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Études sur le développement des cryptes intestinales chez la souris

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(1)

ETUDES SUR LE DEVELOPPEMENT DES CRYYI'ES INTESTINALES CHEZ LA SOURIS

par

GHANIA MILANE

Département d'anatomie et de biologie cellulaire

Thèse présentée à la Faculté de Médecine en vue de l'obtention du grade de

Philosophiae Doctor (Ph.D.) Juillet 1993

(2)

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Catégories par sujets

HUMANITiS ET SCIENCES SOCIALES

COMMUNICATIONS ET LES ARTS Lecture 0535 PHILftSOPHIE, RELIGION ET Ancienne 5 9

Architecture 0729 Mathemahqu~s 0280 THEO OGIE Méd1evale 058

Beaux-arts 0357 Musique .0522 Ph1losoph1e 0422 Moderne 0582

Bibliothecon~1e : . 0399 Orientation et consultahon 0519 Rel1t;én Histoire des noirs 0328

Cinéma ... 0900 Philosophie de I' éducahon ... 0998 néralites 0318 Alnco1ne 0331 Communication verbale 0459 Physique . . . 0523 Çledt . . . 0319 Çanadienne 0334 Communications .. .. 0708 Programmes d'études et Etu es b1bl1ques 0321 Etats Unis 0337 Danse 0378 enseifanement 0727 Histoire des rel1rc1ons 0320 Europeenne 0335 Histoire de l'art 0377 Psychoog e 0525 Philosophe de a rel1g1on 0322 Moyen or entale 333 Joumal1sme 0391 Sciences 0714 Theologie 0469 Lahno-amer came 03 6

Musique ... .. . . 0413 Sciences sociales 0534 Asie Austra e et Ocean e 332 Sciences de 1 mlormahon 0723 Soc1ol~1e de 1 education . . 0340 SCIENCES SOCIALES H1Sto1re des sciences . 585

Théâtre 0465 Techno og1e 0710 Anthropol~1e lo1SirS . 8 4

ÉDUCATION LANGUE, LITTÉRATURE ET Archéoog e Culturelle 0324 0326 Planificat1on urbaine et régionale 0999 Généralités ... 515 LINGUISTIQUE Physique 0327 Science palitique

Administration 0514 Lon~es Oro1t .. 0398 Géneral1tes 0615

Art ... 0273 nérolites . 0679 Economie Admm1Strat on publique 0617 Collèges commu~~~Îa1res 0275 Anciennes . 0289 Générol1tes 0501 Droit et re et ons

Çommerce . .. 0688 Lmgu stique 0290 Çommerce Affaires 0505 mternat1onales 0616 Çconom e domestique 0278 MOOernes 0291 Çconom1e agricole 0503 Soc1olog1e

Çducahon permanente 0516 L1tterature Economie du travail 0510 Géneral1tes 0626 Çducahon préscolaire . 0518 Genéral1tes 0401 Finances 0508 Aide et bien aire social 0630 Education sanitaire 0680 Anciennes . 0294 Histoire 0509 Criminologie et

Enseignement owicole 0517 Comparée 0295 Théorie 0511 établ1Ssements

Enseiffinement b1 ingue et Med1evale . 0297 Çtudes américaines 0323 pénitentiaires 0627 mu ticulturel . 0282 Moderne 0298 Çtudes canadiennes . 0385 Démographie 0938 Enseignement industriel 0521 Alncame 0316 Etudes fémm stes 0453 Etudes de nd1v1du et

Enseignement primaire 0524 America me . 0591 Folklore 0358 • de la lem 1 e 628 Enseignement professionne 0747 Anglaise 0593 ç;eograph1e 0366 Etudes des re al ons

Enseignement rel1g1eux 0527 Asia:;}ue 0305 Gerontolog1e 0351 mterethn ques et

Enseignement seconda re 0533 Can 1enne !Anglaise) 0352 Gestion des alfa res des re al ons raciales 0631 Enseignement special 0529 Canadienne Française) 0355 Général1tes 0310 Structure et developpement Çnse1gnement supérieur 0745 Germanique 0311 Administration .0454 social 0700 Evaluahon .. . .... . .. 0288 Banques 0770 Théorie et methodes 0344 Finances 0277 Latino-americame Moyen orientale 0312 0315 Comptobil1te 0272 Travail et relatons

Formohon des enseignants 0530 Romane 0313 Marketing 0338 mdustr e es 0629 H1sto1re de 1 éducation 0520 Slave et est europeenne 0314 H1Stoire Transports 7 9 Longues et l1tterature 0279 H1Sta1re genera e 0578 Travail soc10 452

SCIENCES ET INGÉNIERIE

SCIENCES BIOLOGIQUES GéolC!gie 0372 SCIENCES PHYSIQUES B1oméd1cale 0541

Agriculture Géopliysique 0373 Sciences Pures Chaleur et ther

Géneral1tés 0473 ~drolog1e 0388 Ch1m1e m~nam1que 0348

~ronom1e 0285 néralog e 0411 General1tes 0485 Cond1t1onnement

1mentat1on et technologie Oceanogroph1e phys que 0415 Bioch1m1e 487 (Emballage) 0549 al menta1re 0359 Paleabotanique 0345 Chimie agr cale 0749 Génie aerospatia 0538

Çulture 0479 Paleoecolog1e 0426 Génie ch1m1que 0542

ElevP9S et al1mentat1on 0475 Paleontolc;>g1e 0418 Ch1m1e ana yt1que Ch1m1e minérale 0486 0488 Génie civil 0543 ExJ?lo1tation des P,{!turages 0777 Paleozoolog1e 0985 Ch1m1e nucleaire 0738 Génie electronique et

Paihologie animale 0476 Palynologie 0427 Chimie organique 0490 électrique 0544

Patholc;>gie ~étole 0480 Génie industriel 0546

Ph~iolog1e vx,tale 0817 SCIENCES DE LA SANTÉ ET DE Ch1m1e pharmaceutique 0491 Génie mecan que 0548 S culture et une 0478 L'ENVIRONNEMENT Phhsique 0494 Génie nue ea re 0552 T echnolog1e du bo1S 0746 Econom e domestique 0386 PoY,m(res Raél1ation 0495 0754 ln~énierie des systames 0790

Biol~e neral1tes . 0306 Sciences de 1 environnement 0768 Mathematiques 0405 Mecan1que navale 0547 Sciences de la sente Physique Metallur~1e 0743 Anatomie 0287 Generalites 0566 0605 Science es materiaux 0794 B1olog1e (StoÎi~hques) 0308 Géneral tes Technique du petrole 0765

Admm1Strat1on des h1p taux 0769 Acoustique 0986

Biol091e moléculaire 0307 Al1mentahon et nutrition 0570 Astronomie et Technique mm1ere 0551 Botanique 0309 Aud1ol~1e 0300 astrophysique 0606 Techniques sanitaires et

p(. Çellule .. 0379<. Ch1m10 erap1e 0992 Electronique et electnc1té 0607 municipales 0554 Ecologie . 0329 Denhstene 0567 Fluides et plasma 0759 Technologie hydraulique 0545 Entomologie 0353 Developpement huma n 0758 Météorologie 0608 Mecanique appl1quee 0346 Génehque 0369 Ense gnement 0350 Optique 0752 Geotechnolog1e 0428 Limnologie . 0793 Immunologie 0982 Particules (Physique Molieres plast ques

M crob10logie 0410 Lo sirs 0575 nucleaire) 0798 (Techno og e 0795 Neurologie . 0317 Medecme du trava1 et Physique atomique 0748 Recherche operat annelle 0796

Oceanographie. 0416 Textiles et l1Ssus (Technologie) 0794

Physiologie . . 0433 Medecme et chirur~ie therap1e 0354 0564 Physique de Physique moleculaire 1 etat solide 0611 0609

Rad1ahon . . 0821 Obstétrique et gynecolog1e 0380 Physique nucléaire 0610 PSYCHOLOGIE

Science vetérmaire 0778 Genéral1tés 0621

Zoologie 0472 Ç>phtalmolog1e 0381 Radiation 0756 Personnal1te 0625 Biophysique Oiihofahonie Patho og1e 0460 0571 Stahstiques 0463 Psychob1olog1e 0349 Generalités 0786 Pharmacie 0572 Sciences ~iqués Et Psychologie cl n que 0622 Med1cale 0760 Pharmacologie 0419 T echnolog1e Psycholog e du comportement 0384 Physiotherapie 0382 Informatique 0984 Psychologie du developf>!!ment 0620

