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Amélioration des méthodes de régénération et de
transformation génétique du melon (Cucumis melo L.)
dans le cadre de la validation fonctionnelle du gène A
El-Batoul Djouani
To cite this version:
El-Batoul Djouani. Amélioration des méthodes de régénération et de transformation génétique du
melon (Cucumis melo L.) dans le cadre de la validation fonctionnelle du gène A. [Stage] Université
Montpellier 2 (Sciences et Techniques) (UM2), Montpellier, FRA. 2007, 29 p. �hal-02823248�
Unité de Génétique et d’Amélioration Université Montpellier II des Fruits et Légumes
Réalisé par : DJOUANI El-Batoul.
1ére année Master Biologie Fonctionnelle des plantes. Maître de stage : Mme CHOVELON Véronique.
2006 / 2007
Amélioration des méthodes de régénération et de
transformation génétique du melon
(Cucumis melo L.)
Remerciements :
Je remercie Mme CAUSSE Mathilde pour son accueil au sein de l’unité GAFL.
Je tiens à remercier tout particulièrement Mme CHOVELON Véronique, pour m’avoir
permis de réaliser ce stage et pour avoir suivi constamment mon travail avec ses précieux
conseils et sa patience.
Je remercie également Mr AARROUF Jawad, pour l’aide qu’il m’a apportée pour
l’avancement de mon travail.
Je remercie Mme DOGIMONT Catherine de me permettre d’effectuer ce stage.
Un grand merci à toute l’équipe de Biologie Cellulaire, en particulier ; Marie-claude,
Nathalie, Fabrice, Marianne, Vérane, Manu, Karine et Marion ; Pour leur accueil, leur aide
et leur bonne humeur.
Je remercie mes chers parents pour m’avoir encouragée et soutenue tout le long de
mes études et qui ont toujours été un soutien moral pour moi. Et surtout à mes chères sœurs
et à mon frère.
Table des Matières :
INTRODUCTION GENERALE……….………..….….01
I- CONTEXTE……….…………..….….01
II- OBJECTIFS……….…….…….……..02
II- MATERIELS ET METHODES……….…….……..…..02
II.1- Matériels………..……....….…..02
1.1- Matériel végétal………...………..02
1.1-1. Type d’explants testés………...…..…...02
1.1-2. Désinfection des explants……….…………..02
1.2- Matériel bactérien……….………....03
II.2- Méthodes……….03
2.1- Protocoles de régénération……….……..03
2.2- Protocoles de transformation génétique………...04
2.2.1- Préparation de la solution bactérienne……….……...04
2.2.2- Coculture………...04
2.2.3- Régénération des explants transformés………...05
2.2.4- Sélection des transformants………...05
2.2.5- Analyse des explants et des plantules transformés………...05
2.3 - Analyse du niveau de ploïdie par cytométrie………...06
2.4- Etude cytologique et fixation des échantillons……….06
2.4.1- Prélèvement des échantillons………..……...06
2.4.2- Fixation des échantillons par la méthode FAA………...…..06
2.5- Analyse statistique des données………...…06
III- RESULTATS III.1- Résultats des expériences de régénération par Organogenèse………....07
3.1.1- Effet du génotype sur la régénération………..…..07
3.1.2- Effet du type d’explants sur la régénération……….….07
3.1.3- Effet du milieu de culture sur la régénération……….…..08
3.1.4- Effet de l’interaction génotype / milieu / type d’explants sur la régénération ………...……...08
3.1.5- Etude cytologique de l’organogenèse………...…08
III.2- Résultats des expériences de transformation génétique avec la construction 35B-GUS………...…..…...09
3.2.1- Etape de coculture………..……....…09
3.2.2- Effet des traitements de coculture sur la régénération des explants transformés………..……...…...09
3.2.3- Comparaison entre la régénération des explants transformés et non transformés………..……….10 3.2.4 - Etude cytologique d’organogenèse après transformation
génétique……….……….…10
III.3 - Résultats des expériences de transformation génétique avec les constructions contenant le gène A (A-2301 et A-3301)………...10
3.3.1 Transformations réalisées avec la construction A-2301………...10
3.3.2 Transformations réalisées avec la construction A-3301……….……….…11
IV- DISCUSSION...12
LISTE DES ABREVIATIONS : AIA : Acide indole 3-acétique BAP : 6- benzylaminopurine DO : densité optique
EDTA : acide éthylène diamine tétra-acétique GUS : β-glucuronidase
MS : milieu de MURASHIGE & SKOOG nptII : néomycine phosphotransferase II 2iP : Dimethylallylamino purine
35S : promoteur du virus de la mosaïque du chou-fleur X-Gluc : acide 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide
LIEU DU STAGE :
Mon stage s’est déroulé dans le laboratoire de biologie cellulaire de l’Unité de Génétique et d’Amélioration des Fruits et des Légumes (UGAFL) à l’INRA d’Avignon. Plusieurs types de recherches sont menés au sein de cette Unité dont les principales activités concernent les bases génétiques et moléculaires de la résistance aux maladies et de la qualité des fruits et légumes, ainsi que la caractérisation fonctionnelle des gènes concernés.
INTRODUCTION GENERALE
Le melon (Cucumis melo L.) est une Cucurbitacée originaire d’Afrique de l’Est, ramenée en France au 15ème siècle. C’est une espèce qui représente un grand intérêt économique et agronomique dans de nombreux pays, La chine et la Turquie sont les premiers pays producteurs ; en 2005 la production mondiale a été estimée à 28 millions de tonnes (FAO, 2005). Le melon est consommé en produit frais et sa qualité (texture, arômes, teneur en sucre) conditionne directement sa vente.
En ce qui concerne sa biologie florale, on distingue trois types de fleurs : bisexuées, mâles ou femelles (J. Odet et al., 1985). La répartition des sexes dans les individus est présentée dans le tableau 01. L’expression du sexe peut être modifiée par l’action des hormones de croissances. Différentes études ont montré que les gènes de la biologie florale des Cucurbitacées s’inscrivent dans la voie de biosynthèse ou de régulation de l’éthylène (E. Papadopoulou et al., 2005). Le taux d’éthylène endogène est deux fois supérieur dans les lignées gynoїques que dans les lignées monoïques ou andromonoïques. Le mécanisme génétique de la sexualité florale chez le melon est contrôlé par deux gènes : le Gène A et le gène G, la combinaison des allèles de ces deux gènes est à l’origine des différents types floraux. La compréhension du déterminisme sexuel d’une fleur est très importante dans le développement biologique d’une plante, cela a aussi des applications pratiques dans l’agriculture, la sélection, la création d’hybrides et le maintien des lignées, car souvent le sexe d’une fleur limite les possibilités de croisement et de culture. Le melon étant une espèce allogame, cela pose des problèmes de contrôle de la pollinisation et la nécessité de castration manuelle.
