...5

II- Structure des Norovirus ...5

III- Caractéristiques génétiques des Norovirus ...10

IV- Variabilité génétique des Norovirus ...13

V- Physiopathologie des infections à Norovirus ...16

V-1- Caractéristiques physico-chimiques des Norovirus ...18

V-2- Aspects immunologiques de l’infection à Norovirus ...19

V-3- Mode de transmission des Norovirus ...22

VI- Aspects cliniques de l’infection à Norovirus ...23

VII- Epidémiologie des Norovirus ...25

VIII- Epidémiologie moléculaire des Norovirus ...25

IX- Diagnostic biologique des Norovirus ...28

X- Traitement et prophylaxie des infections à Norovirus ...30

CHAPITRE II : MATÉRIELS ET METHODES ...32

I- Contexte de l’étude ...33

II- Sites sentinelles de l’étude ...33

III- Population de l’étude ...34

III-1 Définition de cas de GEA ...34

III-2 Critères d’inclusion et d’exclusion ...34

III-3 Recrutement des patients et recueil des données ...34

III-4 Collecte et analyse des prélèvements de selles ...34

III-5 Recueil de données ...35

IV- Diagnostic des Norovirus ...35

IV-1 Patients ...35

IV-2 Prélèvement de selles ...35

IV-3 Détection des Norovirus par la PCR en temps réel ...36

V- Génotypage des Norovirus ...39

V-1 RT-PCR conventionnelle ...39

V-2 Technique de séquençage ...40

V-3 Analyse de séquences par logiciel Mega version 5.2 ...41

V-4 Numéro d’accession à la Genbank ...41

(11)

CHAPITRE III: RESULTATS ...43

I- Caractéristiques épidémiologiques de la population étudiée ...44

I-1 Distribution des GEA en fonction du sexe ...44

I-2 Distribution des GEA en fonction de l’âge ...44

I-3 Distribution des GEA entre l’hôpital et le centre de santé ...45

I-4 Sévérité des GEA recrutées...45

I-5 Distribution GEA entre les sites sentinelles ...46

I-6 Distribution saisonnière des GEA ...47

II- Prévalence des Norovirus dans la population étudiée ...48

II-1 Durant l’année 2011 ...48

II-2 Durant l’année 2012 ...49

III- Caractéristiques épidémiologiques des GEANV ...50

III-1 Distribution des GEANV en fonction du sexe ...50

III-2 Distribution des GEANV en fonction de l’âge ...50

III-3 Distribution des GEANV entre l’hôpital et le C/S ...52

III-4 Sévérité des GEANV ...53

III-5 Distribution des GEANV en fonction du lieu ...54

III-5-1 Durant l’année 2011 ...54

III-5-2 Durant l’année 2012 ...54

III-6 Distribution saisonnière des GEANV ...55

IV- Caractéristiques épidémiologiques des GEANV et des GEARV ...56

IV-1 Prévalence des RV comparativement aux NV dans la population étudiée ...56

IV-2 Distribution des GEANV et des GEARV en fonction du sexe ...57

IV-3 Distribution des GEANV et des GEARV en fonction de l’âge ...58

IV-4 Distribution des GEANV et des GEARV entre l’hôpital et le C/S ...59

IV-5 Sévérité des GEARV ...61

IV-6 Distribution saisonnière des GEANV et des GEARV ...62

V- Caractéristique des souches norovirales et analyse phylogénétique ...63

CHAPITRE IV: DISCUSSIONS...71

CHAPITRE V: CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ...80

CHAPITRE VI: PUBLICATIONS ...82

CHAPITRE VII: ANNEXES ...97

(12)

ABRÉVIATIONS

AA: Acides Aminés

ARN: Acides Ribonucléiques

ADNc: Acides Désoxy-ribonucleiques complémentaire CDC: Center of Disease and Control (Atlanta/USA)

CEERAM: Centre Européen d’Expertise et de Recherche sur les Agents Microbiens CHU: Centre Hospitalier Universitaire

CNR: Centre National de Référence

CNRST: Centre National de Recherche Scientifiques et Techniques CPE: Cellule Provinciale d’Epidémiologie

C/S: Centre de Santé

DELM: Direction de l’Epidémiologie et de Lutte contre les Maladies ELISA: Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay

EMRO: East Mediterraneen Region Oriental GEA: Gastroentérite aiguë

GEARV: Gastroentérite aiguë à Rotavirus GEANV: Gastroentérite aiguë à Norovirus HBGA: Histo-Blood Group Antigens

HSCT: Hematopoietic Stem Cell Transplantation HuCalv: Calicivirus Humain

INH: Institut National d’Hygiène KDa: Kilo Daltons

NV: Norovirus

NCBI: National Center for Biotechnology Information OMS: Organisation Mondiale de la Santé

ORF: Open Reading Frame Pb: Paires de bases

RIVM: Rijks Instituut voor Volksgezondheid en Milieu in Netherlands (Institut national de Santé publique et de l’environnement)

RV: Rotavirus

RT-PCR: Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction TIAC: Toxi-infection Alimentaire Collective

(13)

LISTE DES FIGURES

Chapitre I : DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES

Figure 1: Virus Norwalk observés en microscopie électronique ...6

Figure 2: Représentation structurale tridimensionnelle du virus de Norwalk ...7

Figure 3: Structure par rayons X de la capside du virus Norwalk ...7

Figure 4: Les différents domaines de la protéine de capside VP1 ...8

Figure 5: Formation et propriétés structurelles des VLP des Norovirus ...9

Figure 6: Structure du génome des Norovirus ...11

Figure 7: Analyse phylogénétique de la capside des calicivirus ...12

Figure 8: Arbre phylogénique de la région complète du Norovirus ...14

Figure 9: Classification phylogénique des Norovirus ...15

Figure 10: Aspect des muqueuses de l’intestin grêle ...17

Figure 11: Cycle de vie et pathogénèse des Norovirus ...17

Figure 12: Modèle d’infection par Norovirus en fonction du caractère sécréteur ou non sécréteur ...20

Figure 13: Voies de transmission des calicivirus humains ...23

Figure 14: Symptômes cliniques d’une infection à Norovirus ...24

Figure 15: Épidémiologie moléculaire des calicivirus humains détectés chez des cas sporadiques et au cours d’épidémies en France de 1998 à 2004 ...26

