TD N° 6
PLASMIDES ET ENZYMES DE RESTRICTION
EXERCICE 1 :
On se propose d’établir la carte de restriction d’un plasmide circulaire double brin avec les enzymes Pst I et EcoR V.
1) Quelle est est la propriété principale des sites de reconnaissance des enzymes de restriction
2) Schématiser les réactions catalysées par les enzymes Pst I et EcoR V. comment appelle t on les extrémités obtenues
3) Quelle est la probabilité théorique de trouver un site de coupure de l’ADN par Pst I et EcoR V on supposant que la composition et la répartition des bases soient aléatoires ? quelles serait la taille des fragments ainsi générés ? 4) La digestion du plasmide par Pst I et Eco R V donne les résultats suivants : Enzymes
utilisées Taille des fragments en kbp
EcoRV 4.2 3.4
Pst I 3.6 2.7 1.3
Pst I et
EcoR V . 2.2 2 1.4 1.3 0.7
Etablir la carte de restriction de ce plasmide sachant que les sites de restriction pour Pst I et EcoR V sont respectivement les suivants :
Pst I : CTGCA G EcoR V : GAT ATC Exercice 2 :
Quelles sont les affirmations vraies :
1) Les sites de coupures d’enzymes de restriction sont le plus souvent des zones palindromiques,
2) La coupure se fait toujours au centre du site de restriction,
3) Les enzymes de restriction sont issues de bactéries dans lesquelles on a modifié le patrimoine génétique pour permettre leur production,
4) La séquence AluI correspond a un site de restriction, 5) Ces enzymes sont indispensables au clonage,
Exercice 3 :
Combien de fragments d’ADN vont être produits par une enzyme de restriction que l’on fait agir sur un plasmide possédant un site pour cette enzyme ?
Sur un ADN linéaire d’un bactériophage possédant deux sites de restriction de cette enzyme ?
Corrigé type Exercice 1 :
1. La caractéristique principale d’un site de restriction est qu’il est palindromique 2. Les enzymes :
Pst I fourni des extrémités cohésives CTG CA G (la coupure n’ai pas au centre du site
EcoR V donne des extrémités franches GAT ATC (coupure au centre du site)
3. Les enzymes Pst I et EcoR V possèdent des sites de même taille de 6 paire de base donc la fréquence des deux enzymes est la même c a d (1/4)6 sachant que 1/4 est la fréquence aléatoire de chaque base et 6 est l nombre de base de chaque site
En consequent, on peut trouver un site EcoR V ou Pst I chaque 4096 paire de base 4. Pour schématiser la carte de restriction globale, il faut commencer par la carte
de chaque enzyme tout seul ensuite les deux enzymes ensemble. Comme donnés, on a :
- EcoR V donne 4.2 et 3.4 (4.2+3.4=7.6)
-Pst I donne 3.6, 2.7 et 1.3 (3.6+2.7+1.3=7.6)
-E+P donnent 2.2, 2, 1.4, 1.3 et 0.7 (2.2+2+1.4+1.3+0.7=7.6) On compare toujours les fragments obtenus par simple digestion avec celle obtenu par double digestion
A la lumière de cette comparaison on remarque que 1.3 est le seul fragment non recoupé.
Les 4 fragments restant de chaque digestion simple sont recoupé, comme suit : 4.2 recoupé par Pst I en (2.2+2)
3.4 recoupé par Pst I en (1.3+2)
3.6 recoupé par EcoR V en (2.2+1.4) 3.4 kb
2.7 recoupé par EcoR V en (0.7+2)
A la lumière de ces résultats, les cartes sont comme suit :
EcoR V Pst I 1.3 1.3 1.4 0.7 4.2 3.4 3.6 3.6 2.7 2.7 2.2 2 4.2 kb EcoR V + Pst I Exercice 2 : 1) Vrai 7.6 kb
2) Faux. La coupure peut être au centre ou non
3) Faux. Les bactéries produisent naturellement les enzymes de restriction 4) Vrai
5) Vrai Exercice 3 :
- une enzyme de restriction que l’on fait agir sur un plasmide possédant un site pour cette enzyme donne apres digestion un fragment linéaire.
- Sur un ADN linéaire d’un bactériophage possédant deux sites de restriction de cette enzyme , on obtient apres digestion 3 fragments selon la loi :
ADN circulaire : le nombre de fragments=nbr de sites ADN linéaire : le nombre de fragments=nbr de sites +1
