L'
L'ORIGINE DU PEPTIDE DE 70 KD EXTERNALISE DANS UNE VESICULE LORS DE LA MATURAT-ION
-.
IN VITRO DU RETICULOCYTE DE MOUTON
par DANIELI.E-DANSEREAU B.Sc.
Th~se pr~sent~e
a
la facu1t~ d'êt~ ./'._-- ._.-~
-1I1IP~t'1eures et de recherche pour/satisfaire partiellement aux
'ex~es
pour ,;l'
l'obtention du grade de mattre ~s sciences,
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D~partement de biochimie ,. -.---t ·11 Universit' HcG111, Kontr~al, "Qu'bèc. AoOt 86®
..
Permi5~ion has been granted to . the Nationa1 Library of
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•
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-L'ORIGINE DU PEPTI.OE
D~70 KD EXTERNALISE DU
RETICU~OCYTEDE
MOUTON
1 1
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,A IDes parents pour leur support et leur confiance.
1
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'6 111 ....Lorsque des r~ticulocytes de mouton sont culéiv€s in vitro, 11, est possible de recueillir des v~sicules dans le milieu de culture. Les principales prot~ine8 trouvées so~t le r~cepteur de la
transferrine et une protéine de 70 kd. Nous avons examin~ la nature de cette derni~re ~ l'aide de cartographie peptidique et
d' "immunoblot."
La pO~,~ibllité que cette' protéine de 70 kd ,soit l'albumine et
t.
l'ankyrine a été éliminée pa r carto~raphie peptidiq ue. Al' aide de cette méthode, nous avons pu aus.si établir l'origine de la protél~e. Elle se retrouve assoc1é~
a.
la membrane plasmique du réticulocyte et de l ' ~rythrocyte. Elle est prôbablement rél1éea.
la chatne Ug~r~ de la clatherine au niveau de la mem~rane. : En effet,.
10r8qu~ les
-membranes sont traitées avec 1 ~-chymotrypslne, enzyme qui l1b~re la chatne Ug~re de la cage de clatherines, on obtient une quantité supérieure de la pr'otéine de 70 kd dans le surnageant.
L' ident1t~ de la pt:ot~lne de 70 kd a été d~términée a l ' aide -d'anticorps' polyclonaux. Un "immùnob-lot" a été effectué avec des anticorps dir~és contre l' "uncoating clatherine ATPase." Le résultat démontre que la prot~ine de 70 ltd est reconnue par l'anticorps cQntre l' "uncoating clatherine ATPase" de l ' érythocyte humain. De plus la' carte peptldique de l ' "unçoatlng clatherine ATP~8e" concorde avec c-e,lle de la pro tUne de 70 kd. L'activité d'ATPase a été ~montr'e
par une bande de gel contenant la protéine de 70 1td.. La SF'cJ,fic:1t(
..
•
•
)
) , Q iv il" \\de la protline de 70 kd pour d1ff'~ents nqcl'otides a aussi ~t'
4
eUllin'e. Elle semble poss'der une pdf':rence marqu'e pour l' ATP.
-
\
\Ces r'aultats nous am~nent
a
conclure que la prot'ine de 70 kd1
....
, - \retrouv6e dans des v'aieules l1h'r'es lor~! de la maturation in vitro
d~ r'ticulocyte de mouton est l' "uncoating elatherioe ATPase."
,
,
.
•
•
.
, "..
•
) , J-..
\ ~'o
o
1-We can collect vesicles from the culture medium of ln vitrQ
cultured retlculocyt~s. The major proteins found ln these vesicles
are the transferrin receptor and a 70 kd proteine The characterlstics of the latter were studied by peptide mapping and immunoblotting.
By peptide mapping, we determined that the 70 kd protein was not albumin or ankyrin •. By the same method, we also .established lta
orlg1n: the 70 kd protein is associated with both reticulocyte and erythrocyte pla~ma membranes. ,lt ls probably associated with the
llght chain of clather~n, near the~m~rane. Indeed, the ~upernatant
of membranes treated with ~-chymotrypsin, an enzyme which frees the
,
llght chain of clatherin from clatherin cages, contains hlgher levels
01
70 kd proteine/)
We determined the Identity of the 70 kd protein wi~h the help of a polyclona~ antibo~y. We immunoblotted uslng an antibody against
human erythrocyte uncoating clatherin ATPase and showed that the
antibody can, recognize the 7Q kd proteine Furthermore, peptide maps of the 70 kd prptein and of the uncoatlng clatherin ATP~se are
superimposable. ATPase activlty was shown in a gel band containlng
l';.~
the 70 kd proteine We also examined nucleotide speclflclty and found a marked preference for ATP.
From these results, we conclude that the 70 kd proteln found in veslcles shed during sheep reticulocyte in vitro maturation 18 the uncoating clatherin ATPase.
1 •
o
,
•
vi
RellerclelDents
Preml~rement, je d~slre exprimer ma reconnaissance et ma
gratitude 1 ma directrice de th~se,- Dr. Rose M. Johnstone. Tout au long de ces ann~es, elle a su me guider et me procurer encouragements,
.
id~es et support. Ses conseils~ son exp~rience furent tr~s
appr~ci~s.
De plus, j'aimerais souligner le climat amical et d'entraide
qui r~gne dans le laboratoire. Celui-ci est
dO
aux gens qui en font partie, soient Claire Turbide, Anoush Cochikian, Linda Orr, JohnHcCormick et Mohammed Adam. Ces ann~es de travail ont toujours ~t~
agr6ables grlce
a
leur pr~sence et leur amitié ••
je tiens
a
remercier 'Dr. Jonathan Q. Davis et Dr. Vann Bennett pour leur précieuse collaborati6n.Un merci aussi
a
ma m~re, Francette Dansereau, et à mon mari Denis, qui m'ont.
aid~e et accord~ de leur temps pour corriger ce manoscrit. Un merci sp~cial à Claire Turbide qui m'~donné de sontemps pour lp traduction de mon r~sumé.
•
Pour les figures, je tiens à remercier-Kathy Teng. Merci
a
Ellen Lougheed pour avoir dactylographié cette th~se.:pour terminer, je dbire exprimer ma gratitude '1 mon mari Denis
pour son support constant.
Ces études d, I18ltrise ont 't~\ rendues possible avéc l'aide du Fonde pour la formation de chercheurs et l'aide'
a
la recherche, du Fond. pourla
recherche ~n sant6,du Qu'be~ alnsl que le Mln18~;re de.,.
l'Education du Qu'bec. l, ~-J
1. /~'l:o;,j...-
,
al..
•
/"
". vii.
,TABLE DES MATIERES
PAGE
; '
REsumê • • • • • • • • • • • ... • • • • • • •
·
• • • • • • • 'iti Abstract _ • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • ~ • • • •,.
iv Remerciements • • • • • • • • • ••
• • • • • • • • • ••
•
• vTable des mati~res • • • • • • • • • • • • • • • •
•
• • • • • vi Liste des abbr~viations·
• • • • • • • •· ·
• • • • • • • • • • vU1 Liste des tableaux • •.
• ~ • • • • • • • • • • • • • 0 • • 0 • ixListe des figures 0
·
• 0 • 0 •.'
.
•·
0 • 0 •·
• • • 0 • 0 • • x CHAPITRE 1Introduction
· · ·
• • • • • • • 0 .' 0 • •A. Maturation des pr~curseurs érythroides • • • •
.
