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Caractéristiques comportementales et attentionnelles des porteurs de l'allèle à 7 répétitions (7R) du récepteur dopaminergique D4 (DRD4) chez les enfants atteints d'un trouble déficitaire de l'attention avec hyperactivité (TDAH)

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Academic year: 2021

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Texte intégral

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UNIVERSITÉ

.LAVAI-CARACTERISTIQUES COMPORTEMENTALES ET

ATTENTIONNELLES DES PORTEURS DE L'ALLÈLE À

7RÉPÉTITIONS (7R) DU RÉCEPTEUR DOPAMINERGIQUE D4

(DRD4) CHEZ LES ENFANTS ATTEINTS D'UN TROUBLE

DÉFICITAIRE DE L'ATTENTION AVEC HYPERACTIVITÉ (TDAH)

Mémoire Myriam Giguère Maîtrise en neurobiologie Maître es sciences (M.Sc) Québec, Canada ©Myriam Giguère, 2013

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RESUME

Le trouble déficitaire de l'attention avec ou sans hyperactivité (TDAH) est un trouble neurobiologique fréquent chez les enfants d'âge scolaire. L'étiologie du TDAH inclut une forte composante génétique et implique le système dopaminergique. Il y aurait une association entre le trouble et 1'allele à 7 répétitions (7R) du gène du récepteur de la dopamine D4 (DRD4). Cependant, les caractéristiques cliniques du TDAH associées à ce polymorphisme sont peu étudiées dans les populations caucasiennes. Le but de cette étude est de déterminer les caractéristiques comportementales (échelle de Conners et child behavior checklist) et attentionnelles (NEPSY et CPT) associées à la présence ou l'absence de l'allèle DRD4-7R dans une population d'enfants canadiens-français atteints de TDAH (n = 137). Nos résultats montrent que les enfants atteints de TDAH et porteurs du DRD4-7R ont significativement plus de problèmes de comportement, mais à l'inverse, ils ont une meilleure attentior visuelle que les non-porteurs du polymorphisme. L'identification de profils spécifiques associés à des facteurs de risque génétiques pourrait améliorer la compréhension de l'implication du système dopaminergique ainsi que dans l'étiologie du TDAH.

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TABLE DES MATIERES

RÉSUMÉ iii TABLE DES MATIÈRES v

LISTE DES TABLEAUX ix LISTE DES FIGURES xi LISTE DES ABBREVIATIONS xiii

REMERCIEMENTS xv AVANT-PROPOS xvii

CHAPITRE 1 : INTRODUCTION GÉNÉRALE 1 CHAPITRE 2 : ÉTAT DES CONNAISSANCES 5

2.1 CLINIQUE DU TDAH 7

2.1.1 Prévalence 7 2.1.2 Critères diagnostiques 7

Particularités selon l'âge 7

2.1.3 Comorbidités 8 2.1.4 Répercussions et évolution 8

2.1.5 Traitements 9 Traitements pharmacologiques 9

Traitements non pharmacologiques 10

2.1.6 Neuropsychologie 10 2.2 ÉTIOLOGIE DU TDAH 11

2.2.1 Environnement 11 Facteurs prénataux 11 Prématurité et faible poids à la naissance 11

Infections 12 Carences dans l'alimentation 12

2.2.2 Génétique 12 2.3 IMPLICATION DES DIFFÉRENTS SYSTÈMES DE NEUROTRANSMISSION

DANS LE TDAH 13 2.3.1 Le système noradrénergique 13 2.3.2 Le système sérotoninergique 14 2.3.3 Le système dopaminergique 14 Modèles animaux 14 Imagerie cérébrale 15 Pharmacologie 15 Gènes dopaminergiques 15

2.4 IMPLICATION DU DRD4-7R DANS LE TDAH 18

2.4.1 Caractéristiques comportementales 19 2.4.2 Caractéristiques attentionnelles 19 2.5 POURQUOI ENTREPRENDRE NOTRE ÉTUDE 20

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CHAPITRE 4: ARTICLE 25

TITLE 27 ABSTRACT 29 RÉSUMÉ 29 4.1 BACKGROUND 31

4.2 MATERIALS AND METHODS 33

4.2.1 Subject population 33 4.2.2 Behavior evaluation 34 4.2.3 Attention evaluation 34 4.2.4 Genotyping 35 4.2.5 Statistical analysis 36 4.3 RESULTS 36 4.3.1 Behavior portrait 37 4.3.2 Attention portrait 38 4.4 DISCUSSION 38 4.5 CONCLUSIONS 41 4.6 COMPETING INTERESTS 41 4.7 ACKNOWLEDGMENT 41 CHAPITRE 5 : SPÉCIFICATIONS SUR LA MÉTHODOLOGIE 45

5.1 GÉNOTYPAGE 47 5.1.1 Méthode de travail 47 5.1.2 Fabrication du marqueur 48 5.1.3 Identification et classification des génotypes 48

5.2 DONNÉES CLINIQUES 49 5.2.1 Validation des données 49 5.2.2 Vérifications des données 49 CHAPITRE 6 : CONCLUSION GÉNÉRALE 51

BIBLIOGRAPHIE 55

ANNEXE 63

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LISTE DES TABLEAUX

Table 1- Characteristics of children with ADHD (n = 137) categorized by their DRD4-7R

genotype 42 Table 2- Mann-Whitney U-test percentiles of Conners teacher scale for children with

ADHD categorized by their DRD4-7R genotype 42 Table 3- Mann-Whitney U-test percentiles of Conners parent scale for children with ADHD

categorized by their DRD4-7R genotype 43 Table 4- Mann-Whitney U-test percentiles of CBCL's scale for children with ADHD

categorized by their DRD4-7R genotype 43 Table 5- Mann-Whitney U-test percentiles of NEPSY variables for children with ADHD

categorized by their DRD4-7R genotype ; 44 Table 6- Mann-Whitney U-test percentiles of CPT variables for children with ADHD

categorized by their DRD4- 7R genotype 44

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LISTE DES FIGURES

Figure 1- Représentation de la plaque de travail de 96 puits; les puits en gris correspondent

aux puits vides 47 Figure 2- Photo d'un gel après l'électrophorèse où l'encadré en jaune indique le marqueur

avec les alleles 4R (flèche et ligne pointillée jaune) et 7R (flèche et ligne pointillée rouge). 48

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LISTE DES ABBREVIATIONS

TDAH: Trouble déficitaire de l'attention avec ou sans hyperactivité / ADHD: Attention deficit hyperactivity disorder

7R: allele à 7 répétitions 17 repeats allele

DRD4: protéine du récepteur de la dopamine D4 (gène = DRD4) IDRD4: protéine of dopamine receptor D4 (gene = DRD4) DRD4-7R: allele à 7 répétitions du gène du récepteur de la dopamine D4

/ dopamine receptor D4 7 repeats allele

DSM-IV: Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, fourth edition TDAH-I: TDAH sous-type inattentif

/ ADHD-I: ADHD inattentive subtype TDAH-H: TDAH sous-type hyperactif

/ ADHD-H: ADHD hyperactive subtype TDAH-C: TDAH sous-type combiné

/ ADHD-C: ADHD combine subtype MPH: méthylphénidate

DAT : protéine du transporteur de la dopamine (gène = DAT1 ou SLC6A3) SNP: single nucleotide polymorphism

pb: paires de bases / bp : base pair SHR: Spontaneously hypertentive rats

A/T/C/G: Adenine, thymine, cytosine et guanine (acides nucléiques)

/ d-A/T/C/G-TP: deoxy-adenosine/thymidine/cytidine/guanine-triphosphate VNTR: variable number of tandem repeat

4R et 2R: allele à 4 et 2 répétitions I 4 and 2 repeats allele CPT: continuous performance test

SART: sustained attention to response test

C-DISC-IV: Clinical Diagnostic Interview Schedule for Children, fourth edition WISC-IV: Wechsler intelligence scale for children, fourth edition

WPPSY-III: Wechsler preschool and primary scale of intelligence, third edition CTRS-R: Conners teacher rating scale-revised

CPRS-R: Conners parent rating scale-revised CBCL: child behavior checklist

NEPSY: developmental NEuroPSYchological assessment PCR: polymerase chain reaction

SPSS: statistical package for the social sciences CGI: Conners global index

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REMERCIEMENTS

Ce projet a impliqué beaucoup de personnes que je tiens grandement à remercier. D'abord, je tiens à souligner la participation de toute l'équipe clinique et de recherche du pavillon St-Georges de l'Hôtel-Dieu de Lévis dont ma directrice Dre Leila Ben Amor. Également, je remercie toutes les personnes qui travaillent aux laboratoires de recherche de l'hôpital Saint-François D'Assise. Tout particulièrement, Sylvie Giroux qui a été présente au laboratoire du début à la fin pour me soutenir et m'accompagner dans les différentes démarches de la maîtrise. Un gros merci à Myrto Mondor de l'hôpital du St-Sacrement qui m'a aidée dans les analyses statistiques qui ont été pour moi une étape difficile.