Figure 16: Evolution des épidémies à Norovirus GII.4 en France entre 2000 et 2010 ...27

Figure 17: Distribution des souches de calicivirus selon le mode de transmission ...27

Figure 18: Régions cibles du génome dans le diagnostic et le génotypage moléculaires des Norovirus ...29

Figure 19: Fixation du Norovirus aux antigènes du groupe sanguin HBGA exprimés à la surface des cellules gastro-intestinales ...31

Chapitre II : MATERIELS ET METHODES Figure 20: Répartition des quatre sites sentinelles de la surveillance des GEARV et des GEANV au Maroc ...33

Figure 21: Différentes régions du génome ciblées dans le diagnostic des Norovirus ...36

Figure 22: Courbes obtenues en PCR en temps réel ...38

(14)

Chapitre III: RESULTATS

Figure 24: Répartition selon l’âge de la population étudiée, dans les 4 sites sentinelles ...44

Figure 25: Répartition selon la structure de prise en charge de la population étudiée ...45

Figure 26: Degré de déshydratation selon les tranches d’âge, durant la période de l’étude ...46

Figure 27: Distribution saisonnière des cas de GEA durant l’année 2011 et l’année 2012 ...47

Figure 28: Algorithme suivi lors du diagnostic biologique des GEARV et des GEANV au laboratoire de virologie de l’INH et résultats obtenus durant l’année 2011 ...48

Figure 29: Algorithme suivi lors du diagnostic biologique des GEARV et des GEANV au laboratoire de virologie de l’INH et résultats obtenus durant l’année 2012 ...49

Figure 30: Répartition des GEANV selon l’âge, durant l’année 2011 et l’année 2012 ...51

Figure 31: Répartition des GEANV entre les Centres de santé et les Hôpitaux sentinelles, durant la période de l’étude ...52

Figure 32: Distribution saisonnière des cas de GEANV entre le 1er Janvier 2011 et le 31 Décembre 2012 ...55

Figure 33: Proportion des GEARV, des GEANV et des GEA à RV/NV chez les enfants de moins de 5 ans, entre le 1er Janvier et le 31 décembre 2011 ...56

Figure 34: Proportion des GEARV, des GEANV et des GEA à RV/NV chez les enfants de moins de 5 ans, entre le 1er Janvier et le 31 décembre 2012 ...57

Figure 35: Répartition des GEARV et des GEANV selon l’âge des enfants <5 ans, durant l’année 2011 et 2012 ...58

Figure 36: Répartition des GEARV et des GEANV entre l’hôpital et le Centre de Santé, entre le 1er Janvier 2011 et le 31 décembre 2012 ...60

Figure 37: Comparaison de la distribution saisonnière des cas de GEANV, des GEARV et des GEARV/NV...62

Figure 38: Analyse phylogénétique des séquences de Norovirus ...64

Figure 39: Rapport du RIVM concernant la souche Oujda-C85 ...67

Figure 40: Rapport du RIVM concernant la souche de référence CS E1/2002/USA ...67

Figure 41: Polymorphisme de la région C de la capside virale des souches de Norovirus séquencées lors de cette étude ...68

Figure 42: Diversité des souches NV de génogroupe GII ayant circulées au Maroc durant la période de l’étude ...69

(15)

Chapitre VII: ANNEXES

Figure 44: Courbes obtenues par le détecteur Prism 7500 SDS ABI ...105

Figure 45: Etapes de la réaction de Séquence ...111

Figure 46: Mécanisme de la fluorescence par la technique du transfert d’énergie par résonance .112

LISTE DES PHOTOS

Chapitre II : MATERIELS ET METHODES

Photo 1: Gel d’agarose, représentant des prélèvements positifs de génogroupe GII ...39

Chapitre VII: ANNEXES

Photo 2: Détecteur Prism 7500 SDS ABI (Applied Biosystems) ...104

(16)

LISTE DES TABLEAUX

Chapitre II: MATERIELS ET METHODES

Tableau 1: Amorces et sondes dans utilisées la PCR en temps réel, pour la région C du

génome des Norovirus...37

Tableau 2: Amorces utilisées dans la RT-PCR pour la région C du génome des Norovirus ...39

Chapitre III: RESULTATS

Tableau 3: Répartition des cas de GEA selon les sites sentinelles durant les 2 années de

l’étude ...46

Tableau 4: Caractéristiques cliniques de l'infection à Norovirus en 2011 et 2012 ...53

Tableau 5: Répartition par site sentinelle des cas de GEANV chez les enfants < 5 ans, entre le 1er Janvier et le 31 décembre 2011 ...54

Tableau 6 : Répartition par site sentinelle des cas de GEANV chez les enfants <5 ans, entre le 1er Janvier et le 31 décembre 2012 ...54

Tableau 7: Caractéristiques cliniques de l'infection à Rotavirus en 2011 et 2012 ...61

Tableau 8: Estimation de la divergence entre les séquences (Pairwise distances) établit par le logiciel Mega 5.2 ...65

Chapitre IV: DISCUSSION

Tableau 9: Prévalence des NV dans les cas sporadiques de GEA dans différents pays,

représentants les différents continents ...73

Chapitre VII: ANNEXES

Tableau 10: Volumes de tampon AVL et mélange carrier RNA-tampon AVE ...101

Tableau 11: Mélange de réaction ou Master Mix de la PCR en temps réel ...103

Tableau 12: Mélange de réaction ou Master Mix de la RT-PCR « One-step » pour les souches de génogroupe GII ...103

Tableau 13: Mélange de réaction ou Master Mix de la RT-PCR « One-step » pour les souches de génogroupe GI ...104

Tableau 14: Composition des mélanges de base standard ...117

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PROBLÉMATIQUE

Les maladies diarrhéiques constituent une des principales causes de mortalité chez l’enfant de moins de cinq ans toutes étiologies confondues, et représentent chaque année prés de 1.4 milliards d’épisodes et 1.6 à 2.5 millions de décès, majoritairement dans les pays en voie de développement (Kosek et al. 2003; Parashar et al. 2003; Bryce et al. 2005).

