Utilisation d'axicons pour la microscopie à deux photons

PASCAL DUFOUR

UTILISATION D’AXICONS POUR LA MICROSCOPIE À DEUX

PHOTONS

Thèse présentée

à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l’Université Laval

dans le cadre du programme de doctorat en physique

pour l’obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)

Département de physique, de génie physique et d’optique

Faculté des sciences et de génie

Université Laval

Québec

2012

RÉSUMÉ COURT

L’étude des interactions entre les cellules nerveuses d’un tissu vivant requiert l’imagerie de plusieurs cellules simultanément. La microscopie confocale conventionnelle ayant le problème d’être limitée au plan focal de la lentille utilisée, cela nous permet de détecter seulement les cellules situées dans une petite épaisseur; plusieurs plans doivent alors être balayés pour obtenir une image complète. Idéalement, pour imager simultanément plusieurs cellules dans un tissu épais, la profondeur de champ doit être augmentée significativement. A cette fin, on propose un système de microscopie laser qui incorpore un axicon, lequel a la propriété de focaliser la lumière en un faisceau quasi-Bessel. Le contrôle du profil du faisceau incident sur l’axicon procure une ligne focale sur l’axe longitudinal ayant une intensité constante dans le milieu absorbant ainsi qu’une grande résolution transverse. Conséquemment, nous devons balayer notre échantillon en deux dimensions seulement pour obtenir une image complète de tout le volume, réduisant ainsi considérablement le temps d’acquisition.

RÉSUMÉ

Un des enjeux majeurs de la biochimie et de la biologie cellulaire actuelle est de pouvoir suivre de manière dynamique les événements moléculaires à l’intérieur de la cellule vivante dans son contexte fonctionnel, c'est-à-dire in situ (dans son tissu d’origine). Il ne suffit plus, par exemple, d’identifier une réaction biochimique in vitro pour pouvoir savoir si un enzyme ou un autre rencontrera son substrat à l’intérieur de la cellule. Il apparaît de plus en plus évident que des facteurs spatio-temporels très fins à l’intérieur de la cellule vivante déterminent en grande partie la spécificité des signaux cellulaires. Il suffit de penser aux fluctuations calciques intracellulaires, par exemple, qui participent à une multitude de cascades de signalisation; sans spécificité spatiale et temporelle, la cellule ne pourrait utiliser les signaux calciques de manière utile et efficace.

A cette fin, on propose un système de microscopie laser qui incorpore un axicon, lequel a la propriété de focaliser la lumière en un faisceau quasi-Bessel. Le contrôle du profil du faisceau incident sur l’axicon procure une ligne focale sur l’axe longitudinal ayant une intensité constante dans le milieu absorbant ainsi qu’une grande résolution transverse. Conséquemment, nous devons balayer notre échantillon en deux dimensions seulement pour obtenir une image complète de tout le volume, réduisant ainsi considérablement le temps d’acquisition. Nous présenterons les résultats théoriques de la génération d’un faisceau quasi-Bessel dans un échantillon absorbant, les caractéristiques du laser Ti:saphir utilisé ainsi que le schéma proposé pour la microscopie laser avec un axicon. Nous verrons qu’il est possible d’imager des échantillons fluorescents allant jusqu’à 1 mm d’épaisseur avec un seul balayage.

Dans cette thèse, nous passerons en revue quelques principes qui sont à la base des avantages de la microscopie par excitation à deux photons afin de mettre en relief certains des défis (résolution spatiale, résolution temporelle, sensibilité, profondeur de pénétration dans le tissu et phototoxicité) pour améliorer l’utilisation de cette approche pour l’imagerie cellulaire fonctionnelle. Les propriétés des faisceaux de Bessel formés par l’axicon seront étudiées en profondeur. Nous décrirons ensuite notre microscope à deux photons avec un axicon et nous présenterons plusieurs résultats obtenus avec ce dernier.

REMERCIEMENTS

J’aimerais particulièrement remercier Nathalie McCarthy, ma directrice de recherche, qui a toujours été disponible pour répondre à mes questions et pour me guider dans mes recherches. Je la remercie pour toute l’expérience qu’elle m’a permis d’acquérir tout au long de mes études. Merci pour tout le temps qui m’a été consacré.

Je remercie aussi Yves DeKoninck, mon co-directeur de recherche, qui a aussi toujours été disponible. Je le remercie pour toutes ces bonnes idées et l’intérêt qu’il a toujours eu pour le projet.

Je ne voudrais pas oublier ma conjointe Suzie, mes trois enfants (Anabelle, Félix-Olivier et Marianne), mes amis d’étude ainsi que mes amis d’enfance avec lesquels j’ai passé de bon moment et qui m’ont permis de passer à travers mes études.

Enfin je remercie ma famille, en particulier mes parents, qui m’ont soutenu tout au long de mes études et qui m’ont toujours encouragé à continuer.

Bonne lecture!

LISTE DES SYMBOLES ET ABRÉVIATIONS

Symboles romains

a Rayon de l’axicon

c Vitesse de la lumière dans le vide

d Diamètre d’un obstacle devant l’axicon

d

Épaisseur maximale de l’axicon

D Diamètre de l’axicon

L Profondeur de champ de l’axicon

n indice de réfraction

NA Ouverture numérique

P

Puissance du laser argon

P

Puissance du laser Ti:saphir

w

Taille à 1/e d’un faisceau gaussien

w

Taille du faisceau gaussien dans le plan focal

z

Position du maximum d’intensité sur l’axe z

Symboles grecs

 Angle de l’axicon

 Angle entre l’axe z et un rayon dévié par l’axicon

 Phase de l’exponentielle dans l’intégrale de Fresnel-Kirchhoff

 Angle de rotation de l’axicon

 Angle pour lequel les photons arrivent à la limite de la PMT

 Indice de réfraction moins 1 (n-1)

 Absorption dans les échantillons

 Longueur d’onde dans le vide

 Angle par rapport à la normale à la sortie de l’axicon

 Axe radial dans le plan d’observation



Axe radial dans le plan de l’axicon

Abréviations

CARS Coherent Anti-Stokes Raman Scattering

CFP Cyan Fluorescent Protein

CCD Charge Coupled Device

CMOS Complementary Metal Oxide Semiconductor

FLIM Fluorecence Lifetime Imaging Microscopy

GFP Green Fluorescent Protein

GM Göpper-Mayer

IRM Imagerie à Résonance Magnétique

OCT Tomographie par cohérence optique (Optical Coherence Tomography)

OPU Onde Plane Uniforme

PMT Tube photomultiplicateur (PhotoMultiplicator Tube)

RESOLFT Reversible Saturable Optical Fluorescence Transition

SHG Génération de seconde harmonique (Second Harmonic Generation)