Je tiens aussi à remercier mes amis, ma famille ainsi que mon conjoint qui ont été des éléments clés pour l'accomplissement de ce projet. J'ai trouvé que les études de 2e

cycle sont exigeantes sur le plan moral. Sans toutes ces personnes, je n'aurais jamais pu mener à bien ce projet, qui a été une expérience des plus enrichissantes.

Je peux maintenant tourner la page sur ces années au cours desquelles j'ai énormément grandi et grâce auxquelles je me suis épanouie.

MERCI !

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AVANT-PROPOS

L'article inséré dans le mémoire correspond à une grande partie des travaux et des analyses faites au cours de ma maîtrise. Il sera éventuellement soumis à un journal scientifique.

J'ai activement contribué à toutes les étapes de la conception de cet article. Le projet de maîtrise a été élaboré à partir d'un plus gros projet déjà en route qui comportait plusieurs volets, dont un de génétique. J'ai alors occupé le poste de coordonnatrice pour le projet à compter de septembre 2010 à juillet 2011 (fin du recrutement). J'ai participé aux entrevues qui ont été faites avec les parents ainsi qu'au recrutement des participants. J'ai également saisi les données des tests comportementaux et neuropsychologiques. Du côté du laboratoire, j'ai fait le génotypage de tous les individus et saisi ces données. Pour ce qui est du projet en tant que tel, j'en ai précisé l'objectif ainsi que fait les différentes analyses statistiques ainsi que les analyses de résultats. Je suis également la principale écrivaine de l'article.

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Le trouble déficitaire de l'attention avec ou sans hyperactivité (TDAH) est un trouble très fréquent atteignant environ 5 % des enfants d'âge scolaire. Le TDAH se divise en trois sous-types : inattentif, hyperactif/impulsif et combiné, selon la prédominance des symptômes de l'une et/ou de l'autre catégorie. Ces enfants rencontrent souvent des problèmes d'estime personnelle, des difficultés dans leurs relations interpersonnelles et d'importantes difficultés académiques [1].

Le TDAH est un trouble multifactoriel et multigénique, c'est-à-dire que plusieurs facteurs environnementaux et génétiques sont impliqués. Les complications périnatales sont des exemples de facteurs environnementaux pouvant augmenter le risque d'être atteint du trouble [2]. Les études familiales, d'adoptions et de jumeaux confirment qu'une part de l'apparition du TDAH est due aux facteurs génétiques [3-6]. D'un autre côté, l'implication de la dopamine dans le développement du trouble est supportée par les modèles animaux, l'imagerie cérébrale et la pharmacologie [7].

Compte tenu du rôle de la dopamine et de la composante génétique dans l'étiologie du TDAH, l'association entre les gènes dopaminergiques et le trouble a été étudiée. Entre autres, les études ont rapporté une association entre l'allèle à 7 répétitions (7R) du polymorphisme du récepteur de la dopamine D4 (DRD4) et le TDAH [8]. Toutefois, les caractéristiques cliniques liées au polymorphisme à 7R du DRD4 (DRD4-7R) sont peu étudiées dans la population caucasienne et les résultats sont très controversés [9-10].

Le but de cette étude est de déterminer les caractéristiques comportementales et attentionnelles associées à la présence ou l'absence de l'allèle DRD4-7R dans une population génétiquement et cliniquement homogène d'enfants canadiens-français atteints de TDAH.

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2.1 CLINIQUE DU TDAH

2.1.1 Prévalence

Selon le Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4e édition

(DSM-IV), le TDAH atteint en moyenne 5 % des enfants d'âge scolaire [1]. Cette prévalence peut varier entre 2 % et 18 % selon la source d'information (patient lui-même, parents et/ou enseignants) et les cultures [11]. Le trouble est toutefois plus fréquent chez les garçons que chez les filles. En fait, la proportion garçon : fille peut varier entre 2 : 1 et 9 : 1 selon le sous-type clinique du TDAH et la méthode d'échantillonnage [1]. La prévalence peut également varier selon l'âge puisque le trouble persiste jusqu'à l'âge adulte chez un à deux tiers des enfants [4].

2.1.2 Critères diagnostiques

Pour poser un diagnostic, l'enfant doit présenter au moins six critères sur neuf dans l'une et/ou l'autre des deux catégories de symptômes : inattention et hyperactivité/impulsivité (Annexe). Le trouble est alors subdivisé en trois sous-types selon la présence des symptômes. Lorsque les symptômes répondent à au moins six des neuf critères d'inattention, il s'agit d'un TDAH de sous-type inattentif (TDAH-I). On parle du sous-type hyperactif (TDAH-H) lorsque la personne présente au moins six sur neuf critères d'hyperactivité/impulsivité. Finalement, le sous-type combiné ou mixte (TDAH-C) s'impose lorsque les symptômes répondent aux deux catégories de critères diagnostiques. [12].

Le diagnostic du TDAH nécessite également que la gêne fonctionnelle liée aux symptômes soit présente dans au moins deux environnements différents [12].

Particularités selon l'âge

Chez l'enfant d'âge préscolaire, le diagnostic de TDAH est parfois difficile à poser. En effet, au cours du développement, les jeunes enfants présentent des variations importantes des comportements attentionnels et moteurs. Pour poser un diagnostic de

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TDAH, ces variations ne doivent pas correspondre au niveau de développement de l'enfant. Elles doivent également entraîner un dysfonctionnement important dans sa vie [1].

L'enfant d'âge scolaire évolue dans au moins deux milieux différents: le milieu scolaire et familial. Il est donc possible d'avoir l'opinion des intervenants à l'école en plus de celui des parents. Il est alors plus facile de détecter les symptômes ainsi que la gêne fonctionnelle du TDAH. En plus, les symptômes ont plutôt tendance à survenir lorsque l'enfant est en groupe que lorsqu'il est seul ou dans des situations un à un [1].

2.1.3 Comorbidités

Le TDAH est souvent associé à d'autres troubles mentaux, mais il ne doit pas être diagnostiqué si un autre trouble peut mieux expliquer les symptômes (ex. trouble envahissant du développement, trouble bipolaire, trouble de la personnalité, etc.). [12]. Les comorbidités les plus fréquentes sont le trouble de l'opposition (40 à 65 %), le trouble des conduites (21 à 45 %) et le trouble anxieux (13 à 37 %) [13-14].

Toutefois, les études ont montré que les comorbidités changent en fonction de l'âge des personnes atteintes. En effet, les enfants d'âge scolaire peuvent présenter, en plus d'un TDAH, des difficultés d'apprentissage, de la dyslexie ou de la dysorthographie [15]. À un âge plus avancé, la dépression est un exemple de comorbidité fréquemment associée avec le TDAH [16].

2.1.4 Répercussions et évolution

Plus spécifiquement, les symptômes d'hyperactivité s'estompent avec l'âge laissant des traces d'impulsivité, d'un trop-plein d'énergie et/ou de la nervosité. Par contre, les symptômes d'inattention, eux, vont persister. De manière plus générale, le TDAH a des répercussions importantes sur la vie personnelle, les relations interpersonnelles et l'apprentissage (scolaire ou professionnel) [1, 15].

Les répercussions et l'évolution du trouble sont très marquées en absence de traitement. Une faible estime de soi est souvent présente chez les personnes atteintes de TDAH [1]. Un autre exemple, les personnes présentant des symptômes d'hyperactivité

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et/ou d'impulsivité peuvent avoir des comportements très invasifs et dérangeant rendant les relations interpersonnelles plus difficiles. Une mauvaise gestion de la colère et des gestes impulsifs peut également envenimer les relations avec les autres [14-15]. Les études ont montré que l'évolution des sujets avec un TDAH sans traitement est caractérisée par un degré de scolarité plus bas que chez des sujets non atteints. Cela serait dû au décrochage scolaire et à des problèmes interpersonnels avec les figures d'autorités (ex.: professeurs) [14, 17].

À l'opposé, l'évolution du TDAH sous traitement est caractérisée par une atténuation des symptômes d'inattention et d'hyperactivité/impulsivité [1]. Les traitements permettent ainsi de réduire les répercussions sur leur vie personnelle, les relations interpersonnelles, les performances scolaires et professionnelles.

2.1.5 Traitements

Le traitement du TDAH repose sur ceux types de traitements: pharmacologique et non pharmacologique. Ces traitements peuvent être combinés ou administrés séparément. Le traitement pharmacologique est toutefois le plus utilisé [18].

