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Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier Discipline ou spécialité : Pharmacologie
JURY
M. Bernard BODO, Professeur, Muséum d'Histoire Naturelle, Paris Rapporteur M. Thierry CRESTEIL, Directeur de Recherche, ICSN, Gif-sur-Yvette Rapporteur M. Bruno DAVID, Directeur Approvisionnements R&D, Pierre-Fabre, Ramonville Examinateur M. Jean-Edouard GAIRIN, Professeur, Université Paul Sabatier, Toulouse Directeur de thèse
Présentée et soutenue par Lucie KRZACZKOWSKI Le 30 Septembre 2008
Titre : Recherche exploratoire de substances actives en pharmacologie antitumorale à
A mes parents,
qui m’ont transmis courage et ténacité,
qui m’ont toujours portée pour mener à bien mes études,
qui ont su m'épauler et me guider tout au long de ces années durant les moments difficiles et
Ce travail de thèse, à l’interface de la chimie et de la biologie, est le fruit d’une collaboration entre le CNRS et Pierre-Fabre. Ainsi, je remercie en tout premier lieu ces deux partenaires pour m’avoir financée les trois premières années par une bourse BDIE.
Ensuite, je tiens à remercier le Pr. Jean-Edouard Gairin à deux titres : d’une part en tant que directeur de l’UMR 2587 pour m’avoir accueillie dans son laboratoire, d’autre part en tant que directeur thèse pour m'avoir permis, par son soutien et ses conseils, par sa disponibilité et sa confiance, de préparer mon doctorat dans les meilleures conditions. Je le remercie sincèrement de m’avoir incitée à écrire la revue pour Médecine/Science, exercice de style que j’ai pris énormément de plaisir à accomplir…
Cette thèse s’étant déroulée en collaboration avec l’UMS 2597, je remercie le Dr. Georges Massiot pour son accueil, pour m’avoir permis d’effectuer les extractions des Bryophytes et les travaux de fractionnement bio-guidé. Merci aussi pour nos discussions enrichissantes autour de spectres RMN… A ce propos, j’adresse de sincères remerciements au Dr. Laurence Marcourt pour avoir enregistré ces spectres.
Je souhaite également remercier tout particulièrement le Dr. Michel Wright, Directeur de Recherche au CNRS et émérite de l’UMR avec qui j’ai passé plusieurs heures à récolter des Bryophytes et de nombreuses autres à discuter sur les phénotypes ainsi qu’à rédiger les articles. Au même titre, je remercie très sincèrement le Dr. Chantal Etievant, chercheur Pierre-Fabre de l’UMR pour son aide et ses précieux conseils, pour sa participation active à la réalisation de la publication sur les phénotypes induits par les extraits de Bryophytes… Merci à tous les deux de m’avoir fait partager votre expérience et vos compétences. Nos discussions et nos échanges furent pour moi l’occasion d’un apprentissage considérable…
Végétaux pour la R&D Pierre-Fabre, qui m’a fourni plusieurs Bryophytes, qui m’a permis de rencontrer le Pr. Yoshinori Asakawa, et qui me fait l’honneur d’être dans ce jury de thèse.
Merci infiniment à tous ceux qui ont participé à la constitution de la banque de Bryophytes par la récolte de différents échantillons. Un merci spécial au Pr. Joël Boustie qui a récolté d’importantes quantités d’Isothecium myosuroides et de Thuidium tamariscinum. Merci aussi à Mme Martine Maitre et au Dr. Nicolas Steward d’avoir tenté les cultures de micro-organismes, et à l’équipe du pôle phytophylière de Pierre-Fabre rue Ariane à Ramonville qui m’a accueillie pour me permettre d’extraire les 2 kg de Thamnobryum
alopecurum…
Je remercie l’ensemble des personnes des deux unités dans lesquelles j’ai mené mes travaux. Quelques remerciements particuliers : à Christelle, qui m’a patiemment formée aux techniques de fractionnement, à Fred, pour les boîtes de cellules et les plaques de cytotox qu’il m’a souvent préparées, merci aussi pour ta bonne humeur légendaire ! Merci à Niko, pour ton aide en cytométrie en flux. Et bien sûr, je ne saurais oublier Aude et Delphine, qui m’ont tant aidée dans le sprint final de la rédaction de ce manuscrit… Delphine, merci pour nos discussions sur les phénotypes, pour ton aide, ton soutien précieux, pour avoir été là aussi bien dans les moments heureux que dans les instants difficiles, pour ton amitié.
Plus généralement, j’adresse des remerciements à toutes les personnes de l’ISTMT que j’ai côtoyées, qui ont toujours eu un mot d’encouragement au détour d’un couloir, dans les escaliers ou bien en salle de pause. Une pensée spéciale à Vio, Annelies, les deux Jérôme…
Je n’oublie pas non plus tous mes amis Toulousains – en particulier Céline & Pierre, Céline & Damien, Matt & Sandrine, Hélène & Guillaume, Flo, Matthieu – avec qui j’ai partagé de nombreux bons moments… Merci aussi à mes amis non Toulousains – Sylvaine, Nadège, Caro, Alexa, Jérôme, Damien… – qui, même éloignés géographiquement, ont toujours été présents par leur soutien et ont cru en moi, même dans les passages difficiles.
Je remercie Denis, avec qui je partage ma vie depuis plus de 3 ans, et qui m’a soutenue sans faille dans les moments particulièrement difficiles. Merci pour m’avoir encouragée, écoutée, aidée… et supportée pendant cette période. Merci aussi pour les nombreuses heures,
t’adresse… Je n’en serais probablement là, à écrire ces quelques lignes, sans toi… Merci aussi à ses parents pour leur soutien et leurs encouragements.