Les techniques de transformation génétique et de régénération sont absolument nécessaires au développement des méthodes de biologie moléculaire. La transformation génétique permet d’insérer un gène d’intérêt dans un génotype qui en est dépourvu et de valider la fonction de ce gène par l’étude de son expression au niveau des plantes transformées. L’intégration d’un nouveau gène peut avoir comme effet l’introduction d’un nouveau caractère ou l’inactivation d’un caractère déjà présent (www.Gnis.fr). L’utilisation de la transgénèse chez le melon par les gènes A et G permettra donc de mieux comprendre la biologie florale de cette espèce.
I- CONTEXTE
Dans le cadre d’une collaboration entre l’unité GAFL à l’INRA d’Avignon et l’Unité de Recherche en Génomique Végétale (URGV) à Evry, deux gènes (A et G) ont été récemment clonés (Fergany, 2006 ; C. Troadec, 2007). Le gène A a été délimité à un intervalle physique de 14 Kb. Dans cet intervalle, un seul gène (de 2010 b) a été prédit et correspond au gène A (figure 01). Ce gène code pour la production d’une protéine de 50,47 KDa semblable à une protéine de la famille de 1-amino cyclopropane carboxylase synthase (ACC synthase), une enzyme clef de la voie de biosynthèse de l’éthylène (M. Fergany, 2006).
Phénotype Type floral sur une même plante
Génotype Monoïque Fleurs mâles et femelles [A- G-] Andromonoϊque Fleurs mâles et hermaphrodites [aa G-]
Hermaphrodite Fleurs hermaphrodites uniquement
[aa gg] Gynoϊque Fleurs femelles uniquement [A- gg]
Tableau 01 : Représentation des différents phénotypes sexuels obtenus par les différentes combinaisons entre les gènes A et G. (C. Troadec, 2007).
Exon 1 Exon 2 Exon 3 180 b 287 b 871 b
ATG
---
-
---
---
AAAAAAIntron 1 Intron 2 95 b 577 b
Figure 01 : Structure intron-exon du gène A du melon (M. Fergany, 2006).
La validation fonctionnelle du gène A par transgénèse constitue un objectif important pour le laboratoire de biologie cellulaire de l’unité GAFL. De nombreux travaux ont été réalisés pour améliorer la régénération et la transformation génétique faisant appel à des techniques différentes d’organogenèse et d’embryogenèse somatique, (Pech, 2002 ; Mendi et al., 2004 ; Gray, 1993 ; Vallés et al., 1994). Cependant le melon est une espèce récalcitrante à la régénération et à la transformation et le taux de réussite reste souvent faible. L’efficacité de la régénération est étroitement liée au génotype, au type d’explants utilisés (feuilles, cotylédons, hypocotyles, racines, tiges), à la composition des différents milieux de culture en hormones de croissance et aux facteurs physiques en chambre de culture (température, qualité et intensité lumineuse, photopériode). La difficulté de régénérer des plantes transformées ainsi que les problèmes de polyploïdie ont été pris en considération au cours de notre étude pour pouvoir améliorer les protocoles de régénération et de transformation chez cette espèce.
II- OBJECTIFS :
Mise au point d’un protocole efficace de régénération par organogenèse et de transformation du melon (Cucumis melo) par Agrobacterium tumefaciens à l’aide du gène marqueur GUS de β-Glucuronidase.
Application de ce protocole pour initier des études de validation fonctionnelle du gène A (gène contrôlant la biologie florale chez le melon).
III- MATERIELS ET METHODES : 1- Matériels
1.3- Matériel végétal :
Deux génotypes de melon présentant différents types floraux ont été utilisés : · Védrantais : originaire de France, andromonoïque (aaGG)
· Paul : originaire de Pologne, hermaphrodite (aagg) 1.1.2- Type d’explants testés :
Les explants choisis pour l’étude sont soit :
· des jeunes feuilles obtenues après 13 jours de semis en terrine, découpées en quatre explants (de 0,3 à 0,5 cm de côté),
· des cotylédons pré-germés sur un milieu MS 1/2 à l’obscurité à 28°C pendant 4 jours, découpés en deux explants.
1.1.1- Désinfection des explants :
La technique diffère selon le type d’explant utilisé :
· pour les cotylédons : les graines sont désinfectées dans l’éthanol 70° pendant 30 sec puis rincées trois fois à l’eau stérile ; les téguments sont ensuite enlevés manuellement au scalpel et les cotylédons sont désinfectés pendant 20 min à l’hypochlorite de calcium 2,5% + 0,1% tween 20, puis rincés trois fois à l’eau stérile.
· les jeunes feuilles issues de semis sont désinfectées à l’Inovchlore (1 pastille de 1,5 g + 10 ml de teepol (4vol/1vol. d’eau distillée) + 800 ml d’eau distillée) pendant 10 min, puis rincées trois fois à l’eau stérile avant d’être découpées.
1.4- Matériel bactérien :
Nous avons choisi de travailler avec trois constructions génétiques. Les études préliminaires pour l’amélioration du protocole de transformation ont été réalisées avec la construction 35B-GUS ; les meilleurs résultats obtenus avec cette construction ont été par la suite appliqués pour la transformation avec les constructions A-2301 et A-3301 comprenant le gène A. Les différentes constructions utilisées sont décrites dans le tableau 02.
Les constructions du gène A ont été réalisées dans des vecteurs pCAMBIA (figure 02) à partir du gène sous contrôle de ses propres séquences régulatrices. Ces séquences, promotrice et terminatrice, n’étant pas correctement définies, les constructions ont été réalisées à partir de séquences plus ou moins longues encadrant le gène A:
- la construction A-2301 correspond à une séquence de 13300 b comprenant le gène A,en plus gène rapporteur GUS (2000b) (Y. Akasaka-k et al., 2004) et du gène de sélection nptII de résistance à la kanamycine.
- la construction A-3301 correspond au gène A (2010 b) entouré d’environ 1000 b en amont et en aval (soit une taille totale de 4655b) en plus du gène rapporteur GUS et du gène de sélection bar (560b) de résistance à l’herbicide basta (A.Madhavi L et al., 2006).