Traitements pharmacologiques

Les traitements pharmacologiques disponibles pour traiter le TDAH sont divisés en deux catégories : les psychostimulants et les non-psychostimulants.

Les psychostimulants incluent les médications à base d'amphétamines ou de méthylphénidate (MPH) qui sont sélectives à la dopamine [18]. Le MPH est l'une des molécules les plus utilisées pour le traitement du TDAH améliorant les symptômes chez 60 % à 70 % des patients [19]. Le MPH arrive à bloquer environ 60 % des transporteurs de la dopamine (DAT) en agissant comme antagoniste. Ce mécanisme d'action permet d'optimiser la transmission de la dopamine [7]. Le MPH diminue également les symptômes en régulant le flux du système vasculaire cérébral [20].

Pour les patients qui ne répondent pas aux psychostimulants, les non-psychostimulants peuvent également diminuer les symptômes du TDAH [18].

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L'atomoxétine, un exemple de non-psychostimulant, agit comme antagoniste du transporteur de la noradrenaline [21]. Lorsque les psychostimulants sont peu ou pas efficaces pour traiter le TDAH, il est aussi possible d'utiliser des antidépresseurs tricycliques ou des antagonistes sélectifs de sérotonine [22].

Traitements non pharmacologiques

Le traitement non pharmacologique inclut des interventions psychoéducatives, comportementales ainsi que des stratégies d'adaptation scolaire ou professionnelles. Une revue de littérature a montré que, chez l'enfant, ces différents traitements entraînent une amélioration des problèmes de comportement dérangeants, une meilleure acceptation par les pairs et un meilleur fonctionnement social. Ces interventions permettent également une amélioration des interactions parent-enfant ainsi qu'une diminution du stress parental [23].

2.1.6 Neuropsychologie

Les études neurops>..'iologiques ont montré que les enfants atteints de TDAH, comparés aux enfants non atteints, ont un déficit en ce qui concerne les fonctions executives et la motivation [24-26].

Les fonctions executives sont définies par Willcutt E.G. et al, comme étant un contrôle cognitif qui facilite la prise de décisions et la résolution de problèmes. Ces fonctions incluent, entre autres, l'attention soutenue, les processus d'inhibition, le traitement des erreurs et la mémoire de travail [26]. Une revue de littérature a rapporté que les systèmes dopaminergique, noradrénergique et sérotoninergique sont impliqués dans tous ces aspects [27]. D'un autre côté, les fonctions executives seraient presque entièrement d'origine génétique [28].

Nigg J.T. définit la motivation comme étant la relation entre une demande (ex. un comportement) et une réponse. Le renforcement consiste à conditionner la demande en fonction d'une réponse voulue (positif: bon comportement = récompense, négatif: mauvais comportement = conséquence) [24]. Les enfants atteints de TDAH répondraient moins bien à la discipline que les enfants non atteints du trouble [7]. Les voies axonales dopaminergiques appelées mésocorticale et mésolimbique, qui relient l'aire tegmentaire du

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mésencéphale au cortex préfrontal et au système limbique respectivement, sont impliquées dans la motivation et le renforcement [29].

2.2 ÉTIOLOGIE DU TDAH

L'étiologie du TDAH est d'origine multifactorielle et multigénique impliquant des facteurs environnementaux et plusieurs gènes. Ces différents facteurs pourraient agir séparément ou en interaction [2]. Effectivement, Nigg J. et al ont montré que les gènes et les facteurs environnementaux interagissent bel et bien ensemble dans le développement du TDAH [30].

2.2.1 Environnement

Facteurs prénataux

La consommation de nicotine ou d'alcool pendant la grossesse sont des facteurs prénataux très étudiés quant à leur association avec le TDAH. Certaines études ont retrouvé une association (Mick E. et al, Streissgtuth A.P. et al, Milberger S. et al, etc.) alors que d'autres n'en ont pas retrouvé (Hill S.Y. et al, Weissman M.M. et al, O'Connor T.G. et al, etc.) (pour une revue, voir Linnet K.M. et al, 2003) [31-37]. Linnet K.M. et al ont suggéré que cette controverse serait due aux différences méthodologiques entre les études [33].

Prématurité et faible poids à la naissance

Plusieurs études ont confirmé que la prématurité est un facteur de risque d'être atteint du TDAH. Le risque serait directement proportionnel à la sévérité de la prématurité (moins de semaines de gestation). À titre d'exemple, un enfant né entre 23 et 28 semaines de gestation aurait deux fois plus de risque de développer un TDAH qu'un enfant né à terme. Le risque diminue progressivement plus le temps de gestation s'approche de 40 semaines [38].

Le faible poids à la naissance est souvent associé à la prématurité. Les études ont montré qu'il contribuerait lui aussi au risque d'être atteint du TDAH. Par exemple, les enfants nés à terme avec un poids entre 1500 g et 2499 g ont deux fois plus de risque de

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développer un trouble d'hyperactivité que les enfants nés à terme avec un poids de plus 3000g [39].

Infections

Les études sont peu nombreuses concernant le risque d'être atteint du TDAH relié aux infections. Il y a toutefois quelques exemples disponibles. Nozyce M.L. et al ont recruté 274 enfants, âgés entre 2 et 17 ans, positifs pour le VIH. Les scores d'impulsivité et d'hyperactivité étaient cliniquement significatifs à l'échelle de Conners (version parents) chez 20 % de leur population. Leur étude ne comportait toutefois pas de groupe contrôle [40].

Carences dans l'alimentation

Des études sur les carences alimentaires dans les pays défavorisés ont trouvé que des déficiences en zinc, en iode et en oméga-3 représenteraient toutes des facteurs de risque d'être atteint du TDAH. Ces résultats nécessitent toutefois d'être répliqués [2, 41-4?,j.

2.2.2 Génétique

Biederman J. et al ont été parmi les premiers à montrer que le TDAH était un trouble familial. Les membres de la famille des enfants atteints du trouble auraient un risque plus élevé d'être également atteints que les membres de la famille d'enfants ne présentant pas le trouble (respectivement 20 % et 3 %) [3-4]. Par la suite, plusieurs études ont confirmé ces résultats. Les parents et la fratrie d'enfant atteint de TDAH auraient de deux à huit fois plus de risque de développer le TDAH que les familles contrôles [5].

Des études d'adoption ont aussi confirmé la contribution des facteurs génétiques dans l'étiologie du TDAH. Sprich S. et al ont comparé le risque d'être atteint du TDAH entre des familles où l'enfant atteint n'est pas adopté (familles biologiques) et des familles où l'enfant atteint a été adopté (familles adoptives). Ils ont trouvé que, dans les familles biologiques, 18 % des parents et 31 % des frères et sœurs sont également atteints du TDAH. Dans les familles adoptives, 6 % des parents et 8 % des fratries sont atteints du trouble ce qui est très similaire aux familles où aucun enfant n'était atteint du trouble (3 % des parents et 6 % de la fratrie atteints) [6].

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Les études de jumeaux ont permis d'évaluer l'héritabilité du TDAH qui est estimé à 76 %. L'héritabilité se définit, selon Faraone S.V. et al, par la proportion attribuable aux gènes dans l'apparition d'un trouble ou d'une maladie dans une population. Elle est calculée en se basant sur le fait que des jumeaux identiques partagent 100 % de leurs gènes alors que les jumeaux fraternels en partagent 50 % [5]. La valeur d'héritabilité retrouvée est basée sur la moyenne des résultats de vingt études de jumeaux (entre autres Rietveld MJ. et al, Martin N. et al et Coolidge F.L. et al, voir Faraone S.V. et al, 2005 pour la liste complète des vingt études) [5, 43-45].

Contrairement aux maladies mendéliennes (ex. la maladie du Huntington) qui sont causées par le dysfonctionnement d'un seul gène, plusieurs gènes sont impliqués dans le développement du TDAH. Il est donc plus difficile de le caractériser génétiquement, car chaque gène impliqué n'aura qu'une petite incidence sur le trouble. Des gènes faisant partie du système noradrénergique, sérotoninergique et dopaminergique ont été identifiés comme étant susceptibles de contribuer au risque d'être atteint du TDAH.

2.3 IMPLICATION DES DIFFÉRENTS SYSTÈMES DE NEUROTRANSMISSION DANS LE TDAH

2.3.1 Le système noradrénergique

Le système noradrénergique est impliqué dans l'amélioration de l'attention visuelle, l'initiation aux réponses adaptives face à un changement, l'attention soutenue, l'apprentissage et la mémoire [46].

Les études chez des modèles animaux viennent appuyer le rôle de la norepinephrine dans le TDAH. Chez les rats, l'absence du neurotransmetteur (knock-out) se traduirait par une augmentation de la distraction et de l'hyperactivité. Au contraire, la stimulation de sa production chez les singes provoquerait une diminution de la distractibilité et améliorait les fonctions cognitives [46].

