Interactions phage-hôte chez Streptococcus
pneumoniae
Thèse
SIHAM OUENNANE
Doctorat en microbiologie
Philosophiae doctor (Ph. D.)
Québec, Canada
©Siham Ouennane, 2017
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Interactions phage-hôte chez Streptococcus
pneumoniae
Thèse
SIHAM OUENNANE
Sous la direction de :
iii
RÉSUMÉ
Streptococcus pneumoniae est une bactérie à la fois commensale et pathogène
opportuniste chez l’humain. Elle est responsable de nombreuses infections telles que la pneumonie, la méningite, l’otite moyenne et la sinusite. En maladie infectieuse, S.
pneumoniae occupe une place importante en tant que l’une des principales causes de
morbidité et de mortalité dans le monde. Elle est dotée de plusieurs capacités fascinantes, comme la compétence naturelle pour l’aider à résister aux antibiotiques et la grande diversité des sérotypes capsulaires pour contourner la vaccination. Puisque la résistance aux antibiotiques ne cesse de menacer l’efficacité des thérapies standards, la thérapie par phage est maintenant reconsidérée comme une des alternatives thérapeutiques. La réévaluation des phages fait renaitre l’espoir thérapeutique, mais sans élucider leur mécanisme d’interaction et décortiquer leur mystère cet espoir restera modeste.
Ce projet de doctorat consiste à mieux comprendre les phages infectant S.
pneumoniae et les interactions phage-hôte. Dans un premier temps, le potentiel des
pneumophages à infecter Streptococcus mitis, une espèce phylogénétiquement proche de S.
pneumoniae, a été mis en évidence. Deux pneumophages se sont avérés les premiers phages
virulents capables d’infecter S. mitis, bactérie pathogène responsable d’endocardite. Les deux phages pouvaient non seulement se répliquer dans S. mitis mais également produisent des plages de lyses plus visibles. Ensuite, la comparaison du génome des phages a confirmé que le changement de l’hôte n’induit aucune variation aux génomes des phages testés. Cependant, plusieurs mutations ont été observées dans la séquence génomique du podophage sauvage et il a fait ensuite l’objet d’une nouvelle annotation. Dans un deuxième temps, l’étude des interactions phage-hôte chez S. pneumoniae a été approfondie. Pour ce faire, l’implication de plusieurs facteurs de l’hôte dans la réplication des pneumophages a été étudiée. Plusieurs gènes pneumococciques se sont avérés nécessaires ou impliqués pour assurer l'efficacité de la réplication des phages seuls ou en cocktail. D’un autre côté, en étudiant ces facteurs de l’hôte, des gènes/ protéines potentiellement essentiels à la viabilité de S. pneumoniae ont été identifiés.
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Cette étude a aussi permis d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et donne un nouvel aperçu du réseau complexe des interactions phage-hôte.
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ABSTRACT
Streptococcus pneumoniae is a commensal and opportunistic pathogen bacterium,
exclusively found in humans. It is the main agent of many infections such as pneumonia, meningitis, otitis media and sinusitis. S. pneumoniae infections are a major cause of morbidity and mortality worldwide. S. pneumoniae has several fascinating abilities, such as natural competence to facilitate the acquisition of antibiotic resistance genes and diversity of capsular serotypes to circumvent the vaccination. The rise of antibiotic resistant bacteria continues to threaten the effectiveness of standard therapies and as such phage therapy is now reconsidered as a therapeutic alternative. The reevaluation of phages as therapeutic agents must go through a better understanding of phage-bacterium interactions.
This PhD thesis aims to better understand S. pneumoniae virulent phages and phage-host interactions. First, the ability of pneumophages to infect Streptococcus mitis, a species phylogenetically related to S. pneumoniae, was demonstrated. The pneumophages are the first two virulent phages able to infect this pathogenic bacterium, the common cause of bacterial endocarditis. Both pneumophages could not only replicate in S. mitis but also produced more visible plaques on this host. The comparison of the genomes of each phage grown on both hosts produced identical nucleotide sequences, confirming that S. mitis as a host does not induce any nucleotide variation. However, the genomic sequence of wild-type podophage was different than the previously reported sequence and it was the subject of a new annotation. In addition, S. pneumoniae phage-host interactions were investigated. The involvement of several host factors in replication of both pneumophages was observed. Indeed, several pneumococcal genes were found to be necessary or involved to ensure efficient phage replication. Moreover, the study of these host factors has led to the identification of new genes that appear to be essential for viability and normal growth of S.
pneumoniae.
This project led to identify new potential therapeutic targets and provided new insight into the complex network of phage-host interactions.
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Table des matières
RÉSUMÉ ... iii
ABSTRACT ... v
Table des matières ... vii
Liste des tableaux ... xi
Liste des figures ... xii
Liste des abréviations ... xiii
Remerciements ... xv
Chapitre I. Introduction ... 1
Avant-propos ... 1
Streptococcus pneumoniae ... 1
Présentation ... 1
Mécanisme de la transformation naturelle ... 3
Croissance et division cellulaire ... 6
Physiopathologie des infections à S. pneumoniae ... 12
Données épidémiologiques ... 12
Mécanismes de la colonisation de l’hôte ... 14
Processus d’infection et infections associées ... 18
Facteurs de virulence ... 19 Capsule polysaccharidique ... 20 Pneumolysine ... 22 Protéines de surface ... 22 Traitements antipneumococciques ... 25 Traitements préventifs ... 25
Traitement et résistance aux antibiotiques ... 27
Bactériophages ... 30
Rappel historique ... 30
Classification des bactériophages ... 32
Réplication des bactériophages ... 34
Phages infectant Streptococcus pneumoniae ... 36
viii
Chapitre 2. Diverse virulent pneumophages infect Streptococcus mitis ... 43
Résumé ... 43
Avant-propos ... 43
Contributions des auteurs... 43
Publication ... 44
Abstract ... 44
Introduction ... 44
Materials and Methods ... 47
Results ... 50
Discussion ... 58
Acknowledgments ... 60
References ... 61
Supporting information ... 65
Chapitre 3. Identification of host factors involved in the interaction of Streptococcus pneumoniae with its virulent phages ... 68
Résumé ... 68
Avant-propos ... 69
Contributions des auteurs... 69
Publication ... 69
Abstract ... 69
Introduction ... 70
Results ... 72
Discussion ... 88
Materials and Methods ... 91
Acknowledgements ... 95
References ... 98
Supporting Information ... 102
Chapitre 4: Discussion et perspectives ... 115
Conclusions ... 124
Bibliographie ... 125
Annexe ... 149
ix
Résumé de la publication ... 149
Avant-propos ... 149
Contributions des auteurs... 149
Publication ... 149
Abstract ... 150
Introduction ... 150
1. Bacteriophage therapy... 153
Other phage applications in human diseases ... 157
Phage applications in industries ... 158
Phage components as antibacterial agents ... 159
2. Immune modulation therapy ... 159
3. Antimicrobial peptides ... 163
4. Probiotics and prebiotics ... 165
5. Other antimicrobial agents ... 167
Medicinal Plants ... 167
Essential oils ... 168
Conclusions ... 168
xi
Liste des tableaux
Table 2.1. Putative Open Reading Frames deduced from SOCP genome sequences and their
predicted functions ... 55
Table S2.1 Primers used in this study to confirm variations within the genome of phage SOCP. ... 65
Table S2.2 Primer sequences of four housekeeping genes. ... 65
Table S2.3 Differences between the genomes of phage SOCP and Cp-1. ... 65
Table S2.4. Codon usage of pneumophages Dp-1 and SOCP for selected amino acids compared to the hosts S. pneumoniae and S. mitis. ... 67