« Last but not least », j’adresse un immense merci à mes parents et à mon p’tit frère Clément, pour leur soutien permanent au cours de cette thèse mais aussi tout au long de mes études, pour avoir cru en moi pendant toutes ces années. Sans vous, cette étape n’aurait probablement jamais été franchie…
Liste des abréviations………11
Avant-propos……….…13
Introduction………...……….……..………...…..17
1. Apport des substances naturelles en chimiothérapie anticancéreuse... 19
1.1. Cancer et division cellulaire ... 19
1.2. Place de la chimiothérapie dans l’arsenal des thérapies anticancéreuses... 24
1.3. Les agents chimiothérapeutiques d’origine naturelle utilisés à l’heure actuelle ... 25
1.3.1. Inhibiteurs des topoisomérases... 25
1.3.2. Agents endommageant l’ADN ... 27
1.3.3. Inhibiteurs des microtubules ... 27
1.4. Nécessité de rechercher de nouveaux agents chimiothérapeutiques ... 29
1.4.1. Composés ciblant les microtubules ... 30
1.4.2. Composés ciblant les kinésines ... 32
1.4.3. Composés ciblant les kinases mitotiques ... 33
1.4.4. Composés ciblant les histones déacétylases (HDAC)... 34
1.5. Intérêt des sources naturelles dans la recherche de nouveaux anticancéreux ... 35
1.5.1. Avantages des produits naturels par rapport aux produits de synthèse... 35
1.5.2. Intérêt de diversifier les sources naturelles et d’explorer des organismes peu étudiés à ce jour ... 36
2. Les Bryophytes, des végétaux singuliers ... 38
2.1. Originalité évolutive des Bryophytes ... 38
2.1.1. Appareil végétatif ... 39
2.1.2. Cycle de reproduction ... 40
2.2. Utilisation des Bryophytes en médecine traditionnelle... 42
2.3. Sources de métabolites particuliers et de substances bioactives ... 43
3. Travaux antérieurs de recherche en pharmacologie antitumorale à partir des Bryophytes ... 46
3.1. Les Bryophytes dans des cribles pharmacologiques ... 46
3.2. Substances cytotoxiques isolées des mousses ... 46
3.3. Substances cytotoxiques isolées des hépatiques ... 48
1. Constitution de la banque d’échantillons et d’extraits bruts de Bryophytes... 57
1.1. Matériel végétal... 57
1.2. Classification des Bryophytes dans la banque ... 58
1.3. Préparation des extraits bruts de Bryophytes ... 58
2. Études biologiques... 59
2.1. Lignée cellulaire ... 59
2.2. Essai phénotypique... 59
2.3. Détermination de la cytotoxicité ... 61
2.4. Étude du cycle cellulaire ... 62
2.5. Analyse statistique... 63
3. Études chimiques... 64
3.1. Produits chimiques ... 64
3.2. Préparation d’extraits de géloses et de suspensions de micro-organismes ... 64
3.3. Techniques utilisées pour le fractionnement bio-guidé... 65
3.3.1. Techniques de chromatographie analytique ... 66
3.3.2. Techniques de chromatographie préparative... 68
3.4. Analyses spectrales ... 69
3.4.1. Résonance magnétique nucléaire (RMN) ... 69
3.4.2. Spectrométrie de masse ... 70
3.5. Caractérisation physico-chimique des produits isolés……….70
Résultats……….……….…...…79
1. Criblage d’extraits de Bryophytes sur un essai phénotypique de perturbation de la division cellulaire... 81
1.1. Constitution de la banque d’extraits et caractérisation chimique... 81
1.1.1. Choix du solvant d’extraction ... 81
1.1.2. Analyse des extraits par CCM... 82
1.1.3. Solubilisation des extraits dans le DMSO... 82
1.2. Évaluation des extraits sur l’essai phénotypique... 83
1.2.1. Description de l’essai ... 83
1.2.2. Choix de la dilution des extraits pour le criblage... 83
1.2.3. Taux de « hits » des extraits ... 84
1.2.4. Phénotypes mis en évidence lors du criblage des extraits de Bryophytes ... 86
2. Fractionnement bio-guidé de six extraits de mousses ... 91
2.1. Choix des mousses et extraction ... 91
2.2. Stratégie globale des purifications : fractionnement bio-guidé... 92
2.3. Bilan du fractionnement bio-guidé des six mousses ... 93
2.4. Difficultés rencontrées lors des purifications et tentatives pour les surmonter... 96
2.5. Isolement de quelques composés en parallèle du fractionnement bio-guidé des extraits ………...98
mousses ... 104
3.1. Questionnement autour de l’activité des extraits de mousses ... 104
3.2. Culture in vitro d’éléments associés aux mousses ... 104
3.3. Effet d’un lavage d’échantillons de mousses avant extraction ... 106
3.4. Comparaison de la cytotoxicité d’extraits de mousses lavées et non lavées avant extraction ... 108
4. Caractérisation biologique de sept extraits de mousses... 111
4.1. Effets sur le cycle cellulaire ... 111
4.2. Caractérisation des phénotypes induits par les extraits ... 114
4.2.1. Cellules interphasiques... 115
4.2.2. Cellules mitotiques ... 117
Discussion……….…….….…..121
1. Criblage, essai phénotypique et originalité des phénotypes ... 123
1.1. Intérêt de l’essai phénotypique... 123
1.2. Criblage initial et originalité des phénotypes ... 125
1.3. Originalité des phénotypes observés à des concentrations équi-cytotoxiques ... 126
2. Intérêt des mousses dans la recherche de substances perturbant la division cellulaire et discussion sur la stratégie de fractionnement ... 129
2.1. Difficultés rencontrées ... 129
2.2. Discussion sur la stratégie de fractionnement bio-guidé... 133
3. Proposition de démarche pour rechercher les substances actives à partir des Bryophytes ... 134
3.1. Cas des mousses ... 134
3.2. Cas des hépatiques ... 135
Références……….………...137
Annexes……….……….…..149
Annexe 1 : Effets phénotypiques majeurs induits par onze produits de référence…………153
Annexe 2 : Spectres RMN du composé 1………..155 Annexe 3 : Revue de synthèse « Les Bryophytes, source potentielle des médicaments de
A : Anaphase
ACN : Acétonitrile
ATP : Adénosine Tri-Phosphate
AcOEt : Acétate d’éthyle
AIA : « Actinomycete Isolation Agar »
C6H12 : Cyclohexane
13
C : Carbone 13
CCM : Chromatographie sur couche mince
Cdk : Kinase cycline-dépendante
CH2Cl2 : Dichlorométhane
COSY : « COrrelation SpectroscopY »
Cq : Carbone quaternaire
CRPS : Centre de Recherche en Pharmacologie-Santé
CSNBA : unité de Chimie des Substances Naturelles BioActives
Cyt : Cytokinèse
δ : déplacement chimique
d : Doublet
DAD : Détecteur à réseau de diodes
DAPI : 4’,6-DiAmidino-2-PhenylIndole »
DMEM : « Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium »
DMSO : Diméthyl-sulfoxide
EDTA : « Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid »
EGTA : « Ethylene Glycol Tetra-acetic Acid »
ESI : « ElectroSpray Ionisation »
FBG : Fractionnement Bio-Guidé
HMBC : « Heteronuclear Multiple Bond Correlation »
HPLC : « High Performance Liquid Chromatography »
IC50 : Concentration inhibant 50% de la croissance cellulaire
IP : Iodure de Propidium
ISTMT : Institut des Sciences et Technologies du Médicament de Toulouse
J : Constante de couplage 1J (Hz)
J-mod : « J-modulated »
Lc : « Lagging chromosome »
LC-MS : « Liquid Chromatography - Mass Spectrometry »
m : Multiplet
M : Métaphase
MeOH : Méthanol
MS : « Mass Spectrometry »
NCI : « National Cancer Institute »
O.N. : Ouverture Numérique
PBS : « Phosphate Buffered Saline »
PDA : « Potato Dextrose Agar »
PEM : Pipes EGTA MgCl2
PFA : Paraformaldéhyde
Pgp : Glycoprotéine P
Plk : « Polo-like » kinases
PM : Prométaphase
ppm : Partie par million
q : Quadruplet
RMN : Résonance Magnétique Nucléaire
RP18 : « Reverse Phase-18 »
s : Singulet
t : Triplet
T : Télophase
TGY : « Tryptone Glucose Yeast »
uma : Unité de masse atomique
Avant
Avant
Avant
Avant----propos
propos
propos
propos
Selon le rapport de l’Institut National du Cancer en 2007, depuis le début du XXIème
siècle, le cancer est toujours en progression en France [1]. Il touche environ 900 000 personnes avec près de 280 000 nouveaux cas par an. Entre 1980 et 2000, le nombre de cas diagnostiqués a augmenté de 60%, en partie en raison de l’accroissement et du vieillissement de la population. Dans cette période de 20 ans, la mortalité a elle augmenté de 20%. Aujourd’hui, les cancers sont la première cause de mortalité chez les moins de 65 ans et la seconde cause de décès tous âges confondus. Chez les adultes, un tiers des décès masculins et un quart des décès féminins sont dus aux cancers. Les chances de survie à 5 ans, évaluées pour les patients chez qui une guérison ou une rémission sont observées, varient suivant les pathologies. En effet, différents types de cancers existent selon le tissu et le type cellulaire dont ils dérivent. Ainsi, pour les femmes atteintes d’un cancer du sein, la survie à 5 ans est de 85% alors qu’elle n’est que de 7% pour les malades d’un cancer du foie. La première cause de mortalité par cancer est le cancer du poumon, pour lequel la survie à 5 ans est de 14%. Compte tenu du taux de guérison encore limité de nombreux cancers et l’absence de traitements pour certains d’entre eux, la lutte contre le cancer reste aujourd’hui un enjeu majeur de santé publique.
