Caractérisation de protéines localisées à l’appareil de Golgi
chez le parasite de la malaria Plasmodium falciparum
Thèse Stéphanie Hallée Doctorat en microbiologie-immunologie Philosophiae doctor (Ph. D) Québec, Canada © Stéphanie Hallée, 2018
III
Résumé
La malaria est une maladie endémique qui a affecté 212 millions de personnes en 2015, et fait plus de 429 000 morts. Parmi les espèces causant la malaria humaine, Plasmodium falciparum est celle qui est associée au plus haut taux de morbidité et de mortalité. L’invasion du globule rouge par le parasite de la malaria, P. falciparum, est une étape clé qui est médiée par la sécrétion coordonnée de différentes protéines contenues dans les organites du complexe apical : les rhoptries, les micronèmes et les granules denses. La biogenèse de ces organites et le transport des différentes protéines apicales sont des phénomènes encore mal compris et peu étudiés. Des travaux ont montré que des microdomaines présents dans la membrane de l’appareil de Golgi possèderaient une composition lipidique et protéique distincte et seraient impliqués dans la sélection différentielle des protéines destinées aux organites du complexe apical. Cependant, la façon dont ces microdomaines sont discriminés l’un de l’autre et les mécanismes régissant leur transport à partir de l’appareil de Golgi vers le complexe apical sont présentement inconnus.
Nous avons donc entrepris d’identifier les différents acteurs moléculaires impliqués dans ce trafic différentiel des protéines apicales. Les travaux réalisés dans le cadre d’un premier projet ont permis de démontrer que la sortiline, un récepteur de cargo conservé chez les eucaryotes, joue un rôle essentiel dans le transport de protéines vers les différents organites apicaux. Nous avons également démontré que la sortiline interagit avec le complexe de protéines RAMA/RAP afin d’assurer leur transport spécifique vers les rhoptries. L’analyse du phénotype en situation de « knock-down » de la sortiline a révélé à la fois un rôle essentiel de la sortiline dans la biogenèse des organites du complexe apical, mais aussi dans le processus de cytokinèse lors de la division cellulaire. Ces résultats mettent en évidence un rôle central et essentiel de la protéine escorte sortiline dans le système de transport protéique chez le parasite de la malaria P. falciparum.
Dans le cadre d’un second projet, nous avons caractérisé une potentielle protéine de rhoptries (PRP2) identifiée chez Plasmodium berghei et chez Toxoplasma gondii. Nous avons cependant démontré que chez P. falciparum, cette hypothétique protéine de rhoptries est plutôt localisée à l’appareil de Golgi et n’est pas impliquée dans les évènements d’invasion. De ce fait, nous avons renommé cette protéine « Golgi protein 1 » (GP1) . Nous avons également découvert que GP1 interagit avec une protéine transmembranaire non caractérisée (« Golgi protein 2 », GP2). Nos travaux ont donc mené à la découverte d’un nouveau complexe de protéines situé dans l’appareil de Golgi et important pour la survie du parasite.
IV
Table des matières
Résumé ... iii
Table des matières ... iv
Liste des figures ... vii
Liste des tableaux ... viii
Liste des abréviations ... ix
Remerciements ... xii Avant-propos ... xiv Chapitre 1 : Introduction ... 1 1.1 Le parasite Plasmodium ... 1 1.1.1 La famille Apicomplexa ... 1 1.1.1.2 Le genre Plasmodium ... 1
1.1.2 Le cycle de vie du parasite Plasmodium falciparum ... 2
1.1.2.1 Le cycle exo-érythrocytaire ... 3 1.1.2.2 Le cycle érythrocytaire ... 4 1.1.2.3 La gamétocytogenèse ... 5 1.1.2.4 Le cycle sporogénique ... 5 1.1.3 La morphologie du parasite ... 6 1.1.3.1 Le mérozoïte ... 6 1.1.3.2 Le gamétocyte ... 7 1.1.3.3 L’ookinète et l’oocyte ... 8 1.1.3.4 Le sporozoïte ... 9 1.2 La Malaria ... 9 1.2.1 Épidémiologie ... 9
1.2.2 Les manifestations cliniques ... 10
1.2.3 La pathogenèse ... 11
1.2.3.1 La protéine PfEMP1 ... 11
1.2.4 Les techniques de diagnostic clinique ... 12
1.2.5 Le contrôle et les traitements de la malaria ... 13
1.2.5.1 Les antimalariaux ... 13
1.2.5.2 La résistance aux antimalariaux ... 14
1.2.6 Les vaccins ... 14
1.2.6.1 Le Vaccin RTS,S ... 14
1.3 La biologie du stade asexué de P. falciparum ... 15
1.3.1 Le complexe apical ... 15
1.3.1.1 Les rhoptries ... 16
1.3.1.2 Les micronèmes... 18
1.3.1.3 Les granules denses ... 18
1.3.2 L’invasion du globule rouge ... 18
1.3.3 Le complexe intra-membranaire ... 21
1.3.3.1 L’IMC dans l’invasion ... 21
1.3.3.2 L’IMC lors de la division cellulaire ... 22
1.3.4 L’exportome ... 23
1.3.5 Autres structures et organites ... 23
1.3.5.1 La vacuole parasitophore... 23
V
1.4 Le transport protéique... 24
1.4.1 Le système de sécrétion protéique chez les eucaryotes... 24
1.4.1.1 Le réticulum endoplasmique ... 25
1.4.1.2 L’appareil de Golgi ... 26
1.4.1.3 Le transport intracellulaire ... 26
1.4.2 Les composantes du trafic vésiculaire eucaryote ... 26
1.4.2.1 Les protéines du manteau ... 27
1.4.2.2 Les protéines adaptatrices ... 28
1.4.2.3 Les récepteurs de cargos... 28
1.4.2.4 La sortiline ... 29
1.4.2.5 Les protéines Rab ... 30
1.4.2.6 Les autres composantes ... 31
1.4.3 Le transport protéique chez P. falciparum ... 32
1.4.3.1 Le système de sécrétion eucaryote vs P. falciparum ... 32
1.4.3.2 L’organisation de l’appareil de Golgi... 34
1.4.3.3 Le transport des protéines apicales ... 35
1.4.3.4 Le transport des protéines à l’apicoplaste ... 37
1.4.3.5 L’export de protéines ... 38
1.4.4 Le transport protéique chez Toxoplasma ... 40
1.4.4.1 La sortiline chez Toxoplasma ... 41
1.5 Les mécanismes de réponse au stress ... 42
1.5.1 Dégradation des protéines associées au RE ... 43
1.5.2 L’autophagie ... 44
1.5.2.1 L’autophagie chez P. falciparum ... 46
Chapitre 2 : Hypothèses et Objectifs ... 48
2.1 Problématique ... 48
2.2 Hypothèses ... 48
2.3 Objectifs ... 49
Chapitre 3 : La sortiline, une protéine escorte impliquée dans le transport de la protéine « Rhoptry-associated membrane antigen » vers les rhoptries chez Plasmodium falciparum ... 50
3.1 Avant-propos ... 50
3.2 Résumé ... 51
3.3 Abstract ... 53
3.4 Introduction ... 54
3.5 Results and Discussion ... 56
3.6 Conclusion ... 59
3.7 Materials and Methods ... 60
3.8 Acknowledgments ... 63
3.9 References ... 64
3.10 Figures ... 67
Chapitre 4 : La protéine escorte sortiline joue un rôle centrale dans la voie de sécrétion régulée du parasite Plasmodium falciparum. ... 71
4.1 Avant-propos ... 71 4.2 Résumé ... 72 4.3 Abstract ... 74 4.4 Introduction ... 75 4.5 Results ... 77 4.6 Discussion ... 84 4.7 Conclusion ... 88
VI
4.9 Acknowledgments ... 94
4.10 References ... 95