STED STimulated Emission Depletion

TABLE DES MATIÈRES

RÉSUMÉ COURT ... ii

REMERCIEMENTS ... iv

LISTE DES SYMBOLES ET ABRÉVIATIONS ... v

TABLE DES MATIÈRES ... vii

Chapitre 1 : Introduction ... 1

1.1 La microscopie conventionnelle ... 1

1.2 La microscopie laser ... 3

1.2.1 La microscopie confocale ... 3

1.2.2 Microscopie à deux photons ... 7

1.2.3 Résolution spatiale ... 9

1.2.4 Maximisation du signal de fluorescence / imagerie en profondeur (deux photons) ... 11

Puissance, focalisation et impulsions courtes ... 12

Taux de répétition du laser ... 12

Section efficace des fluorophores ... 13

Détection des photons de fluorescence ... 14

1.2.5 Résolution temporelle ... 14

1.3 Applications biologiques de la microscopie à deux photons ... 15

Étude physiologique de tissus ... 15

Diagnostic clinique et traitement ... 16

Imagerie cellulaire in vivo ... 16

Suivi de particule en 3D ... 17

Rétablissement de la fluorescence après photoblanchiment ... 17

1.4 Autres systèmes de microscopie ... 17

1.5 Présentation de cette thèse ... 19

1.5.1 Microscopie avec un axicon ... 19

Chapitre 2 : Principes fondamentaux ... 22

2.1 Théorie sur les objectifs conventionnels ... 22

2.1.1 Résolution radiale... 22

2.1.2 Résolution axiale (profondeur de champ) ... 25

2.1.3 Intensité maximale normalisée au point focal d’une lentille ... 26

2.1.4 Pourcentage de recollection d’un objectif ... 26

2.2 Théorie sur l’axicon... 27

2.2.1 Schéma ... 28

2.2.2 Optique des rayons ... 29

Intensité sur l’axe z constante dans un échantillon ... 31

2.2.3 Calcul du profil d’intensité ... 33

2.2.4 Calcul de la résolution radiale ... 37

2.2.5 Calcul de l’intensité sur l’axe z et de la résolution axiale (profondeur de champ) ... 37

2.2.6 Intensité maximale ... 41

2.2.7 Effet du déplacement du faisceau incident sur l’axicon ... 42

2.2.8 Effet de la variation de l’angle d’incidence ... 49

2.2.9 Combinaison des effets sur l’angle et le déplacement... 56

2.2.10Effet du rayon de courbure du faisceau gaussien incident sur l’axicon ... 60

2.2.11Effet de la polarisation sur la transmission ... 60

2.2.12Recollection de la fluorescence ... 62

2.2.13Comparaison avec d’autres méthodes de calculs ... 65

2.3 Comparaison entre l’objectif et l’axicon ... 66

2.3.1 Comparaison de la résolution ... 66

2.3.2 Comparaison de la profondeur de champ ... 66

2.3.3 Comparaison de l’intensité maximale ... 67

2.3.4 Tableau comparatif pour différentes lentilles ... 68

Chapitre 3 : Résultats expérimentaux: objectifs et axicons ... 69

3.1 Caractérisation expérimentale des objectifs ... 69

3.2 Caractérisation expérimentale des axicons ... 71

3.2.1 Schéma ... 71

3.2.2 Caractérisation d’axicons ... 73

3.2.3 Profil 2D d’intensité pour un déplacement transverse ... 85

3.2.4 Profil d’intensité expérimental pour une rotation de l’axicon ... 87

Chapitre 4 : Microscopie à deux photons ... 91

4.1 Résolution des axicons et objectifs ... 91

4.1.1 Caractérisation de la fluorescence dans une microsphère ... 92

4.2 Microscopie laser ... 96

4.2.1 Schéma ... 96

4.2.2 Système de déplacement de l’axicon ... 97

4.2.3 Système d’acquisition ... 100

4.2.4 Optimisation de paramètres ... 103

4.3 Image d’échantillon épais ... 105

4.3.1 Images de microsphères ... 105

4.3.2 Images d’échantillon épais de microsphères ... 106

4.4 Image d’échantillon biologique ... 108

Chapitre 5 : Conclusion... 110 5.1 Conclusion ... 110 5.1.1 Avantages ... 111 5.1.2 Limites ... 111 5.1.3 Perspectives ... 113 5.1.4 Synthèse ... 113

Annexe 1 : Faisceau gaussien ... 115

Annexe 2 : Champ électrique transmis par une lentille conventionnelle et un axicon ... 118

A2.1 Champ électrique après le passage à travers une lentille conventionnelle. ... 118

A2.1.1 Onde plane incidente ... 119

A2.1.2 Faisceau gaussien incident sur une lentille positionnée à l’étranglement. ... 121

A2.2

C

A2.2.1 Calcul à l’aide de l’intégrale de Fresnel-Kirchhoff ... 122

A2.2.2 Calcul numérique, technique de Herman... 125

Annexe 3 : Transmission d’un Axicon précédé d’un iris ... 127

Annexe 4 : Pourcentage de recollection de la fluorescence ... 130

A4.1 Calcul du pourcentage de recollection ... 130

Annexe 5 : Correction pour les axicons avec  grand ... 133

CHAPITRE 1

INTRODUCTION

La microscopie conventionnelle (champ large ou confocale) permet depuis plusieurs années d’observer les caractéristiques microscopiques des tissus biologiques. Les progrès en biologie et en médecine dépendent beaucoup de l’habilité à laquelle les systèmes d’imagerie permettent d’observer le monde à l’échelle des cellules et de leurs composantes encore plus petites. Puisque le but de cette thèse est d’observer des échantillons biologiques, nous limiterons la discussion à la microscopie optique, sans s’attarder, par exemple, à la microscopie électronique qui a une résolution supérieure mais qui cause beaucoup plus de dommages aux échantillons. La microscopie optique est basée sur la capacité des échantillons à absorber, réfléchir et émettre des photons.

Les nouveaux développements en photonique ont permis l’émergence d’une large variété de systèmes d’imagerie de caractéristiques et propriétés différentes. Les principaux défis actuels des systèmes d’imagerie sont la résolution spatiale, la résolution temporelle, la profondeur de pénétration dans le tissu, les dommages biologiques causés par le système, la facilité d’utilisation et le coût.

Dans les sections suivantes, nous ferons un historique de la microscopie conventionnelle, ensuite nous décrirons la microscopie laser et quelques techniques de microscopie spécialisées. Nous terminerons par une brève description du projet de cette thèse.

1.1

LA MICROSCOPIE CONVENTIONNELLE

Depuis plusieurs décennies, l’imagerie cellulaire se fait à l’aide de microscopes conventionnels. La technique de la microscopie à champ large est illustrée à la figure 1.1. L’encadré à gauche du schéma est l’une des configurations possibles pour illuminer

l’échantillon (Koehler illumination). La méthode de Koehler permet de filtrer les composantes avec une grande fréquence spatiale. Cela permet d’éclairer l’échantillon plus uniformément. La source d’éclairage utilisée est généralement une lampe au mercure ou une lampe au xénon puisqu’elles fournissent de larges spectres. L’image de l’échantillon est ensuite formée dans le plan image avec un objectif de microscope. La lame à retard de phase sert pour la microscopie à contraste de phase décrite dans le paragraphe suivant la figure. Dans le cas de la microscopie à champ large, on ignore tout simplement la lame à retard.

Figure 1.1 Représentation schématique de la microscopie à champ large.

La microscopie à champ large permet une résolution près de la limite de diffraction (/2) mais comporte aussi de grandes limitations. Premièrement, puisque la plupart des échantillons biologiques ont un très faible contraste et qu’ils sont transparents, l’image obtenue avec un microscope est souvent très pâle. Les faibles variations de phase (variation d’indice de réfraction) peuvent être amplifiées par la microscopie à contraste de phase [1]. Cette technique a révolutionné l’imagerie cellulaire et la microbiologie. D’ailleurs, un prix Nobel a été décerné à Zernike en 1953 pour le développement de cette technique qui consiste à séparer (par interférence) la lumière de l’ordre zéro par rapport à la lumière diffractée par l’échantillon. On retrouve dans le plan de la lame à retard de phase, la transformée de Fourier du plan de l’échantillon. Cette lame change la phase du champ dans une petite région correspondant à la grandeur de la source d’éclairage dans ce plan. Lorsque le retard de phase de la source d’éclairage est ajusté pour avoir une interférence destructive, l’objet de phase apparaît plus foncé que l’image de fond dans le plan de l’image; on parle alors de contraste de phase positif. Dans le cas contraire, on parle de contraste de phase négatif. La méthode « Differential Interference Contrast » (introduite par Normarski en 1969) peut aussi améliorer le contraste [2]. Cette méthode, qui requiert l’utilisation d’une source polarisée, convertit le gradient du chemin optique de l’échantillon en différence

Source Échantillon Iris Lame de retard de phase Plan de l’image

d’amplitude; ceci équivaut à un filtre passe-haut qui augmente la visibilité des bords et des lignes (les reliefs sont mis en évidence).