SCIENCES DE LA TERRE Radiologie 0574 lngenierie Psychologie exper mentale 0623

Biogé_och1mie 0425 Sanie mentale 0347 Général1tes 0537 Psychologie nélustr1elle . 0624 Gé6ch1m1e . 0996 Santé f>1iblique .0573 Agricole 0539 Psychologie phyS1olog1que 0989 Géodésie . 0370 Soins infirmiers 0569 Automobile 0540 Psychol~1e sociale 0451 Géographie ph}-sique 0368 T ox1colog1e 0383 Psychometr1e 0632

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Subject Categories

THE HUMANITIES AND SOCIAL SCIENCES

COMMUNICATIONS AND THE ARTS Psychology 0525 PHILOSOPHY, RELIGION AND Anc1ent 0579

Architecture 0729 Réoding 0535 THEOLOGY Med1eval 0581 Art History 0377 Rel1g1ous 0527 Ph osophy 0422 Modern 0582 Cinema. 0900 Sciences . 0714 Rel1~n Black 0328 Dance ... 037B Secandary .. 0533 neral .. 031B Afncan 0331 Fine Arts . .. ... 0357 Social Sciences 0534 Biblical Stud1es 0321 As1a, Austral1a and Oceania 0332 lnlormahan Sc1~n~e ... 0723 Sacioogy of 0340 lergy 0319 Canad1an 0334

Journalism L1brarx Science · · · .. 0391 Speca 0529 H story of 0320 Eurapean 0335 0399 Teacher Tram ng . 0530 Ph losophy of 0322 Latin Amencan 0336 Mass Communications .. 0708 Technoldlkoo 0710 Middle Eastern 0333 Music .... 0413 Tests an surements 0288 Theology . 0469 United States 0337

~h Cammunica'h~~· 0459 Vocational 0747 SOCIAL SaENCES H1story of Science 0585

eater . . . . 0465 Amer an Stud1es 0323 Law 0398

LANGUAGE, LITERATURE AND Anthropologk Polit cal Science

EDUCATION LINGUISTICS Archaeaogy 0324 General 0615

General .... 0515 International Law and

Admm1strahan 0514 Lan~ge C ltural 0326 Relations 0616

Adult and Canhnuing 05 6 Anc1ent neral 0679 0289 Bus ness Admm1strat1on Phys1cal 0327 Public Adm n strat1on 0617 Agncultural 0517 Lmguistics 0290 General 0310 Recreation 0814

Art . . . . 0273 Sac1a Work 0452

Bilmgual and Multicultural 0282 L1terature Mciélern 0291 Accounting Bankmg 0272 0770 Sac ology

Business 0688 General 0401 Management 0454 General 0626 Community College 0275 C ass cal 0294 Marketing 0338 Cnmmol~ and Penology 0627 Curriculum and Instruction 0727 Comparatve 0295 Canad1an Stud1es 0385 Demograp~ 0938 Early Childhood 0518 Med1eval 0297 Economies Ethnie and ac1al Stud1es 0631 Elementary 0524 Modern 0298 General 0501 lnd1vidual and Family

F nonce 0277 Afncan 0316 Agncultura 0503 Studies 0628 Guidance and Counselmg 0519 Amen con 0591 Commerce Bus ness 0505 ndustna and Laber

Health . 0680 As an 0305 Finance 0508 Relations 0629 H1gher 0745 Canadian 1Engl1sh} 0352 H1story 0509 Public and Social Welfare 0630

History of 0520 Social Structure and

Home Econom es 0278 Canad1an French} Engl1sh 0355 0593 Theory Laber 0510 0511 Development 0700 lndustr1al 0521 German c 0311 Fo k ore 0358 Theory and Methods 0344

Lan~uage and L1Îerature 0279 Latin Amen an 0312 Geography 0366 T ransportat1on 0709

Ma emat1cs 0280 M ddle Eastern 0315 Gerontology .0351 Urban and Rj1onal Planning 0999 Music 0522 Romance 0313 H st ry Women s Stu e 0453 Philosaphy 0998 S av c and East European 0314 Genera 0578

Phys1ca 0523

THE SCIENCES AND ENGINEERING

BIOLOGICAL SCIENCES Geadesy 0370 Speech Patho ogy 0460 Engmeeri n~

Agr culture Gealogy 0372 T x1cology 0383 Genera 0537 Gene ra 0473 Geopliys1cs 0373 H me Econom s 0386 AerosP,Oce 0538

Agronomy 0285 ~drol99y 0388 Agr cultura 0539

Animal Culture and neralogy 04 1 PHYSICAL SCIENCES Automoltve 0540 Nutrition . 0475 Paleobetany 0345 Pure Sciences B1omed1cal 0541 Animal Pathologx 0476 Pa eaecology 0426 Chem stry Chem1ca 0542

Food Science and Paeontol~y 0418 Civil 0543

Technol~ 0359 Pa eozoology 0985 General 0485 E ectron es and E ectncal 0544 Fores'2: an Wild!tfe 0478 Paynol~ 0427 Agncultura 0749 Heat and Thermodynam1cs 0348 Plant ulture .. . .. . 0479 Phys1cal raphy 0368 Analyt1cal 0486 Hydraul1c 0545 Plant Pathol~ 0480 Phys cal Oceanography 0415 B ochem1stry 0487 lndustr a 0546 Plant Phys ology 08 7 norl!on1c 0488 Manne 0547 Range Ma~ment 0777 HEALTH AND ENVIRONMENTAL Nucear 0738 Mater a s Sc ence 0794

Woèd Technoogy 0746 SCIENCES Organic 0490 Mechanica 0548

Biol~ Pharmaceut1cal 0491 Metallurgy 0743

neral 0306 Health Sciences Enviranmenta Sciences 0768 Phhs1cal Poymer 0494 0495 M ning 0551 Anatamy 0287 Gene rai 0566 Raél1ation 0754 Nuclear 0552 B1astat st es 03 8 Aud1ol~ 0300 Mathemahcs 0405 Packagmg 0549 Botany .. 0309 Chemo eropy 0992 Physics Petroleum 0765 Cell 0379 Dent stry 0567 General 0605 Sanitarx and Municipal 0554 Ecalogx 0329 Education 0350 A oust1cs 0986 System Science 0790 Entomology 0353 Hosp1ta Management 0769 Astronomy and Geatechnology 0428 Genehcs 0369 Human Development 0758 Astrohhys es 0606 Operot1ons Research 0796 L1mnol~ 0793 lmmunology 0982 Atrnosp enc Science 0608 Plost1cs T echnology 0795 Microb10 ogy 0410 Medicine ond Surgery 0564 Atom1c 0748 Textile T echnology 0994 Moleculor 0307 Mental Health 0347 E ectronics and Electr c ~ 0607

Neuroscience 0317 PSYCHOLOGY

Oceanography 0416 Nurs1ng Nutrition 0569 0570 E ementary Part c es an HJlh Energy 0798 General 0621

Ph~1ology .0433 Obstetncs and GynecolJy 0380 F u1 and Plasma 0759 Behav1oral 0384 Radiation 0821 Occupat1onal Health an Molecular 0609 Cl1nical 0622 Vetennary Science 0778 Therafry 0354 Nuclear 0610 Developmenta 0620 Zoology 0472 Ophtha mology 0381 Optics 0752 Ex~rmental 0623 B1ophysics Pathology 0571 Rad1alton 0756 ln ustr1al 0624 General 0786 Pharmacology . 0419 Sol1d State 0611 Persanality 0625 Medical 0760 Pharmati, 0572 Stat stics 0463 Phys10IP!J1cal 0989

EARTH SCIENCES Phbs1cal erapy 0382 Psychob1ology 0349

Pu lie Heath 0573 Applied Sciences Psychometr1cs 0632 Biogeochem stry 0425 Rad1ology 0574 App ed Mechan cs 0346 Soc1a 0451 Ge0chem1stry 0996 Recreatian 0575 Computer Science 0984

(5)

gentillesse subie " J. Salomé

" Il n'y a que deux conduites avec la vie: ou on la rêve ou on l'accomplit" R. Char

"Rien n'est plus dangereux qu'une idée quand on n'en a qu'une" P. Claudel

A ma petite famille;

Smaïl, Baya (saâda)

Hassina, Karim Hayet, Fastah Rebiha, Djelloul Samir, Yazid Leila, Nadjim que j'aime ...