4.11 Figures ... 101
Chapitre 5 : La protéine « Putative rhoptry protein 2 », une protéine de l’appareil de Golgi chez Plasmodium falciparum ... 117
5.1 Avant-propos ... 117
5.2 Résumé ... 118
5.3 Abstract ... 120
5.4 Introduction ... 121
5.5 Results and Discussion ... 122
5.6 Conclusion ... 127
5.7 Materials and Methods ... 128
5.8 Acknowledgments ... 130
5.9 References ... 131
5.10 Figures ... 134
Chapitre 6 : Identification d'un complexe de protéines retrouvé à l'appareil de Golgi et important pour le cycle érythrocytaire asexué chez Plasmodium falciparum. ... 143
6.1 Avant-propos ... 143 6.2 Résumé ... 144 6.3 Abstract ... 146 6.4 Introduction ... 147 6.5 Results ... 148 6.6 Discussion ... 154
6.7 Materials and Methods ... 156
6.8 Acknowledgments ... 163
6.9 References ... 164
6.10 Figures ... 167
Chapitre 7 : Discussion, Conclusion et Perspectives ... 186
7.1 Discussion ... 186
7.1.1 La sortiline, une protéine escorte potentiellement impliquée dans le transport de protéines de rhoptries chez le parasite de la malaria ... 187
7.1.2 La sortiline, une protéine centrale dans le système de sécrétion régulé du parasite P. falciparum ... 189
7.1.3 La protéine GP1, une nouvelle protéine résidente de l’appareil de Golgi ... 193
7.1.4 Identification d’un nouveau complexe protéique localisé à l’appareil de Golgi : le complexe GP1-GP2 ... 194
7.1.4.1 Les rôles possibles du complexe de protéines GP1-GP2... 195
7.2 Conclusion et Perspectives générales ... 198
VII
Liste des figures
Figure 1 : Cycle de vie de P. falciparum ... 3
Figure 2 : Migration vers le foie et la production de mérozoïtes ... 4
Figure 3 : Réplication de P. falciparum à l’intérieur des globules rouges ... 5
Figure 4 : La structure du mérozoïte ... 6
Figure 5 : Les différents stades de gamétocytes ... 8
Figure 6 : Pays endémiques pour la malaria en 2000 et 2016 ... 10
Figure 7 : Représentation schématique du vaccin RTS,S ... 15
Figure 8 : Les organites du complexe apical et ses protéines... 16
Figure 9 : L’invasion du globule rouge ... 19
Figure 10 : Modèle de la structure du glideosome et de la jonction serrée ... 22
Figure 11 : L’IMC et la division cellulaire... 23
Figure 12 : Le système de sécrétion eucaryote ... 25
Figure 13 : La plateforme de tri au TGN ... 27
Figure 14 : La sortiline dans le système de transport ... 30
Figure 15 : Le système de sécrétion de P. falciparum ... 32
Figure 16 : Modèle de la sélection des protéines apicales au TGN ... 37
Figure 17 : Séquences PEXEL et PNEP ... 39
Figure 18 : L’export de protéines chez P. falciparum ... 40
Figure 19 : La structure du TgSORTLR ... 41
Figure 20 : La voie ERAD chez P. falciparum ... 43
VIII
Liste des tableaux
Tableau 1 : Modes d’action et cibles de certains antimalariaux ... 14
Tableau 2 : Résumé des principales composantes du transport vésiculaire eucaryote ... 31
Tableau 3 : La famille de protéines Rab chez P. falciparum ... 33
IX
Liste des abréviations
AAA De l'anglais « ATPases associated with diverse cellular activities » ac-LL De l'anglais « acidic cluster-dileucine motif »
AgsHB Antigène de surface du virus de l'hépatite B
Alv5 De l'anglais « Alveolin 5 »
AMA1 De l'anglais « apical membrane antigen 1 »
AP De l'anglais « adaptator protein »
ARF1 De l'anglais «ADP-ribosylation factor 1»
Atg De l'anglais « Autophagy related protein »
ATPase De l'anglais « Adénosine triphosphatase »
Bet3 De l'anglais « blocked early in transport 3 »
BIP De l'anglais « Binding immunoglobulin protein »
BTP1 De l'anglais « basal complex transmembrane protein 1 »
C Cystéine
CD36 De l'anglais « cluster of differentiation 36 » CDC48 De l'anglais « Cell division control protein 48 » clag De l'anglais « cytoadherence linked asexual gene »
COP De l'anglais « Coat protein »
CSP De l'anglais « Circumsporozoite protein »
DBL De l'anglais « Duffy binding-like domain »
Der1 De l'anglais « Degradation in the endoplasmic reticulum protein 1 »
DRM De l'anglais « Detergent resistant membrane »
EBA-175 De l'anglais « Erythrocyte binding antigen 175 »
EBL De l'anglais « Erythrocyte binding-like »
ERAD De l'anglais « endoplasmique reticulum-associated protein degradation » ERD2 De l'anglais « ER lumen protein retaining receptor »
ETRAMP De l'anglais « apical membrane antigen 1 »
GAC De l'anglais « glideosome-associated connector »
GAP40 De l'anglais « Glideosome-associated protein 40 kDa » GAP45 De l'anglais « Glideosome-associated protein 45 kDa » GAP50 De l'anglais « Glideosome-associated protein 50 kDa »
GD Granules denses
GDP De l'anglais « guanosine diphosphate »
GGA De l'anglais « Golgi-localized, γ ear-containing, ARF-binding protein »
GP1 De l'anglais « Golgi protein 1 »
GP2 De l'anglais « Golgi protein 2 »
X
GRASP De l'anglais « Golgi re-assembly stacking protein »
GTP De l'anglais «guanosine triphosphate »
HMW De l'anglais « high molecular weight »
HRD1 De l'anglais « Hmg CoA reductase degradation 1 »
HRP2 De l'anglais « Histidine-rich protein 2 »
HSP De l'anglais « heat shock protein »
ICAM-1 De l'anglais « InterCellular Adhesion Molecule 1 »
IMC De l'anglais « inner membrane complex »
KAHRP De l'anglais « knob-associated histidine-rich protein »
KD De l'anglais « Knock-down »
KO De l'anglais « knock-out »
LIMP-2 De l'anglais « lysosomal integral membrane protein »
LMW De l'anglais « low molecular weight »
M6P mannose-6-phosphate
M6PR De l'anglais « mannose-6 phosphate receptor »
MIC Micronème
MLC De l'anglais « myosin light chain »
MOP De l'anglais « merozoite organization protein »
MORN1 De l'anglais « membrane occupation recognition nexus 1 »
MPP membrane plasmique du parasite
MSP De l'anglais « merozoite surface protein »
MTIP De l'anglais « Myosin A-tail interacting protein »
MyoA Myosine A
PAS De l'anglais « phagophore assembly site »
PDI Protéine disulfide isomérase
PEXEL De l'anglais « Plasmodium export element »
PfEMP1 De l'anglais « Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 »
PI3K phosphoinositide 3-kinase
PI3P phosphoinositide 3-phosphate
pLDH De l'anglais « Plasmodium lactate dehydrogenase »
PMV Plasmepsine V
PNEP De l'anglais « PEXEL-negative exported protein »
proBDNF De l'anglais « brain-derived neurotrophic factor »
proNGF De l'anglais « nerve growth factor »
PRP2 De l'anglais « Putative rhoptry protein 2 »
PS Peptide signal
PTEX De l'anglais « Plasmodium translocon of exported protein » Rab De l'anglais « Ras-related proteins in brain »
XI
RAP De l'anglais « Rhoptry associated protein »
RBL De l'anglais « The reticulocyte binding-like »
RE Réticulum endoplasmique
RESA De l'anglais « Ring-infected Erythrocyte Surface Antigen »
Rh De l'anglais « reticulocyte binding homologue »