Les traitements anticancéreux incluent principalement, suivant le type de cancer et son degré d'évolution, la chirurgie, la chimiothérapie et la radiothérapie. Dans la plupart des cas, une combinaison de plusieurs approches est utilisée. La chimiothérapie consiste en l’administration de substances qui agissent sur les cellules soit en les détruisant, soit en empêchant leur prolifération. Elle est rarement utilisée de façon isolée, elle est le plus souvent associée à la chirurgie et/ou la radiothérapie. Actuellement, plus de 60% des anticancéreux utilisés en chimiothérapie sont des substances naturelles, des produits dérivés ou inspirés de
tournée vers les plantes supérieures. Cependant la découverte de nouveaux archétypes structuraux est devenue rare, suggérant que la diversité chimique associée à la biodiversité des végétaux supérieurs n’est peut-être pas aussi élevée qu’on le supposait. Depuis une vingtaine d’années, la recherche d’agents chimiothérapeutiques naturels s’est orientée vers les organismes marins et les micro-organismes. Parmi les organismes vivants n’ayant pas fait l’objet d’études approfondies dans la recherche de nouveaux composés actifs dans le domaine antitumoral, on trouve par exemple les Insectes, les Algues et les Bryophytes. Ces dernières ont rarement été étudiées puisqu’à ce jour, moins de 10% des Bryophytes ont fait l’objet d’investigations phytochimiques, souvent succinctes. Il s’agit de plantes terrestres, largement représentées par les mousses et les hépatiques, adaptées à des écosystèmes particuliers. Leurs positions écologique et évolutive singulières laissent envisager la présence de métabolites aux propriétés chimiques et biologiques originales.
Sur la base de cette hypothèse, mon travail de thèse a consisté à déterminer l’intérêt des Bryophytes dans la recherche de nouveaux anticancéreux. Pour cela, une banque d’échantillons de 221 mousses et 16 hépatiques a tout d’abord été criblée. L’effet des extraits de ces végétaux a été évalué sur un essai phénotypique après immunomarquage des cellules cancéreuses humaines HeLa et microscopie à fluorescence. Un important travail a ensuite été mené pour isoler, par fractionnement bio-guidé, les substances capables de perturber la division cellulaire à partir de six extraits de mousses. Malgré tous les efforts, il n’a pas été possible d’isoler ou caractériser les produits actifs. Ces travaux ont par ailleurs soulevé plusieurs interrogations sur l’origine réelle de l’activité des extraits de mousses. Le projet a alors été orienté sur des analyses biologiques à des concentrations équi-cytotoxiques de sept extraits de mousses actifs. Leurs effets ont été évalués sur les cellules HeLa, d’une part par l’analyse du cycle cellulaire en cytométrie en flux, d’autre part par la quantification des anomalies des cellules interphasiques et mitotiques après immunomarquage et microscopie à fluorescence.
Ce projet a été réalisé au sein de deux unités mixtes CNRS-Pierre Fabre de l’ISTMT (Institut des Sciences et Technologies du Médicament de Toulouse) : le Centre de Recherche en Pharmacologie-Santé (CRPS, UMR 2587), où j’ai développé la partie pharmacologique du projet (équipe C. Etiévant), et l’unité de Chimie des Substances
(équipe G. Massiot).
La première partie de ce manuscrit est consacrée à une étude bibliographique sur l’apport des substances naturelles en chimiothérapie anticancéreuse et l’intérêt que peuvent représenter les Bryophytes dans la recherche de nouveaux composés actifs sur la division cellulaire.
La seconde partie présente les différents matériels et méthodes utilisés.
La troisième partie expose les résultats obtenus et se compose de quatre chapitres. La stratégie et les résultats du criblage des extraits sur l’essai phénotypique sont présentés dans le premier chapitre. Ensuite, sont détaillés les travaux de recherche d’isolement des substances actives par fractionnement bio-guidé à partir de six extraits de mousses. Le troisième chapitre expose la mise en évidence d’une origine extrinsèque de l’activité de certains extraits de mousses. Enfin, le dernier chapitre détaille l’étude biologique qui a porté sur sept espèces de mousses pour lesquelles l’activité est intrinsèque.
Dans la dernière partie de ce manuscrit, les résultats obtenus sont discutés et une stratégie pour l’étude pharmacologique des Bryophytes est proposée en distinguant les hépatiques d’une part et les mousses d’autre part.
Introduction
Introduction
Introduction
Introduction
1.
Apport des substances naturelles en chimiothérapie anticancéreuse
1.1. Cancer et division cellulaire
Les cellules tumorales sont caractérisées par une prolifération excessive et incontrôlée, contrairement aux cellules saines dont les cycles de division cellulaire sont finement régulés. Le cycle cellulaire eucaryote est composé de deux étapes principales : l’interphase, subdivisée en trois phases (G1, S, G2), au cours de laquelle l’ADN et les composants du cytosol sont dupliqués, et la mitose qui assure une répartition homogène du matériel génétique et du cytoplasme entre les deux cellules filles (figure 1).
MITOSE INTERPHASE Quiescence Signaux mitogènes Point de contrôle Réplication de l’ADN Points de contrôle Points de contrôle MITOSE INTERPHASE Quiescence Signaux mitogènes Point de contrôle Réplication de l’ADN Points de contrôle Points de contrôle
Figure 1 : Étapes du cycle cellulaire (d’après Meijer)
Le cycle cellulaire est divisé en quatre phases : G1, S, G2 et M. Le passage de l’état quiescent G0 à la phase G1 marque l’entrée de la cellule en division et est initié par des facteurs mitogènes. L’engagement de la cellule dans le cycle est alors irréversible.
Toutes ces phases du cycle cellulaire surviennent dans un ordre précis et chaque phase ne peut débuter que si la précédente est totalement terminée. En effet, le déroulement correct
contrôle sont activés et entraînent soit un blocage du cycle nécessaire aux réparations soit une élimination des cellules endommagées.
Les microtubules sont des éléments du cytosquelette essentiels à la division cellulaire puisqu’ils sont les composants essentiels du fuseau mitotique. Ils ont également un rôle important dans la morphologie, la polarité et la mobilité des cellules ainsi que pour le transport intracellulaire d’organites. Les microtubules sont des structures tubulaires
dynamiques composées d’un assemblage de dimères de tubuline α et de tubuline β [3].
L’addition et l’élimination de ces hétérodimères se produit en permanence aux extrémités des microtubules qui oscillent donc entre assemblage et désassemblage : ce phénomène est appelé l’instabilité dynamique [4]. Les microtubules forment ainsi un réseau dynamique organisé autour d’un centre organisateur des microtubules, le centrosome [5] (figure 2). Chaque centrosome est composé de deux centrioles et de matériel péricentriolaire, un amas dense de protéines entourant les centrioles. Les microtubules sont nucléés à partir de ces centrosomes
et plus particulièrement à partir de complexes contenant de la γ-tubuline, protéine apparentée
aux tubulines α et β. Dans les cellules HeLa la γ-tubuline a été non seulement localisée aux
centrosomes mais également sur les microtubules du fuseau mitotique [6]. Les centrosomes suivent un cycle coordonné au cycle cellulaire [7].
Microtubules Matériel péricentriolaire Complexes contenant la γγγγ-tubuline Centrioles Microtubules Matériel péricentriolaire Complexes contenant la γγγγ-tubuline Centrioles α αα α ββββ Dimères de tubuline α et tubuline β Formation d’un microtubule Microtubule 8 nm 24 nm α αα α ββββ Dimères de tubuline α et tubuline β Formation d’un microtubule Microtubule 8 nm 24 nm
A
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Microtubules Matériel péricentriolaire Complexes contenant la γγγγ-tubuline Centrioles Microtubules Matériel péricentriolaire Complexes contenant la γγγγ-tubuline Centrioles α αα α ββββ Dimères de tubuline α et tubuline β Formation d’un microtubule Microtubule 8 nm 24 nm α αα α ββββ Dimères de tubuline α et tubuline β Formation d’un microtubule Microtubule 8 nm 24 nmA
B
Figure 2 : Les microtubules et le centrosome
A : Formation d’un microtubule à partir d’hétérodimères de tubuline constitués d’une paire de
monomères de tubuline α et β reliés par des liaisons non covalentes (d’après [8])
B : Représentation schématique d’un centrosome. Les centrioles (en vert) sont perpendiculaires et
entourés de matériel péricentriolaire (en rose). Les microtubules (en bleu) sont nucléés à partir de complexes contenant de la γ-tubuline (en rouge) dans le matériel péricentriolaire.