Tableau n° 02 : Présentation des différentes constructions utilisées pour la transformation
Construction Souche Agrobacterie Plasmide de virulence Antibiotiques de sélection / bactérie Vecteur (plasmide binaire) Gènes d’intérêt Taille du gène d’intérêt (b) Gène de résistance / plante 35B-GUS C58 PGV2260 Kanamycine Ampicyline Rifampicine pBI101 GUS (uidA) 2000 nptII (résistance à kanamycine) A-2301 C58C1 pMP90 Kanamycine pCambia2301 A 13300 nptII (résistance à kanamycine)
A-3301 C58C1 pMP90 Kanamycine pCambia3301 A 4655
bar
(résistance à basta)
II.2- Méthodes :
2.1- Protocoles de régénération :
Notre travail consiste à étudier la régénération par organogenèse en se basant sur des protocoles déjà publiés, que nous avons modifiés afin d’améliorer les taux de régénération obtenus. Le milieu de base est le milieu de Murashige et skoog (1962) avec 0,8% d’agar Bacto et 3% de sucre à pH 5,7. Deux protocoles sont testés :
- Protocole de Y. Mendi et al., 2004 :
Après découpage, les explants (feuilles ou cotylédons pré-germées) sont déposés sur un milieu de régénération MR (MS avec 1,12 mg/L de BAP, 0,88 mg/L d’AIA et 0,26 mg/L d’ABA) et maintenus en chambre de culture à 24/28°C avec une photopériode de 8/16h (nuit/jour) sous lumière blanche (tubes fluorescents «blanc industrie»). Un repiquage est effectué tous les 15 jours sur le même milieu. Au bout de quatre semaines, les plantules obtenues sont transférées sur un milieu d’élongation MM (MS avec 0,67 mg/L de BAP) pendant 4 semaines, ensuite sur un milieu de rhizogenèse sans hormones de croissance.
- Protocole de JC. Pech, 2002 :
Les explants découpés (feuilles ou cotylédons pré-germés) sont déposés sur un milieu de régénération MREG (MS avec 0,225 mg/L de BAP et 0,203 mg/L de 2.IP) avec un repiquage tous les 15 jours sur un nouveau milieu. Après 4 à 6 semaines, les plantules sont transférées sur un milieu d’élongation ME (MS avec 0,22 mg/L de BAP et 0,1 mg/L de GA3) puis au bout de 2 à 4 semaines un dernier transfert est réalisé sur un milieu de rhizogenèse sans hormones de croissance.
2.3- Protocoles de transformation génétique : 2.2.1- Préparation de la solution bactérienne :
La culture bactérienne est réalisée à partir d’un stock glycérol conservé à -80°C, par étalement à l’aide d’une öse sur un milieu LB en boite de Pétri (milieu Luria Bertani : 10 g/L de NaCl, 10 g/L de Bactotryptone, 5 g/L d’extrait de levure et 10 g/L d’agar Biomar) contenant les antibiotiques de sélection spécifiques à chaque souche d’Agrobactérie (Tableau 02) ; les boites sont placées à 28°C pendant 3 à 4 jours. Une suspension bactérienne en milieu liquide est réalisée à partir de cette culture bactérienne par prélèvement d’une colonie isolée et mise en culture dans 20 ml de LB liquide avec les antibiotiques de sélection appropriés, puis incubation à 28°C à l’obscurité et en agitation (120 tours par minute) pendant 24 heures.
La concentration bactérienne est mesurée au spectrophotomètre à une longueur d’onde de 600 nm, après 24h de culture la DO600nm obtenue est généralement de l’ordre de 1 à 1,5. La suspension
bactérienne est ensuite centrifugée à 4000 rpm (rotation par minute) pendant 10 min, le culot bactérien est repris dans du KCMS liquide (MS + 200 mg/L de KH2PO4, 0,9 mg/L de Thiamine et 39
mg/L d’Acétosyringone) et ajusté à une DO600 proche de 0,3 ce qui correspond à une concentration
2.2.2- Coculture :
Afin d’améliorer cette étape qui permet la pénétration des bactéries au niveau des explants, nous avons testé en cours de coculture trois types de traitements utilisés par différents auteurs:
- le traitement V0 : les explants sont incubés dans la solution bactérienne (DO600 0.3) pendant
20 min à température ambiante et en agitation (100 tours/min).
- le traitement V+ (J. Kapila et al., 1997) : les explants sont incubés dans la solution bactérienne (DO600 0.3) et placés sous vide (pression de 0,6 à 1 bar) et en agitation.
- le traitement C+ (S. çuruk et al. 2005) : les explants sont déposés dans un tube contenant 500 mg de carborundum et 30 ml d’eau stérile puis vortexés à la vitesse 6 pendant 1 min 30 pour provoquer des blessures ; les explants sont ensuite incubés dans la solution bactérienne (DO600 0.3) pendant 20 min et en agitation.
Après coculture, les explants sont séchés sur du papier absorbant stérile et déposés sur milieu de coculture solide (50 explants/boite) contenant les hormones de croissance spécifiques à chaque protocole et additionné de 39 mg/L d’acétosyringone. Les boites sont laissées pendant 48h à l’obscurité dans la chambre de culture.
2.2.3- Régénération des explants transformés :
Après les deux jours de coculture, les explants sont rincés trois fois à l’eau stérile, séchés sur papier stérile et déposés sur milieu de régénération conformément aux différents protocoles de régénération utilisés.
Les différents milieux utilisés pour la régénération sont additionnés de timentin (100 à 400 mg/L) pour éliminer les bactéries, et d’antibiotiques de sélection (kanamycine ou basta selon les constructions). 2.2.4- Sélection des transformants :
L’étape de la sélection est très importante, elle permet d’éliminer les plantules régénérées non transformées ou «échappées». Différents agents de sélection (antibiotiques ou herbicides) sont utilisés en fonction du gène de sélection (nptII : résistance à la kanamycine ou bar : résistance à l’herbicide Basta) inséré avec le gène d’intérêt dans la construction utilisée pour la transformation. Les explants transformés avec les constructions 35B-GUS et A-2301 sont cultivés sur des milieux contenant de la kanamycine (100 mg/L). Les explants transformés avec la construction A-3301 sont cultivés sur des milieux contenant de l’herbicide Basta (PPT : Phosphinothricine). La concentration de Phosphinothricine à utiliser dans le milieu a été déterminée après un essai de régénération à différentes concentrations de PPT (1, 2 ou 3 mg/L) (J-S.Han et al., 2005).