RhopH De l'anglais « rhoptry high molecular weight »
RON De l'anglais « Rhoptry neck protein »
ROP Rhoptry
SAR1 De l'anglais « secretion associated and Ras-related protein-1 »
SERA De l'anglais « serine repeat antigen »
SNARE De l'anglais « Soluble N-éthylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor »
SNX De l'anglais « sorting nexin »
SorCS De l'anglais « sortilin-related receptor CNS expressed » SorLA De l'anglais « Sorting-related receptor with A-type repeats »
SRP De l'anglais « signal recognition particule »
Sub1 De l'anglais « subtilisin-like protease 1 » Sub2 De l'anglais « subtilisin-like protease 2 »
t-SNARE De l'anglais « target SNARE »
TCA Traitements combinés à base d'artémisinine
TGN Réseau trans-golgien
TgSORTLR De l'anglais « Toxoplasma gondii sortilin-like receptor » TRAP De l'anglais « thrombospondin-related anonymus protein »
Uba De l'anglais « ubiquitin-activating enzyme »
Ubc De l'anglais « ubiquitine conjugating enzyme »
UFD1 De l'anglais « Ubiquitin fusion degradation protein 1 »
UPR De l'anglais « Unfolded protein response »
v-SNARE De l'anglais « vesicular SNARE »
VD Vacuole digestive
VP Vacuole parasitophore
VPS De l'anglais « Vacuolar protein sorting »
VPS10 De l'anglais « vacuolar protein sorting 10 »
XII
Remerciements
Je tiens à remercier de nombreuses personnes qui au cours des sept dernières années m’ont apporté leur soutien autant moralement que scientifiquement. Je tiens d’abord à remercier les membres de mon comité de thèse, les Dres Barbara Papadopoulou, Josée Lavoie et Petra Rohrbach pour le temps accordé à la lecture et à l’évaluation de mes travaux de recherche doctorale.
Je remercie sincèrement mon directeur de recherche, le Dr Dave Richard, de m’avoir accueillie dans son laboratoire à titre de première étudiante graduée. Merci de m’avoir poussée à me dépasser et d’avoir cru en moi dans mes périodes de doutes. Merci pour ton écoute, ton encouragement et tes conseils autant sur le plan scientifique que personnel. Tu m’as enseigné à développer mon sens critique, mon autonomie et tu m’as offert la chance de gérer plusieurs projets et de participer à des congrès internationaux. Tout cela m’a permis de développer des aptitudes et des compétences uniques qui me seront très utiles dans ma vie professionnelle.
Je souhaite également remercier les membres de mon équipe qui ont participé directement ou indirectement à mes travaux de doctorat. Merci Dominic Gagnon d’être un ninja qui est partout et qui fait tout à la fois. Je te remercie pour ta disponibilité et ton écoute. Je remercie Angana Mukherjee pour ses conseils et sa rigueur scientifique, j’ai beaucoup appris à ses côtés. Nos discussions professionnelles et personnelles m’ont grandement inspirée. Je remercie aussi Zeinab Ebrahimzadeh avec qui j’ai évolué depuis le début de mes études graduées. Nous avons franchi ensemble plusieurs étapes importantes et une belle amitié en est née.
Je souhaite également remercier les membres passés de l’équipe. Un merci spécial à David Gaumond pour sa bonne humeur et son positivisme contagieux, il a su animer et égailler mes journées. Je remercie mes deux bonnes amies Catherine Thériault et Véronique Tu pour leur écoute et leur soutien dans les bons moments comme dans les moins bons.
Je tiens aussi à remercier les équipes MOU, BP, PT et Sato pour leur générosité et leur entraide. Je remercie aussi Nathalie pour nos discussions animées et ses conseils scientifiques.
Je tiens à remercier tous les membres de ma famille et ma belle-famille pour leur soutien et leur amour inconditionnel. Je souhaite remercier mes parents d’avoir toujours cru en moi et de m’avoir donné les outils pour accomplir tout ce que je désirais. Je remercie aussi mes grands-parents pour leur amour et leur curiosité envers mon travail. Ils sont pour moi une source d’inspiration. Je remercie mes sœurs
XIII
Audrey et Dominique d’avoir toujours été à l’écoute et été présentes pour moi malgré la distance. Je remercie ma belle-sœur Evelyne et mon beau-frère Larry pour les beaux moments passés avec eux et leur support sincère. Je remercie également mes beaux-parents pour tous les petits plats cuisinés, les messages d’encouragement au quotidien et toutes vos petites attentions.
Finalement, je tiens à remercier mon amoureux Guillaume. Je ne serais pas rendue où je suis présentement sans son soutien et son encouragement. Il a été pour moi un pilier important autant au laboratoire que dans ma vie personnelle. Je le remercie pour tous ses conseils et son expertise scientifique. J’ai la chance de partager ma vie avec une personne merveilleuse qui comprend ma réalité et qui m’a supportée dans mon choix de poursuivre mes études doctorales. Il est pour moi un collègue de travail, mon meilleur ami, mon technicien informatique et mon amoureux. Je ne le remercierai jamais assez de jouer tous ces rôles à la fois, et de toujours être là pour moi.
XIV
Avant-propos
Cette thèse de doctorat porte sur l’identification et la caractérisation de protéines localisées à l’appareil de Golgi chez Plasmodium falciparum. Mes travaux de doctorat ont été axés sur deux principaux projets, le premier a mené à l’identification d’un nouveau complexe de protéines localisées à l’appareil de Golgi, et le second a permis d’identifier un acteur moléculaire majeur, la sortiline, impliqué dans la formation du complexe apical mais aussi dans la biogenèse des mérozoïtes chez P. falciparum.
La présente thèse est divisée en 7 chapitres. Le premier chapitre correspond à l’introduction et présente une revue de la littérature sur le parasite de la malaria. Le cycle de vie ainsi que la morphologie du parasite Plasmodium falciparum est d’abord présentés et décrits. Une seconde section aborde la pathogenèse associée à la malaria ainsi que les stratégies thérapeutiques actuelles. Enseuite, la biologie du parasite au stade asexué est expliquée plus en détail, notamment la structure et le rôle du complexe apical ainsi que celle du complexe intra-membranaire. Ce chapitre traite également du système de transport protéique du parasite ainsi que des différentes composantes cellulaires, et ce en relation avec ce qui est décrit chez les eucaryotes supérieurs. Finalement, cette section se termine sur une brève description des mécanismes de réponse au stress chez le parasite.
Le chapitre 2 présente la problématique du présent sujet ainsi que les hypothèses et objectifs de mes travaux de doctorat. Ces derniers ont fait l’objet de quatre publications, toutes publiées et qui seront présentées dans les chapitres 3,4,5 et 6.