Table 3.1 A summary and general function of S. pneumoniae genes and the lytic phages used in this study, based on Y2H screens by Mariano et al. ... 75
Table 3.2 Effect of gene inactivation and host-phage interactions of S. pneumoniae ... 76
Table 3. 3 Bacterial strains, plasmids and phages used in this study ... 91
Table S3.1 Protein-protein interaction in S. pneumoniae. ... 104
Table S3.2 Primers used for gene knockout assays ... 110
Table S3.3 Primers used for complementation assays ... 112
Table A. 1 Summary of the bacterial anti-phage mechanisms and strategies used by phage to avoid host resistance. ... 155
xii
Liste des figures
Figure 1.1 Morphologie des colonies de diverses souches de S. pneumoniae cultivées sur
gélose sang ... 2
Figure 1.2 Principe de fratricide chez S. pneumoniae ... 6
Figure 1.3 Représentation schématique de la synthèse de la paroi cellulaire... 10
Figure 1.4 Interaction entre S. pneumoniae et les cellules épithéliales. ... 17
Figure 1.5 Principaux facteurs de virulence de S. pneumoniae. ... 20
Figure 2.1 Electron microscopy of virulent phage Dp-1 (A) and phage SOCP (D) ... 51
Figure 2.2 Genome alignment of phages SOCP and Cp-1 ... 54
Figure 2. 3 Comparison of the proteome of pneumophage SOCP/ Cp-1 ... 58
Figure 3. 1 Schematic representation of the genes involved in host-phage interaction. ... 73
Figure 3. 2 Efficiency of plating of two pneumococcal virulent phages on various knockouts in S. pneumoniae ... 82
Figure 3. 3 Efficiency of plating of two pneumococcal virulent phages on S. pneumoniae strains complemented with wild-type genes ... 84
Figure 3. 4 Schematic representation of construction of pFF3 plasmid, using TA cloning-like system ... 94
Figure S3. 1 Map of pLS1RGFP vector showing key features of the plasmid ... 102
Figure S3. 2 Comparison of the maltose effect on phage infection. ... 103
Figure A. 1 Summary of antibiotic target site and resistance mechanisms in Gram-positive and Gram-negative bacteria. ... 152
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Liste des abréviations
ADN acide désoxyribonucléique
ADNdb acide désoxyribonucléique double brin ADNsb acide désoxyribonucléique simple brin AMPs antimicrobial peptides
ARN acide ribonucléique
ARNr acide ribonucléique ribosomique ARNt acide ribonucléique de transfert
BCWH hydrolases de la paroi bactérienne (bacterial cell wall hydrolases) BHI infusion de cœurs et cervelles (brain heart infusion)
BIM mutant bactérien résistant aux bactériophages (bacteriophage insensitive mutant)
CAP pneumonie communautaire acquise (community acquired pneumonia) CBPs protéines de liaison à la choline (choline-binding proteins)
CRISPR clustered regularly interspaced short palindromic repeats CsCl chlorure de césium
CSP peptide de stimulation de la compétence (competence stimulating peptide). EOP efficacité à former des plages de lyse (efficiency of plaquing)
GFP green fluorescent protein
IgA1 immunoglobuline A1
LytA autolysine majeure
mAb anticorps monoclonaux (monoclonal antibodies) MgSO4 sulfate de magnésium
MitC mitomycine C
MOI multiplicité d’infection
NanA neuraminidase A
OD densité optique
ORFs cadre de lecture ouvert (open reading frame) PAF facteur d'activation plaquettaire
PCR réaction en chaîne de la polymérase (polymerase chain reaction) PFU plaque forming units
xiv
PG peptidoglycan
PLPs protéines liant la pénicilline
PsaA adhésine A de surface du pneumocoque PspA protéine A de surface du pneumocoque
RBP protéine de liaison au récepteur (receptor binding protein) TSA trypticase soy agar
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Remerciements
C’est enfin l’accomplissement de plusieurs années de travail qui ont nécessité une grande volonté et beaucoup d’effort. Sans l’encouragement et le soutien de plusieurs personnes, je n’aurais pas pu voir la fin de cette thèse.
Tout d’abord, je remercie vivement mon directeur de thèse, Prof Sylvain Moineau, de m’avoir accueillie dans son laboratoire et de m’avoir fait découvrir le monde fascinant des bactériophages. Je vous suis infiniment reconnaissante pour votre disponibilité inconditionnelle, vos précieux conseils et votre grande expertise. Votre passion pour les phages et surtout pour les CRISPR m’a beaucoup impressionné et m’a donné de vraies leçons de la vie. J’ai appris grâce à vous qu’aimer ce qu’on fait est un véritable enjeu pour réussir la vie professionnelle. Je vous remercie pour votre simplicité, gentillesse et amabilité. Merci d’avoir était un leader exemplaire qui a toujours su comment rendre la vie d’un grand groupe au laboratoire un meilleur environnement d’échange, d’apprentissage et de brassage culturel.
Un grand merci à tous mes collègues de travail. Merci pour vos conseils et vos explications. Je remercie surtout ma collègue, ma sœur et mon amie Lynn. Merci pour ta présence, tes encouragements et pour les meilleurs moments de bonheur qu’on a partagé et ceux de stress que j’ai pu surmonter. Si simple si gentille et si franche tout simplement Lynn, merci pour tout. Je remercie également Geneviève. Merci pour tes conseils, tes explications et pour vos qualités humaines et professionnelles. Merci également à Denise pour l’ambiance et le sens d’organisation qui règne dans le laboratoire. Merci à mes amis et collègues Alfonso, Hany et Cas pour tous les meilleurs moments qu’on a pu partager.
Il y’a quelque années, je suis arrivée toute seule et me voilà aujourd’hui entourée de beaucoup d’amis. Merci à vous tous, vous avez su rendre mon intégration si facile et plaisante.
Merci à ma chère sœurette Houda et à mon adorable frère Reda. Merci de m’avoir encouragé et soutenu toujours. Merci pour les longues heures au téléphone. Vous avez toujours su me supporter et partager avec moi, même à distance, tous mes grands moments.
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Que ce travail soit un témoignage de tous mes sentiments et toute ma gratitude pour le soutien, la compréhension, l’encouragement et la patience dont vous avez fait preuve. Un grand merci infini à mes chers parents, Maria et Abdellah. C’était difficile d’être si loin de vous et malgré vous étiez toujours présents pour m’écouter et me faire sortir de ma solitude. Merci d’avoir toujours cru en moi, vos encouragements m’ont beaucoup aidé pour finir cette thèse. Merci pour tous les sacrifices, le soutien et l’affection. Sans vous je n’aurais jamais pu surpasser tous les écueils. Puisse ce modeste travail être le témoignage de ma profonde gratitude et mon profond amour.
Un grand Merci à Saleh. Par où commencer, ici t’étais pour moi toute ma famille! Merci d’avoir toujours été là pour moi et de m’avoir soutenu tout au long de cette thèse. Merci pour ton encouragement, ta confiance et ton support moral. Merci d’avoir toujours cru en moi et en mon potentiel. Merci pour ta compréhension et ton sens d’humour. Tu as toujours su me faire rire et me sortir de mes moments de stress et de panique. Merci pour tout.
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Chapitre I. Introduction
Avant-propos
L’introduction de cette thèse est divisée en plusieurs sections. Les deux premières sections permettent de décrire la bactérie Streptococcus pneumoniae qui fait l’objet de cette étude et traite de son phénotype de résistance aux antibiotiques et de son impact sur la santé publique. La troisième section présente l’histoire des phages, leurs diversités et leurs caractéristiques. Enfin, la dernière section de l’introduction aborde les méthodes alternatives pour le traitement des infections causées par des bactéries pathogènes résistantes aux antibiotiques, présentée sous la forme d’un article de revue en annexe. L’article fait aussi le point sur les différents aspects de la thérapie par phage, les produits de phage et leurs applications dans le domaine médical et agroalimentaire.