2.2.5- Analyse des explants et des plantules transformés :
Les explants en cours de culture ou les plantules régénérées après transformation sont analysés par test GUS pour vérifier l’intégration de l’insert. Afin d’évaluer l’efficacité des différents protocoles de transformation utilisés, cinq explants sont prélevés 2 et 20 jours après transformation. Le matériel prélevé est découpé au scalpel, déposé dans des plaques de polystyrène en présence de 5 à 6 ml de tampon GUS (30 mg de X-Gluc additionné de quelques gouttes de dimethyl formamide, 10 ml d’EDTA, 500µl de ferricyanide et 500µl de ferrocyanide, 90 ml de tampon sodium phosphate) et mis à incuber pendant 24h à l’obscurité et à 37°C. Le tampon GUS est ensuite éliminé et remplacé
pendant 24h par 6 ml d’éthanol 70° puis par 6 ml d’éthanol 90° pour décolorer les explants et révéler la coloration bleue des cellules transformées. L’analyse du test GUS est réalisée suivant une échelle de notation (de 0 à 5) permettant d’estimer le pourcentage de la surface colorée par rapport à la surface totale des explants analysés (H. Ezura et al., 2000).
Cette échelle est la suivante :
- 0 : aucune coloration des explants
- 1 : présence de points bleus sur environ 5% de la surface des explants - 2 : présence de tâches bleues sur environ 15% de la surface des explants - 3 : présence de zones bleues sur environ 30% de la surface des explants - 4 : présence de zones bleues sur environ 50% de la surface des explants - 5 : présence de zone bleue sur 80% à 100% de la surface des explants. 2.3 - Analyse du niveau de ploïdie par cytométrie :
Nous avons analysé par cytométrie de flux le niveau de ploïdie des plantules obtenues après régénération. Des morceaux de feuilles (d’environ 0,5 cm de côté) sont broyés finement à l’aide d’une lame de rasoir dans une petite boite de Pétri contenant 1 ml de tampon contenant du DAPI (Partec), produit fluorescent s’intercalant au niveau de l’ADN. La solution obtenue est ensuite filtrée pour éliminer les débris cellulaires et passée au travers d’un rayon UV afin de mesurer la fluorescence émise par les tissus testés. L’appareil ayant préalablement été étalonné avec une plante diploïde de l’espèce à analyser, le pic correspondant aux cellules diploïdes est positionné à 50 sur un graphique (Figure 03), alors que le pic correspondant aux cellules tétraploïdes est positionné à 100. Le niveau de ploïdie des plantules testées est évalué en fonction de la position des pics obtenus.
2.4- Etude cytologique et fixation des échantillons :
Le but de cette étude est de déterminer l’origine et l’évolution des cellules transformées pendant l’organogenèse.
2.4.1- Prélèvement des échantillons :
Des explants transformés par la construction 35B-GUS ou non transformés, sont prélevés à différents stades de leur régénération (2, 10 et 30 jours de culture).
2.4.2- Fixation des échantillons :
Les échantillons prélevés sont fixés dans une solution FAA (Formol/Acide acétique/Alcool 90% respectivement à 1/1/8 volumes) pendant 24 heures, puis lavés à l’eau courante et déshydratés progressivement à l’éthanol (25, 50, 70, 95 et 100%). Les explants sont ensuite pré-infiltrés dans la résine (Historésine, Kit technovit 71000, Kulzer) à différentes concentrations (¼, ½, ¾, 1) pendant 24h. Des coupes de 5µm sont réalisées à l’aide d’un microtome (Multicut 2045), puis collectées sur des lames et colorées au bleu de toluЇdine. Les coupes sont ensuite montées entre lame et lamelle et observées au microscope.
Figure n° 03 : Graphique de cytometrie obtenu avec une plante diploЇde. 1 : pic de diploЇdie
2 : pic de tétraploïdie 3 : pic d’octoploЇdie
2.5- Analyse statistique des données :
Nous avons analysé les résultats en évaluant l’écart entre les effectifs observés et les effectifs théoriques selon le test d’homogénéité du Khi2de Pearson, en prenant l’hypothèse d’indépendance entre les facteurs étudiés et le taux de régénération des explants :
- si les écarts sont faibles, le
χ²
est non significatif et on en déduit que les variations ne sont pas dues aux facteurs étudiés.- si le
χ²
est significatif, on doit chercher le facteur réellement responsable de cet écart en décomposant leχ²
.
Les effectifs théoriques sont calculés à partir des effectifs observés suivant la formule : Tij = (TOi x TOj) / ∑TOi
Tij est l’effectif théorique dans la i-éme ligne et la j-éme colonne. TOi est le total de l’effectif observé dans la i-éme ligne.
TOj est le total de l’effectif observé dans la j-éme colonne. ∑TOi est l’ensemble des effectifs observés de toutes les lignes. Le
χ²
est calculé suivant la formule :χ²
calculé = ∑li =1 ∑cj=1 ((Oij – Tij) 2 / Tij)Oij est l’effectif observé à la i-éme ligne et la j-éme colonne. I est le nombre le lignes, c est le nombre de colonne.
Le
χ²
calculé est ensuite comparé auχ²
théorique à l’aide de la Table de la loi deχ²
de Pearson ; le degré de liberté étant déterminé de la manière suivante : ddl = (I-1) x (c-1)) avec un risque α = 0,05. III- RESULTATS :III.1- Résultats des expériences de régénération par organogenèse :
Nous avons réalisé au cours de cette étude un essai de régénération simple sans transformation génétique. Nous avons étudié l’effet de trois facteurs sur la régénération du melon : le génotype (Védrantais et Paul), le type d’explant (cotylédons pré-germés et jeunes feuilles) et la composition des milieux de culture (protocoles de Mendi et de Pech). Les résultats sont présentés ci-dessous d’abord de manière individuelle (facteur par facteur) puis nous avons étudié l’effet de l’interaction de ces trois facteurs sur la régénération.
3.1.5- Effet du génotype sur la régénération :
Nous avons étudié l’effet du génotype sur la régénération du melon en utilisant deux variétés différentes Védrantais et Paul. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 03.
Nous avons observé que 46,7% des explants du génotype Védrantais ont régénéré des bourgeons, alors que pour le génotype Paul seulement 9,21% des explants ont bourgeonné. L’analyse statistique de ces résultats montre un effet significatif du génotype sur la régénération : le
χ²
calculé est de 57,02, il est supérieur auχ²
théorique (3,84) pour un ddl=1, ce qui permet de rejeter l’hypothèsed’indépendance.