Les gastroentérites virales représentent l’un des premiers motifs de consultation en médecine et principalement en pédiatrie. Dans les pays développés, la prise en charge précoce et adaptée a permis de réduire la gravité de ces infections qui représentent cependant un coût économique important (Fischer et al. 2004). Malheureusement dans les pays en développement, les maladies diarrhéiques provoquent encore beaucoup de décès. La malnutrition et l'accès limité aux thérapies sont des facteurs aggravants (Relevé Epidémiologique Hebdomadaire de l’OMS, Août 2007).

Au Maroc, les maladies diarrhéiques représentent la 2° cause de décès chez les enfants de moins de cinq ans (Rapport du Ministère de la santé, 1998).

Les Rotavirus et les Norovirus sont les principaux agents viraux responsables de ces gastroentérites pédiatriques. Aucune donnée épidémiologique et encore moins moléculaire concernant les Norovirus n’existe au Maroc.

Le présent travail consiste à établir une étude descriptive, analytique et rétrospective réalisée entre Janvier 2011 et Décembre 2012 chez les enfants de moins de cinq ans hospitalisés ou

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ayant consultés pour une gastroentérite au niveau de quatre hôpitaux et de quatre centres de santé et ce, à l’échelle de quatre grandes villes du Maroc.

L’étude a été réalisée dans le but de répondre aux objectifs spécifiques suivants :

 Déterminer la prévalence et les caractéristiques épidémiologiques des gastroentérites à Norovirus chez les enfants de moins de cinq ans;

 Comparer la prévalence et les caractéristiques épidémiologiques des gastroentérites à Rotavirus et des gastroentérites à Norovirus après l’introduction du vaccin contre les Rotavirus dans le Programme National d’Immunisation et ce, pour évaluer l’impact de cette vaccination.

 Et enfin, réaliser une caractérisation génotypique des souches des Norovirus circulants dans le pays.

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1 INTRODUCTION GÉNÉRALE:

Les maladies diarrhéiques constituent une des principales causes de mortalité chez les enfants de moins de cinq ans toutes étiologies confondues, et représentent chaque année près de 1,4 milliards d’épisodes et 1,6 à 2,5 millions de décès, majoritairement dans les pays en voie de développement (Kosek et al. 2003; Parashar et al. 2003; Bryce et al. 2005).

Les gastroentérites virales représentent l’un des premiers motifs de consultation en médecine pédiatrique. Elles peuvent avoir des conséquences graves si elles provoquent une déshydratation et entraînent une grande perte des sels minéraux essentiels à l’organisme. Les nourrissons, les jeunes enfants et les personnes âgées ou malades sont particulièrement sensibles à la déshydratation (Wilhelmi de Cal et al. 2008; Chow et al. 2010; Oldak et al. 2012).

Les agents étiologiques des gastroentérites peuvent être des bactéries, des parasites ou des virus (Patel et al. 2008):

Les bactéries (Salmonella, Shigella, Campylobacter, E. coli, Yersinia et Vibrio cholerae),

Les parasites (Giardia, Cryptosporidium, amibes...),

 Les virus représentent l’étiologie la plus fréquente, notamment dans les pays

développés, où ils sont à l’origine de plus de 80% des gastroentérites. Mais leur importance varie selon différents facteurs: saison, âge, contexte épidémiologique et niveau sanitaire des populations.

Chez le jeune enfant (six mois à deux ans), les Rotavirus (Famille des Reoviridae) sont la première cause de diarrhée. Ils provoquent souvent des épidémies hivernales extensives et sont responsables d’infections communautaires et nosocomiales.

Chez l’adulte et l’enfant, les Norovirus (Famille des Caliciviridae) constituent l’agent étiologique le plus fréquent dans les diarrhées d’origine alimentaire ou hydrique.

Les astrovirus sont également responsables de gastroentérites chez l’enfant, les personnes âgées et les immunodéprimés.

Les adénovirus entériques sont responsables de gastroentérites sans caractère saisonnier (Wilhelmi de Cal et al. 2008).

D’autres virus peuvent être à l’origine de gastroentérites chez l’Homme, tels que les sapovirus, les virus Aichi, les coronavirus, suite à une contamination hydrique, ou encore les Picobirnavirus chez l’immunodéprimés.

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2

Ces virus se multiplient dans les entérocytes de l’intestin grêle. Leur transmission se fait surtout par voie digestive (oro-fécale) et la contamination peut être soit directe, de personne à personne, soit indirecte par l’intermédiaire d’eau ou d’aliments contaminés (Pothier et al. 2006).

Les Norovirus (NV) sont, après les Rotavirus (RV), la deuxième cause de gastroentérite aigüe (GEA) chez les enfants de moins de 5 ans dans les pays en développement, et sont en passe de devenir la principale cause de gastroentérite dans les pays industrialisés, comme c’est déjà le cas aux Etats-Unis, après le succès de la vaccination contre les RV (Payne et al. 2013). Dans le monde, les RV sont reconnus comme la cause virale la plus fréquente des GEA sévères et provoquent 453.000 morts et plus de 2 millions d'hospitalisations chez les enfants de moins de 5 ans (Tate et al. 2012). En France, entre 7 et 8 décès par an, sont dus aux RV (Pothier 2012), notamment chez les personnes agées ou immunodéprimées.

Chaque année, les NV causent environ 900 000 cas de gastroentérite pédiatrique dans les pays industrialisés et au moins 1.1 million de cas et 220 000 décès dans les pays en développement (Patel et al. 2008). En moyenne chaque année, aux États-Unis, les NV provoquent 19 à 21 millions de cas de GEA. Ils sont à l’origine de 1,7 à 1,9 millions de consultations externes et de 400 000 visites aux services d'urgence principalement chez les jeunes enfants (Hall et al. 2011). Ils entrainent entre 56 000 et 71 000 hospitalisations et entre 570 à 800 décès, principalement chez les jeunes enfants et les personnes âgées (Hall et al. 2013). D’autres études ont montré que 93% de 233 épidémies de gastroentérite entre 1997 et 2000 aux Etats-Unis et 85% de 3714 épidémies entre 1995 et 2000 en Europe étaient dues aux NV (Dolin et al. 2007; Blanton et al. 2006).