Le chapitre 3 correspond à un article scientifique dont je suis la première auteure et qui s’intitule: « Evidence that the Plasmodium falciparum Protein Sortilin Potentially Acts as an Escorter for the Trafficking of the Rhoptry-Associated Membrane Antigen to the Rhoptries ». Cet article a été publié dans la revue « mSphere », le 3 janvier 2018. (Hallée, S., Boddey, J. A., Cowman, A. F. & Richard, D. mSphere 3, 1–10 (2018))
Le chapitre 4 correspond à un article scientifique dont je suis la première auteure et qui s’intitule: « The malaria parasite Plasmodium falciparum Sortilin is essential for merozoite formation and apical complex biogenesis ». Cet article a été accepté pour publication dans la revue « Cellular Microbiology », le 26 mars 2018. (Hallée, S., Counihan, N. A., Matthews, K., de Koning-Ward, T. F. & Richard, D. Cellular Microbiology e12844 (2018))
XV
Le chapitre 5 correspond à un article scientifique dont je suis la première auteure et qui s’intitule: « Evidence that the malaria parasite Plasmodium falciparum putative Rhoptry protein 2 localizes to the Golgi apparatus throughout the Erythrocytic cycle ». Cet article a été publié dans la revue « PLoS one », le 16 septembre 2015. (Hallée, S. & Richard, D. PLoS One 10, 1–15 (2015))
Le chapitre 6 correspond à un article scientifique dont je suis la première auteure et qui s’intitule: « Identification of a Golgi apparatus protein complex important for the asexual erythrocytic cycle of the malaria parasite Plasmodium falciparum ». Cet article a été accepté pour publication dans la revue « Cellular Microbiology », le 26 mars 2018. (Hallée, S., Thériault, C., Gagnon, D., Keher, J., Frischknecht, F., Mair, G. R. & Richard, D. Cellular Microbiology e12843 (2018))
Finalement, le chapitre 7 contient la discussion ainsi que la conclusion et les perspectives générales du projet.
Chapitre 1 : Introduction
1.1 Le parasite Plasmodium
1.1.1 La famille Apicomplexa
Le phylum Apicomplexa, du domaine des eucaryotes et du règne des Chromalveolata, forme un large groupe de protozoaires unicellulaires. En 1970, Levine nomme et identifie la famille Apicomplexa comme étant des parasites intracellulaires obligatoires qui sont caractérisés par la présence d’un complexe apical responsable de l’invasion de la cellule hôte1. Il s’agit du plus large groupe de
parasites unicellulaires, comprenant entre 1.2 et 10 millions d’espèces, dont la majorité est considérée comme pathogène pour les humains ou les animaux2. Parmi les mieux caractérisés, on retrouve les
genres Toxoplasma (responsable de la toxoplasmose chez les oiseaux et les mammifères), Cryptosporidium (connu pour causer la cryptosporidiose chez les vertébrés), Theileria (parasite causant la theilériose chez les animaux de ferme) et Plasmodium (pathogène de la malaria chez les humains et divers vertébrés)3.
Le parasite Toxoplasma est le membre le plus étudié de la famille Apicomplexa et il est fréquemment utilisé comme organisme modèle dans des études de biologie moléculaire et cellulaire. En laboratoire, T. gondii est majoritairement utilisé pour sa plasticité génétique : facilité de transfection (stabilité et efficacité) et grande variété d’outils de modification génique applicable. T. gondii est aussi facilement cultivable in vitro et le modèle animal est très bien établi et facile d’utilisation4.
1.1.1.2 Le genre Plasmodium
Le genre Plasmodium, mieux connu de par le nom de la maladie qu’il cause : la malaria, fut observé pour la première fois dans le sang de patients infectés en 1880 par le français Charles Louis Alphonse Leveran. Ce dernier a d’ailleurs remporté le Prix Nobel de Médecine en 1907 pour sa découverte. Quelques années plus tard, Grassi, Bignami et Bastienelli démontrèrent que la malaria humaine est transmise via un moustique vecteur infecté du genre Anopheles5. Toutefois, le nom malaria fut donné
à cette maladie bien avant la découverte du pathogène, en 1740. Apparu en Italie, le terme malaria signifie mauvais air (« bad air »), puisque la croyance générale à cette époque était que des vapeurs toxiques ou miasmes étaient responsables de la maladie. Lorsque Leveran identifia le genre Plasmodium, il essaya de changer le nom de la maladie pour un nom plus scientifique et proposa le terme Paludisme. Aujourd’hui encore, les deux noms coexistent dans la littérature6.
Seul un nombre restreint de vertébrés sont susceptibles à la malaria : les reptiles, les oiseaux et certains mammifères7. Parmi les espèces de Plasmodium, cinq ont la capacité d’infecter l’humain : P. knowlesi
(retrouvé principalement chez les singes), P. vivax, P. malariae, P. ovale et P. falciparum (aussi capable d’infecter les gorilles). Ce dernier est toutefois associé à la forme la plus sévère de la malaria avec des taux de morbidité et de mortalité les plus élevés. Cependant, à l’extérieur de la région de l’Afrique subsaharienne c’est P. vivax qui est le plus répandu et ce principalement dans le sud-ouest de l’Asie (Inde et Pakistan). Une différence importante entre P. falciparum et P. vivax est la capacité de ce dernier à former des hypnozoites, une forme latente qu’adopte le parasite dans le foie humain et de laquelle il peut sortir quelques jours voir plusieurs années après l’apparition des premiers symptômes cliniques8. Finalement, certaines espèces de Plasmodium vont infecter les rongeurs,
comme P. berghei, P. chabaudi et P. yoelii. Ces dernières sont fréquemment utilisées en laboratoire pour des essais in vivo chez la souris.
1.1.2 Le cycle de vie du parasite Plasmodium falciparum
Le parasite P. falciparum possède un cycle trimorphique comprenant deux hôtes : un humain et un insecte vecteur (Figure 1). La transmission s’effectue lors de la prise d’un repas sanguin par le moustique femelle du genre Anopheles infecté par le parasite. Une fois dans la circulation sanguine humaine, P. falciparum se fraie un chemin jusqu’au foie, puis établi son cycle de réplication à l’intérieur des hépatocytes. Au terme de cette réplication, des millions de parasites sous forme mérozoïte sont libérés dans le sang où ils infectent les globules rouges de façon cyclique. De cette façon, le parasite s’établit à long terme dans la circulation sanguine où il établit un cycle de réplication à tous les 48h. Les mérozoïtes n’ont pas la capacité d’infecter un nouveau moustique, une différenciation sexuelle en gamétocytes est requise. Au terme de cette différenciation, les gamétocytes présents dans la circulation sanguine pourront être ingérés par un autre moustique anophèle lors d’un prochain contact. Finalement, c’est à l’intérieur de l’intestin de l’insecte que les gamètes fusionnent pour former un zygote, qui ultimement se retrouve sous forme de sporozoïtes avant d’être retransmis à l’humain9.
Figure 1 : Cycle de vie de P. falciparum (Adaptée de 10)
1.1.2.1 Le cycle exo-érythrocytaire
Le début de l’infection humaine s’amorce avec l’injection par le moustique anophèle de quelques centaines de sporozoïtes dans l’épiderme humain (Figure 2). Grâce à leur capacité motile, les parasites se dirigent rapidement vers la circulation sanguine puis migrent jusqu’au foie. Avant d’atteindre les hépatocytes, les sporozoïtes doivent au préalable traverser la barrière sinusale du foie, composée majoritairement de cellules de Kupffer, les macrophages spécialisés du foie9. Après avoir navigué à
travers et entre ces cellules immunitaires, les parasites vont finalement atteindre leurs cellules cibles, les hépatocytes. Les sporozoïtes vont d’abord continuer de glisser sur ces cellules hépatiques avant d’en envahir une et d’y élire domicile à l’intérieur d’une vacuole parasitophore (VP). Une fois bien établi dans la cellule hôte, le sporozoïte se différencie en trophozoïte hépatique qui grossit et se réplique. Ce phénomène de schizogonie permet de produire plusieurs mérozoïtes à l’intérieur d’une seule cellule. Les mérozoïtes produits sont contenus dans des vésicules appelées mérosomes. Rendues à terme, ces vésicules ruptures et chaque sporozoite libère des milliers de mérozoïtes dans la circulation sanguine irriguant le foie11,12.