L'association entre des gènes noradrénergiques et le TDAH a alors été étudiée. Dans le gène du transporteur de la noradrenaline, cinq SNP {single nucleotide polymorphism) ont été examinés, mais aucune association n'a été retrouvée avec le

trouble [46]. Les gènes des récepteurs du système noradrénergique (ADRA2A, 2C et IC) 13

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ont également fait l'objet d'études, mais elles ne suggèrent pas d'association avec le trouble [47].

2.3.2 Le système sérotoninergique

La sérotonine joue un rôle dans les problèmes de comportements tels que l'abus de substance, la boulimie, le trouble des conduites et l'agressivité.

À l'aide de modèles animaux, les études ont trouvé que la transmission de la sérotonine serait nécessaire à la modulation de plusieurs comportements présents dans le TDAH. Des souris déficientes en transporteur de sérotonine ont montré une augmentation de prise de cocaïne et d'alcool ainsi que plus d'hyperactivité et de comportements agressifs [22].

Les gènes sérotoninergiques ont fait l'objet d'études concernant leur association avec le TDAH. Dan^ le gène du transporteur de la sérotonine, quelques polymorphismes ont été étudiés. Ent.f autres, l'allèle long d'un polymorphisme d'une délétion/insertion de 44 paires de bases (pb) dans la région du promoteur serait associé au trouble [47-48]. Le gène du récepteur de la sérotonine HTR1B possède un SNP silencieux (rs6296) qui affiche une association significative avec le TDAH [5]. Le gène du récepteur HTR2A possède un SNP (rs6313) où deux études n'ont pas retrouvé d'association avec le trouble [49-50].

2.3.3 Le système dopaminergique

Plusieurs domaines de recherche permettent d'affirmer qu'un dysfonctionnement dopaminergique est impliqué dans le TDAH.

Modèles animaux

Une lignée de rats (Spontaneously Hypertensive Rats : SHR) possède les mêmes symptômes que les personnes atteintes de TDAH. Ces rats affichent des comportements d'impulsivité, d'hyperactivité ainsi que des difficultés pour soutenir leur attention. Ils se retrouvent donc à être un très bon modèle pour étudier le trouble [51]. Les rats SHR auraient une libération de base de dopamine inférieure à celle des rats contrôles [52].

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Imagerie cérébrale

Des études d'imagerie structurelle ont montré que le volume total du cerveau des enfants atteints du TDAH était réduit de 3 % par rapport à celui d'une population contrôle [53]. Cette réduction de volume touche des régions riches en dopamine. Entre autres, les régions du noyau caudé et du globus pallidus sont plus petites chez les enfants atteints du trouble que chez les non atteints [54].

Une méta-analyse d'imagerie fonctionnelle a comparé le flux sanguin cérébral entre les personnes atteintes de TDAH et les personnes saines. Contrairement à des enfants contrôles, les enfants atteints de TDAH auraient une hypoactivation bilatérale des régions frontales et du putamen, riche en dopamine. Plus spécifiquement, ils ont une hypoactivation de 44 % du circuit ventral de l'attention et de 39 % du circuit fronto-pariétal (impliqué dans les fonctions executives) [55].

Pharmacologie

Rappelons que la dopamine est directement impliquée dans le mécanisme d'action du traitement pharmacologique le plus utilisé pour traiter le TDAH. Le MPH interagit avec le système dopaminergique [7, 19].

Gènes dopaminergiques

L'implication de facteurs génétiques et de la dopamine dans le développement du TDAH ont mené à l'étude des gènes dopaminergiques comme potentiels gènes candidats au trouble.

Gènes impliqués dans la synthèse de la dopamine

La dopamine bêta-hydroxylase est une enzyme responsable de la conversion de la dopamine en norepinephrine. Une association entre le polymorphisme du site de restriction de la Taql dans l'intron 5 (rs2519152) et le TDAH a été retrouvée. Par contre, une étude a trouvé une association avec l'allèle Al (présence d'une cytosine = C) et deux autres études, avec l'allèle A2 (présence d'une thymine = T). D'autres polymorphismes ont été étudiés, mais aucun n'est associé avec le TDAH [47].

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La tyrosine hydroxylase catalyse la conversion de la tyrosine en dihydroxy-phénylalanine et joue un rôle dans la synthèse de la dopamine. Trois études ont analysé l'association entre les polymorphismes du gène et le TDAH, mais elles ont toutes été négatives [56-58].

La catéchol-o-méthyltransférase est impliquée dans la dégradation de plusieurs neurotransmetteurs dont la dopamine. Sept études ont regardé l'association entre un SNP (rs4680) et le TDAH. Six d'entre elles, réalisées avec des populations caucasiennes, n'ont pas retrouvé d'association entre ce polymorphisme et le trouble. La seule étude positive a été réalisée dans une population chinoise [47].

L'enzyme monoamine oxidase A modère les niveaux de neurotransmetteurs dans le système nerveux central. Une répétition de 30 pb dans la région du promoteur a été associée au TDAH dans les populations israélienne et chinoise, mais pas dans la population caucasienne [5].

Gènes impliqués dans la transmission de la dopamine

La protéine responsable du relâchement et de la recapture de la dopamine est le DAT (impliquée dans le traitement du TDAH). Sa suppression chez les souris entraînerait, entre autres, des symptômes d'hyperactivité. Les revues de littérature ont rapporté que trois polymorphismes ont été étudiés dans le gène du DAT: un VNTR (variable nucleotides tandem repeats) dans la région 3' non traduite et deux SNP dans les régions codantes. Par contre, les méta-analyses n'ont pas rapporté d'association significative avec le trouble [59].

Les cinq récepteurs de la dopamine, nommés de DI à D5, modulent l'assimilation du neurotransmetteur. Ils font partie de la famille des protéines à sept domaines transmembranaires couplées aux protéines G [60]. Ces récepteurs sont divisés en deux catégories basées sur leurs propriétés biochimiques et pharmacologiques: les DI-like (DI et D5) et les D2-like (D2, D3 et D4). Les récepteurs D2-like possèdent des introns qui entraînent une grande variabilité. Ils possèdent également une longue troisième boucle intracellulaire qui est représentative des protéines inhibitrices de protéine G. Contrairement

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au D\-like qui possèdent une boucle courte, représentative des protéines stimulatrices de protéine G [8].

Pour le récepteur de la dopamine DI, la seule étude disponible concernant son association avec le TDAH est celle de Bobb A.J. et al. Ils ont trouvé une association significative entre deux SNP (rs4532 et rs265981) et le trouble [61].

Le récepteur de la dopamine D2 possède un site de restriction de la Taql polymorphe (rs 1800497) qui a été étudié quant à son association avec le TDAH. Comings D.E. et al ont trouvé une association positive entre l'allèle Al (T) du polymorphisme et le trouble [62]. Par contre, trois études n'ont pas retrouvé cette association. Faraone S.V. et al ont affirmé que la discordance pourrait s'expliquer par le fait que la population de l'étude de Comings D.E. et al avait un syndrome de Gilles de La Tourette en comorbidité [5].

Deux polymorphismes ont été analysés dans le récepteur de la dopamine D3 pour leur association avec le TDAH. un SNP dans l'exon 1 (rs6280) et le site de restriction Mspl dans l'intron 5 (rs4646996). Dans les cinq études qui ont été faites, aucune association avec le TDAH n'a été rapportée [5].

Pour le récepteur de la dopamine D5, l'association entre le polymorphisme d'une répétition d'un dinucléotide (cytosine et adenine = CA) à l'extrémité 5' de la partie codante du gène et le TDAH a été étudié. L'allèle qui possède 148 pb (74 répétitions de CA) serait associé avec le trouble [63].

Récepteur de la dopamine D4 (DRD4)

Le gène du DRD4 (DRD4) est localisé sur le chromosome 11. Il fait partie de la famille des D2-like qui contient des introns et possède quatre exons [8]. Le DRD4 est principalement exprimé dans la région des lobes frontaux où les études d'imagerie ont observé des anomalies cérébrales chez les enfants atteints de TDAH [55, 59].

Un premier polymorphisme, VNTR de 120 pb situé dans la région du promoteur du gène, a été étudié pour son association avec le TDAH. Les deux alleles les plus communs sont ceux de 120 pb et de 240 pb. Certaines études ont rapporté une association entre

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l'allèle à 240 pb et le trouble, alors que d'autres n'ont pas retrouvé cette association. D'autres études ont trouvé une association avec l'allèle à 120 pb [59]. Martel M.M. et al ont montré qu'il y a une interaction gène-environnement entre l'allèle à 120 pb et les situations familiales problématiques [64].