L’interphase représente au moins 90% de la durée du cycle. La phase G1 correspond à une période d’activités métaboliques intenses. Durant la phase S, les centrioles et le matériel génétique sont dupliqués. La duplication fidèle de l’ADN met en jeu une importante machinerie protéique et implique notamment l’activité d’ADN polymérases, d’hélicases, de topoisomérases et de ligases [9]. Lors de la phase G2, la maturation des centrosomes a lieu et
les complexes contenant la γ-tubuliney sont recrutés. La morphologie globale des cellules
varie peu durant ces trois phases. Les cellules présentent un noyau unique contenant de l’ADN décondensé entouré d’une membrane nucléaire et un réseau cytoplasmique microtubulaire organisé autour des centrosomes. Des endommagements ou des réplications partielles de l’ADN activent les points de contrôle, conduisant à un blocage du cycle cellulaire pendant lequel la cellule va tenter de réparer son ADN.
Le déroulement de la mitose est essentiellement soumis à la dynamique des microtubules qui s’organisent de façon symétrique dans la cellule à partir des deux centrosomes nouvellement séparés [10]. Le fuseau mitotique ainsi formé assure l’alignement des chromosomes sur la plaque équatoriale en métaphase et permet la séparation physique et quantitative des chromatides sœurs entre les deux cellules filles. La mitose est classiquement divisée en cinq étapes : la prophase, la prométaphase, la métaphase, l’anaphase et la télophase (figure 3). En prophase, l’ADN se condense, et les microtubules se réorganisent dans le cytoplasme pour former deux asters à partir des centrosomes. En fin de prophase, la membrane nucléaire se rompt. En prométaphase, les centrosomes migrent de chaque côté de la cellule et le fuseau mitotique bipolaire se met en place. Les extrémités libres des microtubules interagissent avec les chromosomes. La métaphase est caractérisée par un fuseau bipolaire symétrique et par l’alignement, perpendiculaire à l’axe du fuseau, de tous les chromosomes formant la plaque équatoriale. Lors de l’anaphase, les chromatides sœurs de chaque chromosome sont séparées et le fuseau de microtubules entraîne leur migration vers les pôles de la cellule. Enfin, la télophase est marquée par la décondensation des chromosomes, la re-formation de deux enveloppes nucléaires autour de chaque masse d’ADN, et l’apparition du « midbody » qui sera le lieu de l’invagination entre les deux cellules filles. La séparation physique des deux cellules filles est appelée cytokinèse.
Prophase Prométaphase Métaphase Anaphase Télophase Cytokinèse Point de contrôle mitotique Prophase Prométaphase Métaphase Anaphase Télophase Cytokinèse Point de contrôle mitotique
Figure 3 : Les étapes de la mitose. Les microtubules sont marqués en rouge, les centrosomes en vert et
l’ADN en bleu. Photographies de cellules cancéreuses humaines HeLa prises au laboratoire avec un microscope à fluorescence Zeiss Axiovert 200 M couplé à une caméra AxioCam MRm.
De nombreuses protéines sont impliquées dans la régulation de la progression de la cellule en mitose, notamment plusieurs familles de kinases et de moteurs moléculaires, les kinésines et les dynéines [11]. Des mécanismes de surveillance assurent également l’intégrité du déroulement de la mitose et la bloquent lorsque des anomalies sont détectées. Notamment, le point de contrôle mitotique est situé à la transition métaphase/anaphase. Il reste activé tant que les chromosomes ne sont pas correctement alignés en métaphase. En effet, tant que les deux chromatides de chaque chromosome ne sont pas correctement attachées aux microtubules du fuseau mitotique, la séparation des chromatides sœurs et l’entrée en anaphase sont empêchées [12].
Les cellules tumorales présentent des caractéristiques qui leur permettent notamment d’échapper à la régulation de la division cellulaire. La perte ou les altérations des voies de contrôle de la division dans les cellules cancéreuses réduisent la fidélité des évènements cellulaires tels que la réplication et la ségrégation des chromosomes conduisant à une instabilité génétique et à l’aneuploïdie [12, 13]. Des perturbations dans le nombre, la fonction
et l’intégrité des centrosomes peuvent également contribuer à l’aneuploïdie et donc à l’oncogénèse [8].
Il est admis que le cancer dérive d’une succession d’anomalies dans le génome [14]. L’initiation du processus néoplasique est due à une mutation initiale située dans un oncogène (tout gène dont l’activation participe à l’oncogénèse), dans un gène suppresseur de tumeur (tout gène dont la perte de fonction favorise l’oncognénèse) ou d’autres gènes impliqués dans la croissance et la prolifération cellulaire [14]. La protéine mutée résultante, dite oncoprotéine, confère alors un avantage sélectif à la cellule qui prolifère de façon clonale [15]. Les cellules sont génétiquement instables et se multiplient en accumulant des anomalies génétiques et chromosomiques.
Hanahan et Weinberg ont proposé six altérations nécessaires à la croissance tumorale [16]. Selon les auteurs, ces altérations sont caractéristiques de la plupart des types de cancer mais les mécanismes et l’ordre chronologique d’apparition varient selon les cancers :
(a) Acquisition de leurs propres signaux de croissance. Dans les cellules normales,
le passage de l’état quiescent à l’entrée dans le cycle cellulaire est soumis à une stimulation par des signaux mitogènes sans lesquels elles ne peuvent pas proliférer. Au contraire, les cellules cancéreuses produisent leurs propres signaux de croissance réduisant ainsi leur dépendance au microenvironnement tissulaire.
(b) Insensibilité aux signaux de non-prolifération.
(c) Echappement à la mort cellulaire programmée (apoptose), souvent lié à
l’inactivation de la protéine p53 issue du gène suppresseur de tumeur P53.
(d) Stimulation de l’angiogénèse. A partir d’une certaine masse tumorale les
cellules cancéreuses émettent des signaux pour recruter les cellules vasculaires du tissu environnant, afin de favoriser la formation de nouveaux vaisseaux sanguins. La tumeur vascularisée peut ainsi subvenir à ses propres besoins et envahir progressivement le tissu de l’hôte.
(e) Acquisition de pouvoirs invasifs et métastasants. Les cellules métastatiques
1.2. Place de la chimiothérapie dans l’arsenal des thérapies anticancéreuses
La prolifération excessive des cellules cancéreuses est ciblée par les thérapies anticancéreuses classiques basées sur l’utilisation de rayons ionisants (radiothérapie), et/ou l’administration de médicaments (chimiothérapie). Elles sont utilisées seules ou en complément d’une extraction chirurgicale de la tumeur, lorsque que cette dernière est possible.
La chimiothérapie consiste en l’administration de médicaments qui agissent sur les cellules cancéreuses en empêchant leur prolifération. Selon le rapport de l’Institut National du Cancer sur la situation du cancer en France en 2007, elle représente 18% des activités en oncologie derrière la chirurgie (42%) et devant les autres traitements tels que la radiothérapie, l’hormonothérapie ou la thérapie génique [1]. L’utilisation de la chimiothérapie est en forte croissance comme l’indique son volume d’activité qui a augmenté de 46% entre 2003 et 2005.
L’utilisation de la chimiothérapie anticancéreuse dépend du type de cancer à traiter. Cette thérapie est administrée seule dans le cas d’une chimiothérapie à visée curative. Plusieurs agents anticancéreux avec des mécanismes d’action différents sont généralement combinés pour augmenter l’efficacité du traitement. La chimiothérapie est également utilisée de façon complémentaire à la chirurgie ou à la radiothérapie. Elle est alors administrée préalablement à l’acte chirurgical (chimiothérapie néoadjuvante) ou en parallèle d’un autre traitement afin de prévenir le développement de métastases (chimiothérapie adjuvante) [15]. La chimiothérapie complémentaire est utilisée car statistiquement les malades ont plus de chances de survie qu’en l’absence de chimiothérapie.