En Suisse allemande 73 épidémies à NV ont été recensées entre 2001 et 2003 (Fretz et al. 2005). Ces épidémies sont dues, le plus souvent, à un contact de personne à personne ayant consommé des aliments contaminés; les mollusques sont incriminés dans 68% des cas, et les fruits sont les vecteurs de la contamination par les NV dans 32% des cas. En 2014, le Centre Européen d’Expertise et de Recherche sur les Agents Microbiens (CEERAM) a recensé plusieurs cas de contaminations de mollusques par les NV, notamment des huitres hollandaises, des palourdes surgelées tunisiennes et des palourdes cuites originaires du Vietnam.

En 2013, le CEERAM a signalé une contamination par NV des fraises surgelées importées de Chine. L’eau utilisée pour le lavage de ces fraises a été incriminé comme étant le vecteur de cette contamination.

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3

En Italie, l’eau potable a été également contaminée par le NV et a été la cause d’une épidémie en Juin 2009 (Scarcella C et al. 2009).

Selon les données épidémiologiques de l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS), la diarrhée est la deuxième cause de mortalité chez l’enfant de moins de 5 ans et elle est à l’origine de 760 000 décès d’enfants par an (Aide-mémoire OMS N°330 online, Avril 2013), mais surtout plus de 85 % de ces décès touchent les pays en développement, en Afrique et en Asie (Rapport OMS, Avril 2011). En effet, dans les pays développés, environ 70 enfants décèdent chaque année de la diarrhée, alors que dans les pays en développement, ce chiffre s'élève à 2000 victimes par jour. La malnutrition et l'accès limité aux thérapies sont des facteurs aggravants, car il faut remplacer rapidement les fluides perdus lors de la diarrhée et du vomissement (Relevé Epidémiologique Hebdomadaire de l’OMS online, Août 2007). Au Maroc, selon l'enquête nationale sur les causes et les circonstances des décès des enfants de moins de 5 ans, réalisée par le Ministère de la Santé en 1997, les maladies diarrhéiques représentent la deuxième cause. En effet, l’enquête a enregistré en 1997, 6000 décès dans ce groupe d'âge, soit 33% des décès toutes causes confondues (Rapport du Ministère de la santé, 1998).

La Direction de l’Epidémiologie et de Lutte contre les Maladies (DELM) et l’Institut National d’Hygiène (INH), avec l’appui du Bureau Régional de la Méditerranée orientale (EMRO) de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) ont instauré en juin 2006, un réseau de surveillance sentinelle des gastroentérites aigues à Rotavirus (GEARV), constitué des services de pédiatrie au niveau des hôpitaux régionaux de 4 Directions de la santé (Tanger, Oujda, Beni-Mellal et Rabat).

Les données recueillies pendant 4 années de surveillance, ont confirmé l'étiologie rotavirale dans les gastroentérites infectieuses chez les enfants de moins de 5 ans, au Maroc. L'épidémiologie moléculaire des souches isolées des RV a ensuite été étudiée (Benhafid et al. 2009). Cette opération a contribué à l'introduction du vaccin rotaviral dans Programme National d’Immunisation (PNI) en Octobre 2010.

Par contre et jusqu’à l’heure actuelle, il n’y a aucune donnée épidémiologique concernant les diarrhées à étiologie norovirale, ni d’information sur la distribution génotypique des NV circulant dans la population marocaine.

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4

Chapitre I :

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5 I- Rappel historique sur les Norovirus

L’infection par les NV, a été décrite pour la première fois en 1945 (Reimann et al. 1945). Appelée grippe intestinale ou «winter vomiting disease» par les Anglo-Saxons, l’étiologie de cette maladie n’a pas pu être définie pendant des décennies. En 1968, dans une école de Norwalk, Ohio, s’est déclarée une épidémie de gastroentérite. Le pathogène suspecté a été appelé «Norwalk agent» (Adler et al. 1969).

C’est en 1972 que Kapikian a découvert une particule virale de 27 nm au microscope électronique dans les selles d’un volontaire infecté par un filtrat de selles provenant de l’épidémie de Norwalk. Elle a reçu le nom de «virus de Norwalk» (Kapikian et al. 1972). Avec les analyses morphologiques et phylogénétiques, ce virus a été rebaptisé «Norovirus» par l’«International Committee on Taxonomy of Viruses». Son synonyme est «Norwalk like virus» (NLV).

II- Structure des Norovirus

D’un point de vue structural, les NV sont des virus non enveloppés, d’un diamètre allant de 27 à 40 nm, présentant en microscopie électronique un aspect plumeux (figure 1).

Grâce au développement des pseudo-particules virales (VLP), la structure a été résolue par cryomicroscopie électronique et cristallographie aux rayons X (Prasad et al. 1999). La capside composée de 180 copies d’une protéine VP1 et de quelques copies d’une protéine basique VP2, montre une symétrie icosaédrique. D’un point de vue architectural, 90 dimères forment une coquille surmontée de protubérances en forme d’arches et de 32 dépressions en forme de coupes (figure 2). Des variations structurales entre les différentes souches de NV ont été observées et leurs implications fonctionnelles étudiées (Chen et al. 2004).

La protéine VP1 s’organise en un domaine interne relativement conservé (shell) comprenant un bras N-terminal (N) ainsi que le domaine S (domaine intermédiaire) et un domaine exposé à la surface de la capside, le domaine P (protruding). Ce dernier comporte deux sous-domaines, P1 et P2. Le domaine P2 représente le domaine le plus variable de la capside des NV (figure 3 et 4) et son exposition à la surface est compatible avec son rôle dans l’interaction avec des récepteurs présents à la surface des cellules épithéliales intestinales (Tan et al. 2003; Tan et al. 2004).

La protéine VP2, faiblement représentée dans la capside virale, augmenterait la stabilité de la protéine VP1 et ainsi la protégerait de la dégradation, notamment par les protéases (Estes et al. 2000).