• • -" 0 B. Maturation du réticulocyte·
• 0·
•·
•·
• •1. ARN • • • •
·
• • •· · ·
• •· ·
• • • • • •·
2. M~tabolisme des glucides • •
·
• 930 Métabolisme des protéines et des lipides JO • 0 0 0 10
40 Membrane plasmique • •
· ·
• • • • • 13--...\
4.1 Organisation· ·
•·
• • • • • •·
134.2 Rales de la membrane·
· · ·
• •·
• ••·
• • 204.2.1 Syst~mes de transports • • • • • • • • 21 4.2.2 ' Les :-écepteurs • • •
· ·
• • • • • •·
• 23--4.3 Changements lors de la maturation
·
• •·
• • • 26 CHAPITRE 2 Matériels et méthodes ~ •·
.
• • • • • • • • 0 • • •· .
.
• • o 31 b CHAPITRE 3 Origine de la protéine de 70 kd • • • 0 • • • 0 • • 0 0 0 • 0 • • 41 CHAPITRE 4 Identité dé la protéine de 70 kd • • 0 0 0 0 • • • • 0 0 • 0 • • ' 64 , CHAPITRE 5 Discussion • • • • • • ••
• • • • • • • • • • • • • • • • • • • BIBLIOGRAPHIE '\•
• • • • • • • • • • • ••
• ••
• • •·
,
.
.
APPENDICE • • • • • • • • • .~~. • • • • • • • • • • • • • • • • • 77 85 95, .. _.. ~ \-o
ADN:
ADP: AMP: ARR: ARNase: ATP: ATPasé:,.... oC: CFU-E: CFU .... S: CTP: DMSO; EnTA: EGS: G:~ g: GTP:3H:
BRP: ,.
IgG: Id: M: mARN:..
IIlCi: .ma/à!:
ml: r mM: msecondes: IDI: lDIole: PAGE: PAS: PMSF:(
RPM: SDS:tl:
tARN:TBS:
TCA:
TRIS: uCi:-ua/al:
ul:uM:
..- UTP: . ,\
-~ste des Abbr6viations
dêide -dêsoxyribonuclC§ique AdC§nos1ne diphosphate, . Adênosine monophospha te Acide ribonuclGique RibonucUase Adênosine triphosphate AdEnosine triphosphatase Degrê Celcius
Colonie formant des unitEs C§rythroides . Colonie formant des unitês» cellul,e .souche
Cytidlnoeine triphosphate Dimêthyl sulfoxide
Ethylênediaminé têtraacêtate
Ethylêne glyèol bis (succlnimidyl-succ1nate) Phase de croissance
Gramme
Guanosine triphosphate Hydrogêne tricié
Pêroxydase de raifort de cheval Immunoglobuline gamma
Kl1odalton Molaire
Acide ribonuclGique messager milliCurle
Milligramme par millilitre Millilitre
M111i1P.0le ml11isecondes Nanomètrr-,
Electt\()phor~ e stfr gel de polyacrylamide
nanom~le \~
.Acide pêx:.iod que de Sc~f
Flu~rure d~J~hC§ny~ mêthyl sulfonyllique
• R6volutlons P1r minute Dodêcyl sul e .de sodium
demI-vie ~
Jc1de rlbonuclC§ique de' transfert Tampon tris-saline
Acide trichloroacEtique
TtIhydroxymêthyl aminomêthane microCurie
Micr~ramme par mil'lilitre lIicroli tre Micro.ole Uridinosine triphosphate , '
..
--viii•
...
. . f
o
ixListe des Tableaux
... PAGE
1. Hêtabol1s~e et composa~tes du r~ticulocyte et de
l'érythrocyte • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 8
2. Enzymes dont l'activitfi est rfidulte de 2
a
3 foislors de la maturation de r~tlculocytes • • • • • • • • • • 10
3. Activit~ d'ATPase dans les r v~slcules • • • • • • t • • • • \ 10
4. Actlvit~ d'ATPase de bandes de prot~lnes obtenues
d'un gel SDS •• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 11 Il'
..
,
••
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(
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x
Liste des Figure,s
Page 1. Hod~le de la myé1opoi~se
.
. .
. .
.
. . .
. . .
.
.
.
.
2 2. Illustration schématique des év~nements de l'érythropoièse • 4 .. 3. Organisation moléculaire des protéines du cytosquelette • • 174.
5.
P~~j~eptidique des vésicules ex~rnalisées • • • • • Cartes peptidiques des résidus 1251 tyrosyl des
pro~~ines
. .
43de 69 et 70 kd • • • • • • • • • • • • • • • • • • • - - 46
6. Effet du ~ -mercaptoéthanol sur le do~blet de protéines
dé 70 kd • • • • • • • • • • • • • • • • • • •
. . .
487. Cartes peptidiques,des résidus 1251 tyrosyl de l'albumine 51
8. Effet de l~ -chymotrypsine sur les membranes
réticulocytaires • • • • • • • • • • • • • • • • • •
c. . . •
539. Cartes peptidiques des résidus 125
r
tyrosyl des protéines provenant de membranes plasmiques traitées à1 \I(-chymotrypsine et de vésicules • • • • • • • • • • • • • 56 10. Cartes peptidiques des résidus 1251 tyrosyl des peptides
provenant de vésicules et membranes érythrocytaires • • • • e 58
11.< Cartes peptidiques des résidus 1251 tyrosyl de l' ankyrine
et de la protéine de 70 kd • • • • • • • • • • • • • • 60 12 "Crosslink" de rt!cepteurs de la transferrine avec les
protéines ellvlronnantes • • • • • • • • • • • • • • .. • • • 13. "Immunoblot" du peptide de 70 kd avec l' anti-tluncoating
63
clatherine ATPase" • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 66
14. Cartes peptidlques des résidus 125
r
tyrosyl de la protéine de 70 kd et de l"uncoating clatherine ATPase"du cerveau de veau • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 15. Spécificité de la protéine de 70 kd provenant de vésicules'
69
pour l'ATP • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 74
16. Speciflcité de la protéine de 70 kd provenant de vésicules
o
o
..
"..
' l INTRODUCTIONLe r8le du globule rouge est d'être le véhicule servant
a
la synthêse, au transport et à la protection de l'hémoglobine; pigment essentiel à la vie de la cellule. Le globule rouge est produit par~ythropoiese normoblastique. Celle-ci s'effectue dans le stroma de la moelle des os à l'extérieur des sinusoides (1). La cellule initiale est appelée la cellule souche. Celle-ci poss~de la particularité d'être capab1&-de se renouveler et de donner la vie à une progéniture nombreuse et différente (2). Elle représente 1% des ce11ules
hêmapoiétiques (3). La descendance possib,le de la cellule souche est reprhentêe à la figure 1.
Pour arriver à produire un érythrocyte, une série de
dlfférenciat'ions et de maturations est nécessaire. Celle-ci se compose de cinq stages comme on peut le voir
a
la figure 2. Les scientifiques se sont penchés sur les facteurs qui influencent cette cascaded'êvénements et ont trouvé que l'érythropoiétine régularise
l'érythropoiêse tout en optimisant la concentrati9D de l'hémoglobine dans le sang (4). Des équipes de chercheurs ont démontré que
f
l'êrythopoétine augmente l'incorporation du fer radioactif dans les tissus hêmapoiétiques (5-7). D'autres étuqes ont aussi démontré que 1'êrythropoiétine accrott la synthêse d'h dans des cultures de cellules de moelle osseuse
.1'~opoiêtine agit sur 1
éry-throide (CFU-E) pendant 1 production
probable que
descendance
et a comme effet d'augmenter la Cette synthêse est le premier signe biochimique détectable de la différenciation des cellules (9) •
o
-o
BFU-E1
CFU-E Siries ~rlhrOCYta1re. Globules rougesCellule Bouche du genre
.
myfiloide-Iymphoide CFU-S/~
CFU-H CFU-C1
{ I
Famille desmérCarYCyte.