Zygote
Gamétocytes
Cycle sporogénique Sporozoites
Gamétocytes
Sporozoites
Mérozoites
Cycle érythrocytaire
Figure 2 : Migration vers le foie et la production de mérozoïtes 1.1.2.2 Le cycle érythrocytaire
Les mérozoïtes nouvellement libérés par les hépatocytes vont rapidement gagner la circulation sanguine et infecter les globules rouges (Figure 3). Ce processus se déroule en quelques minutes et nécessite plusieurs interactions de type ligand-récepteur entre la surface de du globule rouge et celle du parasite. Suite à cet attachement, le mérozoïte pénètre progressivement à l’intérieur de l’érythrocyte tout en formant une VP, dans laquelle il va se développer13. Durant les premières 24h,
P. falciparum se présente sous la forme anneau et termine de former la VP, puis commence à exporter des protéines dans le globule rouge. Au stade trophozoite (24-36h), le parasite s’active et grossit. La demande énergétique augmente et le parasite doit dégrader l’hémoglobine en hémozoïne. De plus, la production protéique augmente et l’export de protéines s’intensifie. En effet, à ce stade, le globule rouge est grandement modifié par Plasmodium, et ce afin d’augmenter l’apport de nutriments et d’augmenter l’adhésion de la cellule aux parois des vaisseaux sanguins. À 40 heures post-invasion, le parasite est prêt à se diviser et à se répliquer ; il s’agit du stade schizont. Au terme de la division cellulaire (schizogonie), il y a formation de 16 à 32 mérozoïtes à l’intérieur du schizont. Lors de la rupture de la membrane érythrocytaire, les nouveaux mérozoïtes produits sont libérés dans la circulation sanguine où ils vont infecter de nouveaux globules rouges et entreprendre un second cycle de vie. Ce cycle de 48 heures est nommé cycle érythrocytaire ou cycle asexué et est responsable de tous les symptômes de la malaria14,15.
Figure 3 : Réplication de P. falciparum à l’intérieur des globules rouges (Adaptée de 16)
1.1.2.3 La gamétocytogenèse
La gamétocytogenèse est intimement liée au cycle asexué. De ce fait, au cours du cycle érythrocytaire, une faible proportion de parasites va évoluer vers la forme gamétocyte. Le processus décisionnel ainsi que les mécanismes déclenchant ce changement de voie restent cependant encore mal compris. Néanmoins, les hypothèses pointent vers un changement épigénétique et transcriptionnel dû à des stimuli environnementaux17–22. La décision d’évoluer vers le stade gamétocyte est prise dès les
premières étapes du cycle érythrocytaire. Ce processus de maturation prend de 7 à 15 jours et mène à la formation de gamétocytes mâles ou femelles matures17,18. Il s’agit d’une étape critique puisque
seuls les parasites sexués sont en mesure d’être transmis de l’humain au moustique femelle, permettant ainsi sa propagation23.
1.1.2.4 Le cycle sporogénique
Une fois prélevés de la circulation sanguine humaine, les gamétocytes migrent à l’intérieur de l’estomac de l’anophèle et continuent de se différencier pour devenir des macrogamètes. Les conditions chimiques particulières de ce nouvel environnement entraînent la lyse du globule rouge et les gamètes se retrouvent alors sous forme extracellulaire. Dans une fenêtre de 60 min, le gamète femelle est fécondé par le gamète mâle pour former un zygote. Ce dernier se développe et se transforme ensuite en ookinète24. L’ookinète mature est doté de capacité motile, ce qui lui permet de
migrer à travers les cellules épithéliales de la paroi intestinale25. Après cette traversée, l’ookinète se
dépose sur la lame basale de l’estomac et commence une autre étape de différentiation afin de devenir un oocyte. C’est à cet endroit, à l’abri, que l’oocyte va se multiplier et produire des milliers de sporozoïtes. Rendu à maturité, l’oocyte va graduellement permettre la libération de sporozoïtes, qui iront rejoindre l’hémolymphe de l’insecte, avec pour destination finale ses glandes salivaires26,27.
Cette étape de production de sporozoïtes appelée sporogonie est cruciale puisque ce sont ces parasites, entreposés dans les glandes salivaires, qui seront injectés à l’humain lors d’un prochain repas sanguin.
1.1.3 La morphologie du parasite
Rappelons que pour compléter son cycle trimorphique, P. falciparum doit infecter deux hôtes, l’humain et un insecte vecteur. Cette dualité entraîne le parasite à adopter plusieurs formes afin de survivre dans des environnements variés et d’infecter efficacement diverses cellules hôtes.
1.1.3.1 Le mérozoïte
Le mérozoïte est une forme invasive non motile dont l’hôte exclusif est le globule rouge et qui est associé au cycle érythrocytaire. Il s’agit certainement de la forme la plus étudiée de P. falciparum. En effet, depuis le développement de méthodes de culture in vitro par Trager et Jensen à la fin des années 1970, il est devenu possible d’étudier le cycle érythrocytaire et la morphologie du parasite en laboratoire28,29.
Figure 4 : La structure du mérozoïte (Adaptée de 30)
Le mérozoïte de Plasmodium est très petit comparativement aux autres membres de la famille Apicomplexa, 1,6 µm de long et 1 µm de large, soit l’équivalent d’une grosse bactérie30. Il possède
une forme plutôt ovoïde, mais polarisée, rappelant celle d’un avocat (Figure 4). Parmi les composantes cellulaires du mérozoïte, on retrouve les organites traditionnellement retrouvés chez les cellules eucaryotes : un noyau, un réticulum endoplasmique (RE), un appareil de Golgi, une
mitochondrie ainsi qu’un organite plus atypique, l’apicoplaste. Ce dernier est le lieu où s’effectue la synthèse de lipides, nécessaire à la formation des membranes, ainsi que le site de production de l’hème, utilisé lors de la synthèse protéique31–33.
Une autre structure distinctive retrouvée chez le mérozoïte (ainsi que chez le gamétocyte, l’ookinète et le sporozoïte) est le complexe intra-membranaire (IMC). Il s’agit d’une structure sous-jacente à la membrane plasmique du parasite (MPP) qui assure plusieurs rôles lors du cycle érythrocytaire : division cellulaire, invasion du globule rouge et rôle structural34,35.
Finalement, la principale particularité du mérozoïte est probablement son complexe apical. Ce dernier est composé de trois organites sécrétoires : les rhoptries, les micronèmes et les granules denses. Au moment de l’invasion du globule rouge, ces organites apicaux sécrètent des protéines qui permettent d’effectuer les différentes étapes nécessaires à son entrée dans la cellule hôte36,37. Au cours de ce
processus d’invasion, il y a formation d’une VP entourant le mérozoïte, qui va devenir son lieu de résidence à l’intérieur de la cellule hôte. Cette étape d’invasion est cruciale pour la survie du mérozoïte et se déroule généralement en quelques minutes. Cependant, d’un point de vue immunologique, ces quelques minutes représentent une opportunité d’action importante pour les cellules du système immunitaire. En effet, il s’agit du seul moment de vulnérabilité pour le parasite au cours duquel, il peut être ciblé par les anticorps. C’est pour cette raison que beaucoup d’efforts sont entrepris afin d’étudier les molécules de surface du mérozoïte ainsi que les molécules sécrétées avant son entrée dans le globule rouge, et ce afin de trouver de nouvelles cibles vaccinales33.