Un SNP (rsl800955) situé en amont du site de transcription du gène influencerait l'activité du promoteur. L'allèle « T » conférerait le risque d'être atteint du TDAH, car il réduirait de 40 % l'activité du promoteur contrairement à l'allèle « C ». Les méta-analyses ont rapporté une association modeste entre ce polymorphisme et le trouble [59].

Un autre VNTR de 48 pb, répété entre 2 et 11 fois, se situe dans le troisième exon du gène qui code pour la troisième boucle intracellulaire de la protéine. L'allèle à 4 répétitions (4R) est le plus fréquent dans la population générale (64 %) suivie de l'allèle à 7 répétitions {7R; 21 %) et de l'allèle à 2 répétitions (2R; 8 %) [8]. Les études ont suggéré que le changer.ent du nombre de répétitions joue un rôle dans l'interaction avec l'adénylyl cyclase et les protéines G. Le polymorphisme de 7R du DRD4 (DRD4-7R) a de deux à trois fois moins de potentiel pour interagir avec l'adénylyl cyclase que l'allèle à 4R et 2R [8, 65]. Certaines études ont retrouvé une association entre le DRD4-7R et le TDAH (ex. Holmes J. et al et Arcos-Burgos M. et al), alors que d'autres n'ont pas réussi à répliquer ces résultats (ex. Mill J. et al et Kustanovich V. et al) [59, 66-70]. Par contre, les méta-analyses ont conclu qu'il y avait une association entre le DRD4-7R et le TDAH [5, 47, 59, 71]. Gizer I.R. et al, la plus récente méta-analyse, ont rapporté un risque relatif de 1.33 [59]. L'allèle à 7R augmenterait ainsi le risque d'être atteint du TDAH. Au contraire, l'allèle à 4R conférerait un effet protecteur par rapport au trouble [8]. Il y aurait aussi un effet de gène-environnement entre le gène du DRD4-7R et la consommation de nicotine au moment de la grossesse [72].

2.4 IMPLICATION DU DRD4-7R DANS LE TDAH

Rappelons que les enfants atteints de TDAH auraient un volume cérébral plus petit contrairement à des enfants non atteints [53]. Il s'avère que le DRD4-7R serait associé à une diminution de l'épaisseur corticale autant chez les sujets atteints de TDAH que chez les sujets sains. Les sujets atteints de TDAH et porteurs du DRD4-7R auraient la réduction

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d'épaisseur corticale la plus importante, suivi des sujets atteints du trouble, mais non-porteurs du polymorphisme. Les sujets sains et non-porteurs du polymorphisme ont également une réduction de leur épaisseur corticale comparés aux sujets sains et non-porteurs [73].

Comme mentionné précédemment, l'allèle du DRD4-7R entraînerait un hypofonctionnement du récepteur. Une libération plus importante de dopamine serait alors nécessaire chez les porteurs du DRD4-7R pour avoir une réponse équivalente aux porteurs de l'allèle à 4R [74]. Les études ont montré que cette variation fonctionnelle retentit sur la réponse à la médication pour traiter le TDAH, malgré le fait que la médication n'agit pas directement sur les récepteurs. L'allèle à 4R serait plus fréquent chez les personnes qui répondent bien aux psychostimulants. D'un autre côté, les sujets atteints de TDAH et porteurs du DRD4-7R auraient besoin d'une plus forte dose de médications pour le contrôle des symptômes [75-76].

L'implication du DRD4-7R dans les caractéristiques cliniques du TDAlI a également été étudiée.

2.4.1 Caractéristiques comportementales

À notre connaissance, peu d'études ont été réalisées pour explorer les caractéristiques comportementales du TDAH associées au DRD4-7R.

Swanson J. et al ont été les premiers à soulever l'hypothèse que les porteurs du DRD4-7R auraient un comportement extrême comparés aux non-porteurs du polymorphisme [10]. De leur côté, Holmes J. et al ont trouvé une association entre le DRD4-7R et des enfants atteints à la fois de TDAH et du trouble des conduites en comorbidité [68]. Les études cliniques ont montré que le TDAH avec un trouble des conduites était une condition plus sévère que le TDAH seul [77-79].

2.4.2 Caractéristiques attentionnelles

Les études sur les caractéristiques neuropsychologiques chez les porteurs du DRD4-7R atteints de TDAH sont nombreuses, mais très diversifiées quant à leur population et leur méthodologie [80-83]. En particulier, l'âge et les caractéristiques génétiques de la

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population étudiée sont des facteurs qui peuvent influencer ces résultats [84-85]. Nous rapportons, dans ce qui suit, les résultats des études avec une population d'enfants d'origine caucasienne qui ont utilisé des tests pour mesurer l'attention.

Swanson J. et al et Bellgrove M.A. et al ont trouvé que les enfants atteints de TDAH et porteurs du DRD4-7R ont une meilleure performance à des tests d'attention soutenue comparés aux enfants qui sont non-porteurs de l'allèle [10, 86]. À l'opposé, Langley K. et al ne voient aucune différence dans un test d'attention soutenue entre des enfants avec un TDAH porteurs du polymorphisme et ceux qui sont non-porteurs. Par contre, ils ont observé que les porteurs du DRD4-7R ont une moins bonne performance dans un test d'attention visuelle que les non-porteurs [9].

2.5 POURQUOI ENTREPRENDRE NOTRE ÉTUDE

L'état des connaissances confirme l'implication du système dopaminergique dans l'étiologie du TDAH. L'association entre le TDAH et l'allèle 7R -"a gène du DRD4 est aussi bien établie. Par contre, les connaissances actuelles ne permettent pas d'identifier les caractéristiques cliniques du TDAH associées à la présence du polymorphisme DRD4-7R dans les populations caucasiennes, en particulier la population canadienne-française. Les études sur les caractéristiques cliniques du TDAH associé au polymorphisme à risque sont très hétérogènes méthodologiquement (ex : les outils utilisés, origine ethnique de l'échantillon). Dans la présente étude, la particularité de la population canadienne-française (ayant un effet fondateur) permet d'avoir une certaine homogénéité génétique. Les outils utilisés dans notre étude sont validés et fréquemment utilisé en clinique, ce qui permet de faciliter leur application et l'interprétation des résultats. Ces deux caractéristiques de notre étude permettent donc de pallier à certaines lacunes des études précédentes et d'apporter un ajout à la littérature scientifique dans ce domaine.

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Cette étude vise à mieux caractériser le portrait comportemental et attentionnel des enfants avec un TDAH porteurs de l'allèle DRD4-7R, comparés à des enfants TDAH non-porteurs de cet allele, dans une population ethniquement homogène (canadienne-française) et cliniquement bien caractérisée.

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TITLE

Behavior and attention characteristics of French-Canadian children with

attention deficit hyperactivity disorder carrying the dopamine receptor

D4 7 repeats allele

Myriam Giguère ' '

mvriam.gimiere.lffljulaval.ca *Leila Ben Amor1'2

leila benamorraissss.gouv.qc.ca Sylvie Giroux

Svlvie.Giroux(â):crsfa.ulaval.ca François Rousseau '

francois.rousseau(tt.;mac.corn

1 Département of psychiatry, Hotel Dieu de Levis Hospital,

6550 St-Georges, Levis (Quebec), G6V 6X2, Canada Phone: 1-418-835-7155 Fax: 1-418-838-8873

2 Laval University,

2325, rue de l'Université, Quebec (Quebec), GI V 0A6, Canada Phone:418-656-2131

3 CHU Québec, Saint-François D'Assise Hospital,

10, rue de l'Espinay, Quebec (Quebec), GIL 3L5, Canada Phone:418-525-4444

* Corresponding author

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ABSTRACT

Attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) is a prevalent worldwide neurobiological disorder with a highly genetic etiologic component. Implication of the dopamine genes in this disorder is well supported by animal and human research. In particular, association between the 7 repeats (7R) allele of the dopamine receptor D4 (DRD4) gene and ADHD has been well established. The aim of this study is to determine behavior (Conners rating scales, child behavior checklist) and attention (developmental neuropsychological assessment test, continuous performance test) characteristics associated with the dopamine receptor D4 7 repeats (DRD4-7R) allele in a well-characterized clinical and genetic sample of French-Canadian school-aged children with ADHD (n = 137). We observed that children with ADHD who were carriers of the DRD4-7R had significantly more behavioral problems than non carriers, but carriers of the polymorphism had better visual attention on the NEPSY than non carriers. Presence of DRD4-7R allele is associated with a mixed profile of worse behavior but better visual attention in French-Canadian children with ADHD. Identification of specific profiles associated with established genetic risk factors could increase our understanding of the genetic and dopaminergic etiology of ADHD.