Il est important de noter que la quasi-totalité des plantules transférées sur milieu d’élongation ne s’allongent pas et qu’un pourcentage non négligeable d’entre elles est mal formé ou vitrifié. Le % final de régénération (nombre de plantules obtenues sur milieu d’élongation/nombre d’explants mis en
culture) n’est que de 23,57% pour le génotype Védrantais et seulement la moitié de ces plantes sont diploïdes.
3.1.2- Effet du type d’explants sur la régénération :
Le type d’explant utilisé peut jouer un rôle important sur le taux de régénération. Environ dix jours après la mise en culture, on observe un début de bourgeonnement en bordure des explants au niveau des coupures. Les résultats présentés dans le tableau 04 nous montrent que le bourgeonnement des cotylédons pré-germés (60,8 %) est meilleur que celui obtenu avec les feuilles (7,85%). Le résultat statistique étant très significatif, le type d’explant a un effet réel sur la régénération (le
χ²
calculé est de 93.39 avec un ddl=1).Le taux de plantules obtenues au final est de 28,4% pour les cotylédons pré-germés, ce qui est supérieur au taux obtenu avec les feuilles. Nous avons également obtenu un taux supérieur de plantules diploïdes à partir de cotylédons pré-germés.
3.1.3- Effet du milieu de culture sur la régénération :
Le milieu de culture a pour rôle d’assurer la nutrition des explants et d’initier le processus de régénération. Dans le but d’obtenir un milieu de culture adéquat pour la régénération des explants, nous avons utilisé deux combinaisons d’hormones de croissance différentes : le milieu de Mendi qui contient une forte concentration en cytokinine (1,12mg/L de BAP), de l’acide abscissique (0,26 mg/L d’ABA) et de l’auxine (0,88 mg/L d’AIA), tandis que le milieu de Pech ne contient que des cytokinines (0,225 mg/L de BAP et 0,203 mg/L de 2.IP). Les résultats sont résumés dans le tableau 05.
La régénération des explants cultivés sur le milieu de Pech est nettement supérieure à celle obtenue avec le protocole de Mendi. Les taux d’explants ayant produit au moins un bourgeon sont respectivement de 51,8% (milieu MREG) et de 1,04% (milieu MR). L’étude statistique de ces résultats montre qu’il existe un effet significatif du milieu de culture sur la régénération (le
χ²
calculé est de74,41 avec un ddl de 1). Le % final de plantules obtenues sur milieu d’élongation est de 26,81% avec le milieu de Pech, dont 45 % des plantes sont diploïdes.
3.1.4- Effet de l’interaction génotype / milieu / type d’explants sur la régénération :
L’étude de l’interaction entre les différents facteurs est nécessaire pour expliquer les résultats obtenus. Les résultats de l’interaction sont représentés dans le tableau 06.
Le pourcentage de régénération le plus élevé (70,66%) est obtenu à partir des cotylédons pré-germés du génotype Védrantais sur le milieu MREG de Pech. Le test statistique confirme ce résultat (χ²calculé est de 283,62, le
χ²
théorique de 14,1 avec un ddl de 7). Il faut noter aussi que les explants de feuilles sur le milieu de Mendi ne régénèrent pas et se vitrifient rapidement.
3.1.5- Etude cytologique de l’organogenèse:
Les observations cytologiques ont montré que les cellules sous épidermiques sont à l’origine du bourgeonnement chez le melon (photo 01). Ces cellules forment des protubérances cellulaires puis des massifs méristématiques (photo 02) qui se développent en bourgeons (photo 03 et 04) ; la photo 5 montre un stade plus évolué avec la formation d’ébauches foliaires. Des résultats similaires ont été observés par Mendi et al., 2003 chez la pastèque. Nous avons observé au cours des différentes expériences de régénération, qu’une grande partie des plantules transférées ne se développent pas normalement sur le milieu d’élongation; ceci peut être dû à la désorganisation du méristème apical. Une étude cytologique est en cours de réalisation pour confirmer ou infirmer cette hypothèse.
Tableau n° 03 : Effet du génotype sur la régénération (tous traitements confondus). Génotypes Nbr total d’explants Nbr d’explants avec au moins 1 bourgeon % d’explants ayant régénéré Nbr de plantules obtenues % de régénération (nbr pltes /expls) % de plantes diploïdes Védrantais 246 115 S 46,74 58 23,57 45,54 Paul 141 13 S 9,21 7 4,96 / (S : test significatif)
Tableau n° 04 : Effet du type d’explants sur la régénération (tous traitements confondus).
Type d’explants Nbr total d’explants Nbr d’explants avec au moins 1 bourgeon % d’explants ayant régénéré Nbr de plantules obtenues % de régénération (nbr pltes /expls) % de plantules diploïdes Cotylédons pré-germés 176 107 S 60,8 50 28,40 47,31 Feuilles 140 11 S 7,85 11 7,85 25
Tableau n° 05 : Effet du milieu de culture sur la régénération du génotype Védrantais (tous traitements confondus).
Milieu de régénération Nbr total d’explants Nbr d’explants avec au moins 1 bourgeon % d’explants ayant régénéré Nbr de plantules obtenues % de régénération (nbr pltes /expls) % de plantules diploïdes MREG (Pech) 220 114 S 51,8 59 26,81 45 MR (Mendi) 96 1 S 1,04 2 2,08 /
Tableau n° 06 : effet de l’interaction des différents traitements sur la régénération
Génotypes /explants Nbr total d’explants Nbr d’explants avec au moins 1 bourgeon % d’explants ayant régénéré Nbr de plantules obtenues % de régénération (nbr pltes/expls) % de plantules diploïdes Protocole de Pech (milieu MREG)
Védrantais /cotylédon 150 106 S 70,66 48 32 47,31 Védrantais / feuille 70 8 NS 11,42 8 11,42 25 Paul /cotylédon 71 10 NS 14,08 10 14,08 / Paul /feuille 70 3 NS 4,28 3 4,28 /
Protocole de Mendi (milieu MR) Védrantais /cotylédon 26 1 NS 3,84 2 7,69 / Védrantais /feuille 70 0 S 0 0 0 / Paul /cotylédon 56 1 NS 1,78 0 0 / Paul / feuille 70 0 S 0 0 0 /
Photo 01: division des cellules sous épidermique Photo 02 : protubérances cellulaires
Photo 03 : développement d’un bourgeon
III.2- Résultats des expériences de transformation génétique avec la construction 35B-GUS : Le but de la transformation avec cette construction est de mettre au point une méthode plus efficace permettant une régénération de plantules transformées.