Famille desSlnUlocYt ••
Plaquettes Granulocytes Famille lymphoide Famille des monocytes1
MacrophagesFigure 1. Mod~le de la my'lopoi~se
Les classes de cellules 'crites en majuscules peuvent @tre d'tectfies par des tests de formation d~ colonies.
CFU-S: BFU-E: CFU-E: CFU-K: CFU-C:
Cellule souche pluripotentielle
Progl!niteur primitif des 'rythrocytes Progl!niteur mature des I!rythrocytes Progfiniteur des ml!gacaryocytes
Progl!niteur des granulocytes, monocytes et
~ macrophages aussi appell! CRU-GM pour colonies
formant des u~s de granulocytes et de macropha~es
Traduit de Till.
J.
E. and KcCulloch, E •. A., Bioc. Btop. Aèta, 605,431-459,1980.
,
3
Figure 2. Illustration acb6aatique~dea 'v.6nementa de l'érythropoiise.
Elle d6bute avec la cellule ~ouche pluri-potentielle et s~ t~rmine avec l'firythr4cyte -mature. Sous l'action de stimuli appropri6s, la
cellule souche pluripotentielle se transforme en cellule formant des unit6s 6rythroides. L'fitape, suivante du d'v6loppement est l'6rythroblaste, le premier'pr6curseur ~rythroide morphologiquement reconnaissable. Puis l'érythroblaste passe par 3 stages de matur~tion dfifinis arbitrairement 0 soient le normoblaste basophile,
, Rolychromatophile et orthochromatophile. Tout au long de cette maturation, 11 y a trois ou quatre divisions mitotiques des cellules. Le
r6ticulocyte app~ralt
a
la suite de la perte du noyau picnotique par le normoblasteorthrochromatophile. Le réticulocyte mature en
6ryth~ocyte en circulant dans le sang. Le' processus de maturation dure 72 heures à partir de l'érythroblaste jusqu'au réticulocyte, puis 48
heures supplémentaires sont nécessaires à la maturation du réticulocyte.
•
Traduit de Izak, G., Prog. Hematology, ~, 1-41, 1977.
1
o
.'.
\
,
" , ' ....
, .\
~ - "\\
""" -Cellule souche pluripote~tielle (CFU-S).r "-,
.
Hormoblas~e basophile Nol"ll1Qblaste . po1ychromatophile -Hormoblaste orthochromatoph11e Rêticulocyteo
~ \o
ro
1 \ -"'D'autres facteurs influencent la. stimulation des eellule.
'souches vers les globules rouges, parmi lesquels on note les
.,,;
androg~ne8 (10, Il), l'hormone de'croissance (12)~ l'acide
ad~nosine 3', 5'-phosphorique cyclique- (7-13) et la prolactine (14) entre autres.
A. Maturation des precurseurs ~rythroides
Main~enant que les cellul~s souches se sont transform~es sous
l'influence des facteurs mentionnes plus haùt en précurseurs
erythroides, la maturation peut commencer. Les caracteristiques de
ce~le-ci sont la synth~se de l'hémoglobine et l'élimination comp1~te
ou partielle des organelles cellulaires. La transformation de la
1 cellule érythrolde en~ratne de profonds changements morphologiques et
,
-biochimiques. Il y aura un certain, nombre 'de divisions cellulaires
,
qui sont influèncées'par la vitesse de production de l'hémoglobine.
Le changement majeur qui intervient est <un arrêt progressif de la
synth~se ~e l'~DN, de l'ARN ainsi que des protéines.- Cependant pour
,qu'il y ait arr~t complet de la synth~se des acides nucléiques, la
-quantité minimale d'hemog10bine presente dans la cellule doit être de
10%(15) ou 20%(16) selon les auteurs. Mais voyons plus en d~tail les différents ~~~nements ayant lieu lors de la maturation tels '
qu' ident1fi~s
a
la figure 2. '\==
o
j
o
[
Durant le normoblaste basophile, la synth~se de l'ARN d'crott
et le nuclfiole disparatt. Le transfert de l'ARR du noyau au
cy~oplasme cesse (17). La cellule est incapable de renouveler par
synthlse ses ribosomes, mitochondries, mARN et tARN (6, 18, 19). La
\ '
longfivitfi de ceux-ci est le facteur limitant la snyth~se des .
protfiines. Selon Thorell (20), la synth~se de l'hémoglobine ne
commence que tard au normoblaste basophile ou t8t dans le normoblaste
polychromatoph1le. Borsook (21) explique le phénom~ne par la
poss1bilid qu'un "inh~b1teur de la synthèse de l'hémoglobine soit
perdu avec la disparition de l'ADN ou encore qu'une protéine masque le
segment nécessaire
a
la synthèse des mARN de l'hémoglobine. Le,taux de synthèse des protéines ne change pas beaucoüp durant la-maturation. Il est probable que lorsque la synthè~e de l'hémoglobine
cODence, elle remplace les autres protéines. L'hémoglobine
comprendra jusqu"
a
95% des protéines de l' érythrQcyte (21).Tard dans le stade normoblaste orthochromatophile, le noyau est
expulsfi (22). En m8me temps que le noyau est perdu, la synthèse d'ARN
cesse (5,18,21,23). Rapopor-t et'al. (17) définissent l'arriv~e au \
\
stade du réticulocyte ~r l' arr@t de la synthèse de l'ADN. Le
r'ticulocyte est considfiré comme une cellule anuclfiée ou nucl'ée sans
,synthlse d'ADN mais contenant des mitochondries et des ribosomes
fonctionnels. Les deux majeures difffirence8 entre les rfiticu10cytes
et les autres cellules prfi-érythrocyaires sont l'absence de réticulum
,
endoplasmique et du noyau a1nsi que la pr'sence de seulement quelquesreliques de ly8080me8 et de vacuoles cytoplasm1ques 'chez le
r't1culocytè (17).
·0
o
Le dernier stagê de maturation est la transformation du ri
!il
r6tieulocyte'en érythrocyte. Celui-ci est caract'ris6 par la
disparition des ribosomes, mitochondries et yacuoles cytoplasmiques.
7
. La synthèse des protéines et la respiration sont 6limin6es tout comme
~ d'autres enzymes et protéines de la membrane et du cytosol. Au
t~bleau,l, les diff6rences entre le réticulocyte et l'érythrocyte sont
enumérées (l,
175.
~
Maturation du réticulocyte,1. ARN
Le réticulum du réticu~ocyte vu' au microscope optique apr's
coloration avec le bleu méthylène est en r6alité des polyribosomes
• précipites et non comme on l'a longtemps cru, le réticulum
endoplasmique (24). La classification des réticulocytes selon quatre ,
....
stades est basée sur la 'quantité et l'apparence de l'ARN (25). La
quantité d' ARN présente dans les cellules réticulocytaires diminue
avec l'âge. Le réticulocyte contient 0,1 - 1,0 g d'ARN par 100 ml de ,cellule et l'érythrocyte en possède 10-35 mg
(17).