Les principaux agents chimiothérapeutiques utilisés actuellement peuvent être regroupés en trois catégories selon leur mode d’action [15] : les premiers perturbent la synthèse d’ADN, les seconds introduisent des dommages à l’ADN, les troisièmes inhibent les fonctions du fuseau mitotique. L’ADN et les microtubules sont donc les deux cibles essentielles des agents chimiothérapeutiques. Plusieurs dizaines de composés naturels ou synthétiques sont utilisés en chimiothérapie anticancéreuse. Parmi ces agents, plus de 60% sont soit directement isolés de sources naturelles, soit dérivés de produits naturels après modification chimique ou encore entièrement synthétiques mais dont la structure est inspirée
de produits naturels [17]. Ce sont parmi tous ces composés que sont issus les exemples présentés ci-dessous.
1.3. Les agents chimiothérapeutiques d’origine naturelle utilisés à l’heure actuelle
1.3.1. Inhibiteurs des topoisomérases
Les nombreux inhibiteurs des topoisomérases sont considérés comme les agents chimiothérapeutiques les plus efficaces utilisés en clinique [18]. Les topoisomérases régulent les enroulements de la double hélice d’ADN afin de permettre sa réplication correcte [19]. Elles assurent leurs fonctions en réalisant des coupures réversibles dans la double hélice après avoir formé des liaisons covalentes à l’ADN. Deux classes de topoisomérases (I et II) sont distinguées d’après le nombre de brins d’ADN qu’elles clivent lors de leur activité catalytique.
Isolée au début des années 1970 d’un extrait des écorces de l’arbre Camptotheca
acuminata (Nyssaceae), la camptothécine (tableau 1) est le premier poison agissant sur la
topoisomérase I à avoir été découvert [20]. Elle agit en stabilisant le complexe covalent topoisomérase I-ADN et inhibe ainsi la réplication de l’ADN induisant un blocage des cellules en phase S et finalement la mort de ces cellules. Cette substance, peu soluble dans l’eau et fortement toxique, n’est pas utilisée en clinique. Le Topotécan et l’Irinotécan, deux dérivés hémisynthétiques de la camptothécine, sont des inhibiteurs puissants de la topoisomérase I, plus solubles dans l’eau que leur analogue naturel, et utilisés pour le traitement de plusieurs tumeurs solides [21]. D’autres analogues sont actuellement en essais cliniques afin d’étendre le potentiel thérapeutique de cette famille de composés [22].
N N O O O HO N N O O O HO N HO N N O O O HO O O N N
Composé Structure Source Cible Utilisation thérapeutique
Camptothécine
feuilles de Camptotheca
acuminata
topoisomérase I aucune, trop toxique
Topotécan
dérivé hémisynthétique
de la camptothécine
topoisomérase I cancer métastatique de l'ovaire,
cancer du poumon à petites cellules
Irinotécan
dérivé hémisynthétique
de la camptothécine
topoisomérase I cancer colorectal N N O O O HO N N O O O HO N HO N N O O O HO O O N N
Composé Structure Source Cible Utilisation thérapeutique
Camptothécine
feuilles de Camptotheca
acuminata
topoisomérase I aucune, trop toxique
Topotécan
dérivé hémisynthétique
de la camptothécine
topoisomérase I cancer métastatique de l'ovaire,
cancer du poumon à petites cellules
Irinotécan
dérivé hémisynthétique
de la camptothécine
topoisomérase I cancer colorectal
Tableau 1 : Exemples de substances naturelles et hémisynthétiques inhibitrices de la topoisomérase I
L'étoposide (tableau 2), un des premiers agents ciblant la topoisomérase II, est dérivé de la podophyllotoxine issue des racines de Podophyllum peltatum (Berberidaceae) [23]. Il est par exemple utilisé dans le traitement de cancers du poumon, du testicule ou de glioblastomes [24]. Six substances ciblant la topoisomérase II font actuellement l’objet d’études cliniques [18]. O O O OCH3 OH H3CO O O O O O R OH HO Etoposide: R = CH3 Teniposide: R = S
topoisomérase II,
pas d'effet sur les microtubules dérivé
semi-synthétique de la podophyllotoxine
topoisomérase II,
inhibition de la polymérisation des microtubules racines de Podophyllum peltatum Cible Source naturelle Structure
topoisomérase II,
pas d'effet sur les microtubules dérivé
semi-synthétique de la podophyllotoxine
topoisomérase II,
inhibition de la polymérisation des microtubules racines de Podophyllum peltatum Cible Source naturelle Structure O O O OCH3 OCH3 H3CO O OH podophyllotoxine
1.3.2. Agents endommageant l’ADN
Les agents intercalants, comme les anthracyclines et la bléomycine issus de différents champignons du genre Streptomyces, induisent des dommages à l’ADN (tableau 3) [25]. La daunorubicine et la doxorubicine sont utilisées en clinique pour le traitement des leucémies et des lymphomes.
Composé, Structure Source naturelle Cible
Streptomyces verticillus ADN
champignons du genre
Streptomyces ADN et complexe ADN-topoisomérase II
N N H2N HN O O N H O N H N O H N HO O NH N S S N O N H S H N O H2N NH2 O NH2 H HO H H O O O O NH2 O OH OH HO OH H OH H OH O R OH O O O OH O OH O OH NH2 Bléomycine A2 Doxorubicin e: R=OH Dau norubici ne: R=H
Tableau 3 : Intercalants naturels de l’ADN
1.3.3. Inhibiteurs des microtubules
Les inhibiteurs des microtubules agissent en se liant à la tubuline, perturbant la mise en place correcte d’un fuseau mitotique fonctionnel. Le cycle cellulaire est arrêté en mitose à la transition métaphase/anaphase ; l’activation du point de contrôle mitotique entraîne par conséquent la mort de la cellule. La plupart des substances agissant directement sur la mitose sont issues de sources naturelles [3, 26].
Parmi les agents chimiothérapeutiques ciblant les microtubules, deux catégories ont été définies d’après leurs mécanismes d’action (tableau 4) :
- ceux qui inhibent l’assemblage des microtubules, tels que les Vinca-alcaloïdes et
leurs dérivés [28]. Isolés de la pervenche de Madagascar Catharanthus roseus (Apocynaceae), la vinblastine et la vincristine sont des produits naturels utilisés en chimiothérapie anticancéreuse depuis 50 ans [29]. Ces composés se lient à la
tubuline β avec une haute affinité. Ils sont notamment utilisés dans le traitement du
cancer du poumon, du sein et des lymphomes.
- ceux qui inhibent le désassemblage des microtubules, tels que les taxanes. Isolé en
1971 de Taxus brevifolia (Taxaceae) [30] et mis sur le marché en 1992, le paclitaxel (Taxol®) fut le premier composé découvert pour son activité de stabilisation des microtubules [31]. Comme la source naturelle est limitée, le taxol a d’abord été produit par des approches hémisynthétiques et aujourd’hui par des cultures de cellules végétales [32]. Les taxanes sont utilisés dans le traitement du cancer du poumon, du sein et de la prostate.
Structure Source naturelle Effet sur les cellules HeLa à forte concentration
Feuilles de la pervenche de Madagascar Catharanthus
roseus
Ecorce de tronc de l'if Taxus brevifolia O O Ph NH O Ph OH O OH AcO O OH OCOPh H OAc N OH N H H3CO2C N N HO OCOCH3 H CO2CH3 H O R H3C Vinblastine: R = CH3 Vincristine: R = CHO
Tableau 4 : Exemples de poisons naturels des microtubules. Les photographies de la colonne de droite
ont été prises au laboratoire avec un microscope à fluorescence Zeiss Axiovert 200 M couplé à une caméra AxioCam MRm. Il s’agit de cellules cancéreuses humaines HeLa marquées pour les microtubules en vert, les centrosomes en rouge et l’ADN en bleu.