Une autre limitation de la microscopie à champ large (ou à contraste de phase), est que l’image contient l’image du plan focal de la lentille mais elle contient aussi l’information de la partie hors foyer qui apparaît flou et qui est superposée à l’image. Ceci limite la résolution du système et la qualité des images (normalement limitées par la diffraction de la lumière). Une façon indirecte de réduire ce phénomène est d’imager des tranches très minces d’échantillon placées directement au foyer de la lentille d’imagerie. Le sectionnement peut aussi se faire à l’aide de cultures planes de cellules, mais ceci ne correspond pas toujours à la réalité observée in vivo.

Traditionnellement, les images étaient observées avec l’oeil à travers un oculaire ou elles étaient enregistrées sur des plaques photographiques. Maintenant, la plupart des systèmes enregistrent les images numériquement avec une caméra CCD (Charge Coupled Device) ou avec des caméras CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor). Dans ce cas, en plus de l’ouverture numérique de l’objectif, la qualité de l’image dépend du nombre de pixels, de leur surface de détection, de leur efficacité quantique et du nombre de « bits » du système d’acquisition.

Puisque les microscopes à champ large souffrent de plusieurs lacunes, une nouvelle technique d’imagerie était nécessaire afin d’étudier les composantes et les interactions entre cellules vivantes. Cette nouvelle alternative est la microscopie laser à balayage [3].

1.2

LA MICROSCOPIE LASER

1.2.1 La microscopie confocale

La microscopie laser [4] est basée sur le principe d’absorption et d’émission des atomes présenté par Einstein en 1917 [5]. Afin d’exciter efficacement les molécules fluorescentes, on focalise un faisceau laser dans un tout petit volume. La fluorescence naturelle et induite des molécules sera discutée plus loin. Chacune des molécules fluorescentes présentes dans ce volume peut absorber un photon et réémettre par la suite un photon par fluorescence à une longueur d’onde légèrement plus longue. En microscopie confocale, on récolte la lumière réémise depuis le volume d’excitation à l’aide du même objectif (epi illumination) et on mesure la fluorescence émise à l’aide d’un sténopé confocal placé au foyer d’un deuxième

objectif devant le détecteur (voir figure 1.2). Le sténopé, qui est en fait la différence principale avec la microscopie à champ large, empêche la détection de la fluorescence qui ne provient pas du plan focal. Le volume d’excitation doit être éclairé un certain temps afin qu’on puisse récolter assez de fluorescence pour avoir une image claire. Ce temps est appelé « pixel dwell time ». On peut ensuite reconstituer l’image d’un plan xy de l’échantillon en déplaçant le volume d’excitation (point focal de l’objectif) dans le plan transverse sur l’échantillon [6]. Des images en trois dimensions peuvent être prises en imageant plusieurs plans à des profondeurs différentes. Contrairement à la microscopie conventionnelle, on peut donc imager une mince tranche d’échantillon en profondeur dans un échantillon épais sans avoir des images trop bruyantes. En fait, l’épaisseur de la couche imagée dépend directement du diamètre du sténopé ainsi que de l’ouverture numérique de l’objectif. Comme le sténopé limite l’intensité du signal atteignant le détecteur, un compromis doit être fait sur la taille de l’ouverture de ce dernier afin d’obtenir une image bien définie avec assez de signal. Malgré ces avantages, les images demeurent plus bruyante que lorsqu’on utilise un échantillon mince avec microscopie à champ large puisque certains photons indésirables ayant été diffusés ou émis sur l’axe optique sont aussi détectés.

Figure 1.2 Représentation schématique de la microscopie confocale.

Faisceau laser Filtre Échantillon Plan focal Objectif Miroir dichroïque Détecteur Sténopé x z Objectif 2

Il y a plusieurs façons de déplacer le volume d’excitation dans le plan focal de l’échantillon. Il est possible de déplacer l’objectif ou l’échantillon lui-même, mais la façon la plus rapide est de balayer l’angle du front d’onde du faisceau laser sur la lentille pour ainsi déplacer le point focal de la même façon. Avec cette configuration, il est possible d’obtenir une image 2D de 512x512 point en 1/30 de seconde [7]. On doit par contre noter que pour une configuration identique, la vitesse de balayage diminue la quantité de lumière détectée pour chaque point, ce qui diminue la qualité des images. Il y a donc encore une fois un compromis à faire entre la vitesse d’acquisition et la qualité des images. D’autres méthodes plus complexes, comme le disque rotatif de Nipkow [8], permettent de balayer l’échantillon rapidement. Ce disque (voir figure 1.3) a des trous disposés en spirale sur la surface circulaire [9]. Lorsque le disque tourne, chaque point fait un balayage presque linéaire sur l’échantillon qui doit être beaucoup plus petit que le disque. Après une rotation de 360, on obtient une image 2D complète. Le principal désavantage de cette technique est qu’elle occasionne une énorme perte en puissance.

Figure 1.3 Représentation schématique d’un disque de Nipkow.

Pour détecter la lumière émise, on utilise généralement des tubes photomultiplicateurs (PMT) ou des photodiodes à avalanche. Les photodiodes rapides conventionnelles sont moins utilisées puisque la surface de détection est beaucoup plus petite. L’utilisation d’un PMT (ou d’un autre détecteur très sensible) est requise puisque, dans la plupart des cas, la lumière récoltée est très faible. La détection d’un photon par un PMT crée une avalanche d’environ 106 _{électrons qui sont facilement détectables par la suite. De plus, comme le}

temps de réponse des PMT utilisés est de quelques nanosecondes, cela nous permet d’obtenir une mesure rapidement.

La microscopie confocale donne des images à une profondeur bien définie dans l’échantillon. Par contre, cette profondeur est limitée par l’absorption et la diffusion dans les tissus. La profondeur maximale est d’environ 100 m. Lorsqu’on image en profondeur, une partie de la lumière émise hors du point focal est diffusée et détectée par le système; cela augmente le bruit dans les images et contribue à limiter la profondeur maximale.

Typiquement, pour imager un tissu avec un microscope confocal, on utilise des molécules fluorescentes. Pour des longueurs d’onde ultraviolettes, la plupart des tissus sont autofluorescents (inherent fluorescence) [10], ce qui permet de les imager sans ajout d’agent extérieur. Par contre, c’est un phénomène moins efficace pour les longueurs d’onde visibles. L’ajout de différentes molécules fluorescentes dans les cellules permet l’imagerie des différents composants cellulaires. Ceci est un atout pour imager une partie bien définie d’une cellule et une grande diversité de phénomènes. Par exemple, on peut imager la membrane de neurones, imager spatialement et temporellement la concentration d’un ion en particulier avec des fluorophores sensibles à la présence d’ions, imager le potentiel électrique, identifier des cellules préalablement marquées par un agent, imager certaines parties d’une cellule (mitochondrie, noyau, canaux ioniques, etc.) ou certaines protéines, etc.

Il existe plusieurs types de molécules fluorescentes. Les molécules fluorescentes synthétiques, par exemple le bleu de méthylène et les « azo dyes », produisent une faible fluorescence. Des molécules fluorescentes beaucoup plus efficaces avec de grandes efficacités quantiques ont été découvertes récemment. La plus répandue est le GFP (Green Fluorescent Molecule) qui peut être encodée génétiquement; donc on n’a pas besoin de l’injecter artificiellement. La GFP, extraite des méduses, est excitée autour de 395 nm et 475 nm et réémet la lumière autour de 509 nm. Il y a aussi plusieurs dérivés du GFP qui sont fluorescents à d’autres longueurs d’onde. Encore plus récemment, les points quantiques (quantum dots) [11, 12] ont émergé comme sonde fluorescente pour les microscopes à champ large et les microscopes laser. Jusqu’à tout récemment, les points quantiques n’étaient pas solubles dans l’eau et donc très peu utilisables. Mais récemment, l’ajout de micelles à ces derniers a mis fin à ce problème. Les points quantiques ont l’avantage de résister au photo-blanchiment (dégradation du caractère fluorescent suite à son irradiation), d’avoir une bonne efficacité quantique, de réduire la photo-toxicité et d’avoir une quasi-infinité de couleurs d’excitation. Leur désavantage est qu’ils ont une fluorescence qui varie rapidement dans le temps (blinking). Il existe une multitude d’autres fluorophores différents; certains sont sensibles à la présence d’ions, de protéines ou autres, d’autres sont sensibles à une différence de potentiel, et aussi, certains ont une section efficace

multiphotonique beaucoup plus grande [13]. Les microsphères fluorescentes sont aussi utilisées pour imager certains phénomènes.