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6

L'expression de la protéine de capside du NV dans les baculovirus recombinants infectants des cellules d'insectes conduit à l'auto-assemblage spontané de particules pseudo-virales ou « Virus Like Particle » (VLP) (figure 5). Ces VLP ont une structure antigénique et biochimique similaire aux particules excrétées durant l’infection (Green 2007), elles sont non pathogènes parce qu'elles n'ont pas d’acide nucléique et sont donc incapables de se répliquer. Des études précliniques indiquent que les VLP sont immunogènes lorsqu'elles sont administrées par différentes voies:

- Intramusculaire (IM) (Jiang et al. 1992) - Orale (PO) (Ball et al. 1998)

- Intra-nasale (IN) (Guerrero et al. 2001)

Figure 1:Virus Norwalk observés en microscopie électronique

(Pr A. BOSH, Département de microbiologie, Université de Barcelone, Espagne)

Particule

virale

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7

Figure 2 : Représentation structurale tridimensionnelle du virus de Norwalk

(Prasad et al. 1999)

Figure 3: Structure par rayons X de la capside du virus Norwalk, montrant les détails de la structure des

sous-unités (Prasad et al. 1999)

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8

Figure 4 : Les différents domaines de la protéine de capside VP1 (Hutson et al. 2004)

Le petit domaine N-terminal (AA 10-49, vert) s’oriente à l'intérieur de la particule. Le domaine shell (S) est de couleur jaune et s'étend des acides aminés 50 à 225.

Les sous-domaines P1 sont de couleur rouge et comprennent des acides aminés 226-278 et 406-520 résidus.

Le domaine P2 (bleu) est une insertion dans le domaine P1 et est constitué des acides aminés 279-405.

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9

Figure 5: Formation et propriétés structurelles des VLP des Norovirus

(Tan and Jiang 2012)

(A) L'expression du domaine P, avec ou sans charnière (à gauche) forme un dimère P (à droite).

(B) Bien que l'expression du domaine P (à gauche) forme des particules P (à droite), une extrémité C est nécessaire pour stabiliser la formation de ces particules P.

(C) Formation des particules P par l’aggrégation des dimères P. Les lignes rouges indiquent les ponts disulfures reliant les dimères P.

(D) Assemblage de la structure cristalline des dimères P. Les sous-domaines P1 et P2 sont indiqués.

(E) Les particules P ont des structures antigéniques de surface semblables aux NV. La VLP (à droite) est constituée par 180 copies de VP1 avec l’expression des dimères P sur sa surface extérieure, tandis que la particule P (à gauche) n’est composée que de 12 dimères P mais avec une orientation similaire à celle de la VLP. La partie reliée par les pointillées rouges indiquent la région P2 d'un dimère P, représentant les structures antigéniques des deux particules.

P: Protruding; VLP: Virus-like particle.

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10 III- Caractéristiques génétiques du Norovirus

Le génome viral est un ARN simple brin, de polarité positive, composé de 7600 nucléotides environ (en excluant la chaine poly A située en 3’). Il est constitué à 48% de G+C et code pour trois cadres de lecture ―Open Reading Frames‖ ORF1, ORF2 et ORF3 (Jiang XN et al. 1990) (figure 6).

À l’extrémité 5’, l’ORF1 code une polyprotéine de 1 738 acides aminés et de poids moléculaire 193,5 kDa, dont la maturation se fait par clivage et donne six protéines non structurales. De l’extrémité N terminale à l’extrémité C terminale, on retrouve la protéine p48, la NTPase, la protéine p22, la protéine VPg, la 3C cystéine protéase et la 3D ARN polymérase ARN dépendante (Hardy et al. 2002 ; Ettayebi et al. 2003). L’extrémité 5’ de l’ARN viral est coiffée par la protéine virale VPg intervenant dans l’initiation de la traduction par des interactions protéines-protéines (Daughenbaugh et al. 2003).

L’ORF2 code une protéine de 530 acides aminés et de poids moléculaire 56,6 kDa, correspondant à la protéine de capside VP1 qui intègre les fonctions suivantes: assemblage de la capside, reconnaissance du récepteur des cellules épithéliales de l’intestin grêle, spécificité d’hôte, diversité de souches et immunogénicité (Chen et al. 2004). Un domaine hautement conservé pour les deux génogroupes des NV, comprenant une séquence consensus de 18 nucléotides indispensable au devenir du virus ; elle s’étend de la région codant la partie C terminale de la polymérase à la région codant la partie N terminale de la capside. Cette séquence serait un signal d’encapsidation ou un site d’initiation de la transcription et correspondrait à un site potentiel de recombinaison (Katayama et al. 2002).

L’ORF3 à l’extrémité 3’ code une petite protéine structurale mineure VP2, de 212 acides aminés et de poids moléculaire 22,5 kDa, jouant un rôle sur l’expression et la stabilité de la protéine de capside VP1 (Bertolotti-Ciarlet et al. 2003).

L’accessibilité des techniques de séquençage des gènes au cours de ces dernières années a grandement modifié l’abord de l’étude des gènes du NV. Ses principales applications sont, le génotypage et l’analyse phylogénique des souches.

Depuis l’obtention de la séquence du génome complet du virus de Norwalk, l’analyse phylogénique de différentes souches a permis de préciser leur taxonomie et de créer quatre genres dans la famille des Caliciviridae : les Lagovirus, les Vesivirus, les Norovirus et les Sapovirus (figure 7).

La prévalence des souches de NV recombinants peut être sous-estimée par le fait que la caractérisation des NV est basée uniquement sur le séquençage partiel du gène de l’ARN

(29)

11

polymérase-ARN dépendante. Idéalement, il faudrait séquencer différentes parties du génome, principalement la région codant l’ARN polymérase-ARN dépendante et la région codant la protéine de capside VP1, pour identifier de tels virus recombinants.