Ces trois familles d’agents se lient aux microtubules sur des sites distincts (figure 4) expliquant leurs mécanismes d’action différents [8, 33].
vinblastine taxol colchicine α αα α ββββ vinblastine taxol colchicine α αα α ββββ
Figure 4 : Les sites de liaison des agents antimitotiques sur les microtubules (d’après [8])
Aujourd’hui, il est admis qu’à de faibles concentrations (concentrations cliniques de l’ordre du nanomolaire) les molécules dites stabilisatrices ou déstabilisatrices des microtubules modifient la dynamique des microtubules [3]. Ces composés bloquent la mitose à la transition métaphase/anaphase et induisent la mort cellulaire. Cependant, bien que ces composés soient utilisés cliniquement, les mécanismes par lesquels ils induisent la mort des cellules tumorales ne sont pas encore bien compris.
1.4. Nécessité de rechercher de nouveaux agents chimiothérapeutiques
L’utilisation des anticancéreux chimiothérapeutiques actuels se heurte à plusieurs obstacles majeurs dont le manque de spécificité, la toxicité et l’induction de phénomènes de résistance [34].
De nombreux effets secondaires sont observés lors de l’administration des agents chimiothérapeutiques, tels que des nausées, des vomissements, des diarrhées… [26]. Ces effets sont liés au fait que les anticancéreux ne sont pas sélectifs des cellules tumorales et
substances agissant sur leur dynamique affectent le transport axonal, ce qui peut expliquer la neurotoxicité.
Différentes causes sont impliquées dans les phénomènes de résistance. Des transporteurs membranaires tels que la glycoprotéine P (Pgp) expulsent les anticancéreux hors de la cellule ce qui conduit à une concentration intracellulaire de composés cytotoxiques faible. Par conséquent, l’élimination des cellules cancéreuses est limitée. La surexpression de ces protéines représente l’un des mécanismes les plus courants de la résistance multidrogues en cancérologie. Des inhibiteurs synthétiques et naturels de Pgp ont été développés mais leur efficacité clinique est décevante [35]. Dans le cas des poisons agissant sur les microtubules, l’expression d’isoformes de tubuline minoritaires ou mutées peut également participer à des phénomènes de résistance [36].
Un défi important réside dans la recherche d’agents chimiothérapeutiques plus spécifiques des cellules cancéreuses, de nouvelles molécules capables de contourner les résistances et de substances agissant sur les cancers pour lesquels il n’existe pas encore de traitement. Plusieurs stratégies sont mises en œuvre pour chercher de nouveaux antitumoraux, comme par exemple la recherche de nouveaux bloqueurs mitotiques. Cette stratégie passe par l’amélioration des agents chimiothérapeutiques ciblant les microtubules ou par la recherche de composés qui inhibent de nouvelles cibles. L’objectif est de trouver des substances pouvant agir sur la progression de la mitose sans inhiber les fonctions des microtubules. Les kinésines et les kinases mitotiques, protéines associées à la tubuline et spécifiques de la mitose, sont des cibles privilégiées dans cette stratégie [37]. Ce sont des protéines clés dans la progression du cycle cellulaire et leur inhibition représente une nouvelle approche pour perturber le fuseau mitotique sans cibler directement les microtubules. Au laboratoire, c’est cette stratégie de recherche de composés bloquant la division cellulaire mais n’agissant pas nécessairement sur les microtubules qui a été privilégiée.
1.4.1. Composés ciblant les microtubules
Le succès clinique des anticancéreux ciblant les microtubules peut inciter à rechercher de nouveaux composés agissant sur ces structures protéiques dynamiques mais ne conduisant pas à des phénomènes de résistance. Les substances naturelles fournissent encore de
nombreux agents dans cette stratégie [38] et permettent ainsi de diversifier l’arsenal des composés potentiellement utilisables en chimiothérapie anticancéreuse. De nombreuses molécules sont actuellement en cours d’essais pré-cliniques et cliniques et des revues récentes font l’état des lieux de ces différentes substances et de leurs mécanismes d’action [39, 40]. Quatre catégories de composés peuvent être identifiées selon leur domaine de liaison aux microtubules : le site de liaison à la colchicine, le domaine Vinca (sites identiques ou chevauchants les sites Vinca), le domaine taxane (sites identiques ou chevauchants les sites taxanes) ainsi que d’autres sites de liaison. Le tableau 5 expose quelques uns de ces agents antitumoraux potentiels. OH O NH2 O O O HO H OH OH N H N O N O O N O O O H N S N S N O O OH O O OH OCH3 OCH3 H3CO H3CO O P O O O Na Na O H2N OH O MeO O O O H H O O O O
Composé Structure Source naturelle Domaine de liaison
à la tubuline Phases d'essais cliniques Référence combretastatine A-4 phosphate écorce de l'arbre sud-africain, Combretum caffrum
site colchicine phases I/II Butler MS 2008
dolastatine 10
mollusque marin
Dolabella auricularia
domaine Vinca phase II Butler MS
2008 E7389, analogue synthétique de l'halichondrine B halichondrine B isolée initialement de l'éponge marine Halichondria ok adai
domaine Vinca phases I/II http://www.clini caltrials.gov/ discodermolide éponge Discodermia dissoluta domaine taxane phase I arrêtée en 2007 en raison d'une forte toxicité
Altmann KH & Gertsch J 2007 épothilone B myxobactérie Sorangium cellulosum
domaine taxane phases II/III Altmann KH & Gertsch J 2007 OH O NH2 O O O HO H OH OH N H N O N O O N O O O H N S N S N O O OH O O OH OCH3 OCH3 H3CO H3CO O P O O O Na Na O H2N OH O MeO O O O H H O O O O
Composé Structure Source naturelle Domaine de liaison
à la tubuline Phases d'essais cliniques Référence combretastatine A-4 phosphate écorce de l'arbre sud-africain, Combretum caffrum
site colchicine phases I/II Butler MS 2008
dolastatine 10
mollusque marin
Dolabella auricularia
domaine Vinca phase II Butler MS
2008 E7389, analogue synthétique de l'halichondrine B halichondrine B isolée initialement de l'éponge marine Halichondria ok adai
domaine Vinca phases I/II http://www.clini caltrials.gov/ discodermolide éponge Discodermia dissoluta domaine taxane phase I arrêtée en 2007 en raison d'une forte toxicité
Altmann KH & Gertsch J 2007 épothilone B myxobactérie Sorangium cellulosum
domaine taxane phases II/III Altmann KH & Gertsch J 2007
celui des taxanes [42]. Ils ont le même effet biologique que le taxol in vitro et l’inhibent de façon compétitive (même site de liaison sur la tubuline ou sites chevauchants). Les épothilones ont l’avantage de démontrer une activité antiproliférative sur différentes lignées cellulaires tumorales résistantes au taxol [43]. La patupilone, qui est l’épothilone B naturelle, est actuellement en phases II et III de plusieurs essais cliniques. Des dérivés hémisynthétiques, comme l’ixabepilone, présentent une solubilité dans l’eau accrue par rapport aux épothilones naturelles, ce qui en font des agents antitumoraux potentiels. Récemment, l’ixabepilone a reçu l’autorisation américaine de mise sur le marché pour le traitement des cancers métastatiques du sein résistants aux anthracyclines et aux taxanes [44]. A ce jour, tous les composés connus agissant comme stabilisateurs des microtubules sont des produits naturels ou dérivés de substances naturelles [39].
1.4.2. Composés ciblant les kinésines
Les kinésines sont des moteurs moléculaires capables de se lier et de se déplacer le long des microtubules. En mitose, plusieurs de ces protéines sont essentielles pour la séparation des centrosomes, l’alignement correct des chromosomes en métaphase et leur attachement aux microtubules [45]. La kinésine Eg5 est parmi les protéines les plus étudiées pour ses rôles dans la formation d’un fuseau bipolaire en prométaphase et la ségrégation des chromatides en anaphase. Le premier inhibiteur d’Eg5 identifié a été le monastrol, composé de synthèse, qui induit un blocage des cellules en prométaphase caractérisées par un fuseau mono-astral et deux centrosomes non séparés (tableau 6) [46, 47]. Des criblages ont été conduits afin de trouver d’autres inhibiteurs de cette kinésine [48] ; certains composés sont aujourd’hui en cours d’essais cliniques et présentent une toxicité acceptable [37, 49]. Le seul produit naturel inhibiteur d’Eg5, le terpendole E, isolé d’une souche fongique proche de champignons du genre Albophoma [50] est actuellement en cours d’essais pré-cliniques [51].