1.2.2 Microscopie à deux photons

Il est possible pour un atome ou une molécule d’absorber « simultanément » deux photons ou plus lors du même événement quantique (figure 1.4a). On appelle ce phénomène l’absorption à deux photons. Elle a été prédite par Maria Göper-Mayer en 1931 [14] et observé 30 ans plus tard par Kaiser et Garrett [15]. La première observation d’absorption à deux photons dans un milieu organique a été faite par Peticolas et al. [16] quelques années plus tard et la microscopie laser basée sur l’absorption à deux photons a été proposée par Sheppard et Kompfner en 1978 [17]. Cependant, c’est seulement en 1990 que Denk et ses collaborateurs [18] ont rapporté la première application expérimentale de l’absorption à deux photons à la microscopie laser. Ce type de microscopie est survenu beaucoup plus tard que la découverte de l’absorption à deux photons puisqu’elle nécessitait l’utilisation d’un laser ayant des impulsions sub-picosecondes. En effet, l’intensité lumineuse utilisée doit être très grande pour qu’il soit probable que deux photons passent près de l’atome à exciter dans un laps de temps très court (10-16 _{s). Des impulsions très}

courtes (< 200 fs) sont nécessaires afin d’atteindre des intensités suffisantes à l’observation de ce phénomène. La principale source laser utilisée est le laser Ti:saphir [19], lequel peut générer des impulsions aussi courtes que 10 fs avec un spectre centré près de 800 nm. Les systèmes laser commerciaux utilisés en microscopie produisent typiquement des impulsions de 100 à 200 fs.

Figure 1.4 (a) Schématisation des niveaux d’énergie d’une molécule fluorescente. Les

flèches vers le haut représente l’absorption à un photon (1p), à 2 photons (2p) et à 3 photons (3p). La flèche pointillée représente le passage vers un niveau d’énergie intermédiaire avant l’émission spontanée d’un photon de fluorescence (flèche vers le bas). (b) Schéma expérimental du montage de la microscopie à deux photons conventionnelle. La source d’excitation est dirigée vers l’échantillon via un système de balayage et un miroir dichroïque, puis elle est concentrée au point focal d’excitation par l’objectif. La fluorescence émise par l’échantillon est ensuite collectée par l’objectif, filtrée par un filtre d’émission et détectée par un PMT.

Le schéma de microscopie à deux photons (figure 1.4b) est semblable au schéma de la microscopie confocale (figure 1.2). On utilise une source laser différente et, par le fait même, les filtres sont différents. Puisque la microscopie à deux photons permet une diminution de la fluorescence hors du point focal [4], l’utilisation du sténopé utilisé en microscopie confocale devient inutile. Dans le volume d’excitation, chacune des molécules de l’échantillon a la possibilité d’absorber deux photons ayant chacun la moitié de l’énergie (donc le double de la longueur d’onde) nécessaire à l’excitation; celles-ci réémettent alors généralement un photon par fluorescence. On image ensuite de la même façon qu’en microscopie à un photon.

Les avantages que présente la microscopie à deux photons, par rapport à la microscopie confocale, offrent de nouvelles opportunités pour l’imagerie. Les applications qui en découlent sont nombreuses, tant au niveau moléculaire, cellulaire et tissulaire. Les principaux avantages de la microscopie à deux photons par rapport à la microscopie à un photon sont une meilleure résolution radiale (dans le plan transverse xy à une profondeur donnée) et axiale (en profondeur le long de l’axe des z), une plus grande profondeur de pénétration, moins d’autofluorescence des tissus, plus de facilité à filtrer les longueurs d’onde d’émission et d’excitation et la simplification du montage.

1.2.3 Résolution spatiale

La figure 1.5a compare l’intensité (absorption à un photon) et l’intensité au carré (deux photons) de taches focales pour un même objectif (ouverture numérique NA = 0.5), à une longueur d’onde de 450 nm et 800 nm (longueurs d’onde typiques pour la microscopie confocale et pour la microscopie à deux photons). L’absorption par les molécules fluorescentes étant proportionnelle à l’intensité au carré dans le cas de la microscopie à deux photons [20, 21], cela améliore la résolution pour une longueur d’onde donnée. Le résultat net est que, théoriquement, la résolution radiale est légèrement inférieure avec une excitation à deux photons à 800 nm qu’avec un photon à 450 nm (figure 1.5a). En revanche, l’intensité au carré diminue plus rapidement sur l’axe z dans le cas à deux photons. Cette illustration ne considère cependant pas l’absorption et la diffusion dans les tissus. Or, le coefficient d’absorption de plusieurs des composantes des tissus est au moins 10 fois moins important à 800 qu’à 450 nm (1.5b). La diffusion est également inférieure à une longueur d’onde de 800 nm. En microscopie confocale (donc à un photon), il y a donc beaucoup plus de fluorescence émise hors du point focal lorsque l’on considère l’absorption (voir Fig. 1.5c). Cette fluorescence hors foyer devient une source de bruit importante, minant la résolution et la sensibilité du système; de plus, elle affecte le tissu (phototoxicité) hors du point d’investigation.

Pour maintenir une résolution près de la limite de diffraction en microscopie confocale, il faut utiliser un sténopé (pinhole), afin de rejeter les photons émis par fluorescence hors du point focal. À mesure que l’épaisseur du tissu augmente (> 100 μm), on doit excessivement réduire le diamètre du sténopé et augmenter l’intensité de la lumière incidente. Ceci rend rapidement l’intensité lumineuse hors foyer trop importante, compromettant le rapport signal sur bruit et l’intégrité du tissu. Ainsi, considérant à la fois le diamètre fini du sténopé et l’importante diffusion dans les tissus biologiques aux courtes

longueurs d’onde, la microscopie à deux photons permet l’acquisition d’images à de plus grandes profondeurs, tout en ayant une meilleure résolution radiale et axiale en minimisant la taille de la région excitée et le stress imposé au tissu [22].

Figure 1.5 (a) Images 2D du profil d’intensité lumineuse des points focaux (dans le

plan xz ou yz à 450 et 800 nm (un photon) et intensité au carré à 800 nm (deux photons; NA = 0,5; coefficient d’absorption  = 0). Les profils d’intensité (a et c) sont des simulations théoriques programmées avec MatLab. (b) Coefficient d’absorption des principaux absorbants dans les tissus en fonction de la longueur d’onde. (c) Profil de l’intensité lumineuse à un photon (gauche) et profil de l’intensité au carré à deux photons (droite) en tenant compte du coefficient d’absorption ( = 85 cm-1 _{pour un}

photon et  = 8.5 cm-1 _{pour deux photons). (d) Image d’un neurone pyramidal du}

néocortex exprimant la GFP à faible grossissement à gauche et avec un grossissement croissant vers la droite : l’image du milieu met en évidence une dendrite; l’image de droite montre les détails d’épines dendritiques. (e) Exemple de technique utilisée pour augmenter la résolution en deçà des limites de diffraction de la lumière : la STED (STimulated Emission Depletion). Ces figures son tirées d’un article publié par notre groupe [23].