L'absence de synthèse d'ARN dans les i~ticulocytes a 6t'
# • '
vérifiée par plusieurs cherçheurs. Ils ont démontré par l'incubation
de réticulocytes avec des précurseurs radioactifs sotent 3H-cytidine,
,3H-uridine cet 3H-adénosine que l'~ncorporation n'a pas lieu dans l'ARN (26-29) •
Plusieurs enzymes-ont ét6 découvertes dans les réticulocytes de
lapin quant lIeurs r8les joués dans la d'gradation de l'ARN. On'
o
,'Il
\
Tableau 1:
1 M'tabo11sme et composantes du t~ticulocyte et de l'~rythrocyte
M~tabolisme Synth~se ADN Synth~se ARN Synthlae'h~mo816bine Synth~se prot~ines Synth~se puri~eé Synth~se pyrimidines Synth~se lipides Respiration Cycle de Krebs Embden-Meyerhof Phosphogluconate
Catabolisme acidès amirt~s Transport acides amin~s
Transport cations
Composantes (mg/ml)
!RN
H~moglobine
Proteines moins h~md8lobine
Lipides -' R~ticuloc'yte x x x x x x x
x
x x x x 4-25 200-300 45 9 1 ; iF ".
.,
Erythrocyt~ x x quelques-uns x 0,3 330 15 5 8 ... i" . ,. ,,-•-o
o
9
enzyme est responsable de la d~gradation des ribosomes. Une autre, la
phosphatase acide du stroma, produit des
nucl~otiJes
3' (17). La ARNase d'Adachi et al. (30) produit des fnagm~nts contenant des, purines et pyrimidines 2' et 3'. Une autre ribonucl~ase caract~r1s~e -dans le reticu10cyte de lapin dégrade l'ARN en oligonucléotides de six9&ses. Elle pref~re les àcides polYCytidyliques et
1
,polyuridyliques (31). Enfin Burka (32) a identif~é une ARNase de lapin qui se retrouve dans le stroma et aussi liée
a
la membrane. Cette derni~re est plus active pour d~grader les polyribosomes.Toutes les enzymes mentionnées ont l~urs copies diminuées lors de la
maturation de la cellule erythrocytaire.
\
2. Métabolisme des glucides
Beaucoqp d'etudes ont démontr~ que l' ~rythrocyte des mammifires n'utilise que la voie ana~robique d'Emden-Heyerhof pour produire
l'énergie nécessaire au maintien de ses fonctions (33, 34). Pour sa
part, le réticulocyte utilise la même voie ainsi que 'la
.,
phosphory1ation oxydative mitochondria1e pou~ ses besoins
'.
~nerg~tiques. Gasko et Danon (35) ont établi que le cycle de Krebs
diminue pour finalement d1sparattre lors de la maturation dU}
réticulocyte. Deux hypothêses sont possibles pour exp~lquer l~
mécanisme de cette perte: l'expulsion des mitochondries ou
l'inactivation des tnzymes par la dégradation des mitochondries. Par
microscopie électronique et des mesures de la respiration, Gaeko et
Danon (36) ont d~montré la corr~lat1on entre la perte graduelle de -la
capacit~ de production aérobique d'ATP et la dégradation,des
o
o
mitochondries lors de la maturation. Rapoport et al. (17, 31-40)
concluent aussi~a une d~gradation des mitochondries-par l'observation
de l'activit~,de la succinate d~shydrog~na8e.
Les diverses enzymes compos~nt les voies métaboliques ont été
étudi~es par plusieurs chercheurs. Selon les enzymes, Ils ont
d~montré la variation de leur activité en fonction"du degré de
10
maturation du réticulocyte, comme on peut le voir au tableau 2 (41-46).
,~ Tableau 2 Enzymes dont l'activit~ est réduite de 2
a
3 fois lors de' la maturation du réticulocyte. Phosphog1ucose isomérase Phosphofrutose kinase Aldolase 2,3-dlphosphoglycérate muta se MOdOpho8phoglyc~rate mutase Pyruvate kinase Lactate déshydrog~nase Glutathione r~ductase Hexokinase Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase Phosphoglycérate kinase Enolase Glucose-6-phosphate déshydrogénase 6-phosphogluconate déshydrogénaseD'autres enzymes comme par exemple le cytochrome oxidase, le succlnate
déshydrogénase et l'aconitase sont absentes des érythrocytes (46).
3. Métabolisme des protéine~ et des lipides
...
L'étude de la syntb~se des prot~ines ?ar ~~ r~ticulocyte et
l'érythrocyte s'est surtout faite par l'incorporation d'acides aminés
radioactifs dans ~es protéines. Schulman (29) ainsi que Borsook
et al. (47) les ont utilisés pour d~montrer la relation entre leur
o
o
montrE qu'avec le temps, les rEticulocytes n'incorporent plus les
acides aminEs radioactifs. Par ailleurs, les protEines synth6tis6es
sont surtout de l'hémoglobine. London et al. (48) l'ont dEmontrE_en
mesurant la radioactivité de l'h~me en relation avec le, degrE de
maturité de la cellule érythrocytaire. Une autre équipe de
chercheurs, Pinheiro et al. (26) est arrivée au m@me résultat en
calculant le rapport de 3H-leucine/3H-tyrosine des protéines
synthétisées. Ce dernier-ést similiaire à celui de l'hémoglobïné ••
Une autre confirmation est apportée par Woodward et al. (49) qui par
..
l'incorporation du tryptophane et de la tyros~ne triciés dansl'hémoglobine ont obtenu un pourcentage de protéines synthétisées de
95%
Une premi~re hypoth~se proposée par Glowacki et al. (50) pour
expliq~er l'arr@t de la synth~se des protéines est l'inactivation des
polyribosomes. Une autre plus récente propose qu'il soit plut8t,dO i
la limitation des facteurs d'initiation de la synth~se des
prot~ines (17).
~
Dans la littérature, il a été rapporté que l'activité
catabolique des protéines est plus élevée dans les réticulocytes que
11
dans le~ érythrocytes. Cette activité joue ùn r8le d'élimination des. protéines aberrantes. McKay et al. ~51) ont demontré que la
destruction des protéines aberrantes diminuait avec l'augmentation de
l'âge de la cellule réticulocytaire. D~utres protéines parfaitement
•
normales sont aussi ~œinées pendant la ma~uration du réticulocyte
~
o
o
"
provenant du,cytosol du r'ticulocyte de lapin sont absents chez ~es
r /
Irythrocytea (52).
La destruct10n ,,~es prot~ines est caus~e par diff~rentes enzymes dont les endopeptidases et les exopeptidases regroupées selon leur pH
,
optimum et leur besoin d'ATP. Melloni et al. (53) ont,etudié la
• dlff~rence des nlveaù~ d'activité des enzymes entre le rétlculocyte et
l'~rythrocyte du lapin. Plusieurs prot~ases montrent une diminution
il:
radicale comme par exemple l'endopeptidase neutre, l'endopeptidase
acide ainsi que l'aminopeptidase A et la carboxypeptidase. Les
'prot'ases class~es selon leur besoin d'ATP démontrent elles aussi une
diminution de leur activité (54.55). Cette diminution d'activit~
semble liée
a
la perte sélective ou l'inactivation de l'ubiquinone ou de peptides reliés ~ celui-ci (56,57).Les lipides synth~ti8~s par le réticulocyte sont compos~s à
part ~gale de lipides neutres et de phospholipides. L'érythrocyte'
synth~tise dix fois moins de lipides qu~ le r~ticulocyte (58).