" On n'apprend à vivre que quand la vie est passée" Montaigne

(6)

TABLE DES MATIERES

TABLE DES MATIERES ... 111

LISTE DES ILLUSTRA TI ONS . . . xi

LISTE DES TABLEAUX ... xiv

LISTE DES ABREVIATIONS ... xv

RESUME ... xvi

INTRODUCTION . . . 1

1. La crypte ... 1

1.1. Organisation morphologique . . . 2

1.2. Les différents types cellulaires . . . 2

1. 3. Rôles des cryptes de Lieberkühn . . . 5

1. 3 .1. Renouvellement et migration cellulaire . . . 5

1.3.2. Sécrétion . . . 6

2. Relation entre l'intestin et les autres composantes de l'appareil digestif chez la souris . . . 8

3. Développement de l'intestin chez la souris foetale . . . 9

4. Facteurs influençant la formation des cryptes . . . 11

a) Facteurs hormonaux et peptidiques . . . 12

b) La diète et les rythmes circadiens . . . 13

c) Les interactions épithélio-mésenchymateuses . . . 13

(7)

5. Objectifs et approche expérimentale . . . 16

MATERIEL ET METHODES . . . 18

1. Liquide amniotique (LAR) . . . 18

1.1. Extrait organique du LAR (EOLAR) . . . 18

1.2. Traitement à L'EOLAR . . . 19

1.2.1. In Vivo . . . . 19

1.2.2. In Vitro . . . . 20

a) Culture . . . 20

b) Addition d 'EOLAR . . . 21

2. Préparation des marqueurs des cryptes intestinales . . . 21

2.1. Les anticorps monoclonaux . . . 21

2.1.1. Préparation du matériel antigénique . . . 21

2.1.2. Immunisation des animaux . . . 22

2.1.3. La fusion ... 22

2.1.4. Sélection des cellules fusionnées . . . 23

2.1.5. Clonage ... 23

2.2. Classification des anticorps . . . 24

2.3. L'anticorps polyclonal . . . 24

2.3.1. Préparation du mélange antigénique . . . 24

2.3.2. Immunisation des animaux . . . 25

(8)

3 .1. Microscopie . . . 26

3.1.1. Préparation des tissus: observations morphologiques . . . 26

3.1.2. Microscopie optique . . . 26

3.1.3. Autoradiographie . . . 27

3.1.4. Microscopie électronique . . . 27

3.2. Immunocytochimie . . . 27

A) A L'aide de l'anticorps polyclonal . . . 27

B) A l'aide de l'anticorps monoclonal MIM-1/130 . . . 28

3.3. Immunofluorescence indirecte . . . 29

3. 3 .1. Congélation des tissus . . . 29

3.3.2 Préparation des coupes à congélation . . . 230

3.3.3. Détection des antigènes par immunofluorescence indirecte 30 4. Dosages biochimiques . . . 31

4.1. Homogénéisation des tissus . . . 31

4.2. Protéines . . . 31

4.3. Extraction et dosage d' ADN . . . 32

4.4. Incorporation de thymidine tritiée . . . 32

4.5. Activités enzymatiques . . . 33

5. Caractérisation biochimique de l'antigène MIM-1/39 . . . 33

5.1. Préparation des bordures en brosse . . . 33

5.2. Solubilisation de l'antigène MIM-1/39 dans l'intestin . . . 34

(9)

5. 3 .1. Spécimens utilisés . . . 34

A) Le jus pancréatique . . . 34

B) Autres échantillons: Homogénéisation . . . 35

5.3.2. "SDS-PAGE" . . . 35

a) Préparation des échantillons . . . 35

b) Préparation du gel d'acrylamide . . . 36

c) Migration et séparation des protéines . . . 36

5.3.3. Electrophorèse bidimensionnelle (Isoélectrofocalisation) . . . 37

A) Première dimension . . . 37

a) Préparation des échantillons . . . 37

b) Préparation des gels en tube . . . 37

c) La préélectrophorèse . . . 38

d) Séparation des protéines selon leurs points isoélectriques . . . 38

e) Démoulage et équilibration des gels . . . 39

B) Deuxième dimension . . . 39

5.4. Immunodétection des antigènes sur la membrane de nitrocellulose . . . 39

5.4.1. Electrotransfert des protéines . . . 39

5.4.2. Détection des antigènes . . . 40

5.5. La déglycosylation . . . 41

RESULTATS ... 43

(10)

1.1. Résultats biochimiques . . . 43 a) Protéines . . . 43 b) ADN ... 45 c) Activités enzymatiques . . . 45 1.2. Observations morphologiques . . . 46 a) Microscopie optique . . . 46 b) Autoradiographie . . . 46

1.3. Production d'anticorps marqueurs des cryptes. . . 49

1.3.1. Localisation des deux antigènes par immunofluorescence indirecte . . . . 49

a) MIM-1/130 . . . 50

b) MIM-1/39 . . . 50

1.3.2. Expression des deux antigènes en fonction du développement intestinal . 50 1.3.2.1. MIM-1/130 ... 50

1.3.2.2. MIM-1/39 . . . 52

a) Immunofluorescence indirecte . . . 52

b) Immunodétection de l'antigène MIM-1/39 sur membrane de nitrocellulose . . . 55

1.4. Effets de l'EOLAR sur l'expression des deux antigènes dans l'intestin . . 57

1.4.1. Effets in vivo . . . 57

a) MIM-1/39 . . . 57

b) MIM-1/130 . . . 57

(11)

1.4.2.1. MIM-1/130 ... 59 a) 24 heures de culture . . . 59 b) 48 heures de culture . . . 59 1.4.2.2. MIM-1/39 . . . 61 A) Immunofluorescence . . . 61 a) 24 heures de culture . . . 61 b) 48 heures de culture . . . 61

B) Immunodétection sur membrane de nitrocellulose . . . 63

2. Caractérisation des deux antigènes associés aux cryptes ... 65

2.1. lmmunofluorescence indirecte ... 65 a) MIM-1/130 . . . 65 b) MIM-1/39 . . . 68 2.2. Immunocytochimie . . . 71 a) MIM-1/130 . . . 71 b) MIM-1/39 . . . 71 2. 3. Biochimie . . . 77

2.3.1. Conditions de solubilisation de l'antigène MIM-1/39 . . . 77

2.3.2. Point isoélectrique de la protéine MIM-1/39 . . . 79

2.3.3. Immunodétection du MIM-1/39 dans divers tissus, sur membrane de nitrocellulose . . . 79

a) Coloration au bleu de Coomassie . . . 79

(12)

2.3.4. Digestion de la protéine MIM-1139 à l'endoglycosidase F . . . 83

2.3.5. Distinction entre l'antigène MIM-1/39 et l'IgA . . . 83

a) Immunofluorescence indirecte . . . 85

b) Localisation sur membrane de nitrocellulose . . . 85

3. Effets de la céruléine sur la sécrétion de la protéine MIM-1/39 . . . 88

a) Immunofluorescence . . . 88

b) Microscopie électronique . . . 88

DISCUSSION . . . 90

1. Effets de l'EOLAR sur la formation des cryptes intestinales in vivo . . . 90

A) Effets de l'EOLAR sur la différenciation fonctionnelle de la muqueuse intestinale . . . 90

B) Effets de l'EOLAR sur la différenciation morphologique de la muqueuse intestinale . . . 92

C) Effets de l'EOLAR sur l'expression des deux antigènes associés aux cryptes ... 94

D) Formation des cryptes: rôle du liquide amniotique . . . 95

E) Formation des cryptes: relations épithélio-mésenchymateuses ... 98

F) Formation des cryptes: hypothèse ... 100

G) A quel niveau agit le CDF? . . . 104

H) Conclusion . . . 105

(13)

A) lA>calisation ... 106

B) Comparaison avec les autres molécules de la matrice extracellulaire. . . . C) Problèmes de caractérisation 107 109 D) Rôles possibles de l'antigène MIM-1/130 ... 110

E) Conclusion ... 112

3. Caractérisation de la protéine MIM-1/39 . . . 113

A) Localisation au cours du développement . . . . 113

B) Comparaison avec d'autres marqueurs intestinaux . . . 114

C) Comparaison avec d'autres marqueurs tissulaires ... 115

D) La protéine MIM-1/39 est une nouvelle glycoprotéine ... 117

E) Résultats avec l'anticorps polyclonal MIM-1/39 ... 119

F) Rôles de la protéine . . . 120

G) Conclusion ... 122

4. Effets de la céruléine sur la sécrétion de la protéine MIM-1/39 ... 122

CONCLUSIONS GENERALES ... 126

PERSPECTIVES ... 129

REMERCIEMENTS ... 131

(14)