RÉSUMÉ

Le trouble déficitaire de l'attention avec ou sans hyperactivité (TDAH) est un trouble neurobiologique fréquent chez les enfants d'âge scolaire. L'étiologie du TDAH inclut une forte composante génétique et implique le système dopaminergique. Il y aurait une association entre le trouble et l'allèle à 7 répétitions (7R) du gène du récepteur de la dopamine D4 (DRD4). Cependant, les caractéristiques cliniques du TDAH associées à ce polymorphisme sont peu étudiées dans les populations caucasiennes. Le but de cette étude est de déterminer les caractéristiques comportementales (échelle de Conners et child behavior checklist) et attentionnelles (NEPSY et CPT) associées à la présence ou l'absence de l'allèle DRD4-7R dans une population d'enfants canadiens-français atteints de TDAH (n = 137). Nos résultats montrent que les enfants atteints de TDAH et porteurs du

DRD4-7R ont significativement plus de problèmes de comportement, mais à l'inverse, ils ont une meilleure attention visuelle que les non-porteurs du polymorphisme. L'identification de profils spécifiques associés à des facteurs de risque génétiques pourrait améliorer la compréhension de l'implication du système dopaminergique ainsi que dans l'étiologie du TDAH.

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4.1 BACKGROUND

Attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) is a neurodevelopmental disorder affecting approximately 7 % of school-aged children worldwide and is observed predominantly in boys with an estimated sex ratio of 6 : 1 [1, 11, 87]. The symptoms of ADHD include inattention, hyperactivity and impulsive behavior. There are different ADHD subtypes based on predominance of symptoms or their combination. These subtypes are labeled inattentive (ADHD-1), hyperactive/impulsive (ADHD-H) and combined (ADHD-C). ADHD exhibits a high comorbidity with oppositional defiant disorder (up to 65 %) and conduct disorder (up to 45%) [1, 14]. In addition, ADHD frequently persists into adulthood and is associated with academic difficulties, family and social dysfunction.

The etiology of ADHD is not currently well understood. However, epidemiological studies have shown that ADHD appears to be associated with genetic factors. Family studies found that relatives of an individual with ADHD have higher risk of having ADHD than relatives of controls (20 % and 3 % risk, respectively) [3-4]. Adoption and twin studies have also supported the role of genes in the etiology of ADHD [5-6]. A meta-analysis of several twin studies showed a mean heritability of 76 % [5].

Many previous genetic studies of ADHD in both animals and humans have observed positive associations with genes in the dopaminergic system [51]. Pharmacological studies have shown that methylphenidate, a widely used medication to treat symptoms of ADHD, acts by blocking dopamine transport at synaptic level [19]. In structural and functional brain imaging studies, patients with ADHD were observed to have both a decreased volume and lowered functioning in the cerebral regions that are rich in dopamine (such as frontal cortex and striatum) compared with controls [54-55]. These regions are implicated in motor activity and in neuropsychological functions affected by ADHD, including executive function, attention, motivation and memory [29].

Following the hypothesis that dopamine is involved in ADHD's etiology, several candidate genes encoding proteins involved in synthesis and transmission of dopamine have been described [5, 47]. In particular, the dopamine receptor D4 (DRD4) gene (on

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chromosome 11) has been widely investigated. This receptor is highly expressed in frontal brain regions in which imaging studies have observed presence of abnormalities in ADHD-affected individuals [55, 59].

The variable number of tandem repeats (VNTR) polymorphism in ex on 3 of DRD4 is a 48-basepair sequence coding for 16 amino acids repeated from 2 to 11 times. The 7 repeats (7R) allele has been associated with an increased risk of ADHD. [8]. This VNTR polymorphism encodes for the third intracellular loop of DRD4, which is important for coupling adenyl cyclase and G-proteins. Variability in number of repeats affects intracellular protein interactions and thus receptor's function. The DRD4 expressed by the

7 repeats allele (DRD4-7R) has a 2- to 3-fold lower potency for dopamine-mediated coupling to adenyl cyclase than DRD4 expressed by 2 or 4 repeats (2R and 4R) alleles [8, 65, 76]. Therefore, DRD4-7R allele has been considered as a risk factor for ADHD because this allele impairs binding efficiency of DRD4. Several meta-analyses have confirmed the role of DRD4-7R allé., in ADHD risk; the most recent meta-analysis observed an odds ratio of 1.33 [5, 59, 71]. Etiology of ADHD is complicated by gene-environment interactions. Interaction between maternal smoking during gestational age and DRD4-7R had been reported [72].

To our knowledge, relatively few studies have explored behavior and attention characteristics associated with this polymorphism in Caucasian population.

Holmes J. et al have observed an association between the DRD4-7R allele and ADHD with comorbid conduct disorder, in a United Kingdom population [68]. Clinical studies have shown that ADHD with conduct disorder in comorbidity is a more severe condition than ADHD alone [77-79].

Numerous studies explored neuropsychological aspect associated with the DRD4-7R but there have been contradictory results. These contradictions may be explained by difference in population characteristics. In particular, age and ethnicity are important factor for characterization of DRD4-7R effects [84-85].

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Three studies with predominantly Caucasian populations reported data on attention aspect of ADHD in presence of DRD4-7R allele. Langley K. et al didn't find any differences between children with ADHD carrying DRD4-7R allele and children with ADHD non carriers of the polymorphism on Continous Performance Test (CPT) [9]. However, two additional studies observed that carriers of the polymorphism have less difficulty in sustained attention tasks (CPT or sustained attention to response test; SART) compared to non carriers [10, 86].

To further explore the behavior and attention characteristics of ADHD associated with the presence of DRD4-7R allele in Caucasian and pediatric population, we conducted a study with homogenous clinical and ethnical sample of French-Canadian children.

We hypothesized that behavior and attention performance of French-Canadian children with ADHD who carried the DRD4-7R allele would be significantly different than children with ADHD who don't carry the DRD4-7R allele.

4.2 MATERIALS AND METHODS

4.2.1 Subject population

Children were recruited from the child psychiatry outpatient clinic of Hotel-Dieu de Levis Hospital (Quebec, Canada) between years 2005 and 2011. Only third-generation, French-Canadian children between 5 and 12 years old were included in the study. To be included in the study, children should have an ADHD diagnosis from an experienced child psychiatrist and positive ADHD scores in parent version of the Clinical Diagnostic Interview Schedule for Children IV (C-DISC-IV). Both criteria are based on the Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, fourth edition (DSM-IV) [1, 88]. Independent diagnoses in two different evaluations (clinical and interview) decreased risk of including false-positive subjects in our sample. Children with an IQ less than 70 or presenting a diagnosis of pervasive developmental disorder were excluded. IQ was determined by Wechsler intelligence scale for children, fourth edition (WISC-IV), for children 6 years in age and older. We used Wechsler preschool and primary scale of intelligence, third version (WPPSI-III), for 5-year-old children. Both scales were presented in French [89-90]. The

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study was approved by research's ethic committee of Laval University. All participants and their parents provided written informed consent.

4.2.2 Behavior evaluation

For all behavior questionnaires, when children were taking medication, we asked the informants to complete the questionnaires having in mind the behavior of their children when they were off the medication. The following scales were used for behavior's evaluation:

- The Conners teacher rating scale, revised version (CTRS-R), is a 59-item questionnaire subdivided into 13 scales that assess teacher's perception of a child's behavior in classroom [91]. We obtained T-scores for each scale (e.g., opposition, cognitive problems and restlessness). Scale goes from 0 to 100, scores clinically significant were those higher than 65.

- The Conners parent rating scale, revised version (CliS-R), is an 80-item questionnaire used for assessing parental reports of childhood behavior problems [92]. We obtained

T-scores for each scale (e.g., opposition, cognitive problems and restlessness). Scale goes from 0 to 100, scores clinically significant were those higher than 65. Principal informant was the mother.

- The child behavior checklist, long version (CBCL), is a 113-item questionnaire designed to obtain data on behavioral/emotional problems and competencies in children and permits cross-information from surveyed parents [93-94]. We analyzed T-scores from internalizing/externalizing problems and from the six DSM-IV-oriented scales. Scale goes from 50 to 100, scores clinically significant were those higher than 65. Principal informant was the mother.

4.2.3 Attention evaluation

An experienced research assistant administered neuropsychological tests. Children taking medications were asked to stop taking their medications 24 hours before the evaluation. The following neuropsychological tests were completed:

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- The developmental NEuroPSYchological assessment test (NEPSY) was used to assess selective attention [95]. This test provides a flexible approach to the assessment of the neuropsychological development of children between 3 and 12 years in age [96]. The NEPSY contains a visual and auditory subtest, which includes speed and attention assessment factors. The NEPSY provides standardized total visual- and auditory-attention scores. Higher scores correspond to better performance; scale goes from 1 to 19.