La résolution radiale de la microscopie laser à un ou deux photons est normalement limitée par la diffraction de la lumière; cette limite est environ la moitié de la longueur d’onde [4]. Or, plusieurs mouvements moléculaires se font sur des échelles spatiales bien plus petites; de même, plusieurs compartiments cellulaires (comme l’épine dendritique d’un neurone; figure 1.5d) sont eux-mêmes inférieurs en taille aux limites de diffraction de la

lumière. Certaines techniques permettent d’augmenter la résolution, par exemple, la RESOLFT (REversible Saturable OpticaL Fluorescence Transition), l’illumination structurée et la STED (STimulated Emission Depletion) [24-26] (figure 1.5e). Avec cette dernière, la résolution transverse peut être aussi bonne que /50 (16 nm). Le fonctionnement de la STED repose sur l’excitation de l’échantillon avec une impulsion laser de la même façon qu’on le fait en microscopie à deux photons. Par la suite, avant que les fluorophores réémettent la fluorescence, on désexcite les molécules autour du point focal par émission stimulée avec une impulsion en forme de beigne. Les molécules encore excitées sont alors dans un volume beaucoup plus petit que le point focal, ce qui améliore la résolution radiale. L’image 1 de la fig. 1.5e présente le profil d’intensité de l’impulsion laser d’excitation et l’image 2 montre le profil d’intensité du faisceau en beigne qui suit l’impulsion d’excitation. L’image 3 présente le profil d’excitation résultant après le passage des deux premières impulsions et l’image 4 montre le profil inverse du beigne. En principe, en augmentant l’intensité de la seconde impulsion, le diamètre de la région non-désexcitée peut être réduit sans limite.

La résolution axiale d’un microscope confocal est environ 500 nm. Cela peut être réduit avec l’aide de la microscopie 4 Pi-confocale [24, 27, 28]. Cette configuration consiste à exciter l’échantillon avec deux faisceaux laser cohérents se propageant en direction inverse; cela augmente l’angle solide d’illumination (comme si on augmentait l’ouverture numérique), ce qui augmente la résolution axiale.

Ces techniques sont cependant complexes et requièrent des alignements très précis. En revanche, on assiste actuellement à l’émergence d’autres approches complémentaires moins complexes, comme la focalisation d’un faisceau laser TM01 avec des impulsions courtes [29].

1.2.4 Maximisation du signal de fluorescence / imagerie en profondeur (deux photons)

Pour avoir une bonne vitesse d’acquisition et imager en profondeur, il faut absolument optimiser l’absorption et la collection de la lumière de plusieurs façons. Par exemple, en doublant l’intensité d’excitation, la fluorescence émise est quadruplée en microscopie à deux photons. Les prochaines sections décrivent différentes façons d’optimiser l’intensité lumineuse d’excitation.

Puissance, focalisation et impulsions courtes

Comme la microscopie à deux photons est un phénomène non-linéaire, maximiser l’intensité lumineuse a un impact particulièrement important sur le signal. Cependant, une intensité lumineuse plus élevée (en photon cm-2 _s-1_{) causera une augmentation du}

dommage au tissu environnant. Il est donc préférable d’optimiser d’autres paramètres. On peut minimiser la taille du point focal, en utilisant, par exemple, des objectifs avec la plus grande ouverture numérique (NA) possible : focaliser un faisceau laser d’une taille de 1 mm sur 1 m fait gagner un facteur 106 _{en intensité crête.}

En microscopie à deux photons, focaliser un faisceau laser intense en un tout petit volume n’est cependant pas suffisant pour obtenir assez de signal de fluorescence dans un court laps de temps (pixel dwell time). Il faut donc exploiter la possibilité de réduire la durée des impulsions laser pour augmenter l’intensité. La fluorescence dépend de la moyenne de l’intensité au carré, laquelle est calculée avec l’équation suivante [30]:

 

 

2 2

f p r

I t g I(t) / f

      , (1.1)

où gp est égale à 0,66 pour une gaussienne, fr est le taux de répétition du laser et  est la

durée de l’impulsion laser. Avec des impulsions de 100 fs et un taux de répétition de 80 MHz, gamme typique des lasers femtosecondes utilisés en microscopie, l’intensité lumineuse maximale par rapport à un faisceau laser continu est augmentée d’un facteur 105

(donc la fluorescence est augmentée d’un facteur 1010 _{en microscopie à deux photons) sans}

changer l’intensité moyenne.

Taux de répétition du laser

Pour une impulsion laser d’une largeur temporelle  et d’une fréquence de répétition fr, le signal de fluorescence est proportionnel à

1/

 



f

photons absorbés (n=2 pour l’absorption à deux photons). Pour augmenter le signal, on peut donc envisager d’utiliser des impulsions courtes et un taux de répétition le plus faible possible. Cependant, il est peu pratique de diminuer la longueur des impulsions en dessous de 100 fs car des impulsions de durée inférieure à 100 fs subiraient un élargissement temporel (dispersion) dans les composantes optiques et dans les tissus. Par contre, le taux de répétition laser peut être réduit. Le taux de répétition est relié à la longueur de la cavité

laser; il est de l’ordre de 100 MHz pour la plupart des lasers utilisés. Pour des raisons d’espace, on ne peut pas varier la longueur de la cavité laser de façon à réduire de beaucoup cette valeur. Pour réduire fr, l’utilisation d’un amplificateur régénératif permet

d’additionner plusieurs impulsions successives afin de produire une impulsion géante (Fig. 1.6). Dans les cas extrêmes, l’intensité crête est multipliée par un facteur 108 _{en réduisant le}

taux de répétition à 1 Hz [32]. En imagerie, puisqu’il faut au moins une impulsion par pixel, on réduit fr par un facteur limité; pour un « pixel dwell time » de 4-10 s, on doit réduire la

fréquence de répétition à 100-250 kHz. Puisque cette technique augmente le signal de fluorescence, elle permet aussi d’imager plus en profondeur dans les échantillons [33]. L’apparition significative d’excitation à deux photons hors du point focal semble cependant limiter la profondeur d’imagerie autour de 1 mm [34].

Figure 1.6 Graphique de l’intensité en fonction du temps pour un faisceau laser continu

(courbe continue) et pour des faisceaux laser pulsés à 100 MHz (plus petit pics), à 10 MHz (moyens pics) et à 250 kHz (plus grand pic). Les faisceaux à 10 MHz et 250 kHz sont générés à l’aide d’un amplificateur régénératif. Notons que les quatre faisceaux laser ont la même puissance moyenne (correspondant à la puissance du faisceau continu).

Section efficace des fluorophores

Bien que certains fluorophores aient les mêmes caractéristiques d’absorption pour l’absorption à un ou deux photons, plusieurs ont un comportement différent. La valeur de l’efficacité d’absorption est en unités de Göpper-Mayer (GM). Certaines molécules comme

Continue

Impulsion (100 MHZ)

ReGen (10 MHz) ReGen (250 kHz)

le NADH (molécule endogène) ont une faible section efficace (0,1 GM) à deux photons tandis que d’autres (GFP, CFP) ont une section efficace acceptable (100 GM). Un des avantages notables des nanocristaux fluorescents de CdSe-ZnS, dits points quantiques (quantum dots), et qui fait leur popularité croissante en microscopie pour le suivi moléculaire [35], est qu’ils ont une section efficace près de 50 000 GM [11]. En microscopie à deux photons, les profils spectraux d’excitation sont également souvent plus larges qu’à un photon, permettant d’exciter plus facilement deux fluorophores avec la même longueur d’onde, ce qui peut être très avantageux pour l’analyse par corrélation croisée de plusieurs signaux [36].

Détection des photons de fluorescence

Une molécule fluorescente excitée réémet un photon dans une direction aléatoire. Comme presque tous les photons émis proviennent du point focal en microscopie à deux photons, ils sont tous pertinents. On peut donc maximiser la collection en utilisant un objectif avec la plus grande ouverture numérique possible (transcollection), car l’ouverture numérique est directement reliée à l’angle solide de recollection. Lorsqu’on travaille avec un explant de tissu, comme les tranches de cerveau couramment utilisées [37, 38], on peut utiliser un deuxième objectif après l’échantillon (épicollection), en plus de l’objectif d’illumination, ce qui permet de récolter au moins deux fois plus de photons.