Composé Source Structure Effet sur les cellules HeLa à forte concentration
monastrol synthèse chimique
terpendole E souche fongique similaire à
Albophoma yamanashiensis OH N H NH O O S N H O H H OH H OH
Tableau 6 : Exemples de composés inhibant la kinésine Eg5. Les photographies de la colonne de droite
ont été prises au laboratoire avec un microscope à fluorescence Zeiss Axiovert 200 M couplé à une caméra AxioCam MRm. Il s’agit de cellules cancéreuses humaines HeLa marquées pour les microtubules en vert, les centrosomes en rouge et l’ADN en bleu. Les cellules mitotiques sont bloquées au stade prométaphase et présentent un fuseau de microtubules monopolaire.
1.4.3. Composés ciblant les kinases mitotiques
Parmi les kinases mitotiques, essentiellement deux familles font l’objet d’investigations pour la recherche d’inhibiteurs : les kinases Aurora et les « polo-like » kinases (Plk) [52, 53]. Ces kinases sont impliquées dans la régulation de plusieurs étapes de la division cellulaire, notamment dans la duplication des centrosomes, la formation d’un fuseau mitotique bipolaire, l’alignement des chromosomes sur la plaque métaphasique et la cytokinèse.
La famille des kinases Aurora comporte trois membres, dont Aurora A, fréquemment surexprimée dans les cellules cancéreuses. Ces protéines sont d’autres cibles potentielles en thérapie anticancéreuse et des inhibiteurs, tous synthétiques, ciblant leur activité enzymatique sont en cours d’essais cliniques [37].
un arrêt en mitose, elle est considérée comme une cible potentielle de nouveaux anticancéreux [54]. Des inhibiteurs de Plk1 ont déjà été identifiés et certains sont en cours d’essais cliniques [53]. La scytonemine, pigment isolé de cyanobactéries, est le premier inhibiteur connu de Plk1 et agit notamment en induisant l’apoptose [55].
N
O
N HO
O OH
Figure 5 : Scytonemine, inhibiteur naturel de Plk1
1.4.4. Composés ciblant les histones déacétylases (HDAC)
L’expression des gènes est finement régulée via des modifications de la chromatine qui mettent en jeu l’activité des histones déacétylases (HDAC) [56]. Dans les cellules cancéreuses, ces enzymes peuvent être surexprimées ou mal recrutées au niveau de la chromatine. Depuis quelques années, elles sont considérées comme des cibles potentielles pour des thérapies anticancéreuses et la recherche d’inhibiteurs s’est largement développée [57]. Ces composés induisent la mort des cellules tumorales par apoptose après un arrêt du cycle cellulaire en phases G1 ou G2/M. Une grande partie de ces inhibiteurs a été isolée de sources naturelles, comme la trichostatine A issue du champignon Streptomyces
hygroscopicus, dont les activités d’inhibition de l’angiogénèse ont notamment été décrites in vivo [58]. Différents composés sont en cours d’essais cliniques et un inhibiteur, SAHA, a
récemment été mis sur le marché pour le traitement des lymphomes T cutanés [59].
Composé Source naturelle Structure Effet sur les cellules HeLa à forte concentration Trichostatine A champignon Streptomyces hygroscopicus N O N H O OH
Tableau 7 : Trichostatine A, inhibiteur naturel d’HDAC. La photographie de la colonne de droite a été
prise au laboratoire avec un microscope à fluorescence Zeiss Axiovert 200 M couplé à une caméra AxioCam MRm. Il s’agit de cellules cancéreuses humaines HeLa en interphase marquées pour les microtubules en rouge, les centrosomes en vert et l’ADN en bleu.
1.5. Intérêt des sources naturelles dans la recherche de nouveaux anticancéreux
1.5.1. Avantages des produits naturels par rapport aux produits de synthèse
Tout d’abord, l’intérêt des produits naturels est historique puisque les substances naturelles ont fourni la plupart des traitements utilisés actuellement. Tulp et Bohlin reconnaissent d’ailleurs que « rétrospectivement, l’utilisation des produits naturels a été la stratégie la plus efficace dans la découverte des médicaments modernes » [60].
Chimiquement, les produits naturels présentent plusieurs avantages par rapport aux molécules de synthèse pour la recherche de nouveaux anticancéreux. Feher et Schmidt ont, à partir de plusieurs bases de données, comparé systématiquement et statistiquement trois classes de composés : les médicaments, les produits naturels et les composés de chimie combinatoire [61]. Ils ont ainsi montré que les molécules naturelles contiennent un nombre de centres chiraux et de cycles bien plus important que les molécules de synthèse. De plus, la composition élémentaire de ces deux types de molécules est significativement différente, les produits naturels possédant une plus grande proportion d’atomes d’oxygène et de soufre, et une plus faible quantité d’atomes d’azote. Un autre élément important est le plus grand nombre de groupements fonctionnels statistiquement contenus dans les produits naturels. Les molécules obtenues en chimie combinatoire ont donc des structures chimiques bien moins variées et bien moins complexes que les produits naturels. En 2000, Harvey estimait que 40% des molécules isolées de sources naturelles n’avaient pas de représentants structuraux parmi les produits de synthèse [62].
Enfin, les substances naturelles permettent d’inspirer la synthèse d’analogues sélectifs avec des propriétés biologiques accrues [63, 64]. Ainsi, entre 1981 et 2002, parmi les 79 nouvelles substances actives mises sur le marché américain pour traiter les cancers, 30 étaient naturelles ou dérivées de produits naturels après hémisynthèse, et 18 étaient synthétiques mais inspirées d’un pharmacophore naturel [65].
présence de cycles, d’hétéroatomes, la fonctionnalisation importante sont des freins pour leur utilisation par l’industrie pharmaceutique.
1.5.2. Intérêt de diversifier les sources naturelles et d’explorer des organismes peu
étudiés à ce jour
Les études ethnopharmacologiques ont permis de découvrir de nombreux médicaments utilisés actuellement. Encore aujourd’hui, l’ethnopharmacologie tient une place importante dans la recherche de composés actifs. Par exemple, la médecine traditionnelle chinoise permet d’aider la recherche de produits aux applications potentielles en thérapie anticancéreuse à partir de végétaux [66].
La recherche de produits actifs s’est historiquement tournée vers les plantes supérieures (Trachéophytes), facilement accessibles, et plus récemment vers les micro-organismes et les micro-organismes marins. Avant le milieu des années 1960, ces derniers n’ont fait l’objet de quasiment aucune étude chimique. Depuis, ils sont de plus en plus étudiés, comme le reflète le dépôt de plus de 300 brevets relatifs à leurs propriétés anticancéreuses entre 1970 et 2000 [63]. Les épothilones, isolées de la myxobactérie Sorangium cellulosum, illustrent l’intérêt pour les micro-organismes. De nouvelles familles chimiques ont ainsi pu être découvertes alors que les travaux sur les plantes vasculaires n’ont pas permis de mettre en évidence de nouveaux archétypes structuraux depuis vingt ans. Ces exemples montrent que plus le spectre d’organismes étudiés est étendu, plus la découverte de produits actifs est importante. La recherche de molécules dans des organismes phylogénétiquement éloignés accroît la possibilité de découvrir des molécules aux squelettes chimiques variés. Cette diversité peut être expliquée par le fait que les métabolites secondaires sont liés à l’écosystème et l’organisme qui les synthétise. Il est supposé que des produits naturels spécifiques sont produits par les plantes et les organismes marins en réponse à un milieu extérieur hostile [67]. Ces organismes, dépourvus de système immunitaire, ont ainsi développé un système complexe de défense chimique favorisant leur survie et impliquant la production d’un grand nombre de métabolites secondaires différents.