1.1.3.2 Le gamétocyte
Le gamétocyte est la forme sexuée de Plasmodium qui assure la transmission du parasite de l’humain vers le moustique anophèle. Autrefois peu étudié, le gamétocyte est aujourd’hui le sujet de nombreuses publications. En effet, de récentes avancées ont permis le développement de nouvelles techniques de production de gamétocytes in vitro39,40. Chez P. falciparum, l’évolution du gamétocyte
vers une forme mature prend de 10 à 12 jours et peut être divisée en cinq stades (Figure 5). Tout d’abord, lors des deux premiers stades (I et II), la morphologie du parasite reste pratiquement indissociable de la forme asexuée trophozoïte. Cependant, lors du stade III, le parasite commence à s’allonger et à prendre plus de place à l’intérieur du globule rouge. Par contre, c’est lors des stades IV et V que des changements structuraux sont les plus marquants. Le parasite adopte alors une forme de croissant ou falciforme (d’où le nom falciparum) et déforme complètement l’érythrocyte. Lors du dernier stade (V), le gamétocyte est rendu à maturité et l’on peut facilement différentier le gamétocyte femelle, plus allongé, du gamétocyte mâle, plus large41. L’adoption et le maintien de cette forme sont
possibles grâce à la présence de l’IMC, directement sous la MPP. Bien que similaire à l’IMC retrouvé chez le mérozoïte, son rôle chez le gamétocyte semble exclusivement structural42.
Figure 5 : Les différents stades de gamétocytes (Adaptée de 43)
1.1.3.3 L’ookinète et l’oocyte
L’ookinète est une forme invasive et motile retrouvée seulement chez le moustique femelle infecté par Plasmodium. Il est caractérisé par une forme allongée et polarisée où l’extrémité la plus étroite correspond au pôle apical. Il diffère des autres stades invasifs du fait qu’il ne possède ni rhoptries ni granules denses à son pôle apical. En effet, il ne renferme qu’un seul type d’organite sécrétoire spécialisé : les micronèmes. Plusieurs rôles ont été attribués aux protéines micronèmales, par exemple la reconnaissance hôte-parasite ainsi que la liaison et la motilité à la surface des cellules épithéliales44,45. En résumé, les micronèmes jouent un rôle essentiel dans le processus d’invasion des
cellules épithéliales, permettant au parasite de traverser la paroi intestinale du moustique.
Le rôle principal de l’oocyte est la production de sporozoïtes. De ce fait, contrairement aux formes invasives, il ne possède pas de pôle apical ni d’organites habituellement impliqués dans le processus d’invasion. Sur une période de 10 à 12 jours, les sporozoïtes vont se développer à l’intérieur de l’oocyte entraînant un gonflement de la MPP46. Au terme du processus de réplication, un seul oocyte
contient des milliers de sporozoïtes. Finalement, ces derniers sont relâchés dans l’hémolymphe d’où ils migrent afin d’atteindre les glandes salivaires de l’anophèle47.
1.1.3.4 Le sporozoïte
Le stade sporozoïte a la particularité d’évoluer dans deux habitats très différents, l’insecte et l’humain, et d’y jouer des rôles essentiels. À l’instar du gamétocyte, le sporozoïte doit interagir avec différents types cellulaires et rapidement s’adapter à ce changement d’environnement. Pour ce faire, le parasite est pourvu d’un système de régulation transcriptionnelle tissue-spécifique hautement contrôlé et flexible48.
Au cours de son existence, le sporozoïte va traverser et envahir plusieurs types cellulaires. Ce long trajet est possible grâce à la capacité motile du sporozoïte, laquelle provient principalement d’un moteur d’actine-myosine et de la protéine TRAP (« thrombospondin-related anonymus protein »). Cette protéine est sécrétée par les micronèmes à la surface du parasite et permet au parasite de se déplacer par glissement, en plus de lui permettre d’envahir les cellules cibles49. Une autre protéine
importante pour le sporozoïte est la protéine circumsporozoïte (CSP). Il s’agit de la principale protéine de surface du sporozoïte qui, avec la protéine TRAP, est responsable de l’invasion des glandes salivaires en plus de l’adhésion et de l’invasion des hépatocytes50. Tout comme le mérozoïte,
le sporozoïte possède un complexe apical composé de micronèmes et de rhoptries, bien qu’aucune granule dense n’ait été observée jusqu’à ce jour51.
En résumé, le parasite Plasmodium est un organisme polymorphique qui s’adapte très bien à ses différents hôtes. Chacun des stades se développe et se transforme en fonction de son environnement, et ce, toujours avec l’objectif final d’assurer la transmission entre l’insecte vecteur et l’hôte humain.
1.2 La Malaria
1.2.1 Épidémiologie
La malaria est présente sur trois continents et touche principalement les pays d’Afrique, d’Asie et d’Amérique du Sud. En 2016, selon l’Organisation mondiale de la santé, 91 pays étaient toujours considérés comme endémiques pour la malaria contrairement à 108 pays en 2000 (Figure 6). Cette diminution de l’incidence des cas est en grande partie attribuable au déploiement à grande échelle de méthodes d’intervention et de contrôle de la malaria. C’est dans la région d’Asie du Sud-Est que l’on observe la plus importante baisse, avec 54% de diminution des cas entre 2010 et 2015, contrairement à 21% pour le continent africain52.
Malgré les efforts pour lutter contre ce fléau, la malaria reste un problème de santé majeur pour les pays fortement touchés. En effet, en 2015 on dénombrait 212 millions d’infections à Plasmodium à l’échelle mondiale. Malgré une diminution du taux de mortalité de 62% entre 2000 et 2015, le nombre
de décès causé par le paludisme reste très élevé et est estimé à 429 000 en 2015. De plus, la grande majorité de ces décès est observée chez les enfants de moins de 5 ans, la population la plus à risque, chez laquelle l’on a dénombré 303 000 morts cette même année52.
Figure 6 : Pays endémiques pour la malaria en 2000 et 2016 (Adaptée de 52)
En plus du coût humain, la malaria a un impact socio-économique important non seulement chez les pays endémiques, mais pour l’ensemble des pays développés. Chez les pays endémiques, le fardeau économique directement associé à l’infection doit s’ajouter à la pauvreté générale de ces pays majoritairement en voie de développement. En effet, les personnes atteintes sont moins efficaces au travail et s’absentent plus fréquemment pour cause de maladie. L’on doit aussi ajouter le coût associé à la prise en charge des malades par le système de santé, qui se chiffrait à 332 millions de dollars US en 2015. Le total de la facture augmente lourdement lorsque l’on ajoute les montants investis en prévention et en recherche et développements. En 2015, c’est 2,9 milliards de dollars qui ont été investis par l’ensemble des pays pour contrôler et éliminer la malaria52.
1.2.2 Les manifestations cliniques
Les premiers symptômes résultant d’une infection à Plasmodium sont très semblables à ceux d’une infection virale et donc difficile à diagnostiquer. Parmi ces symptômes, on retrouve des maux de tête, de la fatigue et des douleurs musculaires. S’ensuivent alors des périodes de fortes fièvres cycliques, des frissons, des nausées et vomissements ainsi qu’un malaise généralisé. Si la maladie n’est pas traitée, elle peut dégénérer et les manifestations cliniques s’aggravent, on parle alors de malaria sévère. La progression vers l’état sévère est très rapide et peut prendre de quelques jours à quelques heures. La malaria sévère est caractérisée par une acidose métabolique, une insuffisance rénale ainsi
que des œdèmes pulmonaires53. Sans traitement, la malaria peut mener au coma (malaria cérébrale)
et est fatale dans la majorité des cas54,55.