Figure 1: Figure 2: Figure 3: Figure 4: Figure 5: Figure 6: Figure 7:

LISTE DES ILLUSTRA TI ONS

Effets d'EOLAR sur les contenus en protéines et en ADN et sur l'incorporation de thymidine tritiée dans le duodénum, l'iléon et le côlon ... 44 Effets d'EOLAR sur l'aspect morphologique du duodénum et du

côlon ... 47 Effets d'EOLAR sur l'incorporation de thymidine tritiée dans le

duodénum et le côlon. Autoradiographie . . . 48 Localisation des antigènes MIM-1/130 et MIM-1/39, dans le

duodénum de souris adultes, par immunofluorescence indirecte . . 51 Expression de l'antigène MIM-1/130 dans le duodénum en

développement. Immunofluorescence indirecte effectuée sur des coupes à congélation (4 microns), de duodénums prélevés à divers

stades de développement . . . 53 Expression de l'antigène MIM-1/39 en immunofluorescence

indirecte effectuée sur des coupes à congélation (4 microns), de

duodénums prélevés à divers stades de développement . . . 54 Courbe de développement de l'antigène MIM-1/39 dans le

duodénum en développement. Immunodétection sur membrane de

(15)

Figure 8: Figure 9: Figure 10. Figure 11. Figure 12. Figure 13. Figure 14.

Effets de l'EOLAR sur l'expression des antigènes MIM-1/39 et

MIM-1/130 in vivo. Immunofluorescence indirecte

effectuée sur des coupes à congélation (4 microns) de duodénums prélevés à 17 jours de gestation. . . 58 Effets d'EOLAR sur l'expression de l'antigène MIM-11130 dans

le duodénum in vitro. Immunofluorescence indirecte

effectuée sur des coupes à congélation, de duodénums prélevés à 15 jours de gestation et cultivés pendant 24 ou 48 heures . . . . 60 Effets d'EOLAR sur l'expression de l'antigène MIM-1/39 dans le

duodénum in vitro. Immunofluorescence indirecte effectuée sur des

coupes à congélation d'explants cultivés pendant 24 ou 48

heures ... 62 Effets d'EOLAR sur l'expression du MIM-1/39 dans le duodénum

in vitro Immunodétection sur membrane de nitrocellulose . . . 64

Localisation de l'antigène MIM-1/130 dans les tissus autres que le duodénum, par immunofluorescence indirecte effectuée sur des

coupes à congélation (3 microns) . . . 67 Localisation du MIM-1/39, par immunofluorescence indirecte

effectuée sur des coupes (1 micron) de divers tissus enrobés dans

du Lowicryl K4M . . . 69 Localisation del 'antigène MIM-1/ 130 par immunocytochimie selon

(16)

Figure 15. Figure 16. Figure 17. Figure 18. Figure 19. Figure 20. Figure 21. Figure 22. Figure 23. Figure 24.

Localisation de l'antigène MIM-1/39 par immunocytochimie effectuée sur des coupes de tissus provenant de souris adultes et

enrobés dans du Lowicryl K4M . . . 75 Condition de solubilisation de la protéine MIM-1/39 dans le

duodénum et le côlon de souris adultes . . . 78 IEF. et point isoélectrique de la protéine MIM-1/39 . . . 78 Détection de l'antigène MIM-1/39 dans divers tissus, par

immunolocalisation sur membrane de nitrocellulose . . . 80 Digestion de la protéine MIM-1/39 à l'endoglycosidase F. . . 82 Comparaison des patrons d'expression de l'antigène MIM-1/39 et

de l'IgA dans le duodénum et le pancréas de souris adulte par

immunofluorescence indirecte . . . 84 Immunolocalisation de l'antigène MIM-1/39 et de l'IgA sur

membrane de nitrocellulose . . . 86 Effets de la céruléine sur l'expression de la protéine MIM-1 /39

Immunofluorescence indirecte effectuée sur des coupes à

congélation . . . 87 Effets de la céruléine sur l'aspect ultrastructural des cellules

indifférenciées des cryptes . . . 89 Schéma traduisant l'hypothèse sur le mécanisme de formation des

(17)

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1: Activités enzymatiques duodénales exprimées en UI . . . . 45 Tableau 2: Tableau récapitulatif des tissus exprimant l'antigène MIM-1/39 et/ou MIM-1/130 ... 66

(18)

LISTE DES ABREVIATIONS APS: Persulfate d'ammonium

BSA: Albumine sérique bovine

CDF: Facteur de différenciation cryptai DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium DTT: Dithiothreitol

EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid

EGTA: Ethyleneglycerol-bis-(B-aminoethyl ether) tetraacetic acid EOLAR: Extrait organique de liquide amniotique de rat

kDa: KiloDalton

MEC: matrice extracellulaire

MIM: Mésenchyme intestinal de souris (Mouse Intestinal Mesenchyme) NaN3: Azide de sodium

NP40: Nonidet P40

PBS: Solution tamponnée au phosphate PMSF: Phénylméthylsulfonyl fluoride dpm: désintégrations par minute SDS: Sodium dodecyl sulfate

PAGE: Electrophorèse sur gel d'acrylamide TCA: Acide trichloracétique

TEMED: Tetraméthylenediamine UI: Unité internationale

(19)

ETUDES SUR LE DEVELOPPEMENT DES CRYPTES INTESTINALES CHEZ LA SOURIS.

Par Ghania Millane

Département d'anatomie et de biologie cellulaire, Faculté de médecine, Université de Sherbrooke.

Thèse présentée à la Faculté de Médecine en vue de l'obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph. D.) en juillet 1993.

Le rôle des cryptes dans la prolifération et le renouvellement cellulaire de l'épithélium intestinal a été largement étudié. Cependant nos connaissances sur leur développement et sur les mécanismes impliqués dans le contrôle de leur morphogénèse sont encore très limitées.

Suite aux travaux publiés par Calvert et al., (1983) qui ont démontré qu'un extrait organique de liquide amniotique de rat (EOLAR) était capable d'induire la formation des cryptes in vitro, nous avons voulu étudier l'effet de ce même EOLAR sur le

développement de la muqueuse intestinale et la formation des cryptes intestinales in vivo.

L'approche expérimentale était d'administrer de l'EOLAR à des souris gestantes et d'évaluer ensuite la différenciation fonctionnelle et morphologique de la muqueuse intestinale chez les foetus.

Nous avons démontré que l'EOLAR n'affecte pas la différenciation fonctionnelle de l'entérocyte. Cependant il entraîne un confinement de la zone de prolifération aux

(20)

espaces intervilleux et une réorganisation morphologique de ces derniers.

L'utilisation d'autres paramètres a été nécessaire pour analyser davantage l'effet de l'EOLAR sur la formation des cryptes. Ainsi 2 anticorps monoclonaux soit le MIM-1/130 qui marque le feuillet péricryptal et le MIM-1/39 exprimé par les cellules indifférenciées de la crypte, ont été produits et utilisés comme marqueurs de la différenciation cryptale

in vitro et in vivo. La mise en évidence de la courbe de développement de l'expression des deux antigènes en fonction du développement intestinal a révélé qu'ils sont liés à la formation des cryptes et que le processus de formation de ces dernières commence 3 à 4 jours avant la naissance.

A 17 jours de gestation, le duodénum des souris traitées à l'EOLAR présente des patrons d'expression (des 2 antigènes) typiques de ceux observés normalement chez des souris âgées de 4 à 5 jours après la naissance. En effet l'EOLAR entraîne une réorganisation rapide des patrons d'expression des 2 antigènes et une accélération de la formation des cryptes in vivo, alors qu'in vitro, il induit l'expression des 2 antigènes après 24 heures de culture et la formation des cryptes 24 heures plus tard.

La caractérisation des deux antigènes montre que le MIM-1/130 est un nouveau constituant de la matrice extracellulaire associée aux fibres de collagène du feuillet fibroblastique sous-jacent à l'épithélium de la crypte, de la glande gastrique et de la vésicule biliaire, et que l'antigène MIM-1/39 est une nouvelle glycoprotéine de haut poids moléculaire, localisée dans les grains de sécrétion des cellules indifférenciées de la crypte, des cellules principales des glandes gastriques et des cellules épithéliales de la vésicule biliaire, du pancréas, des glandes salivaires, linguales et lacrymales.