L'incorporation de linoléate dans les phospholipides est quatre fois
"-moindre chez l'érythrocyte (59). Pour le catabolisme des lipides, peu
d'informations sont connues jusqu'à maintenant sur l'activité des
enzymes impliqu~es et leur disparition lOfS de la maturation du
rlticulocyte.
D'autres enzymes ne faisant pas partie des cycles m~ntionnés
plus haut et présentes dans le cytosol sont aussi affect'es par la
1
asturation du rétlculocyte. La superoxide dismutase est une de ces
, '
e~zyae.. Elle décompose les Interm~diaire8 dangereux du,~~abolisme
de l'oxyaine. Elle 8ubit une diminution de son activit~ lo~~ de
o
1 1 '•
'.
.
.
l'érythropoi~8e (60). D'autres protéines en~ymatiques ont leur activité diminuée par exemple la kinase de la caséine (61), la 'phosphorylase des nucléosides' purimidiques (62),
~nosine
désaminase (62).
4. Membrane plasmique
4.1 Organisation
Les membranes de la cellule érythrocytaire constituent une
barrière qui lui permet de garder son inté~rit~ et restreint ses
,
13
échanges avec son environnement. Elle se compose principalement d'une
d~uble couche de lipides i.e. de phosphatidylchollne,
phosphatidyléthanolamine, phosphatidyls~rine,S~hingomyéline et
cholestérol, de protéines, intégrales ou périph~riques et enfin de glucides sous forme de glycoprotéines (63). Les membr~nes
érythrocytaires sont formées à 52% de protéines, 40% de lipides et le reste soit 8% de glucides {64).
--Parmi les quatre-vingt-dix protéines constituant la membrane de
.J.
l'érythrocyte humain, 30% sont transmembranaires et poss~dent une
partie d'elles-mêmes à l'extérieur de la membrane. La majorité des autres protéines, soit 50% est associée en une structure très bien
organisée qui est accollée à la membrane du c8té cytoplasmique (65,
'66). Les premi~reB'sont dites protéines intégrales i.e. imbriquées 1
~ans la membrane, alors que le6 secondes sont périphériques
a
celle-ci. Le groupe dEs protéine~ intégrales est composé principalement de glycoprotéines, de récepteurs, de la bande 3 et la bande 4.5,o
o
-.
Les glycoprot~ines contiennent 64% de g~ucides et 28% d'acides
N-ac~tylneuraminique
(64). CertainesglYCOproté~es
sontnomm~es
d'apr~8 une coloration
a
l'acide p~riodique de Schiff, i.e. PAS-l, PAS-2 et PAS-3. D'autres sont appel~es glycophorine A, B et C. La\
14
glycophorine A repr~sente 75% des glycoprot~ines totale~. Etant donn~ que la glycophorine A migre dans la même région que PAS-l et PAS-2 sur
un gel d'acrylamide, il est possible qu'elles soient les mêmes
prot~ines mais avec quelques petites modifications (67-69). Certaines
parties de la glycophori~ A. seraient reliées au groupe A dans le
syst~me ABO sanguin et aux déterminants M et N du globule rouge (63, 69).
La bande 3 est la plus abondante des protéines intégrales ainsi
que de la membrane de l'érythrocyte. C'est une glycoprotéine et il
~t
fort possible qu'elle existe sous forme de dimère dans la membrane. Cette protéine est très importante car elle permet à la cellule d'échanger ses ions de bicarbonate pour des ions de chlore.Peu d'informations sont connlles au sujet des protéines de la région
4.5, mais on pense qu'elles pourraient être impliquées dans le
transport des monosaccharides et des nucl~o8ides.
Les protéines périphériques sont regroupées dans une structure ~
matrice filamenteuse de protéines que l'on r~cupère ,après l'extraction
des prot6ines int~grales et des lipides
a
l'aide de TritonX-IOO
(71, 68). \ Le microscope électronique permet une visualisation du
••
-15
cytosquelette. Il est compo8~ de structures orient~e8 p8ral~llement
au plan de la membrane. et d'un rl!seau anastomique de fibres filamenteuses d' un diam~tr~ de 8
a
9 nm (68). On croit que les protl!1nes du cytosquelette sont responsables du maintien de la forme de la cellule, de son élasticité ainsi que des fonctions decommunication à travers la membrane (68, 70).
Le cytosquelette de l'érythrocyte' est cfmst1tué d'une douzaine de protéines, nommées d'après les
ba~~es
duge~e
Faibanks (67). Une ~eprl!sent8tion du gel et de l'organisation moléculaire des protl!1nes est soumise à la figure no.3. Le cytosquelette est composé des bandes'..
suivantes: 1,2,2.1,4.1 (a et b), 4.2,4.9 et 5.
Voyons maintenant plus en détail les composantes du
cytosquelette érythrocytaire. Les deux premières bandes (1 et 2) sont la spectrine. Elle constitue 25% des protéines totales de la membrane et 75% du cytosquelette (66, 72, 69). Elle se compose de de;tx
chatnes, ~ et(3, de poids moléculaire de 240 kd et 220 kd,
respectivement. Ces deux sous-unitl!s possèdent des polypeptides '--- différents avec des domaines communs (66, 6.8-, 69, 72). La spectrine
s'associe à elle-même en solution pour former le
tétram~re~2~2'
L'association est de tête à tête et apparatt au microscope,
~lectronique sous forme de molécule à double brins enro~lés sur elle-même (66; 68, 72). La chatne bétS est liée à la membrane
(
--intérieure de la cellule alors, que l'alpha ne semble pas avoir la m@me ., propriété (66, 69).
L • ankyrine ou les bandes 2.1, z;2 et 2.3 ont un poids
moléculaire de 210, 183 et 165 kd respectivement. Des exp~riences
~I
•
(~,.
Ft.sure 3: Organisation moUculaire des prot~lnes du cytosquelette
(A) Sch6ma illustrant la distribution transmembranalre etJ.1' association moUculaire des principales protéines mellbranaires du globule rouge. La partie sup6r1eure r~presente le milieu
extracellulaire.
(B) - SeMma d'un gel d' acrylamide":SDS de 5% montrant les protéines membranaires du globule rouge selon la méthode de Fairbanks
et: al •• (1981).
-Traduit de Cohen.~ C. de Seminars in Hematology, 20, p. 142, 66. 1983.
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'avec des agents protE~lytiques ont d6montr€ que l' ankyrine poss~de plusieurs domaines repli's sur eux-m~mes (68). On croit que le r8le de l'ankyrine-e~t de maintenir l'association du cytosquelette et de la lDembrane plasmique par l' Intermediaire de la bande 3 et la spectrine.La r'gion du _ gel d'nomm~e bande- 4 comprend plusieurs prot'ines
.
dont on ne connatt pas encore les fonctions dans le cyt~squelette. Les bandes 4.1, 4!2 et- 4.9 sont des prot'ines du cytosque1ette. On sait que la protéine 4.,1 ~eut être subvisée en bande a et b. Pour la protE,ine 4.2, on cqnnatt son poids moléculaire et on sai t qu'elle se retrouve sous forme de tétram~re (68). La bande 4.9 est une
phosphoprotéine. Elle s'associe ! la chatne Mtâ de la spectrine. Elle stabilise aussi les petits segments d'actine en réduisant leur vitesse de polymérisation (66). Enfin, la derni~re protéine connue du cytosquelette, est l'act1ne ou la bande 5. Elle est un élément
important du' cytosqu.elette au m~me titre que la spectrine et
1
~ l' ankyrine. Elle se retrouve sous forme d' oligomères de dix uni t~s ~t
poss~de des propriétés semblables! celles du muscle (66).