3.2.1- Etape de coculture :
Différents traitements ont été réalisés au cours de l’étape de coculture (V0, V+ et C+), 2 et 20 jours après coculture, cinq explants ont été prélevés à partir de chaque expérience et analysés par test GUS. Les résultats permettent de déterminer le meilleur traitement favorisant la pénétration de la bactérie au niveau des tissus. L’efficacité des différents traitements est estimée par le nombre d’explants positifs obtenus en test GUS sur le nombre d’explants analysés, et par l’évaluation de la coloration bleue des explants suivant une échelle de notation inspirée des travaux d’Ezura et al., 2000 et décrite dans le paragraphe « Matériels et Méthodes ».
Les résultats résumés dans le tableau 07 et dans la figure 04 mettent en évidence une meilleure pénétration de la bactérie en présence du vide (V+) ou du carborundum (C+) : le nombre d’explants positifs et l’importance de la coloration bleue sont supérieurs à ceux obtenus avec le traitement (V0) et cela à 2 ou 20 jours après coculture. Nous pouvons aussi noter que la coloration bleue devient plus importante après 20 jours de coculture du fait de la multiplication des cellules transformées et de l’augmentation de la taille des explants en culture.
3.2.2- Effet des traitements de coculture sur la régénération des explants transformés :
Nous avons cherché à connaître l’effet des différents traitements de coculture (V0, V+ et C+) sur la régénération des explants transformés. Les résultats résumés dans la figure 05 (obtenus avec le protocole de Mendi) montrent clairement la différence de régénération entre ces trois traitements, avec un effet significatif (le
χ²
calculé est de 31,4 avec ddl = 2). La régénération des explants est meilleure avec le traitement V0 (30,3%), par contre elle est très réduite avec le vide (V+) et le traitement « carborundum plus vide » (V+C+) donnant des explants vitrifiés et non développés en cours de culture. L’effet du carborundum seul (C+) sur la régénération n’a pas été testé. De plus, il est à noter que nous avons été confronté à des problèmes de contaminations bactériennes en cours de culture avec les explants traités par le vide (figure 05).Au final, le traitement V0 a permis d’obtenir 28 plantules sur milieu d’élongation, dont seulement 3 sont positives après test GUS. Les autres plantules, arrivent toutefois à se développer sur le milieu de sélection contenant de la kanamycine. Ces résultats montrent que le melon possède naturellement un certain niveau de tolérance à la kanamycine, ce qui rend la sélection des transformants plus difficile. C’est pour cette raison que deux agents de sélection (kanamycine et Phosphinothricine) ont été utilisés par la suite dans les transformations avec le gène A.
3.2.3- Comparaison entre la régénération des explants transformés et non transformés :
Dans le but de déterminer l’effet de la transformation par Agrobacterium tumefaciens sur la régénération, nous avons comparé les résultats de régénération simple et de régénération après transformation pour le protocole qui a donné les meilleurs résultats. Nous avons donc choisi pour cette étude de travailler à partir de cotylédons pré-germés du génotype Védrantais déposés sur le milieu de régénération de Pech. Les résultats sont présentés dans la figure 06.
Nous pouvons constater que la transformation génétique diminue fortement le taux de régénération : en régénération simple 70,66% des explants ont formé au moins un bourgeon, tandis qu’après transformation avec la construction 35B-GUS un taux plus faible (12,63%) a été obtenu. Cette influence de la transformation sur la régénération est significativement démontrée par le test statistique (le
χ²
calculé est de 78,45 avec un ddl = 1).3.2.4 - Etude cytologique d’organogenèse après transformation génétique :
Pour compléter les résultats précédemment obtenus, une étude cytologique a été réalisée à partir d’explants prélevés à des stades différents après transformation. Nous avons observé la transformation des cellules sous épidermiques 2 jours après coculture (photo 06) ; ces cellules transformées se développent en zones méristèmatiques après environ 10 jours (photo 07). Dans la plupart des cas, ces massifs cellulaires perdent leur organisation environ 30 jours après transformation (photo 08), ce qui pourrait expliquer les difficultés observées en culture pour la régénération de plantules après transformation.
Figure n° 04 : Résultats de coculture obtenus avec les trois traitements (V0, V+, C+). (E : échelle de notation de 1 à 5).
Tableau n° 07 : Résultats de coculture avec les différents traitements (V0, V+ et C+). Test à j+2 Test à j+20 Traitements Nbr d’explants GUS+ / 5 testés Niveau d’expression du GUS* Nbr d’explants GUS+ / 5 testés Niveau d’expression du GUS* V0 2 1 5 2 V+ 4 4 4 5 C+ 4 3 5 5 * Echelle de notation de 1 à 5
Test GUS réalisé à j+2
V0 (E = 1) V+ (E = 4) C+ (E = 3)
Test GUS réalisé à j+20
0 20 40 60 80 V0 V+ V+C+
Traitem ents de coculture
% d'explants ayant régénéré % d'explants contaminés
Figure n° 05 : Effet des trois traitements de coculture sur la régénération et le taux de contamination des explants par l’Agrobactérie.
0 20 40 60 80 % d'explants ayant régénéré
sans transformation après transformation
Figure n° 06 : comparaison entre les résultats de la régénération simple et de la régénération après transformation
Photo 06 : cellules sous épidermiques Photo 07: zones méristèmatique des cellules transformées (à j+2) transformées (à j+10)
III.3 - Résultats des expériences de transformation génétique avec les constructions contenant le gène A (A-2301 et A-3301):
Les différents protocoles étudiés précédemment ont été appliqués pour la transformation du melon avec les constructions A-2301 et A-3301. L’objectif de ce travail étant la validation du gène A chez le melon par son action au niveau de la biologie florale, les deux génotypes Védrantais (andromonoïque, aa GG) et Paul (hermaphrodite, aa gg) ont été utilisés.
3.3.1- Transformations réalisées avec la construction A-2301
Les transformations réalisées avec la construction A-2301 à partir de cotylédons pré-germés ou de feuilles, déposés sur milieu de régénération (Pech ou Mendi) ont permis d’obtenir un nombre relativement important de plantules. Toutefois aucune de ces plantules étant transformée (tests GUS négatifs) elles ont fini par dégénérer après plusieurs repiquages sur le milieu sélectif.