(21)

En se basant sur l'ensemble de nos observations et celles de la littérature, nous avons élaboré une hypothèse sur le mécanisme de formation des cryptes qui résulteraient d'une réorganisation des espaces intervilleux.

Finalement en utilisant ce nouveau marqueur (MIM-1/39) des cellules indifférenciées de la crypte, nous avons démontré que la céruléine stimule leur sécrétion, ce qui ouvre la voie à des études sur l'activité sécrétoire de ces cellules.

(22)

INTRODUCTION

Chez les mammifères adultes, la muqueuse intestinale est constituée de:

- La lamina propria; provenant du mésenchyme embryonnaire est formée d'un tissu conjonctif lâche où baignent des éléments sanguins et lymphatiques, des nerfs, des fibroblastes et des fibres de collagène et d' élastine. Cette composition reflète son implication dans des fonctions importantes (Trier et Madara, 1981). La lamina propria est délimitée par la muscularis mucosae, fine couche musculaire qui sépare la muqueuse de la sous-muqueuse.

- L'épithélium; originaire de l'endoderme embryonnaire, est formé d'une couche de cellules cylindriques. Il repose sur une lame basale qui le sépare de la lamina propria. Il délimite des villosités, structures en forme de doigts, projetées vers la lumière de l'intestin grêle et des cryptes de Lieberkühn enfouies dans la lamina propria. Dans le côlon, les villosités sont absentes et la surface en contact avec la lumière est recouverte par un épithélium dit de surface (Donnellan, 1965).

La crypte et la villosité constituent l'unité fonctionnelle de la muqueuse intestinale dont l'épithélium villositaire assume des fonctions de digestion et d'absorption, alors que les cryptes sont surtout spécialisées dans la prolifération et le renouvellement cellulaire.

(23)

1.1. Organisation morphologique

La crypte est une glande tubulaire simple qui s'ouvre à la base des villosités. En coupe longitudinale, elle comporte 28 à 30 positions cellulaires et 16 à 18 , en coupe transversale. L'épithélium cryptai est continu avec celui qui recouvre la villosité. D'un point de vue fonctionnel, on définit trois zones au niveau de la crypte:

- Zone de cellules souches: Située dans la base de la crypte (Bjerknes et Cheng, 1981; Potten et Hendry, 1983), cette zone s'étend de la position 1 à 5 cellules. Elle est constituée de cellules souches caractérisées par leur capacité à se diviser et par un cycle cellulaire constant d'environ 36 heures (Bjerknes et Cheng, 1981). On y retrouve aussi des cellules de Paneth.

- Zone de prolifération: s'étendant entre les positions 5 et 18, cette zone est composée de cellules dotées d'un haut degré de prolifération, d'un cycle cellulaire réduit et d'un indice mitotique très élevé (Cheng et Leblond, 1974a, Trier et Madara, 1981).

- Zone de différenciation: située au dessus de la position précédente (19 à 30 cellules), elle est constituée de divers types cellulaires en voie de différenciation qui perdent graduellement leur capacité de prolifération.

1.2. Les différents types cellulaires

L'épithélium de la muqueuse intestinale est composé de différents types cellulaires (Trier et Madara, 1981; Lipkin, 1987; Leeson et al., 1988;).

- Les cellules souches: elles constituent environ 10 % de la population cellulaire de la crypte. Elles sont localisées dans la zone profonde de la glande et se divisent

(24)

activement pour donner soit des cellules souches soit des cellules indifférenciées (Bjerknes et Cheng, 1981).

- Les cellules indifférenciées: elles forment la majeure partie (82 % ) des cellules cryptales. Elles proviennent des cellules souches et constituent les précurseurs des autres cellules de l'épithélium intestinal (Troughton et Trier, 1969). Ce sont des cellules cylindriques, caractérisées par un gros noyau basal, un cytoplasme basophile, des microvillosités courtes et peu abondantes (Trier, 1963) et par des complexes de jonction plus lâches que ceux observés au niveau des cellules différenciées. Ces cellules, peu différenciées comparartivement aux cellules absorbantes, renferment dans leur partie apicale, des granules de sécrétion (Trier, 1963; 1964) de nature inconnue et de dimensions variables selon les espèces mais dont le contenu homogène est riche en glycoprotéines.

- Les cellules caliciformes: ces cellules différenciées sont sécrétrices de mucus (Bierring, 1962; Jennings, 1956) et sont dites aussi cellules à mucus. Elles constituent environ 3.1 % de la population de la crypte et sont localisées partout dans l'épithélium intestinal. Elles renferment un noyau basal et des granules de sécrétion (à mucus) qui remplissent leurs parties apicales (Freeman, 1966). Les mucines sécrétées sont riches en hydrates de carbone (Reid et al., 1990). Des cellules à mucus immatures (les cellules à oligomucus), sont situées exclusivement au niveau de la crypte et sont caractérisées par leur capacité de prolifération et leur granules de sécrétion typiques (Merzel et Leblond, 1969; Cheng, 1974a). Ce sont les précurseurs des cellules caliciformes matures.

(25)

nature zymogénique (Paneth, 1888; Hertzog, 1937), sont absentes chez certains animaux (chien, chat, babouin). Elles sont localisées exclusivement à la base de la crypte de l'intestin grêle et absentes dans le côlon (Leeson et al, 1988; Trier et Madara, 1981). Elles sont caractérisées par un réticulum endoplasmique abondant et des grains de sécrétion apicaux de diamètres variables selon les espèces. Leur contenu est homogène chez l'homme alors qu'il est hétérogène chez la souris. La durée de vie des cellules de Paneth est de 18 à 22 jours (Bjerknes et Cheng, 1981). Des cellules de Paneth jeunes peuvent être observées à la base de la zone de prolifération.

- Les cellules entéroendocrines: elles composent près de 0.6% de la population des cellules intestinales et constituent une grande variété de types cellulaires classifiés selon leur produit de sécrétion (Capella et al., 1969; Ferreira, 1971; Calvert, 1978). Elles se retrouvent au niveau de la villosité et de la crypte et sont caractérisées par leur granules de sécrétion situés dans la partie basale et/ou apicale du cytoplasme (Solcia et al., 1987; Roth et Gordon, 1990).

- Les cellules absorbantes: ces cellules de forme cylindrique sont différenciées et constituent le type cellulaire le plus rencontré dans l'épithélium de la villosité intestinale. Elles sont caractérisées par un cytoplasme granulaire et dense, une bordure en brosse bien organisée et des complexes de jonctions bien développés (Leeson et al., 1988; Louvard, 1989). Des cellules absorbantes immatures (comparativement à celles situées

à la base de la villosité) sont aussi observées dans le haut de la crypte.

D'autres types cellulaires moins connus telles les cellules intermédiaires (Calvert et al., 1988), les cellules cavéolées (Isomaki, 1973; Nabeyama et Leblond, 1974), et les

(26)

cellules M (Owen et Jones, 1974; Owen et Nemanic, 1978), sont retrouvés au niveau de l'épithélium intestinal.

1.3. Rôles des cryptes de Lieberkühn

L'épithélium des villosités intestinales assume un rôle de digestion terminale et d'absorption des aliments, alors que celui des cryptes accomplit deux grands rôles.

1.3.1. Renouvellement et migration cellulaire

Dès les années 1950, des travaux publiés par divers chercheurs (Leblond et Stevens, 1948; Leblond et Messier, 1958; Hughes et al., 1958; Quastler et Sherman, 1959; Messier et Leblond, 1960) ont démontré que l'épithélium intestinal était constamment renouvelé. Les cellules produites d'abord au niveau de la crypte, migrent le long de l'axe crypte-villosité pour être rejetées dans la lumière intestinale au niveau de la zone d'extrusion située à l'apex de la villosité.

Des études de microscopie électronique ou d'autoradiographie ont permis de décrire la structure morphologique des différents types cellulaires qui composent l'épithélium crypta! (Trier, 1963; Trier et Madara, 1981), les paramètres relatifs à leur cinétique de croissance tels les cycles cellulaires et l'ultrastructure des organites en développement (Lipkin et al., 1963; Caimie et al., 1965; Cairnie, 1967; Van Dongen et al., 1976; Cheng et al., 1969; Ferreira et Leblond, 1971).