Figure 6 : Structure du génome des NV (Linda et al. 2004)

Hel: Helicase Pro: Protéase

Pol: ARN Polymérase

VPg: genome-linked viral protein

ORF1

ORF2

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Figure 7: Analyse phylogénétique de la capside de quelques souches représentatives des calicivirus

(Green et al. 2001)

SMSV: San Miguel Sea lion Virus; RHDV: Rabbit Hemorrhagic Disease Virus;

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13 IV- Variabilité génétique des Norovirus

Les analyses phylogénétiques classent les NV en six génogroupes (GI à GVI) dont trois comprennent des souches humaines, les génogroupes I, II et IV. Les deux principaux génogroupes affectant les humains sont le GI et le GII, avec une hétérogénéité génétique considérable entre eux. En effet, l’identité entre protéines de capsides de souches appartenant aux génogroupes I et II ne dépasse pas 60 % et ce pourcentage est encore plus faible dans la région P2. Chaque génogroupe est lui-même subdivisé en clusters ou génotypes sur la base de la séquence en acides aminés de la protéine de capside VP1. Les différents génotypes présentent 20 % à 30% de divergence dans la protéine de capside majeure VP1 codée par l’ORF2 (Lindesmith LC et al. 2008). Kroneman et ses collaborateurs ont proposé en Janvier 2013, plus de 30 génotypes à l’intérieur des trois génogroupes touchant les humains (GI 1 à 9, GII 1 à 22 et GIV 1) (figure 8) (Kroneman et al. 2013).

Depuis 1995, GII.4 a été le génotype en circulation le plus dominant, à travers le monde (Lindesmith LC et al. 2008).

Des calicivirus animaux sont également classés au sein du genre Norovirus, parmi lesquels on distingue des souches bovines avec le génogroupe III (virus Jena et Newbury-agent 2), des souches porcines avec le génogroupe II et une souche murine avec le génogroupe V (figure 9). La détection de NV dans des fèces de veaux ou de porcs présentant ou non des symptômes de gastroentérites est fréquente (Wise et al. 2004). Ces découvertes ont soulevé d'importantes questions sur une éventuelle transmission zoonotique et l'existence d'un réservoir animal pour les NV. La caractérisation moléculaire des deux prototypes de NV bovins a révélé qu'ils étaient génétiquement proches des NV humains.

Les animaux pourraient être des porteurs passifs de NV, ou bien ils pourraient être infectés de manière active par ces virus et dès lors, être responsables d'une zoonose (Scipioni A. 2009). Un mécanisme important d'évolution des NV est la recombinaison (shift), générant des modifications du génome viral et aboutissant à la création d’un génome « chimère » à partir de deux génomes parentaux différents, lors d’une co-infection (Jiang X.N. et al. 1999; Katayama K et al. 2002).

Les nouvelles souches présenteraient des mutations majeures (drift) dans la protéine VP1, notamment au niveau de la région P2 (Ambert-Balay et al. 2005). Ces mutations pourraient être à l’origine d’une modification des propriétés de liaison de ces virus à leurs récepteurs cellulaires (Bon et al. 2004).

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14

L'évolution rapide des variants du GII.4 a conduit à l'émergence de nouvelles souches associées à des épidémies mondiales, capables d'infecter des populations nouvellement sensibles par manque d’immunité protectrice (Siebenga et al. 2009).

La souche épidémique la plus récente est la souche GII.4 variant Sydney 2012. Plusieurs épidémies dues à ce nouveau variant ont été signalées en Europe, en Australie et au Japon (van Beek et al. 2013 ; Fonager et al. 2013 ; Thongprachum et al. 2014).

Ces phénomènes de recombinaison (shift) et de mutation (drift) générant de nouveaux virus, ainsi que l’émergence de nouveaux variants à l’intérieur d’un génotype donné, contribuent à la variabilité génétique des souches de NV et au dynamisme de leur circulation.

L'analyse phylogénétique des souches GII.4 au cours des 20 dernières années montre que les NV subissent tous les 2 à 3 ans environ une dérive génétique (Bull et al. 2007; Siebenga et al. 2007).

Figure 8 : Arbre phylogénétique de la région complète de la Capside du NV pour le génogroupe GI (a) et le

génogroupe GII (b) (Kroneman et al. 2013)

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Figure 9: Classification phylogénique des NV en 5 génogroupes (GI à GV), basée sur la diversité de la

séquence complète de la protéine de la capside VP1. Les génogroupes GI, GII et GIV constituent les souches norovirales humaines.

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16 V- Physiopathologie des infections à Norovirus

Le site de réplication virale primaire est le tractus intestinal supérieur ; des lésions histo-pathologiques avec raccourcissement des villosités (figure 10), une malabsorption transitoire des graisses, du D-xylose et du lactose ainsi qu’une diminution des enzymes de la bordure en brosse ont été décrites (Kohli et al. 2005).

Des études montrent que les NV se lient aux cellules épithéliales gastro- intestinales par des séquences polysaccharidiques spécifiques d’antigènes de groupe sanguin (Tan et al. 2005; Ruvoën-Clouet et al. 2013). Si ces oligosaccharides jouent le rôle de ligands pour les NV, cela n’exclut pas la nécessité d’un co-ligand, qui pourrait jouer le rôle de récepteur. Ce qui expliquerait que les cellules Caco2 exprimant ces récepteurs oligosaccharidiques, lient les particules virales mais ne permettent pas la pénétration du virus dans les cellules (Kohli et al. 2005). Les entérocytes matures des sommets des villosités intestinales expriment, de façon importante, les antigènes des systèmes A, B, O et Lewis, à la manière des globules rouges humains, et servent donc de cellules cibles préférentielles aux NV (Marionneau et al. 2002; Le pendu et al. 2006).

Les NV se sont parfaitement adaptés à leur hôte dans leur évolution. Leur cycle de vie est relativement simple. Ils se répliquent dans les entérocytes, provoquent une maladie de brève durée et sont éliminés en grande quantité pour infecter d’autres entérocytes (figure 11). Pour se multiplier dans la cellule infectée, le virus utilise sa propre ARN polymérase, qui contrairement à de nombreuses autres polymérases, n’a pas de fonction correctrice, ce qui fait que les mutations sont fréquentes et que la diversité antigénique est grande (Lopman BA et al. 2002).

Des études chez des sujets sains ont montré que certaines personnes ne développeront pas d’infection (porteurs asymptomatiques) et sont à l’origine de la dissémination du NV (Karst et al. 2003). La protection de ces personnes est mise en relation avec l’absence de récepteur au NV. Les différentes souches de NV utilisent cependant différents antigènes de groupe sanguin comme récepteurs, ce qui fait qu’aucune protection n’est garantie contre toutes les souches (de Rougemont et al. 2010).

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17

Figure 10 : Aspect des muqueuses de l’intestin grêle.