Streptococcus pneumoniae
Présentation
Streptococcus pneumoniae est une bactérie de grande importance clinique connue aussi
sous le nom de pneumocoque en référence à sa morphologie et à la pneumonie communautaire acquise (PCA) causée principalement par cet agent pathogène. Cette bactérie à Gram-positif appartient à la famille des Streptococcaceae et au genre
Streptococcus qui regroupe actuellement 72 espèces, incluant plusieurs bactéries très
pathogènes pour l’homme (Richards, et al., 2014). Découverte pour la première fois en 1881 par Leo Escolar, elle a aussi été isolée simultanément par Louis Pasteur et George Miller Sternberg à partir d'échantillons de salive humaine (Watson, et al., 1993). Au fil du temps, cette bactérie a porté plusieurs noms pour mettre en évidence à la fois ses particularités bactériologique et taxonomique, passant de Microbe septicémique de la
salive, nom donné par Pasteur, puis Micrococcus pasteuri par Sternberg à Pneumococcus
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Diplococcus pneumoniae, de 1920 à 1974, avant d’être finalement rebaptisé à son nom
actuel, Streptococcus pneumoniae (Watson, et al., 1993).
S. pneumoniae se présente sous forme de coque, de 0,5 à 1,25 micromètre de diamètre,
souvent groupé en diplocoque ou en courte chaînette. Cette bactérie ne forme pas de spores et est non-motile malgré la présence de pili (Muschiol, et al., 2015). Le pneumocoque a un métabolisme anaérobie facultatif produisant une hémolyse partielle, de type alpha, due à la lyse des globules rouges, visible par une coloration verdâtre autour des colonies ayant poussé sur une gélose sang. Une hémolyse de type bêta a été aussi observée en conditions d'anaérobie lors d’une incubation à basse température (entre 6 et 22°C) (Lorian & Popoola, 1972). La forme virulente du pneumocoque est entourée d’une capsule polysaccharidique et présente une morphologie coloniale d’aspect lisse sur gélose sang, tandis qu’une souche non capsulée, avirulente, donne des colonies d’aspects rugueux (Belanger, et al., 2004) (Figure 1.1).
Figure 1.1 Morphologie des colonies de diverses souches de S. pneumoniae cultivées sur gélose sang. (A) souche D39; (B) R6; (C) AB2; (D) AB7; (E) AB28; (F) R36A; (G)
AB14; (H) AB15. Figure tirée de Bélanger et al. (2004).
Cette bactérie est catalase négative donc elle a recourt à d’autres sources exogènes de catalase, dont celles dans une gélose sang frais, par exemple pour dégrader la grande quantité de peroxyde d'hydrogène produit lors de sa croissance (Ranjan, et al., 2014). Elle se différencie des autres Streptococcus par sa sensibilité à l’optochine, sa lyse par la bile et surtout par la caractérisation de ses antigènes polysaccharidiques capsulaires. S.
pneumoniae est incapable d’obtenir l’énergie (ATP) par respiration et opte pour un
métabolisme fermentaire homolactique en fermentant les sucres en acide lactique. En effet, le pneumocoque possède de nombreux gènes impliqués dans le métabolisme des sucres et
3
leur transport, ce qui permet le métabolisme d’une large variété de substrats carbonés (Hoskins, et al., 2001).
Mécanisme de la transformation naturelle
S. pneumoniae fait partie des bactéries ayant une capacité inhérente d’incorporer l’ADN
exogène par la transformation génétique naturelle. En 1928, Frederick Griffith a démontré pour la première fois le phénomène de la transformation naturelle par transfert de caractères entre deux souches de S. pneumoniae. Ce n’est qu’en 1944 que cette découverte a été valorisée et reprise par Avery, MacLeod et McCarty qui ont montré que c’est l’ADN qui permet le transfert de caractères d’une bactérie à l’autre (Avery, et al., 1944). Leurs travaux ont permis d’identifier le principe de la transformation et de supporter l'hérédité génétique. Cette propriété a fait de cette bactérie un microorganisme modèle pour l’étude de la transformation, de l’acquisition d’ADN de l’environnement et de l’intégration dans son génome par recombinaison homologue. Actuellement, la transformation naturelle a été démontrée chez plus de 80 espèces bactériennes permettant à la cellule receveuse d’acquérir de nouveaux gènes pour mieux s’adapter et persister face aux changements des conditions environnementales (Johnston, et al., 2014). Chez la plupart des bactéries transformables, les protéines impliquées dans la transformation sont directement codées par le génome de la bactérie et ne s’expriment pas de façon permanente mais exigent des conditions spécifiques pour assurer leur expression. En effet, le pneumocoque a la capacité de s’adapter naturellement pour incorporer l’ADN exogène, et ceci lorsque la bactérie est dans un état spécifique nommé état de compétence, ou x-state, obtenue à un moment spécifique de sa phase exponentielle de croissance (Campbell, et al., 1998). L'induction de la compétence génétique est une stratégie utilisée par les bactéries afin d’augmenter leur répertoire génétique sous des conditions de stress (Perry, et al., 2009).
Chez S. pneumoniae, l’état physiologique transitoire est coordonné par un peptide de stimulation de la compétence CSP (Competence Stimulating Peptide). Le CSP est une sorte d’hormone polypeptidique extracellulaire de 17 acides aminés (Johnsborg & Havarstein, 2009). Il est particulièrement important pour initier la compétence et sa présence dans le milieu active la transcription de deux gènes, comX et comW. Il active également 15 autres
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gènes précoces et 60 autres gènes tardifs impliqués soit dans les mécanismes de la fixation et d’internalisation de l’ADN exogène ou dans le devenir de cet ADN internalisé (Johnsborg & Havarstein, 2009, Piotrowski, et al., 2009). Chez le pneumocoque, il existe six isoformes de ce peptide, mais la majorité des souches produisent soit le CSP-1 ou le CSP-2, qui s’attachent respectivement aux récepteurs ComD-1 et ComD-2 et diffèrent de 12 acides aminés (Allan, et al., 2007, Johnsborg & Havarstein, 2009). Lors de la transformation chez le pneumocoque, la première étape du processus d’entrée est la fixation de l’ADN double brin à la surface des cellules transformables et qui requiert la présence de protéines codées par les gènes tardifs comGs. L’entrée d’un brin et la dégradation simultanée du brin complémentaire se produisent à des vitesses similaires, ~100 nucléotides s-1 à 30°C, et avec des polarités opposées, ce qui est compatible avec un modèle de couplage de la dégradation d’un brin et de l’internalisation de son complément (Mejean & Claverys, 1993, Berge, et al., 2002). Par ailleurs, il a été proposé que la rétraction de pili et la formation de pores par des protéines membranaires puissent avoir un rôle dans la fixation et l’internalisation d’ADN exogène dans la bactérie (Chen & Dubnau, 2004, Laurenceau, et
al., 2013). Lee pore d’entrée de l’ADN est composé de deux pseudo-pili apparentés aux
systèmes de sécrétion de type IV et ayant une structure homologue à la protéine majeure de piline ComGC (Muschiol, et al., 2015).
En 2005, il a été démontré que la transformation chez S. pneumoniae touche l’ensemble des cellules d’une culture bactérienne et que l’état de compétence induit la lyse de toutes les bactéries non compétentes, de la même espèce ou d’espèces proches, par les pneumocoques compétents, (Gilmore & Haas, 2005, Guiral, et al., 2005), un phénomène nommé au début allolyse puis fratricide (Claverys & Havarstein, 2007) (Figure 1.2).
Le phénomène fratricide implique l’activation d’un système enzymatique dont les cellules compétentes sont immunisées. La plupart des protéines intervenant dans ce phénomène sont codées par des gènes tardifs. Des enzymes lytiques, comme l’autolysine majeure LytA, sont requises pour induire le fratricide chez S. pneumoniae et pour lyser les cellules non compétentes. D’autres enzymes nécessaires incluent LytC codant pour une hydrolase du peptidoglycane dont l’expression est constitutive, CbpD codant pour une amidase et CibAB codant pour une bactériocine (Guiral, et al., 2005). Cependant, les bactéries compétentes
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sont immunisées contre l’action de ces protéines lytiques par l’expression des protéines d’immunité comme CibC et ComM (Muschiol, et al., 2015).
Ce mécanisme de fratricide joue un rôle important en diminuant la compétition pour les nutriments, augmentant l’efficacité de la transformation et la libération de facteurs de virulence, comme la pneumolysine (Havarstein, et al., 2006). Cela permet de stimuler le système de défense des bactéries et surtout leur permet d’avoir un groupe de gènes communs qui représente une véritable voie pour échapper aux pressions de sélection comme les antibiotiques.