Des études effectuées sur la prolifération cellulaire consistant en des injections uniques ou continues de thymidine tritiée à des souris adultes (Cheng et al., 1969; Cheng et Leblond, 1974a; 1974b; Cheng, 1974a; 1974b) ont révélé que les 4 types cellulaires

(27)

étaient capables d'incorporer de la thymidine tritiée et de se renouveler. En comparant leur temps de renouvellement, ces auteurs ont conclu que les cellules de Paneth, caliciformes et entéroendocrines proviennent toutes de cellules épithéliales dont les plus indifférenciées sont localisées à la base des cryptes.

Ces études ont conduit Cheng et Leblond (1974c) à proposer l'hypothèse de la théorie unitaire de l'origine des différents types cellulaires, qui stipule que toutes les cellules de l'épithélium intestinal sont produites par les cellules souches situées dans la base de la crypte, au niveau de la zone de cellules souches (Bjerknes et Cheng, 1981).

Il est maintenant bien connu que chez l'adulte, une cellule souche se divise et génère deux cellules filles dont une seule quitte cette zone, entre en prolifération rapide et donne naissance à des cellules immatures. Celles ci se différencient au fur et à mesure qu'elles migrent soit vers la base de la crypte pour donner des cellules de Paneth, soit vers le haut pour engendrer les autres types cellulaires (endocrines, caliciformes, absorbantes, etc ... ). Ces dernières poursuivent leur différenciation tout en migrant le long de l'axe crypte-villosité. Le temps de passage de ces cellules de la base de la crypte à l'apex de la villosité chez la souris est d'environ 3 à 4 jours. Par contre la durée de vie des cellules de Paneth est évaluée à 2 ou 3 semaines, après quoi elles sont phagocytées par les cellules avoisinantes (Cheng et Leblond, 1974c).

1. 3. 2. Sécrétion

En plus de l'élimination d'eau et des électrolytes (Welsh et al., 1982), la crypte intestinale secrète des hormones (Solcia et al., 1987; Walsh, 1987), des immunoglobulines, des acides aminés et des protéines. Deux types de cellules sécrétrices

(28)

sont retrouvées exclusivement au niveau de la crypte:

- Les cellules de Paneth: chez la souris, les granules de sécrétion de ces cellules ont un contenu hétérogène. Ils sont constitués d'un corps central riche en glycoprotéines neutres, et d'un halo périphérique riche en glycoprotéines acides (Selzman et Liebelt, 1961). Des études immunohistochimiques ont démontré aussi la présence d'immunoglobulines (Erlandsen et al., 1976), de métaux, et d'enzymes lysosomaux (Peeters et Vantrappen, 1975) au niveau de ces cellules. Ces enzymes lysosomaux assurent aux cellules de Paneth, un rôle de défense lors de la phagocytose des bactéries. Leur fonction sécrétrice stimulée par la pilocarpine est inhibée par l'atropine (Trier et al., 1967).

- Les cellules indifférenciées: les chercheurs ont beaucoup étudié ces cellules pour leur activité dans la prolifération et le renouvellement cellulaire, plutôt que pour leur fonction de sécrétion exocrine, pourtant suggérée dès le début de ce siècle (Zipkin, 1904; Clara, 1926; Patzelt, 1936; Mcklin et Mcklin, 1932).

Cependant, des études publiées dans les années soixante (Trier, 1963; 1964), ont rapporté la présence de granules de sécrétion dans la partie apicale des cellules indifférenciées de la crypte. Ces granules, étant colorés au PAS (Periodic Acid Shift) et non au bleu alcian, seraient riches en glycoprotéines neutres. Les résultats obtenus suite à l'injection de pilocarpine chez l'homme ont conduit Trier (1964) à suggérer que ces cellules possédaient un rôle de sécrétion exocrine. A cause de toutes ces sécrétions les cryptes ont longtemps été appelées glandes de Lieberkühn, terme que l'on ne retrouve plus ou très rarement dans la littérature récente.

(29)

2. Relation entre l'intestin et les autres composantes de l'appareil digestif chez la souris

La digestion et l'absorption des aliments sont deux fonctions qui s'effectuent en partie au niveau de l'estomac, de l'intestin grêle et du côlon. Ces deux fonctions, régulées par une variété de facteurs hormonaux et peptidiques, ne sont possibles qu'en présence des sécrétions biliaires et des enzymes produits par les glandes salivaires, le pancréas et l'épithélium gastro-intestinal.

En plus de cette complémentarité fonctionnelle, ces divers organes qui dérivent de l'endoderme pour la plupart et de l'ectoderme pour les glandes salivaires (Arey, 1954; Rugh, 1968), possèdent chez l'adulte certaines caractéristiques ultrastructurales communes. Du point de vue histologique, on note la ressemblance entre certains types cellulaires qui forment leur épithélium. Ainsi on retrouve des cellules endocrines dans l'estomac, l'intestin et le pancréas; des cellules à mucus dans l'estomac, l'intestin et les glandes mixtes (salivaires et linguales) et des cellules de type séreux (caractérisées par la présence de granules de sécrétion dans leur cytoplasme apical), dans la crypte intestinale (cellules de Paneth et cellules indifférenciées), dans l'estomac (cellules principales) dans la vésicule biliaire (cellules épithéliales), et dans les glandes séreuses soit le pancréas, les glandes salivaires et linguales (les acinocytes).

Une autre composante commune à l'estomac, l'intestin et la vésicule biliaire, est une interface épithélio-mésenchymateuse particulière. Ces épithéliums qui sont très actifs dans la prolifération et le renouvellement cellulaires reposent sur un réseau de fibroblastes bien organisé (McDonald et al., 1964; Donnellan, 1965; Kaye et al., 1966a;

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1966b; 1968; Pascal et al., 1968; Mathan et al. , 1972; Marsh et al. , 197 4; Maskens et al., 1979; Neal et Potten, 1981; Richman et al., 1987). Des études effectuées chez le rat (Mathan et al., 1972), ont rapporté l'existence d'une relation intime entre l'épithélium et ces fibroblastes dans le duodénum en différenciation. Ceci laisse croire que les interactions entre ces deux tissus pourraient avoir un rôle à jouer dans le développement intestinal.

3. Développement de l'intestin chez la souris foetale

Bien que les processus de morphogénèse qui surviennent au cours du développement intestinal, soient semblables chez les mammifères, les différentes étapes de différenciation (exemple: formation des villosités), ont lieu à des moments différents, compte tenu de la variation des périodes de gestation d'une espèce à l'autre (Kammeraad, 1942; Hugon et Borgers, 1969; Helander, 1973; Moxey et Trier, 1979; Ménard et Calvert, 1991). Cependant les animaux chez lesquels cette maturation de l'intestin s'effectue sur des périodes courtes (espèces mutines), constituent un bon modèle pour l'étude de certains mécanismes régissant le développement intestinal. En effet chez la souris, la différenciation de l'intestin foetal se déroule rapidement durant les quatre derniers jours de gestation.

A 15 jours de l'âge foetal, l'épithélium délimitant une lumière principale, est pluristratifié. Il est composé de cellules peu différenciées (Hugon et Borgers, 1969; Calvert et Ménard, 1978). Il y a ensuite apparition de lumières secondaires dans l'épaisseur de l'épithélium, qui vont fusionner avec la lumière principale vers 16 jours

(31)

de gestation; alors des villosités trapues apparaissent. L'épithélium, encore pluristratifié dans les espaces intervilleux, devient simple cylindrique sur les villosités (Mathan et al.,

1976). A ce stade de développement, des cellules capables de proliférer sont localisées surtout dans l'épithélium intervilleux, mais aussi au niveau des villosités. Certains types

cellulaires telles les cellules endocrines et caliciformes commencent à apparaître (Calvert, 1978; 1979). Le processus de différenciation morphologique et fonctionnel se poursuit durant les deux derniers jours de gestation. La taille et le nombre des villosités augmentent. Les entérocytes acquièrent une bordure en brosse et des complexes de jonctions bien organisés (Calvert et al., 1981; Teillet et al., 1981). Il y a augmentation du nombre de mitochondries et diminution des ribosomes libres et surtout apparition et augmentation de plusieurs activités enzymatiques (Doell et Krechmer, 1962; Hugon et Borgers, 1969; Moog, 1961; 1962; 1981; Calvert et Ménard, 1978; Calvert et al., 1979; 1981; Henning, 1985). Cette différenciation morphologique et fonctionnelle est accompagnée par un processus de ségrégation entre une zone de cellules matures localisées sur la villosité et une zone de prolifération qui se restreint graduellement à l'espace intervilleux juste avant la naissance (Hermos et al., 1971; Calvert, 1979). Peu de temps après la naissance, des cryptes apparaissent au niveau des espaces intervilleux. On peut déjà y observer des cellules intermédiaires et des cellules de Paneth au niveau de ces structures qui sont d'abord rudimentaires puis augmentent en volume et en nombre.