(A) Muqueuses non infectées ; (B) Muqueuses infectées par le NV avec vacuolisation (flèches bleues) et desquamation (flèches rouges) des entérocytes (Pothier et al. 2006)

Figure 11 : Cycle de vie et pathogénèse des Norovirus

(Huynen P. 2011)

Couche Muqueuse non infectée Villosités Intestinales raccourcies Villosités Intestinales

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18

L’excrétion virale dans les selles, est maximale entre le 1er

et le 3ème jour après le début des symptômes, et se termine habituellement de trois à sept jours après le début de la maladie. Les virus peuvent être détectés dans les selles à des titres faibles jusqu’à 8 semaines après le début des symptômes chez des personnes sans pathologie sous jacente (Atmar et al. 2008) et pendant plus d’un an chez des personnes immunodéprimées (Nilsson et al. 2003; Kaufmann et al. 2005). Cette détection n’implique pas nécessairement une excrétion de NV comportant un risque de transmission. L’excrétion du virus précède les symptômes chez 30% des personnes.

V-1 Caractéristiques physico-chimiques des Norovirus

Les NV font partie des virus dits non enveloppés (ne possédant pas d’enveloppe lipidique) et se caractérisent par une forte résistance aux conditions extérieures et aux désinfectants.

Les NV sont très stables dans l'environnement: 1 mois à 20°C, plus de 2 mois à 4°C. Ils sont insensibles à l'alcool ˂ 70° (Belliot et al. 2008), aux détergents anioniques à 1%. Ils sont sensibles au glutaraldéhyde 0,5%, à l'eau de Javel 1.000 ppm (partie par million), à l'iode 0,8%, au chauffage à 56°C pendant une heure.

Ils conservent leur pouvoir infectieux après exposition à pH 2,7 pendant 3 heures à température ambiante, après traitement avec 20% d’éther à 4°C pendant 18 heures ou après 30 minutes d’incubation à 60°C (Dolin et al. 1972).

Les NV sont également résistant à l’inactivation après chloration des eaux de boisson (Keswick et al. 1985).

Une étude réalisée par une équipe tunisienne, montre que les NV sont particulièrement résistants aux variations de pH et à de nombreux produits chimiques. Après rejet dans le milieu extérieur, les NV ne se multiplient pas mais vont s'agréger sur des particules organiques leur permettant de persister dans les rejets urbains et de résister aux traitements d'épuration (chlore, ozone, UV). Ils peuvent ainsi re-contaminer l'homme de diverses manières (Sdiri-Loulizi et al. 2008).

Une autre étude a montré que les NV peuvent survivre jusqu’à 12 jours sur un tapis contaminé par des vomissures (Cheesbrought et al. 2000; Evans et al. 2002).

L’intégrité du génome viral (dégradé par les U.V) et de la capside du virus (détruite par une dose de 1.000 ppm de chlore) est obligatoire pour l’infectivité des particules virales.

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V-2 Aspects immunologiques de l’infection à Norovirus

Les études sur l’immunité conférée par les NV sont nombreuses et ont généré des résultats parfois contradictoires. On peut toutefois retenir quelques faits essentiels. Pour des souches homologues (appartenant au même génotype), il existe une immunité à court terme de 6 à 14 semaines (Dolin et al. 1972; Wyatt et al. 1974), alors que l’immunité à long terme est pratiquement inexistante (Parrino et al. 1977). Cette absence d’immunité homologue et hétérologue à long terme, associée à la grande diversité des souches virales, y compris au sein du même génogroupe, rend difficile la mise en place de vaccins efficaces.

Une étude péruvienne suggère que les infections à répétition dues au NV de même génogroupe sont fréquentes mais que 97% des infections répétées sont dues à des souches de génotypes différents ou d’un nouveau variant GII.4. Ceci suggère que l’immunité est génotype-spécifique avec une faible cross-protection entre les souches de génogroupe différent (Saito et al. 2014).

L’étude de la réponse immunitaire suite à une infection à NV est difficile, vu l’impossibilité de multiplier les NV humains en culture cellulaire. C’est pourquoi, une série d’études sur des volontaires sains a été réalisée aux États-Unis pour tester le pouvoir pathogène et immunogène des NV. Ces études ont révélé que, parmi les individus dépourvus d’anticorps avant l’ingestion de virus, certains étaient sensibles à l’infection et développaient une réponse anticorps, alors que d’autres restaient asymptomatiques tout en présentant une séroconversion et en excrétant du virus pendant plusieurs semaines. Ces derniers autoriseraient ainsi des contaminations insidieuses. Une troisième catégorie de sujets restait insensible à l’infection expérimentale et ne développait pas d’anticorps (Parrino et al. 1977; Graham et al. 1994; Rockx et al. 2002).

L’existence de ce groupe d’individus dépourvus à la fois d’anticorps pré et post-infection et de sensibilité aux infections expérimentales a conduit à émettre l’hypothèse d’une résistance génétique aux infections à NV.

La susceptibilité génétique à des infections à NV est liée à l'expression des antigènes de groupe sanguin HBGA (Histo-Blood Group Antigens) sur la surface de la muqueuse de cellules épithéliales intestinales. Les HBGA sont des hydrates de carbone des groupes sanguins ABO y compris Lewis, et sont exprimés sur les précurseurs des cellules épithéliales. La susceptibilité génétique de l’hôte et les modes de liaison du NV semblent être spécifiques à la souche (certaines souches de NV ont des liaisons préférentielles aux différents hydrates de carbone de groupe sanguin HBGA). Le plus important HBGA liée à la sensibilité de la

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gastroentérite à NV est l'antigène H1 qui se trouve à la surface des cellules épithéliales et qui est codé par le gène sécréteur FUT2. Or, cet antigène sert de ligand pour les Virus Like Particles ou VLPs de NV et agit probablement comme récepteur viral (Hutson et al. 2003). Les hôtes avec des allèles mutants nuls homozygotes sont décrits comme non-sécréteurs (Figure 12). Les non-sécréteurs ont été montré comme étant résistants à l'infection au NV de genogroupe GI, y compris les souches de virus de Norwalk, ainsi qu’au NV de genogroupe GII.4, génotype prédominant dans les épidémies dans le monde (Le Pendu et al. 2006; Lindesmith et al. 2003). Cependant, un individu non sécréteur a développé une gastro-entérite dans une récente épidémie à NV GII.4, ce qui pourrait être en faveur d’une interaction virus – glycane souche spécifique (Carlsson et al. 2009).