1.2.5 Résolution temporelle

L’imagerie fonctionnelle va au-delà de la morphologie. Ce type d’imagerie fait intervenir une dimension supplémentaire, soit le temps. Elle permet de suivre l’évolution des composantes présentes dans un environnement vivant et d’étudier les événements et les fonctions reliées à ces composantes. Bien que l’imagerie fonctionnelle fasse souvent référence à des techniques telles que l’Imagerie à Résonance Magnétique (IRM) ou l’imagerie par tomographie d’émission de positrons (PET), la résolution spatiale nettement supérieure qu’offre la microscopie à deux photons en fait une technique de choix pour l’imagerie fonctionnelle cellulaire et sub-cellulaire.

Pour disposer d’une bonne résolution temporelle, il faut entre autre optimiser le signal de fluorescence (en utilisant les stratégies mentionnées à la section précédente), optimiser la vitesse de balayage et imager seulement le volume ou l’aire qui nous intéresse.

Pour certains signaux, 30 images par seconde demeurent cependant insuffisantes. Une manière d’y remédier est de limiter l’échantillonnage à une aire réduite, voire à une seule ligne de balayage, comme c’est le cas pour l’imagerie fonctionnelle d’événements synaptiques [37-39]. Une autre approche prometteuse est l’utilisation de déflecteurs acousto-optiques; éléments non-mécaniques qui permettent donc d’envisager des déplacements de faisceaux beaucoup plus rapides [40].

D’autres méthodes ont été proposées afin d’améliorer la résolution temporelle. Par exemple, il est possible de séparer le faisceau en plusieurs faisceaux parallèles, et ainsi obtenir plusieurs points focaux dans l’échantillon [41-43]; par la suite, il suffit d’avoir une matrice de détecteurs (ou tout simplement une caméra CCD) avec une excellente résolution pour obtenir une image complète du plan focal. Une autre technique consiste en l’utilisation d’une lentille cylindrique pour illuminer l’échantillon avec une ligne perpendiculaire au plan d’incidence [44]. Il est aussi possible d’utiliser des fentes minces pour focaliser sur une ligne transverse [45-47].

1.3

APPLICATIONS BIOLOGIQUES DE LA MICROSCOPIE À DEUX

PHOTONS

Étude physiologique de tissus

La microscopie à deux photons est grandement utilisée pour comprendre la physiologie de différents tissus puisque cette méthode permet de sonder plus en profondeur. Notons que cette profondeur est limitée par les coefficients de diffusion et d’absorption du tissu étudié. Cette application mène à un éventail très varié de recherches et d’études. Par exemple, Denk et al. ont étudié les fluctuations de concentrations de calcium induites par la lumière à l’intérieur de la rétine chez la salamandre tigre [48]. De leur côté, Masters et ses collègues ont utilisé la microscopie à deux photons pour imager l’autofluorescence des cellules de la peau humaine en superficie et dans les couches sous-cutanées [49]. Leurs études montrent qu’il est possible d’étudier l’état métabolique des cellules cutanées à l’aide ce type de microscopie.

En neurobiologie, outre l’information sur la structure du réseau neuronal et le neurone lui-même, l’excitation à deux photons permet d’obtenir des renseignements précieux sur la physiologie comme, par exemple, le rôle du calcium au niveau des épines dendritiques [37] et la plasticité neuronale [50] qui est très importante dans les étapes d’apprentissage.

Diagnostic clinique et traitement

Au cours des dernières années, plusieurs chercheurs ont concentré leurs recherches sur les diagnostics cliniques qui peuvent être faits à partir de l’imagerie à deux photons. La biopsie optique basée sur l’excitation à deux photons est une méthode non invasive prometteuse qui permettrait de recueillir de l’information à partir de tissus vivants. Par exemple, Dunn a démontré que la microscopie peut être employée pour évaluer divers aspects de la fonction rénale in vivo [51]. Ceux-ci incluent la vitalité et l'apoptose de cellules, le transport des fluides, l’endocytose médiée par les récepteurs, le flux sanguin, et le trafic de leucocytes.

De plus, certaines études ont montré que la microscopie à deux photons présentait un potentiel dans le traitement de certaines pathologies. La thérapie photodynamique permet de détruire des tissus distincts, comme des tumeurs. Ces tissus sont, au préalable, additionnés d’un agent photosensible et détruit par illumination laser. Cette thérapie a d’abord été utilisée avec l’excitation à un photon, mais l’excitation à deux photons semble être de mise pour cette forme de thérapie. David Cramb décrit les récentes avancées de la thérapie photodynamique avec excitation à deux photons [52]. Selon lui, ce type d’excitation est avantageux pour plusieurs raisons, incluant ; i) la capacité de traiter des zones plus petites et plus confinées, et ii) la capacité de traiter plus profondément dans les tissus malades.

Imagerie cellulaire in vivo

Jusqu'ici, la plupart des études d’imagerie à deux photons ont été réalisées sur les cellules isolées ou sur des tissus in vitro. Cependant, les avantages que présente le microscope à deux photons ont permis le développement, au cours des dernières années, de l’imagerie in vivo. Cette nouvelle application a, entre autres, été utilisée pour la peau humaine [49], pour le flux sanguin cortical, en embryologie [53], pour déterminer la morphologie des épines dendritiques [54], pour caractériser les plaques d’Alzheimer [55], pour les tumeurs [56], et également pour l’imagerie calcique [57].

Finalement, la venue de endomicroscopes utilisant la technologie du microscope à deux photons promet d’avantage d’avancement en imagerie in vivo, particulièrement en neurobiologie [58]. Ceux-ci peuvent atteindre des zones plus profondes et leur utilisation ne se limite pas aux couches superficielles.

Suivi de particule en 3D

La microscopie à deux photons permet également de faire de l’imagerie au niveau moléculaire. La première démonstration de la détection d’une particule en solution a été faite par Mertz et ses collaborateurs en 1995 [59]. Depuis, cette technique a été à plusieurs reprises utilisée pour traquer des particules distinctes en trois dimensions, et mieux comprendre la dynamique moléculaire des cellules et de leurs environnements [60].

Rétablissement de la fluorescence après photoblanchiment

De manière générale, le photoblanchiment est indésirable en microscopie laser; cependant, celui-ci peut s’avérer fort utile pour étudier le coefficient de diffusion de certaines particules. Cette technique consiste à irradier intensément un petit volume de l’échantillon se trouvant dans la région focale de l’objectif (ceci est rendu possible grâce à la résolution axiale accrue de la microscopie à deux photons). Les molécules non-blanchies provenant des régions périphériques diffusent dans ce volume et simultanément la fluorescence de cette région est imagée par le microscope. Il est ainsi possible de caractériser la diffusion d’une molécule fluorescente avec une résolution tridimensionnelle de l’ordre du micromètre [61].

1.4

AUTRES SYSTÈMES DE MICROSCOPIE

Plusieurs autres types de microscopie spécialisés pour certaines applications ont vu le jour depuis les années 1990. En voici quelques exemples :

1 - La microscopie par réflexion totale interne [62] (Total Internal Reflection (TIR) microscopy) qui permet d’imager la surface d’un échantillon avec une résolution axiale très grande en utilisant l’onde évanescente qui diminue exponentiellement après la surface de réflexion. Cette technique permet de réduire la fluorescence de fond et le contraste de l’image est augmenté. Elle est idéale pour mesurer les changements rapides ou les objets en mouvement (très près de l’interface entre l’échantillon et le milieu d’indice de réfraction supérieur), comme les événements moléculaires sur les membranes cellulaires à l’interface avec le verre dans les cultures cellulaires (exocytosis [63]).