- The continuous performance test II (CPT-II) was used to assess sustained attention [97]. The CPT-II respondents are asked to press the space bar or click the mouse button when a letter, except letter 'X', appears on computer screen. The inter-stimulus intervals (ISIs) are 1, 2 and 4 seconds, and display time on the screen is 250 milliseconds. The unique CPT paradigm is a test structure consisting of 6 blocks and 3 blocks, each blocks and sub-blocks containing 20 trials of letter presentations. Presentation ISIs vary between sub-blocks of trials, and total test time is 14 minutes [98]. This test provides standardized scores of subject's omission and commission errors, with higher scores corresponding to worse performance. Each scale goes from 0 to 100.

4.2.4 Genotyping

Biological samples (blood or saliva) for genotyping were collected from subjects (n = 137). A blood sample DNA extraction was performed using Flexigene DNA Kit (Qiagen, Toronto, Ontario, Canada) following manufacturer's instructions. The OG-250 Collection Kit (Oragene, DNA Genotek Inc., Kanata, Ontario, Canada) was used to process subjects' saliva samples. After incubation overnight at 50 °C, DNA was extracted from saliva following manufacturer's instructions. A genomic amplification was performed using the GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit (Qiagen) for the 25 samples that had a DNA concentration lower that 20 ng/ul. Purified DNA was stored at -20 °C.

The VNTR of the third exon of the DRD4 gene was amplified in a 96-well plate format polymerase chain reaction (PCR). Primers used were DRD4-up (sense) GCCCGCTCATGCTGCTGCTC-3' and DRD4-\ow (antisense) 5'-TCTTGGCACGCCGCCTCCTG-3' [75]. Reaction mixture contained IX PCR Buffer, IX Q Solution, 200 uM dATP, dTTP and dCTP, 150 uM dGTP, 50 nM 7-deaza-dGTP, 0.3

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(iM of each of the above primers, 0.03 unit/ul HotStar Taq polymerase (Qiagen) and 1 ng/ul of DNA for total volume of 15 ul. PCR mixture was maintained at 95 °C for 15 minutes to allow the enzyme to activate; 35 cycles consisting of 45 seconds at 95 °C, 45 seconds at 67 °C and 45 seconds at 72 °C were then performed. A final 7 minute extension phase ended the cycle. PCR products were loaded onto 1.8 % agarose gel stained with SYBR SAFE and were separated by electrophoresis for 2 hours, after which gel was analyzed under UV light. SYBR SAFE was also added to TBE IX buffer in electrophoresis chamber (1 jil/100 ml TBE) to optimize fluorescence of DNA.

We analyzed DNA for DRD4 genotype and categorized subjects as either carriers or non carriers of the 7R allele. Subjects were categorized as carriers if they had at least one 7R allele (hetero- or homozygous) of the two possible alleles. Subjects without the 7R allele were classified as non carriers.

4.2.5 Statistical analysis

We used the non-parametric Mann-Whitney U-test to compare carriers and non carriers of the DRD4-7R allele because the distribution of data was skewed and could not be transformed to approximate normality (CTRS-R, CPRS-R, CBCL, NEPSY and CPT scores). Student's t-tests were used to compare mean age and IQ of carriers and non carriers of the DRD4-7R allele. Chi-squared tests were used to compare comorbidity, ADHD clinical subtypes and gender distribution between carriers and non carriers with ADHD. A Fisher's exact test was used when numerical data were too sparse for chi-squared test.

For all tests, statistical significance was established at 5 % (p < 0.05). All Mann-Whitney U-tests for behavior and attention data were performed with statistical package for the social sciences (SPSS) 12.0.1 for Windows. Student's t-tests, chi-squared tests and Fisher's exact tests were performed with Minitab 16.1 for Windows.

4.3 RESULTS

A total of 137 children, predominantly boys (75 %), with mean age of 9.1 years and mean IQ of 99.1 were included in the study. Comorbid conditions were frequently observed in our sample, including oppositional defiant disorder (75.0 %), anxiety disorder (28.1 %),

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learning disorder (9.4 %), specific phobias (6.3 %), communication disorder (6.3 %) and conduct disorder (3.1 %). Some children were observed to have more than one comorbid condition (thus, total percentage do not sum to 100 %). All three ADHD clinical subtypes were represented in our sample: ADHD-C (70.1 %), ADHD-I (27.0 %) and ADHD-H (2.9 %).

Table 1 presents characteristics of our ADHD population according to their DRD4-7R genotype. There were no significant differences between groups with or without the DRD4-7R allele for age (t = 0.23, df = 82, p = 0.82), gender (X2= 2.67, df = 1, p = 0.10), IQ

(t = 0.63, df = 69, p = 0.53), comorbidity (X2= 1.886, df = 1, p = 0.17) or clinical subtype

(X2= 0.097, df= l,p = 0.76).

For the following results, the difference in the number of subjects between the tables is due to few missing data (ex. parents did not give back one questionnaire, one neuropsychological subtest was not valid).

4.3.1 Behavior portrait

- CTRS-R: There were significant differences in Mann-Whitney U-test between carrier and non carrier of the DRD4-7R allele for T-scores on the subscales "Cognitive problems" (p = 0.02), "CGI: Emotional lability" (p = 0.03), "CGI: Total" (p = 0.03), "DSM-IV: Inattention" (p = 0.04), "DSM-IV: Impulsivity" (p = 0.03) and "DSM-IV: Total" (p = 0.04). For "Hyperactivity", "ADHD index" and "DSM-IV Restlessness" subscales, difference were close but not significant (p = 0.05, p = 0.06 and p = 0.07 respectively) (tab. 2). A general tendency shows that carriers of the polymorphism have higher scores than non carriers, even if the differences are not statistically significant.

- CPRS-R: There were no significant differences between children with and without the DRD4-7R allele for any scale (tab. 3). Higher scores don't follow the same tendency than the teachers' scores; about half of the scores are higher in carriers of DRD4-7R, where the other half is higher in non carriers. But, we can notice that almost all scores are higher than the teachers' one.

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- CBCL: There were no significant differences between children with and without the DRD4-7R allele for any scale (tab. 4). No tendency can be observed, scores are very similar between carriers and non carriers.

4.3.2 Attention portrait

There was a significant difference between carrier and non carrier of the DRD4-7R allele on NEPSY visual attention score (p = 0.02). However, there was no significant difference for NEPSY's auditory attention scores between the two groups (p = 0.80) (tab. 5).

We observed no significant differences between CPT scores of ADHD subjects with or without DRD4-7R allele for either omission (p = 0.82) or commission scores (p = 0.69) (tab. 6). Carriers of the DRD4-7R have worse scores on both variables.

4.4 DISCUSSION

In this study of genetically homogenous .French-Canadian population and clinically well-characterized children with ADHD, we found that carriers of the DRD4-7R allele are different from non carriers. Carriers of the DRD4-7R allele exhibit significantly more behavioral problems on CTRS-R and better visual attention on NEPSY than non carriers of this polymorphism.

To our knowledge, there have been no prior studies that observed a correlation between increased behavioral problems and DRD4-7R polymorphism in ADHD children using the Conners scale. Nevertheless, Holmes J. et al observed an association between DRD4-7R and children with ADHD and comorbid conduct disorder which corresponds to a more severe condition than ADHD alone [77-79].

In contrast to CTRS-R scores, we did not find significant differences between carriers and non carriers of the polymorphism for CPRS-R or CBCL scores, which both had parents as informant. In contrast with teachers' scores, parents' scores don't follow any tendency. Parents' higher scores are mixed in carriers and non carriers and teachers' higher scores are only in carriers. This finding is consistent with previous studies indicating that different environmental evaluations between teachers and parents may induce different 38

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results depending on the informant [99-100]. DSM-IV state that symptoms of ADHD are more present when people affected are in group situations like at school [1]. We could also notice that majority of the scale of CPRS-R, no matter if children are carrying the risk allele or not, have superior score than teacher's one. Studies have found that generally, parents report more behavior problems and score higher than teachers. Parental stress and presence of depression could conduct to higher scoring [100-101]. Parents of children with ADHD also usually have more psychopathology including ADHD than control children's parents [102]. That leads some studies to conclude that teachers would be better informants than parents [103].

Carriers of the DRD4-7R allele were observed to have significantly better visual attention scores than non carriers. Contrary to our results, Langley K. et al observed that carriers of the DRD4-7R allele exhibited more visual attention problems than non carriers. They used a matching figures test of visual attention [9]. Difference in result could be explained by the difference between the two measures.