Le cytosquelette est un assemblage des protéines mentionnées plus haut. Elles interagissent ent~e elles et avec les autres protéines membranaires pour former un réseau tridimensionnel. Plusieurs interactions s'y produisent.
La premUre interaction étudiée est celle spectrine-ankyrlne-bande 3. Il Y a un site de 11aison pour l ' ankyrine par hétérodlm~re
de spectrine ~2h). L' ankyrine pos8~de un domaine de 72 kd qui lie 'fortellent la spect~rine: Ce domaine peut être coupE avec des agents
p~ot'olytlques comme l'c\-chymOtrypslne et par,conséquent l'ankyrine
o
ne s'associe plusa
la spectrlne (159). L'ankyrine est le pivot qui ·19ancre le cytosquelette à la membrane lipidique par l'intermêdiaire de
\
la spectrine et de la bande 3. Une mole d'ank~rine lie trois ~oles de
bandes 3. Malgré le ratio de un pour trois, il Y a beaucoup d~
bandes 3 qui ne ~ont pas liêes par l'ankyrine puisque le nombre des
derniêres e~t dix fois moindre que la bande 3 (66). Il n'est pas
a8s~ré que les bandes 3 soient toutes capables de s'associer avec"
l'ankyrine. Il semble que toutes les bandes 3 soient identiques entre
elles (72).
La bande 3 est aussi associée à la bande 4.2 et à la bande 6, i.e. la glycéraldéhyde déshydrogénase. Un tétram~re de bande 6 lie un
tétramère de bande 3 (64, 75). çette liaison de la glycêraldéhyde
dêshydrogénase semble coopérative. Lorsqu'on purifie -la bande 3, la
,bande 4.2 est aussi excisée de la membrane à moins que l'on ajoute' des agents dissociants (75). Il semble donc que le tétramère de la
'f
bande 4.2 soit associé à la bande 3. Là raison de eette association est inconnue. Par l'induction~de liens covalents entre les protéines
l l'aide de composés chim~ques, il a été démontré que la bande 4.2 est
associée à la spectrine (69). <
~
Une autre association importante, est cell~
actine-spectrine-bandê 4.1. L'actlne est dans un état non
filamenteux, i.e. sous forme de G-actine. Il semblereait que pour
avoir la formation de F-actlne (actine filamenteuse), i.e. la
polymérisation de celle-ci, la spectrine et la bande 4.1 soient
nécessaires. Celles-ci
sta~iliseraient
l'actine etconstituerai~t
le noyau de cytosquelette. L'actine existe dans un êtat dynamique, 1o
\
o
fi
l'&quilibre entre le8 formes-G et F. Quelques complexes poss~dent
..
l-actine sous forme polymetis~e et sont n~cessatre8
a
la r~action qui entratne la polym~risation enti~re de l'actine (72).'Le t~tram~re de la spectrine peut lier covalemment et
s'associer les filaments d'actines. L' associatio~ u de F-actine avec la
speétrine est faible et a besoin de la prot~ine 4.]. pour la stabiliser. La bande 4.1 promouvoit et durcit les liens qui les unissent, possiblement par une enzyme dépendante du calcium (68). Comment 'la bande ,4.1 agi-t. sur ce lien n'est pas-clair. La spectrine
poss~de d,eux sites pour la ban4e 4.1 un sur chaque bout (73). Le raIe de la bande 4.1 semble être de maintenir l'élast~cité et l~ forme de la membrane (66, 72). La structure du cy,!=osque1ette se compose d~
t'tramares de spectrines. reliées par leurs extrémités et par
e
l'entremise de la bande 4.1 à des points de jonction que sont les protofilaments d'actine
(73).
Une autre protéine faisant partie de ce complexe est la bande 4.9. Celle-ci pourrait être impliquée dans la stabilisation de courts filaments d'actine en réduisant la vitesse depolym~rlsatlon de l'actine (66).
4.2. RaIes de la membrane
La memb~ane sert de barriare, elle limite les ~changes de la cellule avec l'ext~rieur. Malgr~ tout, il existe des m~canismes qui
lui permettent de communiquer avec son environnement. Ell~ poss~de
des portes et des sonnettes qui sont des moyens de véhiculer des
,
met&riaux et de l'information. Ceux-ci sont respectivement les
sy.tames de transport et les récepteurs. Parmi les premiers, on peut
•
/
.;
o
-0
.
.,
21
4
noter les transporteuJ;'s ~es suc'res, des nucUos1des, des acides
.
aminés, dès anions et des cation~. Les récepteurs sont nombreux et assurent les mecanismes d~licats de rl!gt11aflon d!!s processus
. fondamentaux de la cellule. Pour en nommer quelques-uns, 11 Y a les récepteurs béta-adénergiques, ceux de l'insuline et de la transferrine.
\ '
4.2.1. Systèmes de' transport
Une controverse a longtemps' existé au sujet du transporteur des sucres. Longdon (76, 77) affirmait que la bande 3 était le
transporteur et que la protéine de la région 4.5 était seulement une , partie de celui-ci. Plusieurs autres chercheurs_ on~ démonêr~ en
utilisant diverses méthodes dont des coupures protéolytiques (78), de la cartographie peptidique (79) et des anticorps monoclonaux (80) que
'\
,
la bande 3 et la bande 4.5' sont des protéines différentes et que c'est la protéiné' de la région 4.5 qui est responsable ,du transport des sucres. Depuis, la séquence du transporteur du glucose a ét~ publl~e
'Ii
par Mueckler et al. (81). Elle correspond à la séquenc~ d'une protéine de poids moléculaire de 55 kD, donc faisant partie de la région 4.5. De p~s Sase' et al. (82) ont soulevé l 'hypoth~se que la bande 7 soit elle' aussi impliqu~e dans le transport des sucres. Par
..
ailleurs, le transporteur des nucléosides a ét~ lui aussi identifiE
a
là région 4.5 , , (83).J Les acides aminés sont des composants essentiels
a
la cellule •.
Le réticulocyte doit pouvoir les assimiler pour produire ses protéines et autres composants cellulaires. ',. Pour ce faire, 11 utilise divers systames de transport regroupés selon les ,affinités des acides
•
o
-&IIIin' •• Certaine ey.tbes sont d'pendants du sodium et d'autres ne le lont pas,,. Les syst~mes d'pendants du sodium présent chez le
\
r'ticulocyte des animaux ~up'rieurs sont lès suivants: le syst~me Gly transporte la glycine et la sarcosine, le système A achemine la
major.id des acides ami~'s sous leur forme zwitterion, le système ASe
transporte l'alanine, la s~rine et la cyst~ine, le système B est
• utilis" par la (t>-alanine. la taurine et 1 , r acide 4-aminobutyr:l.que. , Ces syst~mes transportent les ac:l.des aminés sous leur forme de
zwitteribn. D'autre systèmes véhiculent les acides aminés sous leur forme anionique parmI' lesquels l,.es systèmes X
AB
et XA•
Ils sont.
utilisés respect! vement par l ' aspartate et le glu~'amate pour le premier et l ' aspartate seulement pour ,~,J.e
.
second (84) •Les systèmes, connus chez le globule rouge des mammifères, ind'pendants du sodium sont au nombre de trois. Le système L préfère les acides amin's branch's avec des chatnes apolaires i.e. la
phenylalanine, la leucine, la valine, la tyrosine et la méthionine (84-86) • Le système T, présent principalement chez les globules' rouges de 1 'humaln~ est util:l.s' par la tyrosine, la phénylalanine et le tryptophane (84, 85). Le dernier système est le système..J1+. Il transporte l ' arginine et la lysine (84, 85, 87). Comme on peut le remarquer, les diff'rents systèmes se chevauchent •
. Pour terminer avec les systèmes de transport, 11 Y a bien"; sar
·188 anions et les cations. L"change des anions·est effectué à
travere la membrane par l'intermédiaire d!oune protEine très bien
•
caract'risée, la bande 3. La bande 3 est la glycoprdt':l.ne la plus abondante de la lIembrane 'rythrocytaire. Elle repr'éénte 25% des
o
,,,,
, \
'.., -;..,...
protêines totales. Sa fonction est d'êchanger les ions bicarbonatêa
de la cellule pour des ions chlorurès (88). Cet ~change est
!g
ohligatoirement d'un ion pour un autre ion ét est électron!quement
neutre'. Le temps três rapide de cet êchange, tt: 40-60 msecoÎldes J
accrott la capacité du sang à transporter le C02 des ,tissus aux
, ,
poumons. Récemment, Kopito et Lodish (89) ont séquencê la bande 3.