2 – La tomographie par cohérence optique [64] (Optical Coherence Tomography (OCT)) permet d’imager en profondeur en balayant le miroir de l’un des bras d’un interféromètre

de Michelson. Cette technique utilise de la lumière infrarouge ayant une petite longueur de cohérence temporelle. L’interférence entre le signal de référence (provenant du miroir) et du signal réfléchi (par un changement d’indice de réfraction) dans l’échantillon est constructive lorsque la profondeur dans l’échantillon correspond à la distance du miroir. Après une oscillation du miroir, on obtient donc une image linéaire. On peut ensuite déplacer le système pour avoir une image 3D.

3 – La microscopie par absorption à trois photons [65] permet une résolution encore plus grande que la microscopie à deux photons puisque l’absorption est dans ce cas proportionnelle au cube de l’intensité lumineuse.

4- La microscopie par génération de seconde harmonique [66] (SHG ou Second Harmonic Generation microscopy) est une récente addition à la microscopie non-linéaire. La SHG a les mêmes avantages que la microscopie à deux photons (sélection de tranche, pénétration) et est sensible aux parties de l’échantillon où l’indice de réfraction ou la susceptibilité non-linéaire change (spécialement aux interfaces). L’un de ses avantages est que la lumière harmonique est produite instantanément sans état excité. Par conséquent, il n’y a pas de photo blanchiment [67].

5 – La microscopie CARS [68] (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering microscopy) permet l’imagerie vibrationnelle d’échantillons biologiques sans ajout de fluorophores. La CARS procure de l’information sur la composition chimique à l’aide de la lumière décalée vers le bleu induite par les caractéristiques vibrationnelles des molécules dans l’échantillon. C’est une technique de mélange à 4 ondes dans laquelle 2 impulsions colinéaires interagissent avec l’échantillon pour produire le signal anti-Stokes. Ce signal est augmenté lorsque la différence de fréquence entre les 2 impulsions correspond à la fréquence vibrationnelle de la molécule. Il est possible d’utiliser cette méthode dans une configuration à champ large [69].

6 - La microscopie par imagerie de temps de vie des fluorophores [70] (FLIM ou Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) permet d’imager simultanément plusieurs fluorophores ayant des temps de vie différents. Il est aussi possible, grâce à cette technique, d’imager la variation du temps de désexcitation d’un procédé non-radiatif. La fraction des fluorophores qui sont désexcités non-radiativement peut varier en fonction de l’environnement, par exemple le pH ou la présence d’autres fluorophores.

1.5

PRÉSENTATION DE CETTE THÈSE

La plupart des études faisant appel à la microscopie à deux photons cherchent à augmenter la résolution radiale et axiale. En revanche, meilleure est la résolution axiale (le long de l’axe z), plus le nombre d’images à enregistrer est grand pour capturer l’état d’objets dispersés dans un échantillon épais de tissu, ce qui limite d’autant la résolution temporelle des phénomènes dynamiques à observer. Pour l’étude de l’activité au sein d’un réseau de neurones dans le cerveau, par exemple, il est critique de pouvoir obtenir une image à grande vitesse de tout le volume de tissu pour détecter les décharges successives des cellules qui se produisent sur une échelle de temps de quelques millisecondes. Si les cellules à l’étude ne sont pas trop densément groupées, une stratégie à exploiter est d’éliminer le besoin de scanner le volume dans l’axe des z, puisque cette information n’est pas nécessairement utile. On peut donc envisager augmenter la profondeur de champ. L’enjeu est cependant de ne pas sacrifier la résolution radiale (dans le plan xy), ce qui se produit avec des objectifs classiques en diminuant l’ouverture numérique, par exemple.

1.5.1 Microscopie avec un axicon

Plusieurs techniques tentent d’augmenter la profondeur de champ des lentilles, comme l’utilisation d’axilens [71] ou de lentilles biréfringentes entre deux polariseurs [72]. Ces techniques ont une profondeur de champ limitée et la résolution radiale varie le long de l’axe de propagation. Une alternative intéressante est d’utiliser une lentille conique appelée axicon (figure 1.7a), qui focalise la lumière sur une ligne d’excitation sur l’axe des z, éliminant ainsi la nécessité d’effectuer des balayages successifs afin d’imager tout le volume d’intérêt (figure 1.7c). Cet élément optique a la particularité de focaliser la lumière sur une mince ligne axiale, tout en maintenant une résolution radiale comparable à celle d’un objectif conventionnel. Le même axicon est utilisé pour collecter la fluorescence émise et la rediriger vers le système de détection. Le schéma de ce type de microscopie (voir figure 1.7b) est similaire à celui de la microscopie à deux photons. L’objectif est remplacé par l’axicon, et au lieu de balayer le faisceau laser sur l’axicon, c’est l’axicon qui est déplacé pour imager l’échantillon. Pour un axicon de 30, la ligne focale obtenue est d’une longueur de l’ordre du mm tout en ayant une résolution axiale constante de l’ordre du micron (figure 1.7d). On a montré qu’un microscope à base d’axicon permet d’obtenir, en un seul balayage, des images fonctionnelles de structures distribuées à différentes profondeurs focales comparables à la somme d’images obtenues avec une lentille conventionnelle en microscopie à deux photons. L’utilisation de l’axicon est compatible avec l’excitation à deux

photons, ce qui permet d’augmenter la résolution radiale de même que d’exploiter les avantages du procédé à deux photons pour l’imagerie dans du tissu épais [73]. Ding et ses collaborateurs ont déjà utilisé un axicon pour augmenter la profondeur de pénétration en tomographie par cohérence optique [74].

Figure 1.7 Un microscope à deux photons utilisant un axicon pour maximiser la

profondeur de champ sans compromettre la résolution radiale. a) Schématisation d’un axicon d’angle α. La lumière est focalisée sur une ligne d’excitation qui traversera le plan xy du spécimen à imager. b) Schéma expérimental du montage de la microscopie à deux photons utilisant un axicon. c) Illustration du volume d’excitation et des images résultant du balayage d’un échantillon avec un objectif (haut) et avec un axicon (bas). d) Simulations montrant le profil d’intensité au carré pour une lentille (gauche) et un axicon (droite) (ouverture numérique = 0,16 et coefficient d’absorption = 8,5 cm-1).

1.5.2 Divisions de la thèse

Dans le deuxième chapitre, on présente les résultats théoriques de la transmission par une lentille conventionnelle et par un axicon. On décrit ensuite les caractéristiques principales de chacun et on compare les deux éléments. Dans le troisième chapitre, on compare les résultats théoriques de la transmission par un axicon avec les résultats expérimentaux. Dans le chapitre suivant, on décrit le microscope à deux photons avec un axicon et on montre les résultats obtenu avec ce dernier. On compare les résultats avec un microscope à deux photons conventionnel. Pour terminer, le chapitre 5 est la conclusion de la thèse.

CHAPITRE 2

PRINCIPES FONDAMENTAUX

Dans ce projet, on utilise un axicon dans un système de microscopie à deux photons à la place d’un objectif conventionnel. Dans ce chapitre, nous ferons un modèle théorique et des simulations numériques pour obtenir l’intensité du champ transmis par une lentille conventionnelle et par un axicon. Nous comparerons ensuite la résolution, la profondeur de champ et l’intensité maximale pour ces deux éléments.

2.1

THÉORIE SUR LES OBJECTIFS CONVENTIONNELS

2.1.1 Résolution radiale

Dans la littérature, la résolution radiale 0 d’un objectif ou d’une lentille éclairée par

une onde plane uniforme (OPU) est donnée par la position du premier zéro de la distribution transverse dans le plan focal de l’objectif. La figure 2.1 présente les principaux paramètres utilisés dans cette section.