Chez les jeunes enfants atteints, on observe plutôt de la léthargie, une perte d’appétit et de la toux. La forme sévère s’accompagne alors de symptômes tels qu’une anémie sévère, des convulsions, une hypoglycémie et le décès est principalement causé par la malaria cérébrale56,57.
1.2.3 La pathogenèse
L’ensemble des symptômes énumérés précédemment sont ressentis lors du cycle érythrocytaire de Plasmodium et sont directement liés à l’infection des globules rouges par le parasite. La principale particularité de P. falciparum est sa capacité à faire adhérer les globules infectés aux parois des vaisseaux sanguins. Ceci permet au parasite de se séquestrer à l’intérieur de différents tissus et organes afin d’éviter l’élimination par la rate58. L’attachement est possible grâce à la présence de
structures protubérantes (« Knob ») à la surface de l’érythrocyte infecté, dont la composante majeure est la protéine PfEMP1 (« Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 »). Cette adhérence des érythrocytes infectés peut entraîner une obstruction des vaisseaux sanguins, empêchant ainsi les tissus d’être correctement perfusés et de recevoir l’apport en oxygène nécessaire59,60.
La diminution de l’apport en globules rouges est aussi expliquée par la destruction massive d’érythrocytes par la rate. En effet, lors de la rupture du globule rouge, il y a libération de nouveaux mérozoïtes, mais aussi de facteurs cellulaires. Ces derniers déclenchent une réponse immunitaire splénique, stimulant la rate afin d’augmenter la filtration et la destruction de globules rouges entraînant une anémie et compromettant l’apport en oxygène61. En plus, on observe une importante
activation des monocytes et des macrophages au moment de la rupture, entraînant une sécrétion de cytokines pro-inflammatoires correspondant aux pics de fièvre typique de la malaria61.
1.2.3.1 La protéine PfEMP1
La protéine PfEMP1 est exprimée à la surface des érythrocytes infectés et joue un rôle central dans la pathogenèse. Elle est codée par la famille de gènes var composée de 40-50 gènes dont l’expression varie selon le clone de P. falciparum. L’expression de PfEMP1 est basée sur le principe de variation antigénique selon lequel chaque parasite exprime un seul type de PfEMP1 au cours d’un cycle érythrocytaire62,63. Une même molécule PfEMP1 est généralement exprimée chez une population de
parasites et varie de façon synchronisée dans le temps et ce afin d’éviter d’épuiser rapidement le répertoire de variants disponibles64,65. De plus, la grande variété de domaines sur PfEMP1 permet aux
globules rouges infectés de lier différents récepteurs cellulaires présent sur les cellules endothéliales, affectant ainsi l’endroit de séquestration de ce globule rouge infecté66. Par exemple, il a été montré
que certains variants de PfEMP1 ont une affinité pour le récepteur ICAM-1 dans le cerveau causant ainsi la malaria cérébrale tandis que dans la circulation périphérique, le CD36 est le récepteur principal de PfEMP166–68. Dans les cas de malaria chez les femmes enceintes, certaines molécules
PfEMP1 peuvent interagir avec la protéine chondroïtine sulfate A exprimée à la surface des cellules épithéliales placentaires, causant ainsi des complications à la fois chez la femme, mais aussi chez le fœtus69.
Finalement, il est important de mentionner que la progression vers la forme sévère tant chez l’adulte que chez l’enfant ne peut être expliquée que par les facteurs mentionnés ci-haut. En effet, il faut aussi tenir compte des co-infections possibles qui sont nombreuses dans les pays en voie de développement, en plus des graves problèmes de malnutrition, qui ensemble pourraient influencer la sévérité de la maladie et les complications observées.
1.2.4 Les techniques de diagnostic clinique
Dû aux complications possibles et à la ressemblance des symptômes avec ceux d’une simple infection virale, il est important de rapidement et correctement diagnostiquer la maladie. Depuis les années 1900, les techniques de diagnostic de la malaria ont été basées sur l’observation au microscope de frottis sanguin colorés au GIEMSA70. Cette technique consiste à étaler une goutte de sang sur une
lame suivie d’une coloration au GIEMSA. Cette coloration permet de distinguer les différents stades asexués et sexués dans le sang, en colorant en bleu violet les différentes structures du parasite : les pigments d’hémozoine, la chromatine et le cytoplasme71. Cependant, l’accès à un microscope de
qualité n’est pas toujours possible dans les régions touchées par la malaria, c’est pourquoi l’on se tourne de plus en plus vers l’utilisation de tests de diagnostic rapide. Depuis les années 1990, on a vu apparaître plus de 200 tests sur le marché, basés sur un principe similaire de détection d’antigènes par les anticorps. Ces tests sont principalement conçus sous le format de cassettes ou de bandelettes de nitrocellulose. Parmi les antigènes les plus fréquemment ciblés par ces tests, on retrouve la protéine de surface HRP2 (« Histidine-rich protein 2 »), la protéine pLDH (« Plasmodium lactate dehydrogenase »), et l’aldolase. Certains tests sont spécifiques aux infections à P. falciparum tandis que d’autres détectent les infections mixtes (falciparum, vivax, malariae et ovale)72,73.
1.2.5 Le contrôle et les traitements de la malaria
Au cours des dernières décennies, des efforts colossaux ont été déployés par les gouvernements et les chercheurs académiques afin de trouver un moyen de traiter, mais surtout de prévenir la malaria. Le meilleur moyen de prévention reste d’empêcher les contacts avec le moustique. L’utilisation de filets imprégnés d’insecticide, de vêtements longs et de répulsif anti-moustique reste la première ligne de défense contre l’infection. Ces techniques ont grandement contribué à diminuer le taux de mortalité et la morbidité de la malaria. Malheureusement, depuis les années 1950, on observe l’apparition de moustiques résistants aux insecticides couramment utilisés.
1.2.5.1 Les antimalariaux
Les antimalariaux peuvent être classés en trois catégories selon leurs cibles et leurs finalités (Tableau 1). De plus, leurs modes d’action sont très variés et agissent sur différents stades du parasite. Par exemple, certains affectent la chaîne de transport des électrons de la mitochondrie (atovaquone, primaquine)74,75. Cependant, la majorité des médicaments disponibles et utilisés agissent contre le
cycle érythrocytaire et plus particulièrement sur la vacuole digestive (VD), avec pour objectif d’inhiber la polymérisation de l’hème en hémozoïne (chloroquine, méfloquine, quinine)76. La
dégradation de l’hémoglobine contenue dans le globule rouge à l’intérieur de la VD du parasite permet la récupération d’acides aminés nécessaires à la croissance du parasite mais génère aussi un sous-produit toxique pour le parasite, l’hème. Afin de neutraliser l’effet toxique, le parasite séquestre l’hème sous forme d’hémozoïne, non toxique77,78. De ce fait, inhiber cette dernière étape résulte en
une accumulation d’hème dans le parasite entrainant sa mort.
Depuis plusieurs décennies, on observe une forte augmentation de la résistance aux antimalariaux couramment utilisés. C’est pourquoi la stratégie actuellement recommandée par l’Organisation mondiale de la santé est celle de la thérapie combinée à base d'artémisinine (TCA). Il s’agit de combiner deux molécules dans un même traitement : une semi-synthétique dérivée de l’artémisinine et une autre synthétique, ayant des cibles différentes afin de ralentir l’apparition de résistance. Un exemple est l’utilisation d’artésunate (un dérivé d’artémisine) avec la méfloquine ou encore la dihydroartémisinine en combinaison avec la pipéraquine54.