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Figure 1.2 Principe de fratricide chez S. pneumoniae. Figure tirée et adaptée de Claverys
& Havarstein (2007).
Croissance et division cellulaire
Comme tous les microorganismes, l’accroissement du nombre de cellules est un processus biologique fondamental pour assurer la survie de l’espèce. Chez les bactéries, la croissance implique la division des cellules mères en deux cellules filles. Cette croissance bactérienne est contrôlée par plusieurs mécanismes pour permettre à la fois de choisir le site exact de la
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division, de dupliquer fidèlement le génome et de partager équitablement l’information génétique entre deux cellules filles. La disponibilité des nutriments dans le milieu et d’autres facteurs physicochimiques comme la température, le pH du milieu et la pression osmotique influencent fortement la division cellulaire (Monahan, et al., 2014).
Plusieurs études ont été déployées pour élucider les mécanismes intervenant au cours de la division bactérienne et pourtant ce processus vital reste encore relativement mal compris. La machinerie de la division bactérienne met en jeu plusieurs processus comme la synthèse du peptidoglycane (PG) septal, les protéines liant la pénicilline (PLPs) et plusieurs hydrolases pour l’autolyse, le clivage de septum de séparation et la séparation des cellules filles (Typas, et al., 2012, Sundararajan, et al., 2015). Durant la division cellulaire, le PG joue un rôle clé pour parvenir à l’augmentation du volume de la cellule, la formation du septum de séparation et la séparation des cellules filles. Ainsi, son intégrité est indispensable pour la survie bactérienne (Pinho, et al., 2013). Du point de vue général, les bactéries sont dotées de mécanismes de croissance différents étroitement liés à leur diversité morphologique pour guider la division bactérienne et la ségrégation des chromosomes (Pinho, et al., 2013). Jusqu’à tout récemment, les travaux pour élucider les mécanismes de la division bactérienne ont été réalisés essentiellement chez deux bacilles:
E. coli et B. subtilis (den Blaauwen, et al., 2008). Dans le but d’élargir les connaissances
sur les mécanismes sous-jacents de ce processus vital, plusieurs études récentes ont adopté comme modèle la forme la plus simple des bactéries; les coques dont les plus connus sont
S. pneumoniae (ovocoque) et Staphylococcus aureus (bactérie sphérique) et ayant deux
modes distincts de synthèse du PG (Pinho, et al., 2013).
Le PG est un composant majeur de la paroi bactérienne qui maintient la forme cellulaire et assure une protection mécanique contre la pression osmotique. D’autre part, son intégrité est cruciale pour la survie de la bactérie afin d’empêcher la lyse cellulaire. D’ailleurs, l’inhibition de la synthèse de la paroi bactérienne est la cible vitale des antibiotiques de la famille des β-lactamines. Toutefois, l’usage excessif des antibiotiques de cette famille dans le traitement des infections à pneumocoque a grandement favorisé l’émergence des souches de S. pneumoniae résistantes et multi-résistantes aux β-lactamines, comme on le verra plus loin dans cette présentation bibliographique. Une stratégie pour faire face au problème de la
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résistance de S. pneumoniae aux β-lactamines consiste à étudier et à combler le manque de connaissances reliées à la composition et au mécanisme de remodelage du PG ainsi qu’au processus de la division cellulaire.
Le pneumocoque adopte à la fois deux modèles de synthèse du PG; périphérique (Higgins & Shockman, 1970) et septal (Tomasz, et al., 1964). La synthèse du PG, se déroule en trois étapes qui se produisent à trois endroits différents dans la cellule (Pinho, et al., 2013). D’abord, au niveau du cytoplasme, un ensemble de réactions enzymatiques permet la formation des précurseurs du PG grâce aux protéines de la famille Mur (Pagliero, et al., 2005), puis l’association à un groupement undécaprényl-phosphate au niveau interne de la membrane cytoplasmique pour former le lipide I (MurNAc-pentapeptide) (van Heijenoort, 2001, Pinho, et al., 2013). Après le groupe GlcNAc est ajouté par la protéine MurG pour générer le lipide II qui va être transloqué à travers la membrane (van Heijenoort, 2001). À ce stade, la biosynthèse du PG implique deux types d’activités pour polymériser l’unité monomère du PG: les glycosyltransférases (GTases) pour polymériser les chaînes glycanes et les DD-transpeptidases (dd-TPases) pour réticuler les peptides (Typas, et al., 2012). Ces deux réactions enzymatiques sont résidentes sur les domaines extracellulaires des PLPs, qui sont des molécules associées à la membrane (Pagliero, et al., 2005).
Les PLPs sont associées à la membrane et participent aux étapes finales de synthèse du PG. Le nombre de PLP varie considérablement chez les bactéries. Les bacilles en ont habituellement un grand nombre comme E. coli et B. subtilis ayant respectivement 12 et 16 PLPs. Elles sont moins nombreuses chez les coques, souvent entre quatre et sept (Zapun, et
al., 2008). Les protéines PLPs sont fréquemment divisées en deux catégories: PLPs de
haute masse moléculaire (HMM) et PLPs de faible masse moléculaire (FMM) (Goffin & Ghuysen, 1998). S. pneumoniae possède six PLPs dont cinq PLPs de HMM, regroupées en deux classes A et B, et une PLP de FMM. Les PLPs de classe A comprennent les protéines PLP1a, PLP1b et PLP2a qui sont bifonctionnelles ayant à la fois une activité GTase pour la synthèse des brins glycanes et une activité dd-TPase pour la réticulation du peptidoglycane. Les protéines PLP2b et PLP2x font partie de la classe B et sont monofonctionnelles ayant seulement une activité dd-TPase (Typas, et al., 2012, Pinho, et al., 2013). PLP3 est une protéine de FMM et a une activité carboxypeptidase. Chez d’autres bactéries, les protéines
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de cette catégorie peuvent avoir une activité endopeptidase (Zapun, et al., 2008, Pinho, et
al., 2013). La plupart des PLPs du pneumocoque ont des fonctions redondantes ce qui a
rendu difficile d'assigner une fonction spécifique à chaque PLP (Zapun, et al., 2008). Chez S. pneumoniae, l’utilisation de nouveaux outils comme le marquage avec la vancomycine fluorescente a démontré que la synthèse du PG survient au milieu de la cellule, nommé site de division, entre les anneaux équatoriaux (Daniel & Errington, 2003, Ng, et al., 2004, Zapun, et al., 2008). D’autre part, chez les ovocoques, la synthèse du PG périphérique et du septum de séparation se produisent lors de la division cellulaire (Pinho,
et al., 2013). La synthèse du PG périphérique est catalysée par la protéine PLP2b qui se
produit près du site de la division, conduisant à l’insertion du PG entre ce site et les futurs sites de division, anneaux équatoriaux, et provoquant une légère élongation longitudinale (Pinho, et al., 2013). De même, les protéines PLP1a et PLP2x catalysent la synthèse du septum de séparation qui conduit à la formation du septum perpendiculairement à l’axe longitudinal (Pinho, et al., 2013). Les gènes PLP2x et PLP2b sont essentiels pour S.
pneumoniae et font partie du groupe de gènes dcw (division and cell wall) qui est un
complexe multienzymatique codant pour des protéines impliquées dans la biosynthèse de la paroi cellulaire et la division cellulaire (Massidda, et al., 1998).
D’autres PLPs, comme PLP1b, PLP2a et PLP3, sont également impliquées dans l’insertion et la synthèse du néo-PG, cependant leurs rôles exacts restent inconnus (Pinho, et al., 2013). De même, le mode de recrutement des PLPs sur le site de la division n’est pas clair. Cependant, uniquement l’implication de la reconnaissance du substrat dans la localisation des PLPs de HMM a été observée (Pinho, et al., 2013). De plus, la protéine PLP3 est répartie uniformément dans les deux hémisphères du pneumocoque et semble être absente au futur site de division pendant les étapes initiales de la division pour permettre d’enrichir cette zone en substrats des PLPs. Une fois la croissance et la division en cours, PLP3 semble être plus concentrée au niveau du site de division cellulaire pour réguler le degré de réticulation du PG mature en inhibant toute réaction de trans-peptidation (Morlot, et al., 2004) (Figure 1.3).