Figure 2.1 : Schéma illustrant une onde plane uniforme (OPU) incidente sur une lentille

de distance focale f et de diamètre D. Les traits en pointillées représentent les fronts d’onde.

z

D 0

f OPU

La valeur théorique du rayon 0 où se trouve le premier zéro de la tache d’Airy (voir

annexe 2.1) est obtenue avec l’équation suivante :

0 1,22 / 2 NA

   (2.1)

où  est la longueur d’onde et NA est l’ouverture numérique de l’objectif. Pour établir cette définition, il est considéré que le maximum d’une deuxième tache d’Airy qui serait centrée sur la position du premier zéro de la première tache d’Airy pourra être considéré comme provenant d’une source différente.

En microscopie laser, c’est un faisceau laser ayant un profil gaussien qui est incident sur l’objectif. Les propriétés du faisceau gaussien sont décrites à l’Annexe 1. Par convention, on utilise w0 comme étant la demi-largeur de l’amplitude du champ électrique à

une hauteur de 1/e du maximum dans le plan de l’étranglement (où la taille du faisceau gaussien est minimale et le front d’onde est plan). C’est aussi un profil gaussien qu’on retrouve au foyer de ce même objectif (on utilise w0’ pour la taille au foyer de l’objectif). Sur

la figure 2.2, on compare le profil de l’intensité au point focal pour une onde plane uniforme incidente et pour un faisceau gaussien incident afin de pouvoir déduire l’équation de la résolution pour un faisceau gaussien. On trace sur cette figure la fonction d’une tache d’Airy (en intensité) obtenue avec un objectif de NA = 0,5 et  = 800 nm (0 = 1 m). On

trace aussi le profil gaussien (en intensité) correspondant à cette courbe. En comparant les deux courbes, on peut déterminer que la résolution radiale rr d’un point focal gaussien (en

intensité) est de 2 w '; w₀ 0’ étant la demi-largeur de l’amplitude du champ électrique à 1/e

dans le plan focal de l’objectif (0,707 m sur la courbe de la figure 2.2). La résolution pour I2

(c’est le cas en microscopie à deux photons) est obtenue en divisant la valeur de la résolution obtenue pour I par un facteur 2 .

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

In

te

nsité

(

u.a

.)

Distance (



m)

Figure 2.2 Intensité au point focal d’un objectif pour une onde plane uniforme (courbe

continue) incidente et un faisceau gaussien incident (courbe pointillée). La résolution théorique pour l’OPU est de 1 m et la taille du faisceau gaussien est de 0,707 m (demi-largeur de 0,5 m en intensité).

Dans le cas d’un faisceau gaussien incident, la taille dans le plan focal dépend de la taille du faisceau gaussien incident sur l’objectif. Lorsque la taille du faisceau gaussien incident w0 est égale à D/2,71 (D est le diamètre de l’ouverture de l’objectif), la résolution

radiale est comparable à celle obtenue avec une OPU incidente. Par contre, plus on réduit la taille du faisceau gaussien incident, plus la taille au foyer est augmentée. Donc la résolution radiale diminue (voir équation (2.2)) :

r 0 0 0,45 D r 2 w ' 2 NA w      _{ }  . (2.2)

On voit bien que si D/w0 = 2,71, la résolution est égale à la valeur classique de

résolution pour un objectif (voir équation (2.1)). Dans l’équation (2.2), on doit noter que w0

doit être inférieur à D, sinon le faisceau incident est partiellement bloqué par l’objectif. Lorsque D/w0 > 2,71, on peut considérer l’équation valide.

2.1.2 Résolution axiale (profondeur de champ)

La résolution axiale (aussi appelée la profondeur de champ) est une caractéristique très importante en microscopie. Elle détermine l’épaisseur de la section d’échantillon qui est imagée. Pour un objectif classique, les valeurs données dans la littérature diffèrent légèrement. L’équation (2.3) est obtenue dans la littérature avec des valeurs de C1 allant de

1,4 à 1,8 : 1 a C ₂ r NA   (2.3)

Dans le cas d’un faisceau gaussien, on peut utiliser 2z0’ (z0 est la distance de Rayleigh)

comme étant la résolution axiale (voir Annexe 2).

2 2 0 a 0 ₂ 0 2 w ' D r 2z ' w 2 NA        _{ }  _{  }

Normalement, la profondeur de champ d’un faisceau gaussien est de 2z0’, mais si on

utilise l’intensité du champ électrique c’est plutôt 3z0’. Si on considère un faisceau gaussien,

en ajustant C1 à une valeur de 1,75 et D/w0 = 2,71, la résolution axiale correspond bien à

3z0‘ et l’équation obtenue est la suivante :

2 a 0 ₂ 0 1,5 D r 3z ' w 2 NA      _{ }    (2.4)

où z0’ est la distance de Rayleigh dans le plan focal. Donc, lorsque w0 est optimisé pour

avoir une résolution radiale identique à celle obtenue d’une OPU (D/w0 = 2,71), on obtient

une valeur de C1 = 1,75. Il est à noter que la profondeur de champ augmente rapidement

lorsqu’on diminue w0. Par exemple, si on utilise un faisceau gaussien avec w0 = 1 mm, la

profondeur de champ sera de 76 m au lieu de 5,6 m dans le cas où w0 = 3,7 mm (D = 1

cm; NA = 0,5;  = 800 nm). Lorsque calculée pour la microscopie à deux photons, il est à noter que la résolution axiale est divisée par 1,56 (et non par 2 comme pour la résolution radiale).

2.1.3 Intensité maximale normalisée au point focal d’une lentille

L’intensité maximale au centre du point focal normalisée à l’intensité maximale incidente est donnée par le rapport au carré des tailles minimales incidente et transmise :

2 _{2 2 2 2} max,lc 0 0 0 ' 2 0 ₀ I (0,0) w w NA w I _w D   _{  }    _{ }   _{  }   (2.5)

2.1.4 Pourcentage de recollection d’un objectif

On peut calculer le pourcentage de l’intensité lumineuse qui est collecté par l’objectif avec l’équation suivante (voir Annexe 4) :

1 2 2 obj NA NA 1 1 n n 2  _{ }   _{  }   _{ }          , (2.6)

où n est l’indice de réfraction. Sur la figure 2.3 on trace cette courbe en fonction de NA/n. On voit sur cette figure que plus l’ouverture numérique d’un objectif est grand, plus la collection est grande, tel qu’attendu.

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

0

10

20

30

40

50

Reco

llection

(%

)

Ouverture numérique NA / indice n

Figure 2.3 : Pourcentage de la recollection des photons de fluorescence en fonction de

l’ouverture numérique divisée par l’indice de réfraction n de la substance d’immersion (air, eau ou huile).

2.2

THÉORIE SUR L’AXICON

Les premiers axicons furent présentés par McLeod en 1954 [75]. Dans cet article, on voit qu’il existe plusieurs types d’axicon. En fait, un axicon est une figure de révolution ayant la propriété de réfléchir ou de diffracter une source provenant de son axe de symétrie sur une ligne continue de points sur ce même axe [76]. Dans ce projet, nous utilisons un axicon réfractif de forme conique que nous appelons tout simplement axicon afin d’alléger le texte. En considérant une onde plane uniforme (OPU) incidente sur un axicon de diamètre infini, l’intensité du champ électrique formé après l’axicon est un faisceau Bessel d’ordre 0 [76, 77] avec une intensité centrale qui augmente avec la distance sur l’axe z. Cependant, dans la réalité, l’axicon a un diamètre fini et le faisceau incident est de profil gaussien, le faisceau de sortie n’est pas exactement un faisceau Bessel mais plutôt un faisceau Bessel-Gauss. Le profil central et les premiers anneaux sont semblables dans les deux cas, mais l’intensité des anneaux loin du centre diminue dans le cas du faisceau Bessel-Gauss. En plus, si on utilise un faisceau laser impulsionnel, la visibilité des anneaux est réduite de plus en plus en s’éloignant du centre. Avec un faisceau Bessel idéal, l’énergie contenue dans chacun des anneaux tend vers une valeur constante à mesure qu’on s’éloigne