Ils ont demontrê que la partie C-terminale est une partie
,
hydrophobique responsable du transport des anions et que la partie
N-terminale, p~us hydrophile, est responsable de la liaison'de "'!-'ankyrine. D'au~re part, le transport des cations Na, K et Ca est
principalement assuré par des ATPases (89a). Il existe aussi des
sysdmes de diffusion facilitée p~ur les ions Na, K et CL
4.2.2. Les récepteurs
Les récepteurs sont des protéines et sont imbrIqués à travers la membrane. Ils servent de portes entre les milieux externe et
23
interne de la cellule. Parmi tous les, récepteurs de la membrane, nous
en verrons trois.
Le récepteur béta-adénergique permet à la cellule d'enclencher
t
l' adén~late cyclase'" qui m~ne à la formation de l' AMP cycl1.que. Ce
dernier est une composante importante qui'permet de moduler des
fonctions diverses à l'intérieur de la-cellule. Les molécules qui stimulent ou inhibent l'enzyme, se lient au récepteur. Le syst~me se
compose de trois parties soient le récepteur, l'enzyme et une protéine
rêgulatrice liant un nucléotide (90).
o
•
..
)
'"
/Un autre r~cepteur important pour la, r~gulation de la cellule
est celui de l'insuline. Celui-ci est pr~sent dans la membrane,du
r~ticulocrte mais malheureusement peu d'inf9rmati~ns Bont connues a son sujet. On ne perçoit pas son ralé biologique chez le
r~ticulocyte (91) •
. La transferrine joue un raIe importànt et vital dans la
formation de l'hf;moglobine,' protHne majoritaire du réticulocyte •
.
Elle transporte le fer essentiel a l ' h~me-. Pour pouvoir déverser son
chargement de fer a l'intérieur de la cellule, elle doit pénétrer la
membra~e. Ell~ le fait par l'intermédiaire d'un récepteur.
Iv-Le r~cepteur ~e la transferrine a été identifié dans'plusieurs
types de cellules dont celles du placenta, de tumeurs et bien sOr du
r~ticulocyte (92, 93). Bockxmeer et al. (93) ont identifié une
prot~ine d'environ 275 kd liant la transferrine et se retrouvant
seulement chez le r~ticulocyte et non chez l'érythrocyte du lapin.
Chez plusieurs esp~ces ~tudi~es, le poids moléculaire varie de l7Ô à
200 kd pour ,le dilll~re. Le récepteur est const1tu~ de deux mono~~res
de 80
a
100 kd liés covalemment par un pont. disulfide (94, 95). Le-r'cepte~r est une glycoprot~ine transmembranaire contenant trois
.
unités de sucre. Cette protéine poss~de des groupements phosphatés et
d'acides gras (96,95). La 'proteine peut @tre coupé~,en deux domaines
Jo
d1ff'rents par la trypsine. Un domaine de 70 kd possadant le. site de
l1~lson de la transferrine et qui se retrouve sur l'éxtérieur de la
-.-brane plasmique. Un autre domaine de 5 kd est présent
a
, l'int'rieur de la cellule (95) •..
:'o
o
25
La transferrine lie le ter sous la forme fèrrique de l'&l'ment"
en présence d'ions biGarbonatês ou carbonat~8. Cette liaIson est
dépendante du pH, elle est favorisée par un pH variant entre 7,5
_-.---'e...,t .... 10. A pH 6,5, une dissociation partielle a lieu et
a
pH 5;5, el1~..
devient complête. La transferrine possède deux sites pour le
fer (92). La transferrine lie aussi d'autres atomes métalliques,
comme Jiar example le chrome et le cuivre. Une étude de Korrifeld (97)
- a démontré que l'association de la transferrine avec son r~cepteur est
grandement influencée par la nature et le nombre d~atomes m~ta1lique8
transportés. La constante de dissociation de la transferrine
diferrique est plus petite comparativement à celle de
l'apotransferrlne, la tranferrlne monoferrlque et la transferrine
.
liant le cuivre et le chrome ,au pH physiologique. L'hypothêse
suggérée par cet auteur est que la nature de l'Ion lié influence un u
changement de conformati9n de ,la transf~rrine lui permettant ainsi de
plus ou moins se li.er à son récepteur sur la membrane. La liaison de
la transferrine et de son récepteur est réversible et saturable. Le
pH optimum est de 7,8 (98).
A la suite de la liaison transferrine-récepteur, il y a
endocytose du complexe. 1l la différence de plusieurs complexes
"
hormone-récepteur, ce~ui-ci n'est pas dégradé dans un lysosome. Le
r~cepteur et la transferrine sont recyclés sur la surface ext'rieure du réticulocyte (99, 100).
Après la formation du complexe récepteur-transferrine dans une
"
invagination membranaire (coated pit) enveloppée d'une
couche-de-o clatherlnes, 11 y a ensuite f01'llation d' une .... vésicule contenant le
.
'(
,
"1
•
r'cepteur et la transferrine toujours li's. Puis l'enveloppe de
c1atherines est enlev'é et les conditions de pH changent. L t indrieur
de la v'sicule devient acide, i. e. un pH de 5,4. Ce pH permet la
li~ration du fer qui se dissocie de la transferTine.
L' apotransferrine (transferrine moins deux' ions de fer) est toujours --li'e
a
son recepteur. Puis la v~sicule fusionne avec un endosome quid'ji contient des dcepteurs de cycles pr~aèdents d'endocytose. Le fer est transfer4! vers un autre compartiment en direction des
\.
" ,mitochondries. Puis une vésicule se forme à la surface de l ' endosome et va se fusionner avec la membrane plasmique. On retourne au pH physiologique de 7,4, l ' apotransferrine se dissocie alors de son r4!cepteur et un nouveau cycle recommence (101-108).