La division cellulaire nécessite une identification précise du site de division et de placement de la machinerie de la division. La protéine FtsZ, en référence à la filamentation
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thermosensible, est une protéine responsable de l’organisation du complexe de septation du PG et aussi la première protéine recrutée dans la formation du futur site de division, où elle polymérise pour former un anneau cytoplasmique (Pinho, et al., 2013, Fleurie, et al., 2014). Son positionnement est guidé par la protéine MapZ (Fleurie, et al., 2014). Également, MreB est une protéine essentielle pour la bactérie et homologue à la protéine d'actine intervenant dans l’organisation des protéines de la synthèse du PG ainsi que dans la voie de biosynthèse du PG, induisant ainsi un allongement préseptal chez les bacilles (Typas, et al., 2012).
Figure 1.3 Représentation schématique de la synthèse de la paroi cellulaire (PG septal et PG périphérique) chez les ovocoques (ex. S. pneumoniae). Figure tirée et adaptée de
Pinho et al. (2013).
Toutefois, l’absence de la protéine MreB chez la plupart des ovocoques remet en question les mécanismes qui orchestrent la synthèse périphérique. Il est suggéré que FtsZ coordonne
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et organise non seulement la synthèse du peptidoglycane septal, mais aussi la synthèse du peptidoglycane périphérique (Typas, et al., 2012). Certains chercheurs suggèrent aussi que chez les ovocoques, la protéine FtsZ agit comme un échafaudage topologique pour les PLPs impliquées à la fois dans la synthèse du PG septal et du PG périphérique (Pinho, et al., 2013). D’autres travaux ont montré que la protéine StkP, du type sérine-thréonine kinase, a un rôle clé dans la coordination et le contrôle de la synthèse du PG septale et périphérique de la paroi cellulaire et cette protéine pourrait fonctionnellement remplacer la protéine MreB (Beilharz, et al., 2012). L'analyse génomique de l’organisation des gènes du dcw chez S. pneumoniae a permis l'identification d'une région en aval des gènes FtsA et FtsZ, regroupant des gènes encore non caractérisés et des gènes codant pour des homologues de
YlmG, YlmF/SepF et DivIVA qui sont généralement impliqués dans la ségrégation des
chromosomes, la morphologie cellulaire et/ou la division cellulaire chez diverses espèces (Fadda, et al., 2007, Massidda, et al., 2013).
La séparation des cellules filles lors de la division de cellules bactériennes nécessite le clivage du PG septal. Chez les bactéries, plusieurs hydrolases du PG sont impliquées dans ce processus (Typas, et al., 2012). Les hydrolases ne sont pas essentielles pour la survie de la bactérie, mais importantes pour maintenir la morphologie de la cellule (Sun, et al., 2000). Chez S. pneumoniae, de nombreuses hydrolases ont été mises en évidence, mais le mécanisme moléculaire sous-jacent de ce processus fondamental reste encore mal compris (Bartual, et al., 2014). Chez le pneumocoque, les hydrolases LytA, LytB, LytC, PcsB et CbpD sont responsables du clivage du PG septal pour séparer les cellules (Bartual, et al., 2014). PcsB semble responsable de l’hydrolyse de la partie peptidique du peptidoglycane. D’ailleurs PcsB est essentiel pour la viabilité de S. pneumoniae et est considéré comme un des principaux candidats pour une nouvelle génération de vaccins contre le pneumocoque (Bartual, et al., 2014). Pmp23 catalyse l’hydrolyse des chaines glycanes et pourrait initier la synthèse septale en permettant le recrutement des PLPs (Barendt, et al., 2011). Les deux protéines Pmp23 et DacA semblent affecter la division cellulaire du pneumocoque et la forme des cellules (Barendt, et al., 2011).
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Au cours des dernières années, des progrès considérables ont été réalisés, mais on est encore loin de la compréhension globale du mécanisme de synthèse du peptidoglycane et de son contrôle malgré que les coques soient la forme bactérienne la plus simple. De plus, le rôle exact de la plupart des acteurs fonctionnels impliqués dans ce processus reste encore mal compris. Aussi, il n’est pas clair comment ils sont connectés entre eux pour avoir une telle concordance spatiale et temporale. Une meilleure compréhension de la croissance et de la division permettra sans doute d’avoir de nouvelles cibles thérapeutiques pour le développement de nouveaux antimicrobiens.
Physiopathologie des infections à S. pneumoniae
Données épidémiologiques
S. pneumoniae colonise de façon asymptomatique les muqueuses des voies respiratoires
supérieures de l’homme principalement au niveau du nasopharynx (Chao, et al., 2014). Ainsi, cette bactérie est reconnue comme étant à la fois commensale et pathogène opportuniste exclusivement chez l’humain. Jusqu’à nos jours, l’infection par S. pneumoniae représente encore un problème de santé publique majeur dans les pays développés et en voie de développement. Les infections par S. pneumoniae sont toujours l’une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde, chez les enfants et les adultes avec une prédominance aux âges extrêmes. Le pneumocoque fait partie de la flore normale des voies nasales ou du pharynx de plus d'un tiers de la population et se transmet de personne à personne via les aérosols ou par le contact direct (Bedos, et al., 1999). Chez les enfants, S. pneumoniae colonise le nasopharynx au cours des premières années de la vie (Syrjänen, et al., 2001). En effet, le taux de colonisation augmente de la naissance jusqu’à ce qu’il culmine vers l’âge de deux à trois ans et puis il baisse avec l’âge (Donkor, 2013). Cependant, le taux de colonisation de S. pneumoniae est très élevé chez les enfants en comparaison avec les adultes, entre 20 à 50 % chez les enfants avec un maximum de colonisation vers l’âge de deux à trois ans et de 5 à 20% chez les adultes (Chao, et al., 2014). Le taux est encore plus élevé dans les pays en développement où presque 90% des
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enfants et plus de la moitié des adules sont porteurs de la bactérie, et il est favorisé par le froid avec un niveau élevé durant la période de janvier à mars (Donkor, 2013, Chao, et al., 2014) (Figure 1.4).
Le pneumocoque est responsable de nombreuses infections telles que la pneumonie, la méningite, l’otite moyenne et la sinusite. Chaque année, environ un million de nouveaux cas d’infection par S. pneumoniae sont enregistrés partout dans le monde (Donkor, 2013). Chez les enfants, l’infection par le pneumocoque est considérée comme la deuxième cause de méningite bactérienne et d’otite moyenne après l’infection par Haemophilus influenzae (AlonsoDeVelasco, et al., 1995). Selon les données de l’Organisation mondiale de la Santé pour l’année 2015, la pneumonie est la cause du décès de 15% d’enfants de moins de 5 ans représentant ainsi 922 000 décès; dont environ 476 000 décès causés par la pneumonie due à S. pneumoniae (http://www.who.int/en). Chez les adultes, les données épidémiologiques ont montré que l’infection par S. pneumoniae est la deuxième cause de méningite bactérienne derrière Neisseria meningitidis et aussi la cause principale de la pneumonie communautaire acquise (CAP) avec 2 858 000 cas de pneumonie graves en 2011 (AlonsoDeVelasco, et al., 1995, Walker, et al., 2013).
Au Canada, le taux d’incidence générale des infections invasives à pneumocoque est plus élevé en hiver mais aussi au printemps, ce taux est d’environ 9,7 cas pour 100 000 habitants durant la période de 2008 à 2012, affectant principalement les jeunes enfants âgés de moins de cinq ans et les personnes âgées de 65 ans et plus (Agence de la santé publique du Canada, 2012). En 2014, ce taux a diminué à 8,9 cas par 100 000 habitants avec 16,9 cas pour 100 000 chez les nourrissons d’un an et moins, 11,0 cas pour 100 000 chez les enfants de 1 à 4 ans et 21,5 cas pour 100 000 chez les personnes âgées de 60 ans et plus (Agence de la santé publique du Canada, 2014).