Les facteurs qui régissent la différenciation cryptale ne sont pas encore connus. On ne connaît pas non plus la raison pour laquelle les cryptes ne se forment qu'après la

(32)

naissance chez la souris alors qu'elles sont présentes avant la naissance chez d'autres animaux comme le rat (Ménard et Calvert, 1991; O'Connor, 1966).

4. Facteurs influençant la formation des cryptes

Chez les rongeurs, la différenciation terminale de la muqueuse intestinale se fait au moment du sevrage. On distingue en fait deux périodes de différenciation : une couvrant la période foetale et périnatale et l'autre se faisant au cours de la 3ème semaine post-natale, soit la période de sevrage.

La période foetale est caractérisée par la formation des villosités, l'apparition de certains types cellulaires (cellules caliciformes et enteroendocrines) et la maturation morphologique et fonctionnelle (apparition de certains enzymes de la bordure en brosse) de l 'entérocyte. Le développement de l'intestin foetal semble être accéléré par certains facteurs exogènes telles les hormones (Calvert et al., 1982) bien qu'il obéisse à un programme intrinsèque préétabli.

Pendant la deuxième période (sevrage), la muqueuse intestinale subit une redifférenciation caractérisée essentiellement par la mise en place d'une zone d'extrusion à l'apex des villosités (Calvert et Pothier, 1990) et par des modifications dans le profil enzymatique de la bordure en brosse préparant l'animal à faire face à une nouvelle diète. Le développement de l'intestin du nouveau-né semble être influencé par la diète et par certaines hormones (Ménard et al., 1981; Klein et McKenzie, 1983; Koldovsky, 1983; Foltzer-Jourdainne et al., 1989).

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entièrement connus. Néanmoins plusieurs données concernant les facteurs qui interviennent au cours du développement intestinal semblent indiquer que la maturation de la muqueuse intestinale constitue le résultat d'influences extrinsèques exercées sur des tissus (endoderme et mésenchyme) dont le destin est prédéterminé par leur bagage génétique respectif.

Malgré les nombreuses études, très peu de choses sont connues sur le développement des cryptes de Lieberkühn. En effet, la majorité des facteurs étudiés in vivo et in vitro à date, restent sans effets sur la formation de ces structures. On peut classer ces facteurs en quatre grandes catégories:

a) Facteurs hormonaux et peptidiques

Chez les rongeurs, les diverses substances étudiées tels les glucocorticoïdes, l'EGF, l'insuline et la thyroxine produisent une accélération de la maturation morphologique de l'entérocyte et/ou une induction ou l'augmentation de certaines activités enzymatiques intestinales avant et après la naissance (Herbst et Koldovsky, 1972; Henning et Krechmer, 1973; Fergusson et al., 1973; Celano et al., 1977; Jumawan et al., 1977; Lebenthal, 1977; Malo et Ménard, 1980; 1982; 1983; Heby, 1981; Calvert et al., 1982; Simon-Assman et al., 1982; Beaulieu et Calvert, 1981a; 1981b; 1984; 1985; 1986; 1987; Arsenault et Ménard, 1984; Foltzer-Jourdaine et al., 1989; Riecken et al., 1989; Spaventi et al., 1990).

D'autres études effectuées en culture organotypique, ont rapporté que la glutamine (Beaulieu et Calvert, 1985) permettait la villogénèse dans le duodénum alors que la cytochalasine D (Colony et Conforti, 1993), entraînait une réorganisation de la muqueuse

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dans le côlon de rat foetal.

Les résultats découlant de l'ensemble de ces études (revus par Klein et Mckenzie, 1983 et par Ménard et Calvert, 1991), montrent que les facteurs hormonaux étudiés jusqu'à présent n'ont pas d'effets déterminants sur la formation des cryptes bien que certains d'entre eux pouvaient influencer la prolifération des cellules épithéliales chez le foetus (Beaulieu et Calvert, 1985; 1987).

b) La diète et les rythmes circadiens

Bien que la diète et les rythmes circadiens semblent avoir un rôle à jouer dans la modulation de la prolifération et du profil enzymatique de l'épithélium intestinal (Lev et al., 1979; Henning, 1981; Raul et al., 1981; Scheving et al., 1983; Cameron et al., 1990; Smith et al., 1991; Smith, 1992), ils restent sans effets dans la différenciation cryptale.

c) Les interactions épithélio-mésenchymateuses

Après le travail de Le Douarin et Bussonnet (1966), qui a démontré pour la première fois que l'endoderme était doté d'un pouvoir d'autodifférenciation et d'induction, plusieurs recherches se sont orientées vers le rôle des relations épithélio-mésenchymateuses dans l'ontogenèse de divers tissus et organes (Sawyer et Fallon, 1983; Montgomery et al., 1983; Haffen et al., 1981; 1983; Kédinger et al., 1981; 1987; Stallmach et al., 1989; Mizuno et Yasugi, 1990; Mooney et al., 1992).

Ces études effectuées essentiellement sur des greffons d'endoderme et de mésenchyme réassociés, indiquent qu'une liaison étroite entre ces deux tissus est nécessaire pour la différenciation de l'intestin. De plus, l'effet des hormones sur la maturation de

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l'endoderme semble être modulé par le mésenchyme (Lacroix et al., 1985; Cunha et al., 1983).

En utilisant la même stratégie, Kedinger et al., (1986) ont regardé l'effet du mésenchyme sur la différenciation de cellules provenant d'une culture primaire de l'endoderme intestinal de rat prélevé à 14 jours de gestation, ou de cellules IEC.17 (établies par Quaroni et Isselbacker, 1981). Ils ont montré que, quand ces deux types de cellules épithéliales (qui n'ont aucun pouvoir d'autodifférenciation en culture) étaient enrobées dans du mésenchyme intestinal et que l'ensemble était greffé sous la capsule rénale d'un animal de la même espèce, il y avait différenciation et formation d'un tissu intestinal comportant non seulement des villosités mais aussi des cryptes avec les différents types cellulaires qui les constituent. Il est donc clair que le mésenchyme possède un effet permissif non seulement sur l'endoderme intact mais aussi sur des cellules isolées et que les interactions épithélio-mésenchymateuses constituent un facteur important dans la différenciation des cryptes.

On ignore actuellement le mécanisme d'action de ce facteur. Cependant, l'ensemble des recherches effectuées récemment dans ce domaine indiquent qu'une relation physique (contacts) et une déposition des constituants de la matrice extracellulaire à l'interface de ces deux tissus, constitueraient la voie d'interaction ou de communication entre ces deux tissus (Bissel et Barcellos-Hoff, 1987; Hahn et al., 1987; Simon Assman et al., 1986; 1988; 1989; Aufderheide et Ekblom, 1988; Probstmeir, 1990a; 1990b; Bouziges et al., 1981; Beaulieu et al., 1991; 1993a; 1993b; Beaulieu, 1992; Calnek et Quaroni, 1992; Von Der Mark et al., 1992).

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d) Le liquide amniotique

Le liquide amniotique est un mélange complexe de substances (Lambotte, 1969; Usategui-Gomez, 1974). Celles ci constituent une source majeure de nutrition pour le foetus. On y retrouve diverses hormones telles l'EGF, la thyroxine , l'insuline et le cortisol (Belisle et Turchinsky, 1980), des enzymes telles les dissaccharidases et la phosphatase alcaline (Calvert, 1981) des polyamines (Seale et al., 1979), des protéines telle la fibronectine, divers acides aminés et électrolytes (Emery et al., 1970; Beaulieu et Calvert, 1985), et des immunoglobulines (Lambotte, 1969).

Il a été rapporté que des substances injectées dans la cavité amniotique étaient absorbées par le foetus (Lev et Orlic, 1972) et certaines d'entre elles comme le lactose, entraînaient l'augmentation des activités des enzymes qui les dégradent au niveau de l'intestin du foetus (Lev et al., 1979). Ces résultats laissaient croire que le liquide amniotique pouvait influencer, de façon encore inconnue, le développement morphologique et fonctionnel de la muqueuse intestinale.