3.3.2- Transformations réalisées avec la construction A-3301
Les transformations avec la construction A-3301 ont été réalisées sur des milieux de régénération contenant l’agent de sélection Phosphinothricine (PPT). Nous avons testé trois concentrations de PPT (1, 2 et 3 mg/L).
Les résultats obtenus sur la régénération avec les trois concentrations sont présentés dans la figure 07 (régénération d’explants feuilles des deux génotypes déposés sur le milieu de Pech).
0 10 20 30 0 1 2 3 4 concentrations de PPT (mg/L) % d 'e x p la n ts a y a n t ré g é n é ré Ved Paul
Figure 7 : Effet de la concentration de Phosphinothricine sur la régénération des explants transformés.
Le taux de régénération des explants est supérieur avec une concentration de PPT de 2mg/L (27,5% pour Védrantais et 12,14% pour Paul) alors qu’elle diminue presque de moitié avec 3mg/L et que dans ce cas la quasi-totalité des explants présentent des jaunissements aux extrémités. Le test de
χ²
obtenu avec les différents résultats, a permis de démontrer que les concentrations de Phosphinothricine ont un effet significatif sur la régénération des explants (χ²
calculé de 32,30 supérieurs au χ² théorique (11,1) pour un ddl = 5). Nous avons aussi constaté une meilleure adaptation de Védrantais au PPT, les explants restant plus verts et mieux développés que ceux dePaul. Des transformations génétiques avec la construction A-3301 et avec le traitement V0 sont en cours de réalisation, avec des cotylédons pré-germés de Védrantais sur le milieu de Pech contenant 2 mg/L de PPT.
IV- DISCUSSION :
Régénération par Organogenèse :
La fréquence élevée de régénération de Védrantais par rapport à celle de Paul observée dans cette étude conforte les observations de M. Galperin et al., 2003 qui a démontré l’existence d’un déterminisme génétique de la régénération chez le melon. Il est à noter aussi que lors de la germination des graines, nous avons remarqué que les graines de Védrantais germent plus rapidement que les graines de Paul. La détermination des meilleurs génotypes permet également de comprendre l’effet de chaque type d’explants sur la génération (A.L. Abie et al., 2001). La différence de capacité de régénération observée entre les deux types d’explants testés (feuilles et cotylédons pré-germés) dépend de la composition du milieu de culture utilisé et des réserves de l’explant mis en culture (la présence et la concentration en hormones de croissance diffèrent d’un organe à un autre dans la même plante). Ce sont en fait les hormones exogènes additionnées au milieu de culture qui peuvent accentuer et favoriser le bourgeonnement. La figure 08 (A. Gallien, 2006) nous indique que la synthèse d’auxines a lieu au niveau des parties aériennes (jeunes feuilles et bourgeons) mais que son action se situe au niveau des racines, et que les cytokinines, produites par les extrémités racinaires, ont une action sur le développement des parties supérieures de la plante. Concernant les jeunes feuilles nous avons noté une meilleure régénération sur le milieu de Pech qui ne contient que des cytokinines, ce résultat peut être expliqué par une balance hormonale équilibrée entre les deux hormones puisque un rapport cytokinine/auxine supérieur à 1 favorise l’apparition de bourgeons et le développement de la partie aérienne (J.Margara, 1984). Par contre la présence de feuilles sur le milieu de Mendi (1,12 mg/L de BAP, 0,88 mg/L d’AIA et 0,26 mg/L d’ABA) provoque un développement massif de cals et une forte vitrification. L’apport de ces hormones, en plus de la forte concentration en auxine dans l’explant, tend vers la formation de cals et non pas vers le bourgeonnement. Les cotylédons pré-germés peuvent régénérer des plantules sur les deux milieux de culture, mais de très bons résultats ont été obtenus avec le milieu de Pech, on suppose que les cytokinines sont des hormones clefs pour la régénération des cotylédons de Védrantais.
Certaines plantules obtenues après régénération n’évoluent pas correctement, elles se développent en touffe produisant des feuilles mal formées ou bloquées dans leur croissance puis se vitrifient. Comme l’a rapporté C. Liliane et al., 2001, ce phénomène peut être dû à la désorganisation du méristème apical.
H. Ezura et al., 1994 ont démontré que la régénération du melon se fait à partir des cellules diploïdes et tétraploïdes, nous avons analysé toutes les plantules par cytométrie pour éliminer les tétraploïdes, puisqu’elles sont peu productives à cause de la baisse de fertilité.
Figure n° 08 : Schéma représentatif de la production et du transport des auxines et des cytokinines dans la plante et de leurs sites d’action (réalisé par Alain Gallien, 2006 ; www.svt.ac-dijon.fr).
Transformation génétique :
Plusieurs études ont démontré que l’utilisation de l’acétosyringone au moment de la coculture augmente la fréquence de la transformation (M. Bordas et al., 1997), nous avons rajouté 39mg/L d’acétosyringone dans les différents milieux de coculture que nous avons utilisé, ce composé phénolique a pour rôle d’induire les gènes de virulence de la bactérie pour le transfert de l’insert.
L’étude de la coculture avec les trois traitements (V0, V+ et C+) a montré que le vide et le carborundum ont un effet positif sur la transformation par Agrobacterium tumefaciens ; le carborundum permet de créer des blessures supplémentaires pour la pénétration de la bactérie et la pression du vide permet de forcer la pénétration de la bactérie dans les tissus. L’expression du gène rapporteur GUS a été révélée sur plus de 50% de la surface des explants traités en présence de ces deux traitements. Il faut noter que le nombre d’explants jetés, car contaminés par l’agrobactérie, est très important après les traitements (V+) et (V+C+) comme si le vide, favorisant la pénétration de l’agrobactérie au niveau des tissus, rendait plus difficile son élimination par le timentin contenu dans le milieu de culture. De plus, la régénération des explants transformés avec ces deux traitements est rendue difficile, du fait probablement que les cellules sont abîmées, ce qui diminue leurs capacités de régénération. Le traitement V0 permet un taux de transformation plus faible des explants, mais maintien une capacité de régénération plus intéressante (12,63%). Ce taux, obtenu après transformation, reste très faible par rapport à celui obtenu en régénération simple (70,66%). Nous pouvons supposer que la transformation par A. tumefaciens diminue de manière importante la capacité de régénération des cellules chez le melon ; ce qui pourrait expliquer les difficultés rencontrées chez cette espèce pour l’obtention de plantules transformées.