Les enfants et les personnes âgées sont principalement affectés par des infections pneumococciques sévères, mais d’autres personnes sont aussi des cibles vulnérables. En outre, plusieurs facteurs influencent significativement le risque de contracter des infections à S. pneumoniae; comme l’alcoolisme, l’exposition à la fumée de cigarette, la drépanocytose, le diabète, l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine, une maladie rénale ou cardiaque, une maladie hépatique y compris la cirrhose du foie, une
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maladie pulmonaire (l’asthme, l’emphysème et la bronchite chronique) et aussi en cas d’un cancer ou une immunosuppression due à la maladie ou l'usage de médicaments comme les cortistéroïdes (Talbot, et al., 2005).
En raison du rôle clé de la colonisation du nasopharynx dans les maladies à pneumocoques et la propagation du pneumocoque au site d’infection, il est important de comprendre les différents éléments de cette colonisation et d’élucider les facteurs qui favorisent le passage d’un agent commensal à un agent pathogène capable d’induire des maladies sévères.
Mécanismes de la colonisation de l’hôte
La composition de la microflore du nasopharynx peut soutenir ou entraver la colonisation et l'invasion par symbiose ou par compétition de plusieurs espèces. On estime qu’environ 700 espèces diverses qui partagent cette niche écologique; comme Haemophilus influenzae,
Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis et plusieurs espèces du
genre Streptococcus, tel que S. mutans, S. gordonii, S. pyogenes, S. salivarius, S. pneumoniae,
S. oralis et S. mitis (Donkor, 2013, Adegbola, et al., 2014). S. pneumoniae colonise les surfaces
muqueuses du rhinopharynx et des voies respiratoires supérieures de l’homme et est un constituant normal de cette niche écologique dont la colonisation est asymptomatique. Cette spécificité d’hôte strict n’est pas encore claire, mais de nombreux facteurs bactériens et interactions hôte-pathogène assurent cette colonisation et jouent un rôle dans le développement des pathologies invasives et non invasives. Le mécanisme sous-jacent d’adhésion aux cellules de l'épithélium du nasopharynx ou d'autres cellules eucaryotes implique des interactions de type bactérie-bactérie et bactérie-hôte.
L'adhésion aux cellules épithéliales peut-être facilitée par des pili, qui sont attachés à la paroi de la cellule bactérienne et ils sont généralement codés par un ensemble de gènes groupés en îlots de pathogénicité (Zahner, et al., 2011). La découverte des ilots de pathogénicité dans le génome de S. pneumoniae (Brown, et al., 2001) a permis par la suite la découverte de gènes indispensables pour la synthèse des pili. Ces gènes sont contenus dans deux types d’ilots de pili différents, ilot PI-1 et ilot PI-2 (Barocchi, et al., 2006, Bagnoli, et al., 2008). PI-1 comprend sept gènes dont trois gènes (SrtC-1, SrtC-2 et SrtC-3) codent pour des sortases, plus trois gènes
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qui codent pour des protéines structurales (RrgA, RrgB et RrgC) et un régulateur positif rlrA (Barocchi, et al., 2006). PI-2 code pour un deuxième pilus fonctionnel composé de deux gènes codant pour des protéines structurales pitA, pitB et les deux gènes srtG1 et srtG2 codant pour des sortases (Bagnoli, et al., 2008). L’analyse globale d’une collection d’isolats de S.
pneumoniae a montré que PI-1 est présent dans 30% des souches notamment chez S. pneumoniae TIGR4, souche encapsulée et pathogène, et dans 50% des souches résistantes aux
antibiotiques, alors que PI-2 est présent dans environ 16% des souches mais il est absent chez la souche S. pneumoniae TIGR4 (Bagnoli, et al., 2008). La présence de pili améliore la capacité des pneumocoques à adhérer aux cellules épithéliales et elle pourrait induire une exacerbation de la virulence comme rapportée dans le cas de pili de type PI-1 (Barocchi, et al., 2006).
S. pneumoniae produit plusieurs protéines de surface ayant probablement un rôle important
dans la colonisation, la dissémination et l’invasion de l’hôte. En revanche, on sait peu de choses sur les adhésines bactériennes qui peuvent se comporter comme des facteurs stimulant la colonisation et/ou la virulence (Figure 1.4). Le pneumocoque adhère à des cellules différentes chez l’hôte selon le stade d’infection, et ce par divers mécanismes d’adhésion qui restent encore mal compris. Cependant, l’adhésion au nasopharynx est l’un des mécanismes les mieux élucidés. L’attachement du pneumocoque aux cellules épithéliales est médié par des récepteurs disaccharidiques retrouvés sur la fibronectine, qui est la matrice extracellulaire présente sur les cellules épithéliales pharyngées (Berry, et al., 1999). La colonisation asymptomatique nécessite l’adhésion du pneumocoque à la muqueuse épithéliale des voies respiratoires par des protéines de surface bactérienne comme les adhésines PsaA et CbpA ou par des enzymes de clivages comme les neuraminidases (Bogaert, et al., 2004). L’adhésine de surface PsaA est une lipoprotéine qui assure l’adhérence du pneumocoque aux cellules du nasopharynx par le biais d’une interaction avec la E-cadhérine et intervient aussi dans le transport du manganèse et du zinc (Hammerschmidt, 2006). Une fonction directe dans l’adhésion du pneumocoque est attribuée à l’adhésine majeure multifonctionnelle CbpA (aussi appelée PspC) dont le récepteur est un polymère d’immunoglobuline (plgR) et les acides sialiques, ce qui accroît la migration de la bactérie à travers la barrière muqueuse (Hammerschmidt, 2006).
L’acide sialique est un des hydrates de carbone importants pour le pneumocoque en raison de son rôle comme source de carbone et d'énergie (Gualdi, et al., 2012). Chez l’homme, cet acide sialique est l’acide N-acétylneuraminique utilisé par le pneumocoque comme récepteur pour l’adhésion nasopharyngée (Gualdi, et al., 2012). L’exposition de ces récepteurs nécessite
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l’intervention des neuraminidases du pneumocoque pour cliver l’acide sialique. Cette bactérie a deux neuraminidases communes à tous les pneumocoques, NanA et NanB, permettant de révéler les récepteurs de surface pour l’adhésion (Fillon, et al., 2006). Ces deux enzymes possèdent des propriétés physicochimiques différentes permettant au pneumocoque de persister à des pH différents (Berry, et al., 1996). Ces enzymes participent aussi lors de l’invasion de l’hôte en raison de la présence de l’acide sialique à plusieurs endroits dont les muqueuses et fluides du corps comme les poumons et surtout le cerveau qui présente la plus grande concentration d’acide sialique dans le corps humain (Uchiyama, et al., 2009). L’acide sialique se caractérise aussi par sa capacité d’agir comme un signal moléculaire dans le cas d’infection invasive à S. pneumoniae, entrainant une augmentation de transport et la translocation du pneumocoque dans les poumons (Gualdi, et al., 2012).
Éventuellement, des facteurs de l'hôte sont aussi des éléments clés qui interviennent dans l'interaction des bactéries avec les cellules humaines en facilitant et en augmentant l'adhésion aux cellules (Mushtaq, et al., 2011). Ainsi, il a été démontré que le récepteur du facteur d'activation plaquettaire (PAF) est un ligand permettant l'adhésion des pneumocoques aux cellules endothéliales vasculaires et épithéliales pulmonaires humaines (Iovino, et al., 2013). PAF est aussi un puissant médiateur pro-inflammatoire ayant un rôle important en immunité innée (Iovino, et al., 2013). Un récepteur PAF reconnait des motifs moléculaires associés à des pathogènes et procure un système de reconnaissance inné à la phosphocholine exprimée à surface du pneumocoque et des pathogènes respiratoires bactériens à Gram-positif (Fillon, et
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Figure 1.4 Interaction entre S. pneumoniae et les cellules épithéliales.