D'autres études effectuées chez le lapin (Mulvihill et al., 1985; 1986; 1989), le mouton

(Trahair et al., 1986), le rat (Morikawa et al., 1988) et chez la souris (Calvert, 1981; Bordeleau, 1987), ont fourni des évidences qui supportent l'importance du liquide amniotique comme facteur trophique sur le développement de l'épithélium intestinal ou gastrique en culture.

Cependant, Calvert et al., (1983) ont montré pour la première fois que le liquide amniotique de rat renfermait un ou des facteurs qu'ils ont nommé "facteur de différenciation cryptale "(CDF)", capables d'induire la formation des cryptes in vitro.

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Leur expérience consistait à cultiver des explants de duodénum de souris foetales à 15 jours de gestation, dans un milieu de culture minimum (T8) en présence ou non de l'extrait organique du liquide amniotique de rat (EOLAR) prélevé à 19 jours de gestation. Ils ont en effet remarqué qu'après 48 heures de culture en présence d'EOLAR, il y avait en plus de la formation de villosités, une différenciation des cryptes et de cellules typiques telles les cellules de Paneth. De plus dans certains cas, des cryptes se développaient sur des explants qui ne présentaient aucune villosité. Ceci démontrait effectivement que le CDF présent dans l'EOLAR était capable d'induire la formation de cryptes

in vitro.

5. Objectifs et approche expérimentale.

En premier lieu, en se basant sur les résultats publiés par Calvert et al., (1983), nous avons voulu étudier l'effet du liquide amniotique sur le développement des cryptes intestinales chez la souris

in vivo.

L'approche expérimentale utilisée dans ce travail, consistait à injecter de l'EOLAR dans là cavité abdominale de souris à partir de 14 jours jusqu'à 17 jours de gestation (2 fois par jour) et à évaluer ensuite son effet sur la différenciation morphologique et fonctionnelle de la muqueuse intestinale foetale (17 jours).

Dans un deuxième temps, nous avons étudié le développement des cryptes intestinales au moyen de deux anticorps monoclonaux soit le MIM-1/130 associé au feuillet péricryptal et le MIM-1/39 qui est exprimé par les cellules indifférenciées des cryptes. Ces deux anticorps font partie d'une banque d'anticorps monoclonaux qui ont

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été produits en immunisant des rats contre la muqueuse intestinale de souris (Beaulieu et al., 1992).

L'étude de l'expression de ces marqueurs par immunofluorescence indirecte, en fonction du développement intestinal s'est révélée encourageante puisqu'elle nous permettait d'identifier des éléments épithéliaux et mésenchymateux associés aux cryptes matures mais aussi à la formation de ces dernières. Nous avons alors étudié l'effet de l'EOLAR sur le patron d'expression de ces deux marqueurs et sur la formation des cryptes intestinales in vivo et in vitro.

L'immunolocalisation de ces antigènes au niveau ultrastructural a été déterminée dans l'intestin et dans d'autres tissus en utilisant soit les deux anticorps monoclonaux précités, soit un anticorps polyclonal produit chez des lapins immunisés avec l'antigène MIM-1/39 purifié à partir du jus pancréatique de souris (Calvert et al., 1993).

Une partie importante de ce travail a été consacrée à la caractérisation des deux antigènes, particulièrement le MIM-1/39.

Finalement, en utilisant la protéine MIM-1/39 comme marqueur, nous avons étudié l'effet de la céruléine (un analogue synthétique de la cholécystokinine) sur la sécrétion des cellules indifférenciées de la crypte et d'autres organes.

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MATERIEL ET METHODES

1. Liquide amniotique

Des rates Long Evans Black Hooded adultes ont été utilisées comme source d'approvisionnement en liquide amniotique. Les mâles ont été introduits dans les cages des femelles à 16 heures et retirés le lendemain matin soit au jour "O" de la gestation qui dure normalement 21 jours chez le rat.

A 19 jours de gestation, les rates furent anesthésiées à l'éther et leur cornes utérines ont été retirées suite à une laparotomie. Les sacs vitellins prélevés ont été percés et le liquide amniotique (LAR) a été soigneusement recueilli (environ 7 ml/rate) dans un bêcher en évitant une contamination sanguine possible. Par la suite, le LAR a été centrifugé à 3000 rpm/10 minutes (centrifugeuse: International Equipment Co. Needham. MA.), pour éliminer les débris cellulaires. Après décantation, le LAR a été congelé dans l'azote liquide puis conservé à - 80°C jusqu'à la lyophilisation.

1.1. Extrait organique du LAR (EOLAR)

La préparation d' EOLAR a été effectuée selon la technique décrite par Calvert et al., (1983). A un lyophilisat de 20 ml de LAR ont été ajoutés 10 ml d'un mélange chloroforme: méthanol (1: 1, v:v). La suspension a été agitée vigoureusement au Vortex pendant 1 minute, centrifugée à 1200 g pendant 5 minutes (IEC: International Equipment Co. MA.) puis filtrée sur du coton hydrophile. Cette opération a eu lieu à 4 °C et a été

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répétée trois fois sur le culot. Les surnageants cumulés ont été aliquotés dans des vials prépesés. Le solvant organique fut évaporé sous un courant d'air comprimé et la partie résiduelle (environ 3.6 mg/ml de LAR), dite l'extrait organique du liquide amniotique de rat (EOLAR) a été conservée à - 20°C jusqu'à l'utilisation. L'EOLAR a été préparé au besoin.

1.2. Traitement à L'EOLAR

L'effet de l'EOLAR sur le développement des cryptes intestinales a été étudié chez des souris Swiss ICR gestantes (in vivo). Nous avons aussi vérifié l'action de ce facteur sur l'expression des antigènes MIM-1/39 et MIM-1/130 dans l'intestin foetal en culture (in vitro).

1.2.1. In Vivo

Des souris Swiss ICR ont été utilisées tout au long de cette étude. Celles-ci ont été accouplées pendant une nuit à raison de 4 femelles pour un mâle. La durée normale de gestation chez la souris est de 19 jours. Le jour suivant la fin de l'accouplement ou la naissance est considéré comme le jour "O" de l'age foetal ou néonatal respectivement.

A partir de 14 jours de gestation, les souris pesées, recevaient l'extrait organique de 2.5 ml de LAR (dissout dans 0.25 ml de saline), sous forme d'injection intrapéritonéale, administrée deux fois par jour (à 9 et à 16 heures).

A 17 jours de gestation, une seule injection de 0.5 ml de saline contenant l'extrait organique de 5 ml de LAR fut administrée aux animaux qui ont été sacrifiés 4 heures

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plus tard. Les souris contrôles ont reçu des volumes équivalents de saline selon la même procédure que pour les animaux traités. Une heure avant le sacrifice, 150 µCi (activité spécifique: 79.2 µCi / mole) de thymidine tritiée (New England. Nuclear Corporation, Boston, USA) ont été injectés aux souris, dans le but d'étudier la prolifération des cellules intestinales chez les foetus.

Après laparotomie, les intestins des foetus ont été prélevés et traités pour des analyses biochimiques, morphologiques et autoradiographiques décrites ultérieurement.

1.2.2. In Vitro

a) Culture: dans le but d'évaluer l'effet de l'EOLAR sur l'expression des deux antigènes (MIM-1/39 et MIM-1/130), le duodénum foetal a été cultivé, selon la technique de Calvert et Micheletti (1981). Les foetus ont été prélevés après laparotomie effectuée sur des souris anesthésiées à l'éther à 15 jours de gestation. Les duodénums foetaux ont été prélevés, lavés dans du milieu T8 (Trowell, 1959), puis ouverts à l'aide d'un fù de platine (6 mils, Laboratory Research Industry Inc. Burlington, Vt.) et de microciseaux. Ils ont été ensuite déposés, la muqueuse dirigée vers le haut, sur un papier lentille recouvrant lui même un treillis métallique en acier inoxydable qui reposait au dessus du puits central d'un vase de Pétri Falcon (Falcon Plastics. Los Angeles. CA). Le puits central contenant du milieu de culture Guste assez pour mouiller le papier lentille) fut entouré d'un anneau de papier filtre humide. Les Pétris contenant des explants provenant de 3 à 4 foetus différents, ont été placés dans l'incubateur à 37°C, sous des conditions atmosphériques contrôlées, soit à 37°C et à 5% de C02 et 95% d'02. Après une période de stabilisation de 2 heures, le milieu de culture a été remplacé par du milieu T8 soit en

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Tableau récapitulatif des  tissus  exprimant l'antigène MIM-1/39 et/ou MIM-1/130  (Immunofluorescence)

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