4.3. Changements lors de la maturation
La cellule dticulocytaire subi t des modifications de son int6grit' physique. Son volume -est diminué de 29%, sa surface de 10%
. et sa densi t~ a,p,gmente avec l'Age (64, 65, 63). Ces modifica t ions entratnent
~
augmentation de la rigidité de la cellule. La seule façon d'explIquer ces changements est la perte de ses composantes: les lipides et les prot4!ines. La membrane du réticulocyte du rat perd un tiers de ses lipides lo.rs de sa maturation (65). Le changement\
, ujeur- rappord par plusieurs chercheurs est la diminution des
pho8pholipides et du cholesdrol dans les membranes. Ma1gr4! tou~ le ratio phosphol1pides'/cholesdrol est identique pour les réticulocytes et les &rythrocytes. Par cons6quent, la perte serait donc de morceaux de 1HIIbranes ,plutSt que d~ lipides &p'clf~ques (65, 109-115). Pis cher
---o
o
27 ' et al. (114) rapportent que le phosphatidyls6rine diminue et le
phosphatidyléthanolomine augmente ~ors de la maturation du
réticulocyte du lapin. De plus, Phillips et al. (115) ont d~montr~
une augmentation de la quantité de l'acide linoléique avec le
vieillissement de la cellule érythrocytaire humaine. Il y aurait
aussi une augmentation des acides gras à courte chaIne (i.e. 18 carbones et mOins) par rapport à une diminution de ceux avec des chalnes de carbones plus longues, i.e. 19 et 20 (115).
Les protéines sont aussi changées lors de la maturation du
réticulocyte puisque certaines activités ne sont plus détectables dans
l'erythrocyte. Koch et al. (116) ont démontré qu'une protéine de poids
molécul~ire plus grand què" 250 kd nommée A et la .bande 9
• l "
disparaissaient des membranes du reticulocyte du lapin lors de la
maturation. Etant donné que la membrane perd des morceaux, elle perd
un peu de toutes ses composantes comme par exemple des glycoprotéines,
4es enzymes et des récepteurs. Pour' des raisons encore obscures, des
molécules sont éliminées et spécifiquement quelques-unes en plus grand
nombre.
Les glycopro,dines sont touchées durement et l'acide dalique
diminue de 62% (63, 117-119). Ce sucre que l'on retrouve le plus
souvent
a
la position terminale de la chaIne des sucres sur lesglycoprotéines est enlevé, exposant par le fait m@ma les autres sucres
qui sont majoritairement des galactoses ou galactosamines. .D~autres hydrates de carbones sont enlevés. Notons les hexoses neutres
suivants: D-mannose, D-glucose, D-glucosamine, D-galactosamine et le
D-galactose (118, 119). , ,
-1 .1'
./
0,
-,
Par ailleurs.chez les sucres, la bande 4.5, ~.e. le
~ transporteur de~ sucres, montre une corrêlation ~ntre S8 disparition
e~une baisse du transport du glucose lors de la maturation des
rêticulocytes du porc de guinêe.
..
De plus Kim et ~l. (120) on~notê que lorsque le rêticu10cyte du porc ma ~l1re, la consommation de ribose et de d1hydroxyacêtone augmente par rapporta
une diminution de la consommation du glucose. S~lon1.a
esp~ces,-~transport des ~~~l~osides est aussi affectê lors de la maturation de la cellulerêticulocytaire. Par exemple, chez le mouton, il existe deux phênotypes. La majoritê des cellules sont i~permêab1es aux
nuclêosides alors qu'une faible minor! té
de~
cellules sont 'encore permêables (121, 122).Selon l'esp~ce, l'intégrité de la cellule réticulocytaire est plus Ou moins affectée par le processus d~ maturation. Prenons le cas des systêmes de transport. Les systèmes de transport pour la glycine-dépendants du sodium disparaisent complètement. Le transport de la leucine et de la lysine est diminué (123, 124). D'apr~s Wise (125),
"
les systêmes dêpendants du sodium sont absents de l'érythrocyte et f
seulement le~ syst~mes indêpendants persistent. Par contre, un système, dépendant du sodium est encore prêsent chez les érythrocytes de l'humain; il s'agit du systême ASC (~êfini par Christensen (84».
Cette disparition des systèmes dépendants du sodium pourrait s'expliquer par la diminution du transport de l'ion sodium. Le nombre d'ATPases Na/K présentes dans la membrane réticulocytaire du ~outon,
du porc, du chien et du rat d~crott (122, 126-130).' Il semblerait que le8 ATPases responsables du transport du calcium et du magnésium
o
'.
o
o
29
l---ptêsentes dans les cellules du' porc et du lapin soient aussi affectées
.
d'une diminution d'activité (130, 131). Au contraire, le syst~me de transport des anions n'est pas 'affectê par ie processus de maturation de la cellule (132).Voyons maintenant du/cotê des rêcepteurs comment les choses
varient. Le nombre de récepteurs de l'adênylate cyclasè stimulée par i ~ les cathêcolamines est diminué de trois fois dans le,s érythrocytes du
rat par rapport aux rêticulocytes (90, 133, 134). Le niveau du récepteur de l'insuline est dix fois plus bas dans le globule rouge mature de l'humain (135-139). Ginsberg et Brown (140) pensent que le
récepteur serait perdu par exocytose dans le milieu plutÔt que par
1
dégradation dans les lysosomes.
Une hypoth~se proposée pour expliquer la baisse ou la perte d'activitê des divers transporteurs ou récepteurs est que cette baisse soit dQe à ~ne disparition de molécules plutÔt qu'a l'inactivation.
-Mais on et comment ont lieu ces retraits de molécules? Une partie de la réponse est fournie en étudiant le récepteur de la transferrine.
La transferrine répond au besoin de la cellule en fer pour la formation de l'hémoglobine. Ce besoin décrott au fur et à mesure que l'hêmoglobine est produite. Lorsque le réticulocyte mature, il a un moindre besoin de ~on récepteur de la transferrine. Ce dernier est
perdu au cours de la maturation car au niveau de l'érythrocyte humain, du mouton, du lapin et de la souris, on ne le retrouve plus
(95, ~141). Mais comment le récepteur est-il perdu? Oil va-t-ll? Pan et Johnstone (142) ont trouvé quelques réponses à ces questions. En cultivant des réticulocytes de mouton à 37°C, ,ils ont dêmontrê 1
,
.
-} ,
30
o
l'aide d'anticorps polyclonaux marq~ésA
l'iodec125 et dirlgês contre• '<>{
le rêcep~,r de la transferrine que le récepteur est externalisé
sêlectivement dans une vésicule dans le milieu environnant. La
formation des vésicules et la sortie du rêçepteur sont inhibées par- de
basses tempêratures et par des inhibiteurs de la formation d'ATP. Des
. /
-agents Iysosomotropiques bloquent l'externalisation du rêceptéur (l43)~
Les protéines retrouvêes dans la vêsicule sont principalem~nt
le récepteur de la transferrine et une protéine de 70 kd. L'identitê
de cette derni~re et son rOle sont inconnus. On sait qu'elle n'est
pas une partie du rêcepteur par cartographie peptidique (143). En
•
marquant des cellules rêticulocytaires à l'iode 125, on a déduit que cette protéine êtait à l'intérieur puisqu'elle n'est pas marq~êe.
Selon Pan et Johnstone (142), le récepteur Àe la transferrine
doit rompre ses liens avec le cytosquelette avant de pouvoir ~tre
externalisé dans une vésicule exempte de spectrine. L'hypoth~se
~,
proposée au sujet de l'identité de la protéine de 70 kd, es~ qu'elle
soit une protéine (ou partie de celle-ci) du cytosquelette qui permet
'-
-l'ancrage du récepteur au cytosquelette. Lorsque le récepteur de la 1
transferrine est externalisé, l'ancre est enlevée et le peptide de
70 kd est externalisé avec le rêcep~eur.
Le but de ce projet est d'établir si cette protéine de 70 kd
est 'exclusive au ~éticulocyte ou si on peut aussi la retrouver chez la
cellule mature, i.e. l'êrythrocyte. Il s'agira aussi de voir si on
~peut associer cette protéine