L’analyse cytologique montre que durant les premiers jours qui suivent la coculture, ce sont les cellules sous épidermiques qui sont à l’origine de la régénération et de la transformation mais après environ 30 jours les cellules transformées présentent un aspect complètement déstructuré et ne développent pas de bourgeons. Ce résultat doit être confirmé par une comparaison avec une étude cytologique de l’évolution des cellules transformées d’une autre espèce non récalcitrante à la transformation et à la régénération telle que la tomate.
Nous avons obtenu 28 plantules après transformation par la construction 35B-GUS dont 25 d’entre elles, négatives par test GUS, ne sont pas transformées mais se développent sur le milieu de sélection en présence de kanamycine. Nous avons supposé, comme l’on déjà rapporté différents auteurs, que le melon n’est pas très sensible à cet antibiotique ; toutefois, il serait intéressant d’analyser ces plantules par PCR (pour les deux gènes nptII et uidA) car il est toujours possible d’obtenir des plantules transformées qui n’expriment pas le gène lorsque celui-ci est inséré dans une région du génome qui ne permet pas son expression (absence de contrôle de la position d’insertion du transgène).
Le résultat négatif de transformation obtenu avec la construction A-2301 peut être expliqué par la taille très importante de l’insert, ce qui augmente probablement les difficultés d’insertion dans le génome des cellules.
Du fait de la présence du gène de sélection bar dans le transgène, gène codant pour une phosphinothricine acetyl transférase (PAT) conférant la tolérance à l’herbicide PPT (Y-S. Kim et al., 2006), les transformations avec la construction A-3301 nécessitent une régénération sur un milieu de culture contenant la Phosphinothricine. Des expériences préliminaires ont permis de déterminer la dose de PPT (2mg/L) qui permet la régénération des plantes transformées et l’élimination des échappées.
Cette étude a permis de mettre en évidence les paramètres importants (génotype/nature de l’explant/milieu de culture) favorisant la régénération du melon et d’expliquer en partie les difficultés rencontrées pour la transformation de cette espèce par Agrobacterium tumefaciens. Les évènements de transformation restent très faibles et très aléatoires mais malgré tout, les résultats obtenus vont permettre de mieux orienter les travaux. De nouvelles expériences de transformation sont actuellement en cours à partir de la construction A-3301 et d’un nombre beaucoup plus important d’explants mis en culture avec pour objectif de valider la fonction du gène A dans la biologie florale du melon.
V- CONCLUSION ET PERSPECTIVES :
Au cours de notre expérimentation nous avons procédé à la mise au point d’un protocole de régénération par organogenèse de deux génotypes du melon (Védrantais et Paul) à partir des jeunes feuilles ou des cotylédons pré-germés en suivant deux protocoles (Mendi ou Pech). Nous avons obtenu un taux de régénération satisfaisant à partir de cotylédons pré-germés non transformés de Védrantais sur le milieu de Pech.
Par la suite, nous avons essayé d’améliorer le protocole de transformation du melon par Agrobacterium tumefaciens en étudiant tout d’abord l’étape de coculture des explants en présence de la bactérie. Les traitements appliqués (V+ et C+) favorisant la pénétration de l’agrobactérie dans les tissus mais diminuant fortement leur capacité de régénération, nous avons retenu le traitement V0 (sans vide et sans carborundum) pour la suite de cette étude. L’analyse cytologique a montré que les cellules sous épidermiques qui sont à l’origine de la transformation et de la régénération se désorganisent progressivement empêchant le développement des bourgeons transformés.
L’ensemble des résultats obtenus a été exploité pour initier la validation fonctionnelle du gène A qui contrôle la biologie florale chez le melon en épistasie avec le gène G. De nombreuses transformations ont été réalisées en utilisant la construction A-3301. Les plantules qui vont être obtenues devront être analysées par test GUS, puis par PCR pour vérifier l’intégration du transgène. Les plantules ayant intégré la totalité de l’insert seront analysées au cytomètre de flux afin d’évaluer leur niveau de ploïdie. Les plantes diploïdes seront bouturées puis acclimatées en serre OGM pour pouvoir y être autofécondées. La validation fonctionnelle du gène A sera effectuée par évaluation du phénotype des plantes au niveau floral à la première génération pour s’assurer de son expression, puis à la deuxième génération pour vérifier sa stabilité. Les plantes transformées du génotype andromonoÏque Védrantais (aaGG) devraient développer un phénotype floral de type monoïque (A-GG), par contre l’expression du gène A dans les plantes issues du génotype hermaphrodite Paul (aagg), devrait permettre l’obtention de plantes de type gynoÏque (A-gg).
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Résumé :
L’objectif de mon stage est la mise au point d’un protocole de régénération par organogenèse et de transformation génétique avec Agrobacterium tumefaciens du melon (Cucumis melo L.) dans le cadre de la validation fonctionnelle du gène A. Deux génotypes ont été testés (Védrantais et Paul), ainsi que deux types d’explants (cotylédons pré-germés et feuilles), suivant deux protocoles (Mendi et Pech). Les résultats des expériences de régénération simple ont montré que le génotype Védrantais régénère mieux que Paul. L’étude de l’interaction entre ces trois facteurs (génotype, type d’explant et milieu de culture) a permis de définir les paramètres les plus favorables : la culture de cotylédons pré-germés du génotype Védrantais sur le milieu de régénération de Pech (0,225 mg/L de BAP et 0,203 mg/L de 2.IP) permet le développement de bourgeons sur 70,66% des explants.
Dans le but d’améliorer la transformation génétique, nous avons testé trois traitements au moment de la coculture : agitation des explants en présence de la bactérie (V0), utilisation du vide (V+) ou vortex des explants avec le carborundum (C+). L’estimation du niveau de transformation a été faite par le nombre d’explants transformés prélevés 2 et 20 jours après coculture et par leur niveau d’expression du gène GUS suivant une échelle de notation (de 0 à 5). Les résultats obtenus ont montré que le vide et le carborundum améliorent la transformation, mais diminuent la capacité de régénération des explants.
Une comparaison entre la régénération des explants avec ou sans transformation a permis de montrer que le taux de régénération diminue fortement après transformation. Une étude cytologique a démontré que les cellules qui régénèrent sont également celles qui se transforment (cellules sous épidermiques) mais qu’environ 30 jours après coculture, ces cellules perdent leur organisation et dégénèrent progressivement ; ce qui peut expliquer le très faible taux de régénération de plantules transformées obtenu sur cette espèce.