Figure tirée et adaptée de Bogaert et al. 2004.
Malgré que la paroi bactérienne est pro-inflammatoire dans certaines circonstances, la liaison du récepteur PAF à la paroi bactérienne est silencieuse et n’induit pas de réponse des cellules endothéliales et des neurones (Fillon, et al., 2006).
L’attachement de la bactérie aux cellules épithéliales de l’hôte nécessite un rapprochement et un contact physique dont les mécanismes sont encore peu connus. L’adhésion du pneumocoque aux cellules épithéliales pulmonaires est augmentée en présence de l’immunoglobuline A1 (IgA1) (Bogaert, et al., 2004). Le pneumocoque synthétise une protéase IgA1 qui clive les IgA1 sécrétoires ce qui se traduit par une variation de la charge de la surface de la bactérie et un grand rapprochement physique de la protéine de liaison à la choline (CbpA) du pneumocoque et le récepteur PAF (Weiser, et al., 2003, Bogaert, et
al., 2004). De même, le clivage des IgA1 permet à la bactérie de persister et d’échapper à
l'opsonisation par le complément et la phagocytose par les leucocytes.
Les interactions virus-bactérie ont un impact important sur l’évolution des infections. En effet, les co-infections des voies respiratoires par les virus respiratoires permettent de promouvoir l’adhérence, la croissance et la virulence des bactéries par divers mécanismes
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(Brealey, et al., 2015). Par exemple, l’infection par le virus de la grippe augmente la surface d’adhésion du pneumocoque aux cellules épithéliales en exposant plus de récepteurs pour le pneumocoque, grâce à l’action de la neuraminidase virale (Plotkowski, et
al., 1986). De même, le virus respiratoire syncitial agit comme médiateur qui facilite
l’adhésion entre le pneumocoque et les cellules épithéliales par un pont liant la glycoprotéine G du virus et la protéine PLP1a de S. pneumoniae (Smith, et al., 2014).
Processus d’infection et infections associées
La propagation du pneumocoque à partir du nasopharynx peut conduire à des infections locales telles que la sinusite ou l'otite moyenne. L'aspiration du pneumocoque peut entraîner une propagation directe dans les poumons, entraînant la pneumonie. La forme la plus commune des pneumonies bactériennes est celle de la pneumonie à S. pneumoniae qui représente la cause majeure de la pneumonie acquise en communauté (PAC). Il existe deux types de pneumonie; bronchique et lobaire selon la zone du poumon atteinte (Donkor, 2013). Au début de l’infection, S. pneumoniae se loge au niveau des alvéoles pulmonaires et sa multiplication à ce site induit une réaction inflammatoire qui se traduit par un remplissage de pus et mucus empêchant le fonctionnement normal des alvéoles, soit la distribution efficace de l’oxygène dans le sang (Kadioglu, et al., 2008, Donkor, 2013). L’emphysème pleural est une complication qui survient chez 5% des cas atteints de PAC (Fernandez-Cotarelo, et al., 2007). Le pneumocoque peut également se propager via le sang pour atteindre le cerveau, provoquant la méningite à pneumocoques qui est responsable d’un taux de mortalité très élevé d’environ 20% à 50% (Bogaert, et al., 2004). La méningite est généralement causée par des bactéries qui passent de la circulation sanguine au cerveau et ce à travers la barrière hémato-encéphalique (Mook-Kanamori, et al., 2011). La translocation du pneumocoque à travers cette barrière est facilitée par l’enzyme NanA qui favorise l’invasion des cellules endothéliales du cerveau. La pneumolysine et la protéine CbpA sont aussi importantes pour le développement de la méningite (Iovino, et al., 2016). La péritonite, l'arthrite et l'ostéomyélite sont des manifestations rares de la maladie à pneumocoque (Donkor, 2013). Chez les personnes âgées, la PAC est souvent accompagnée d’un risque de myocardite qui est une inflammation du cœur (Brown, et al., 2014). Dans ce
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cas, le pneumocoque atteint le myocarde et forme des microlésions qui perturbent la fonction cardiaque induisant ainsi une insuffisance et une arythmie cardiaque (Brown, et
al., 2014).
Facteurs de virulence
La connaissance des facteurs de virulence et de leur mode d’action représente une voie prometteuse dans la compréhension, la prévention et l’élaboration de traitements efficaces des infections à S. pneumoniae. Pendant plusieurs années, le pouvoir pathogène du pneumocoque a été attribué en grande partie à la capsule polysaccharidique qui s'oppose à la phagocytose et à un petit nombre de facteurs de virulence. Avec l’avancement des recherches et le séquençage du génome de S. pneumoniae R6 et TIGR4 en 2001, de nombreux autres facteurs de virulence ont été mis en évidence et la liste est probablement loin d’être terminée (Hoskins, et al., 2001, Tettelin, et al., 2001). En outre, environ 387 gènes sont impliqués dans la virulence du pneumocoque et exprimés de façon coordonnée pour contribuer à la colonisation, l’échappement à la phagocytose, l'invasion et la destruction des tissus de l’hôte (Hava & Camilli, 2002). Les facteurs de virulence du pneumocoque peuvent être classés en trois groupes: capsule, toxines, et protéines de surface (Figure 1.5). Dans cette section, seulement les principaux facteurs de chaque groupe seront détaillés.
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Figure 1.5 Principaux facteurs de virulence de S. pneumoniae.
Figure tirée et adaptée de van der Poll et al. 2009.
Capsule polysaccharidique
La capsule de nature polysaccharidique est probablement le facteur de virulence le plus important du pneumocoque. Elle forme une couche protectrice antiphagocytaire qui entoure et couvre diverses protéines de surface de S. pneumoniae. La capsule favorise l’échappement de la bactérie au système immunitaire et son expression réduit le piégeage par le mucus favorisant ainsi l’accès aux surfaces des cellules épithéliales (Kadioglu, et al., 2008). Cependant, la capsule induit une réaction immunogène qui reste gravée dans la mémoire de l’hôte et le protège contre toute attaque future par un pneumocoque portant le même antigène polysaccharidique capsulaire. Pour pallier cette reconnaissance immune, le locus codant pour la capsule du S. pneumoniae a subi plusieurs variations et ce en intégrant
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un grand nombre de gènes codant pour diverses capsules par l’acquisition d'ADN étranger (Wen, et al., 2016). Actuellement, environ 97 sérotypes capsulaires contribuent à l’importance des infections par S. pneumoniae (Geno, et al., 2015). Cependant, seulement 20 à 30 sérotypes capsulaires du pneumocoque présentent un risque accru de maladies invasives (Geno, et al., 2015).
Une fois que le pneumocoque a atteint la surface de la cellule épithéliale, l'expression d'une capsule épaisse semble être désavantageuse pour la bactérie, en raison de son effet inhibiteur sur l'adhérence (Kadioglu, et al., 2008). En effet, le pneumocoque présente deux aspects de colonies : rugeuses (transparentes non-encapsulées ou faiblement encapsulées) et colonies lisses (opaques et encapsulées) qui sont en relation avec une variation de phase réversible entre les deux phénotypes sans changement de sérotype (Geno, et al., 2015). La variation de phase est une étape importante dans la virulence et aussi un processus adaptatif qui conduit à la propagation et la distribution des bactéries dans l’organisme de l’hôte, dont le mécanique est encore mal compris (Donkor, 2013). Ce mécanisme augmente jusqu'à six fois l'invasion du pneumocoque dans les cellules endothéliales du cerveau humain (Ring, et
al., 1998). Les variations de phase induisent des altérations dans les structures et les
composantes associés à la surface (Mitchell & Mitchell, 2010, Donkor, 2013). La présence de la capsule limite également l'autolyse et réduit l'exposition à plusieurs antibiotiques. Les pneumocoques peuvent aussi altérer leur sérotype par des recombinaisons affectant la synthèse de la capsule polysaccharidique. Les sérotypes du pneumocoque sont regroupés en 48 sérogroupes en fonction de l'hétérogénéité des structures et de la composition chimique des polysaccharides ainsi que sur la base des propriétés antigéniques de polysaccharides capsulaires (Croucher, et al., 2015). Cette variation antigénique permet au pneumocoque de basculer d’un sérotype à un autre au sein du même sérogroupe et échappe au système immunitaire de l’hôte (Croucher, et al., 2015). Le pneumocoque peut alors causer des infections ou induire à nouveau les mêmes maladies puisqu’il sera considéré par l’immunité comme un nouvel agent pathogène. De même, la bactérie sera en mesure d’échapper à l’immunité induite par la vaccination dirigée vers un sérotype différent.