De plus, les voies de biosynthèse des métabolites secondaires sont variées. Les plantes utilisent en grande partie la voie des terpènes alors que les micro-organismes ont
majoritairement recours à celle des acétates [68]. Par conséquent, les métabolites naturels produits par ces organismes ont des squelettes chimiques variés, ce qui laisse entrevoir la possibilité d’étendre le spectre de molécules bioactives.
Les produits les plus originaux isolés ces dernières années viennent de biotopes récemment explorés [69]. Encore aujourd’hui, il existe des zones géographiques et des habitats peu ou non explorés. Cela laisse pressentir la découverte potentielle d’une biodiversité nouvelle et inhabituelle et ainsi l’identification probable de produits naturels aux squelettes chimiques nouveaux.
Les travaux de ma thèse se sont centrés sur les Bryophytes, plantes présentes dans tous les écosystèmes excepté le milieu marin. Les parties suivantes vont exposer l’intérêt que peuvent représenter ces végétaux dans la recherche de substances potentiellement actives en pharmacologie anticancéreuse.
2.
Les Bryophytes, des végétaux singuliers
2.1. Originalité évolutive des Bryophytes [70]
Les Bryophytes sont des plantes terrestres qui se distinguent des Trachéophytes (plantes supérieures) par l’absence de tissus conducteurs et de tissus de soutien. Elles forment
un groupe délimité avec précision depuis la fin du XVIIIème siècle. Avec 20 000 espèces sur
un total de 300 000 espèces de plantes terrestres, elles constituent le second plus important phylum de plantes terrestres après les Angiospermes (plantes à fleurs). D’un point de vue taxonomique, trois classes sont définies. Les mousses (Musci) comptent environ 12 000 espèces, les hépatiques (Hepaticae) entre 6 000 et 8 000 espèces et les anthocérotes (Anthocerotae) entre 100 et 300 espèces.
CHAROPHYTES ~ 200 espèces Hépatiques ~ 72 familles, ~ 330 genres, ~ 8.000 espèces Anthocérotes 2 familles, ~ 5 genres, ~ 300 espèces Mousses ~ 99 familles, ~ 750 genres, ~ 12.000 espèces TRACHEOPHYTES ~ 260.000 espèces Jungermanniales ~ 7.500 espèces Metzgeriales Marchantiales Sphagnales Bryales ~11.600 espèces Andreales Milieu
aquatique Milieu terrestre
? BRYOPHYTES ~ 20.000 espèces ? CHAROPHYTES ~ 200 espèces Hépatiques ~ 72 familles, ~ 330 genres, ~ 8.000 espèces Anthocérotes 2 familles, ~ 5 genres, ~ 300 espèces Mousses ~ 99 familles, ~ 750 genres, ~ 12.000 espèces TRACHEOPHYTES ~ 260.000 espèces Jungermanniales ~ 7.500 espèces Metzgeriales Marchantiales Jungermanniales ~ 7.500 espèces Metzgeriales Marchantiales Sphagnales Bryales ~11.600 espèces Andreales Sphagnales Bryales ~11.600 espèces Andreales Milieu
aquatique Milieu terrestre
? BRYOPHYTES
~ 20.000 espèces ?
Figure 6 : Schéma simplifié illustrant la phylogénie des Bryophytes. Les Bryophytes et les plantes
vasculaires (Trachéophytes) constituent la lignée monophylétique des plantes terrestres, les Embryophytes. Selon les analyses phylogénétiques, ces deux groupes de plantes divergent d’un ancêtre commun proche d’une algue verte Charophyte. Cependant, il n’a pas encore été possible de construire un arbre évolutif non ambigu. Peu de fossiles de Bryophytes ont été retrouvés, généralement postérieurs à ceux des plantes vasculaires. Les études moléculaires ne permettent pas actuellement de définir avec précision les relations évolutives entre les Bryophytes et les Trachéophytes et celles entre les différents groupes de Bryophytes. Le schéma simplifié représente les principaux ordres des Bryophytes et montre que les hépatiques et les mousses constituent deux groupes complexes d’un point de vue évolutif.
Les Bryophytes ont divergé des Trachéophytes, plantes dites supérieures, il y a environ 400 millions d’années, lors de l’apparition des plantes sur terre (figure 7) [71]. Elles
ont évolué avec une stratégie d’adaptation au milieu terrestre différente de celle développée par les plantes supérieures et possèdent ainsi des caractères morphologiques et physiologiques particuliers.
2.1.1. Appareil végétatif
Les Bryophytes ne possèdent ni tissus de soutien rigides (absence de lignine), ni tissus conducteurs amenant l’eau du sol aux parties aériennes. Ces derniers apparaissent chez les plantes vasculaires (plantes supérieures), c’est pourquoi les Bryophytes sont souvent qualifiées de plantes inférieures. L’absence de ces tissus limite la taille des Bryophytes, aussi elles ne mesurent que de quelques millimètres à quelques centimètres (70 cm au plus chez les hépatiques du genre Fontinalis).
La partie aérienne est relativement complexe et se présente sous forme, soit d'un axe pourvu d'organes foliacés où chaque feuille est très mince et généralement formée d’une seule assise de cellules, soit d’un thalle, lame verte étalée sur le substrat, épaisse de quelques couches de cellules. Les Bryophytes sont capables d’absorber rapidement l’humidité et les nutriments dissous directement à travers la paroi des cellules des parties aériennes.
La partie souterraine est formée par des rhizoïdes qui permettent aux Bryophytes d’habiter des surfaces telles que les troncs d’arbres, les murs ou les rochers, surfaces impénétrables aux racines des plantes vasculaires.
Ces caractères morphologiques particuliers rendent possible la colonisation d’habitats variés - forêts tempérées, forêts tropicales, toundra, marécages, tourbières, etc. - dans toutes les régions climatiques. Il faut cependant noter que, même s’il existe des espèces aquatiques, les Bryophytes sont absentes du milieu marin.
s g 1 cm 10 cm s 1 cm g s g 1 cm A C B D s g 1 cm s g 1 cm 10 cm 10 cm s 1 cm g s 1 cm g s g 1 cm s g 1 cm A C B D
Figure 7 : Exemples de Bryophytes. g: gamétophyte, s: sporophyte
(A) : Mousse du genre Neckera poussant sur un bloc rocheux. (B) : Mousse du genre Polytrichum.
L'appareil végétatif correspond au gamétophyte (vert) qui se présente sous forme d’un pseudo-cormus comprenant un axe avec des organes foliacés. (C) : Hépatique à thalle (Metzgeriale) du genre Pellia.
(D) : Hépatique à feuilles (Jungermanniale) du genre Jungermannia.
Les échelles sont indiquées de façon approximative. Les photos sont issues du CD-ROM Bilder von Mossende Michael Lüth.
Pour répondre aux contraintes environnementales, les Bryophytes ont adapté leur métabolisme. Elles assurent la photosynthèse et la croissance lors des périodes humides et suspendent leur métabolisme pendant les périodes de sécheresse. Cette tolérance à la dessiccation est commune à la quasi-totalité des espèces de Bryophytes et caractéristique de ces végétaux [72]. Elle s’accompagne d’une tolérance importante à des températures extrêmes : ces plantes peuvent supporter quelques minutes des températures proches de 100°C et plusieurs mois ou années des températures autour de 0°C.
2.1.2. Cycle de reproduction
Comme tous les végétaux, les Bryophytes et les Trachéophytes ont un cycle de vie hétéromorphique, c’est-à-dire qu’elles existent sous deux formes, le gamétophyte et le sporophyte. Dans le cas des Bryophytes, le gamétophyte, qui est haploïde (n chromosomes) est la forme dominante et constitue l’appareil végétatif. Il est grand, chlorophyllien et