We observed no significant differences in CPT scores between children with ADHD who carried the DRD4-7R allele and children with ADHD who were non carriers. This confirms the results of Langley K. et al who also observed no significant differences in the same test scores between carriers and non carriers [9]. However, our results are different from those of Bellgrove M.A. et al and Swanson J. et al who observed that non carriers exhibited difficulties in SART and CPT respectively [10, 86, 104]. These differences in observed results may be because of children's age included in the three studies. The mean age of the sample in Langley K. et al was similar to our study's sample (mean age of approximately 8 years old), whereas children in the other two studies were older (mean age of approximately 12 years old) [9-10, 86]. Altink M.E. et al have shown that results in neuropsychological tests are usually better with older subjects. This could be explained by a maturation of the brain that occurs in different age periods [84].

Different behavior and attention portrayals of ADHD have been previously addressed by Swanson J. et al who suggested that DRD4-7R polymorphism was likely only associated with the behavioral aspects. In regards to attention aspect, the authors

(58)

hypothesized that non carriers of the polymorphism would display deficits, whereas carriers would exhibit better performance on certain tests [26].

Limitations

Our results should be interpreted while considering limitations of this study.

First, we compared ADHD groups with or without the DRD4-7R, but we didn't compare our ADHD groups with normal controls. We consider that a control group would have been less homogenous. For example, control group could include children with symptoms of ADHD without having a diagnosis because they don't have important life impairment. We think that may have introduced bias. We preferred to focus on a better homogeneity in our ADHD group (two diagnoses given by different people).

In our statistical analysis, we didn't correct for multiple comparisons of our non-parametric Mann-Whitney test. This correction is used to prevent type I error, however it increase type II error (probability of accepting the null hypothesis when the alternative is true). It had been reported that the main weakness of correction for multiple comparisons is that the interpretation depends on the number of other tests performed [105-106].

In the same way, a lack of power might explain some of the non-significant results. Power calculations for the Mann-Whitney tests were performed by considering a theoretical distribution of 7R carriers, obtained by shifting different theoretical amounts, and observed distribution of 7R non carriers to see what difference between the two distributions was needed to obtain a power of 80 %. Results indicated that differences of approximately 7 units were needed for CTRS-R, 6 to 7 units were needed for CPRS-R, 5 to 6 units for CBCL, 1.25 to 1.75 units for NEPSY and 4 to 5 units for CPT scales.

Our result on NEPSY should be interpreted with moderation. Scales of NEPSY being short (1 to 19), it's normal that small difference appears significant. To our knowledge, no studies used the NEPSY in their analysis. This test may not be a good tool to study difference between carriers and non carriers of DRD4-7R.

(59)

Finally, we did not test for an association between ADHD and the DRD4- 7R allele because the study was not designed for this purpose. However, we calculated our power to detect an association of an odd ratio of 1.33 in our population and observed that we had limited power (17 %), which permit to detect an odd ratio of 2.27 [59].

4.5 CONCLUSIONS

Altogether, our data show that in a genetically homogeneous and well-characterized clinical sample, children with ADHD that carry the DRD4-7R allele have significantly worse behavioral problems but better visual attention than ADHD children who are non carriers of DRD4-7R. Additional studies are necessary to replicate these results. The clinical profile of worse behavior with better visual attention associated with specific genetic risk factors could better elucidate the role of genetic factors in the etiology of ADHD. Further researches are needed to explore the environmental factors that may interact with genes in the determination of the clinical profile of ADHD in children.

4.6 COMPETING INTERESTS

The authors declare that they have no competing interests.

4.7 ACKNOWLEDGMENT

This study was supported by a grant from the Canadian Institute for Health Research (CIHR) to L. Ben Amor (the PI).

Statistical assistance was provided by Mrs. Myrto Mondor, from St-Sacrement Hospital of Quebec.

(60)

Table 1- Characteristics of children with ADHD (n = 137) categorized by their DRD4-7R genotype With 7R n = 46 Without 7R n = 91 p-value Mean age (SD) 9.1(2.1) 9.0 (2.0) 0.82 Gender Male 31 73 0.10 Gender Female 15 18 0.10 MeanlQ(SD) 100.3 (15.2) 98.6 (12.8) 0.53 Comorbidity* (%) 30.4 19.8 0.17 Subtypes Inattentive 13 24 0.76 Subtypes Hyperactive 2 2 0.76 Subtypes Combine 31 65 0.76

7R = 7 repeats allele, SD = standard deviation

"Comorbidity includes: oppositional defiant disorder, anxiety disorder, specific phobia, communication disorder and conduct disorder. Children can be affected by more than one comorbidity.

Table 2- Mann-Whitney U-test percentiles of Conners teacher scale for children with ADHD categorized by their DRD4-7R genotype

Conner's teacher scale With 7R

(median [Q1-Q3]) n = 39 Without 7R (median [Q1-Q3]) n = 82 p-value Opposition 61 (48-78) 59 (45-72) 0.31 Cognitive problems 63 (55-73) 60 (47-68) 0.02 Hyperactivity 58 (54-71) 55 (47-67) 0.05 Anxiety 66 (54-73) 60 (52-70) 0.24 Perfectionism 53 (47-61) 56 (46-66) 0.52 Social problems 62 (50-76) 57 (45-70) 0.28 ADHD index 64 (58-74) 61 (56-69) 0.06 DSM-IV : Restlessness 63 (58-70) 61 (53-69) 0.07 CGI : Emotional lability 59 (51-68) 53 (45-63) 0.03

CGI : Total 65 (57-72) 59 (52-71) 0.03

DSM-IV : Inattention 67 (57-72) 62 (55-69) 0.04 DSM-IV : Impulsivity 60 (52-72) 55 (46-65) 0.03

DSM-IV: Total 64 (58-73) 61 (52-68) 0.04

7R = 7 repeats allele, Ql= percentile 25, disorders -fourth version, CGI = Conners

Q3= percentile 75, DSM-IV = Diagnostic and Statistical Manual of Global Index

(61)

Table 3- Mann-Whitney U-test percentiles of Conners parent scale for children with ADHD categorized by their DRD4- 7R genotype

Conner's parent scale With 7R

(median [Q1-Q3]) n = 42 Without 7R (median [Q1-Q3]) n = 86 p-value Opposition 67 (56-82) 64 (53-73) 0.15 Cognitive problems 73 (65-83) 72 (64-77) 0.19 Hyperactivity 70 (63-81) 72 (58-84) 0.82 Anxiety 60 (51-71) 55 (45-64) 0.09 Perfectionism 52 (45-59) 48 (41-57) 0.21 Social problems 62 (50-85) 63 (51-82) 0.92 ADHD index 71 (64-77) 71 (63-76) 0.60 DSM-IV : Restlessness 67 (61-79) 71 (62-77) 0.97 CGI : Emotional lability 61 (52-73) 60 (49-71) 0.73

CGI : Total 65 (62-79) 69 (62-75) 0.98

DSM-IV : Inattention 72 (64-79) 73(62-78) 0.49 DSM-IV : Impulsivity 67 (59-81) 71 (59-82) 0.37

DSM-IV : Total 69 (65-79) 72 (64-80) 0.67

7R= 7 repeats allele, Ql= percentile 25, disorders -fourth version, CGI = Conners

0.3= percentile 75, Global Index

DSM-IV = Diagnostic and Statistical Manual of

Table 4- Mann-Whitney U-test percentiles of CBCL's scale for children with ADHD categorized by their DRD4-7R genotype

CBCL's scale (problems) With 7R

(median [Q1-Q3]) n = 39 Without 7R (median [Q1-Q3]) n = 87 p-value Internalizing 65 (57-68) 65 (54-68) 0.63 Externalizing 65 (57-73) 65 (56-72) 0.88 Total 68 (60-70) 64 (59-72) 0.91 Affective 61 (56-70) 63 (59-72) 0.28 Anxiety 63 (54-70) 60 (51-68) 0.43 Somatic 57 (50-62) 57 (50-64) 0.61 ADHD 66 (60-74) 67 (60-75) 0.46 Oppositional defiant 64 (55-73) 63 (58-70) 0.55 Conduct 60 (54-70) 60 (54-71) 0.84

7R = 7 repeats allele, Ql= percentile 25, 03= percentile 75

Figure

Table 1- Characteristics of children with ADHD (n = 137) categorized by their DRD4-7R genotype  With 7R  n = 46  Without 7R n = 91  p-value  Mean age (SD)  9.1(2.1)  9.0 (2.0)  0.82  Gender  Male  31  73  0.10 Gender  Female  15  18  0.10  MeanlQ(SD)  100.
Table 4- Mann-Whitney U-test percentiles of CBCL's scale for children with ADHD categorized by  their DRD4-7R genotype
Table 5- Mann-Whitney U-test percentiles of NEPSY variables for children with ADHD categorized by  their DRD4-7R genotype
Figure 2- Photo d'un gel après l'électrophorèse où l'encadré en jaune indique le marqueur avec les  alleles 4R (flèche et ligne pointillée jaune) et 7R (flèche et ligne pointillée rouge)

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