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Pneumolysine
La pneumolysine est un facteur de virulence puissant produit par tous les sérotypes de pneumocoque. C’est une hémolysine de la famille des thiol-activables qui utilise le cholestérol présent dans les membranes cellulaires comme un récepteur pour son activité cytolytique (Barocchi, et al., 2007). La pneumolysine représente la protéine principale de la virulence de S. pneumoniae dont la libération entraîne une réaction inflammatoire intense via l’induction des lésions tissulaires et provoque des pathologies plus graves (Marriott, et
al., 2008). Cette cytotoxine est libérée sous l’action de l’autolysine majeure. La
pneumolysine est produite sous la forme d'une protéine soluble de 52 kDa, la liaison au cholestérol, des cellules de l’hôte, est suivie de la formation de pores membranaires par oligomérisation (Kadioglu, et al., 2008). Deux modèles sont proposés pour le développement des pores sous l’action de la pneumolysine. Dans le premier modèle, il est suggéré que les unités se réunissent dans la membrane de la cellule hôte pour former des complexes oligomériques et des pores matures. Dans le deuxième modèle, il est proposé que les sous-unités subissent un pré-assemblage après la liaison à la membrane de la cellule hôte, et forment un complexe pré-pore avant l'insertion dans la membrane (Marriott, et al., 2008). La formation des pores provoque la lyse des cellules ciblées. Au niveau des voies respiratoires, cette toxine favorise l’accès au poumon par la lyse des cellules hôtes, l’inhibition du rythme mucociliaire des cellules respiratoires, et la séparation des jonctions serrées des cellules épithéliales (Henriques-Normark & Tuomanen, 2013). La pneumolysine active la voie classique du complément et peut induire une réponse inflammatoire ou des phénomènes d’apoptose chez les cellules hôtes (Henriques-Normark & Tuomanen, 2013). De plus, la libération de la pneumolysine au niveau du sang favorise l’accès au système nerveux central, en dégradant les tissus conjonctifs, et le passage de la barrière hémato-encéphalique provoquant ainsi la méningite pneumococcique et des dommages cérébraux importants (Mitchell & Mitchell, 2010).
Protéines de surface
Le pneumocoque possède une panoplie de protéines de surface dont beaucoup jouent un rôle dans la pathogénicité et la virulence. Ces protéines peuvent être divisées en trois groupes: les lipoprotéines, les protéines à motif LPxTG et les protéines liant la choline.
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Toutes ces protéines peuvent être exportées à travers la membrane plasmique grâce à un peptide signal (Mitchell, 2003). Toutefois, peu est connu sur le mode de production (le terme expression est réservé aux gènes) de ses protéines, le tropisme tissulaire, l'invasion et l’évolution de la maladie.
1- Lipoprotéines
La famille des lipoprotéines pneumocociques regroupe entre 42 à 47 lipoprotéines qui font partie des transporteurs de type ABC impliquées dans le transport des métaux (Kadioglu, et
al., 2008). La protéine PsaA est une importante lipoprotéine présente chez tous les
pneumocoques. Outre son rôle dans l’adhésion et la colonisation, comme mentionné précédemment, elle joue un rôle clé dans la virulence et le transport du manganèse (Bogaert, et al., 2004). Cette protéine présente un site potentiel de liaison divalent aux ions métalliques comme des ions zinc ou manganèse (Kadioglu, et al., 2008). L’importance de cette protéine dans la persistance du pneumocoque est en relation directe avec le manganèse qui joue le rôle de cofacteur pour plusieurs protéines de la virulence et dans la croissance bactérienne (Dintilhac, et al., 1997). De plus, le manganèse est impliqué dans la résistance au stress oxydatif qui peut résulter de la production de peroxyde d'hydrogène, au cours du métabolisme pneumococcique, ainsi que la production d'espèces réactives d'oxygène, lors de la réponse immunitaire innée de l'hôte (Kadioglu, et al., 2008). Plusieurs travaux ont élucidé le rôle de PsaA dans l’adhésion mais sans confirmer s’il s’agit d’une action directe ou indirecte en modulant l’expression d'autres adhésines via la concentration de manganèse (Mitchell, 2003).
2- Protéines à motif LPxTG
Les protéines à motif LPxTG sont ancrées au peptidoglycane par une transpeptidase qui reconnaît la séquence d'acides aminés LPxTG. Comme plusieurs bactéries à Gram-positif, le pneumocoque utilise une sortase pour ce processus d'ancrage. Les sortases assurent l’assemblage et la fixation des pili au peptidoglycane, cependant c’est la sortase A qui catalyse l’ancrage des protéines à motif LPXTG et n’assure aucun rôle dans la synthèse des pili (Kadioglu, et al., 2008). Cette sortase influence la colonisation et la virulence du pneumocoque grâce son importance pour plusieurs protéines de surface (Paterson & Mitchell, 2006).
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L’analyse du génome de S. pneumoniae a montré la présence de 19 et 13 gènes codant pour des protéines à motif LPXTG chez les souches TIGR4 et R6, respectivement (Hoskins, et
al., 2001, Tettelin, et al., 2001). Les principales protéines de ce groupe sont les enzymes
neuraminidase et hyaluronidase. Le rôle des neuraminidases NanA et NanB dans la colonisation et l’invasion de l’hôte est déjà mentionné dans cette revue de la littérature. La hyaluronidase est présente dans la majorité des isolats cliniques de S. pneumoniae et son rôle est l’hydrolyse de l’acide hyaluronique, un composant important des tissus conjonctifs et de la matrice extracellulaire des mammifères (Duran-Reynals, 1933). Cette action permet la migration du pneumocoque du site de la colonisation vers le système sanguin et facilite ainsi la dissémination et l’invasion de l’hôte. (Mitchell, 2003). Le génome du pneumocoque code aussi pour quatre métalloprotéases à motif LPXTG, protéases IgA1, ZmpB, ZmpC et ZmpD qui contribuent à la virulence de cette bactérie (Bergmann & Hammerschmidt, 2006).
3- Protéines liant la choline
La famille des protéines liant la choline (CBPs) reconnaît la phosphorylcholine des acides lipoteichoiques et téichoiques. La phosphorylcholine ancre les CBPs à la paroi cellulaire (Bergmann & Hammerschmidt, 2006). La famille des CBPs comprend 13 à 16 protéines favorisant la virulence du pneumocoque (Bergmann & Hammerschmidt, 2006). Les CBPs incluent quatre hydrolases connues pour leur rôle dans la lyse cellulaire et la virulence: l'autolysine majeure LytA, LytB, lysozyme LytC et une phosphorylcholine estérase (Bergmann & Hammerschmidt, 2006). L’activation de LytA est induite par certaines conditions comme le stress et le traitement à la pénicilline (Mitchell, 2000). La contribution de LytA à la virulence est liée à l’hydrolyse du peptidoglycane qui peut provoquer une inflammation et aussi à la lyse cellulaire qui libère plusieurs toxines comme la pneumolysine. La protéine de surface PspA, présente à la surface de tous les pneumocoques, est nécessaire pour le développement de la virulence (Mitchell, 2000). PspA interfère avec la fixation du facteur de complément C3 à la surface bactérienne et inhibe ainsi l'activation du complément par S. pneumoniae (Bogaert, et al., 2004, Kadioglu,
et al., 2008). De plus, PspA est une protéine de liaison à la lactoferrine. Cette activité