L'attachement aux antigènes de groupe sanguin ABO est donc une part importante de la pathogénicité des infections à NV (Hutson et al. 2003; Thorven et al. 2005). Le risque d'être infecté par le virus de Norwalk pour les personnes sécrétrices présentant le phénotype O est largement supérieur à celui des personnes sécrétrices de phénotype B (Hutson et al. 2002).

Figure 12 : Modèle d’infection par NV en fonction du caractère sécréteur ou non-sécréteur (présence du gène

FUT2 fonctionnel ou pas, respectivement) (Lindesmith et al. 2003)

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D'autres études ont montré qu'une poche de fixation dans le sous-domaine P2 de la protéine de la capside virale, est responsable de l'attachement aux antigènes de groupes sanguins ABO (Tan et al. 2003). Certains acides aminés essentiels dans la reconnaissance de ces antigènes ont été identifiés par mutagenèse dirigée (Tan et al. 2004). La conservation d’une poche de fixation pour les glycanes suggère l’existence d’un motif structurel commun. Des préparations vaccinales ciblant ce motif de la région P2 seront particulièrement intéressantes en vue du développement d’un vaccin efficace contre un large spectre de souches de NV (Harrington et al. 2002).

Aucun vaccin contre les NV n'est encore disponible, toutefois les VLP possèdent des propriétés appropriées pour constituer un tel vaccin. Ces VLP sont stables après lyophilisation et suite à une exposition à pH 2,5 correspondant au pH stomacal. Ils sont fortement immunogéniques après injection par voie parentérale chez les animaux (Estes et al. 2000), orale ou intra nasale chez la souris (Ball et al. 1998; Guerrero et al. 2001).

D’après les travaux de Donaldson et ses collaborateurs, la capside des NV évolue pour échapper à la mémoire immunitaire, tout en conservant sa capacité à se lier à un ou plusieurs types de glycanes de la famille des antigènes tissulaires de groupe sanguin (Donaldson et al. 2008).

Il est à remarquer que des VLP correspondant à certaines souches de NV ne se lient pas aux récepteurs HBGA testés (Huang et al. 2005), suggérant qu’il existe d’autres mécanismes impliqués dans l’attachement des NV.

L'immunité à médiation cellulaire peut être importante pour la clairance virale des NV. Une réponse immunitaire Th1 prédominante a été observée avec une augmentation de la production de l'IFN-γ et de l'IL-2, chez des hôtes humains infectés par le NV (Lindesmith et al. 2005).

La transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques (HSCT) a été signalée chez des malades atteints d’une immunosuppression cellulaire et humorale et qui souffrent de gastroentérites chroniques à NV (Roddie et al. 2009).

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22 V- 3 Mode de transmission des Norovirus

Les épidémies d’infections à NV éclosent de préférence là où les personnes vivent très proches les unes des autres et le virus peut rapidement se transmettre par les vomissements et les diarrhées. En Suisse, 34% ont été enregistrées dans des maisons de retraite et 25% dans des hôpitaux (Fretz et al. 2005).

La grande contagiosité, la résistance des NV en milieu extérieur, ainsi que l’excrétion virale très importante (100 millions de particules virales par gramme de selles) favorisent une importante dissémination du virus (Chan et al. 2006).

Les patients infectés par le NV de génogroupe GII, ont une concentration virale 100 fois plus importante que ceux infectés par le NV de génogroupe GI (Chan et al. 2006), ce qui peut expliquer la prédominance du GII dans le monde (Lopman B. et al. 2004).

Dans les institutions communautaires, la transmission de personne à personne est de loin la plus importante voie d’infection (figure 13). La principale voie de transmission est oro-fécale, soit directement de personne à personne ou indirectement par des surfaces ou objets contaminés (Barker et al. 2004). Les vomissements produisent des gouttelettes qui sont transportées sur de longues distances. Dans les cas sporadiques ou épidémiques hors institution, les aliments ou l’eau potable contaminée sont une cause fréquente (Maunula L et al. 2005). Dans les pays industrialisés, la moitié des cas est associée à des personnes malades travaillant dans le secteur alimentaire. Les huîtres et les moules sont des aliments mis en causes dans des épidémies bien documentées de la littérature (Morse et al. 1986; Le Guyader F.S et al. 2006; Westrell et al. 2010 ; Benabbes et al. 2013).

Une étude tunisienne a montré une corrélation entre les souches de NV détectées dans les eaux usées et les coquillages et celles retrouvées dans les selles des patients. Ceci suggère qu'il existe une relation entre la contamination hydrique et les diarrhées infantiles (Sdiri-Loulizi et al.2008).

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Figure 13 : Voies de transmission des calicivirus humains. (Pothier et al. 2006)

VI- Aspects cliniques de l’infection à Norovirus

Après une période d’incubation de 6 à 48 heures surviennent nausée (95%), vomissements (81%), crampes abdominales (83%) et diarrhée aqueuse (83%). Les diarrhées sans vomissement ou les vomissements uniquement touchent un patient sur cinq environ (19 et 17% respectivement) (figure 14). Les vomissements sont plus fréquents chez les enfants. La diarrhée avec du sang dans les selles ne s’observe pratiquement jamais pour le NV et doit faire penser à une étiologie non virale.

Les épisodes de gastroentérite s’accompagnent généralement de malaise, de douleurs dans les membres et de fatigue. 50% environ des patients ont des températures subfébriles. Par ailleurs, chez la plupart des adultes en bonne santé, cette maladie ne dure que deux à trois jours. Chez les patients hospitalisés, les personnes âgées et les enfants, cette maladie peut évoluer plus sérieusement et avoir des complications. Elle peut durer plus longtemps, de quatre à six jours chez les enfants de moins de 11 ans (Rockx et al. 2002, Pang et al. 2000) et dans les épidémies nosocomiales. Elle peut se compliquer d’une déshydratation avec une altération importante de l’état général et nécessiter une hospitalisation ou entrainer le décès en

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