Tableau 1 : Modes d’action et cibles de certains antimalariaux79,80.
Objectifs Cibles Antimalariaux
Empêcher l’infection
(Prophylaxie) Cycle exoérythrocytaire ; Cycle érythrocytaire Atovaquone, Primaquine, Proguanil, Chloroquine, Méfloquine Traiter la malaria Cycle érythrocytaire Chloroquine, Quinine,
Arthémisine (ACT), Pyriméthamine, Méfloquine Bloquer la transmission Stade sexué Primaquine, Chloroquine 1.2.5.2 La résistance aux antimalariaux
Depuis les 50 dernières années, des mesures drastiques ont été prises en vue d’éradiquer la malaria, impliquant entre autres la prise massive d’antimalariaux. Chaque fois, des bénéfices notables étaient observés, mais on assistait aussi au développement progressif de la résistance à ces mêmes médicaments. De telle sorte qu’aujourd’hui, P. falciparum a acquis une résistance à pratiquement tous les antimalariaux disponibles. C’est pourquoi la TCA est devenue le seul traitement recommandé pour traiter la malaria81. Malheureusement, au cours des dernières années, une apparition de souches
résistantes à l’artémisinine et ses dérivés a été observée dans les pays d’Asie du Sud-Est. Aussi, de récentes évidences ont révélé la présence de souches multirésistantes dans la région du bassin du Mékong (Vietnam, Cambodge), chez lesquelles la TCA est inefficace82–84. Une dispersion de ces
souches multirésistantes à l’Afrique et aux autres pays d’Asie entraînerait des conséquences de santé publique majeures et compromettrait les objectifs d’éradication de la malaria fixés par l’Organisation mondiale de la santé85.
1.2.6 Les vaccins
Avec l’apparition de souches multirésistantes, il devient urgent de développer une stratégie vaccinale efficace. Cette stratégie peut être divisée en deux objectifs : induire une immunité contre la malaria clinique (cible les antigènes du stade exo-érythrocytaire et érythrocytaire) et induire une immunité afin de restreindre la transmission (cible les antigènes du stade exo-érythrocytaire, sexué et sporogénique) 86. À ce jour, un seul candidat a réussi les essais cliniques de phase III et à être approuvé
commercialement. Il s’agit du vaccin RTS,S. 1.2.6.1 Le Vaccin RTS,S
En 2015, le vaccin RTS,S/AS01E (adjuvant AS01), commercialisé sous le nom de Mosquirix par le groupe GlaxoSmithKline, a officiellement été homologué par les agences réglementaires européennes. Il s’agit d’un vaccin à base de protéines recombinantes ciblant la CSP, exprimée à la surface des sporozoïtes. La protéine recombinante correspond à une partie de la CSP fusionnée à la protéine S de l’enveloppe du virus de l’hépatite B (AgsHB) (RTS). Cette protéine fusion est ensuite
co-exprimée avec cette même AgsHB (S) (Figure 7)87,88. Finalement, lorsque co-exprimées ensemble
dans la levure, les protéines RTS et S s’assemblent spontanément pour former des pseudoparticules virales mixtes qui constituent la base de la stratégie vaccinale87.
L’étude clinique de phase III fût conduite sur une cohorte de bébés (6-14 semaines) et de jeunes enfants (5-17 mois) sur 11 sites africains. L’étude a démontré que le vaccin permettait de réduire de 39% les cas de malaria cliniques et de 31.5% les cas sévères chez les enfants de 5 à 17 mois ayant reçu quatre doses de vaccin. Cependant, aucun effet bénéfique notable n’a été observé chez la cohorte vaccinée entre l’âge de 6 à 14 semaines89. Ces résultats montrent que malgré le fait que le vaccin soit
modérément efficace, il permet de réduire la mortalité et la morbidité de façon appréciable chez la population la plus à risque. Il représente donc, jusqu’au développement d’un vaccin grandement plus efficace, une stratégie importante dans la lutte contre la malaria90.
Figure 7 : Représentation schématique du vaccin RTS,S
1.3 La biologie du stade asexué de P. falciparum
Le stade asexué de P. falciparum est central dans la pathologie associée à la malaria. Il s’agit du principal stade étudié in vitro et représente une cible importante pour le développement de nouveaux traitements antimalariaux et de stratégies vaccinales. De ce fait, l’ensemble des projets présentés dans cette thèse ainsi que les caractéristiques biologiques et cellulaires décrient par la suite concerneront principalement le parasite lors du cycle érythrocytaire.
1.3.1 Le complexe apical
Le complexe apical est caractéristique et unique à la famille Apicomplexa. Il est composé de trois organites sécrétoires : les rhoptries, les micronèmes et les granules denses (Figure 8). Lors du stade érythrocytaire, ces organites et la majorité des protéines qu’ils contiennent sont essentiels à la survie du parasite et à l’invasion productive du globule rouge. De par ce rôle, les protéines apicales sont
synthétisées de novo et tardivement lors du cycle érythrocytaire (environ dix heures avant la rupture du globule rouge infecté).
1.3.1.1 Les rhoptries
Chez le mérozoïte, les rhoptries sont des organites en forme de poire et toujours présents en paire à l’extrémité apicale du parasite. Il s’agit d’un organite entouré d’une simple membrane qui peut être divisé en deux sous-régions : le bulbe (région basale) et le cou (région apicale) (Figure 8)91. Les
protéines de rhoptries sont délibérément et spécifiquement localisées dans l’une ou l’autre de ces régions, et ce selon leur ordre de sécrétion lors de l’invasion.
Figure 8 : Les organites du complexe apical et ses protéines Les protéines RAP
Le complexe de protéines RAP (« Rhoptry associated protein ») ou « low molecular weight » (LMW) est localisé au bulbe des rhoptries et est composé des protéines RAP1, RAP2 et RAP3. Ce complexe est présent sous forme d’hétérodimère avec la protéine RAP1 : RAP1/RAP2 ou RAP1/RAP3. Le rôle de ces protéines n’est cependant pas bien déterminé. Par contre, il a été révélé que le complexe RAP1/RAP2 participe à l’invasion, d’une façon mal définie, puisque l’utilisation d’anticorps anti-RAP1 et anti-RAP2 inhibe l’invasion du globule rouge in vivo92,93. Cependant, de façon
contradictoire, l’ablation du complexe RAP1/RAP2 ne semble pas affecter la capacité et le phénotype d’invasion du parasite, in vitro. De plus, il a été montré que RAP1 joue un rôle crucial dans le transport de la protéine RAP2 vers les rhoptries94.
Les protéines RhopH
Une des composantes majeures du bulbe des rhoptries est le complexe de protéines « high molecular weight » (HMW) ou RhopH. Il est composé de trois protéines : RhopH1, RhopH2 et RhopH395,96.
Pour sa part, la protéine RhopH1 est encodée par la famille de gènes clag (« cytoadherence linked asexual gene »). Cette famille de gènes est composée de cinq différents variants, permettant de produire cinq différentes protéines RhopH1 (RhopH1/clag2, clag3.1, clag3.2, clag8, clag9)97. Suite
mérozoïte où, via la protéine RhopH3, il participe au processus d’invasion98,99. Par la suite, le
complexe est transféré dans la VP puis transporté à l’intérieur de la cellule hôte à travers un translocon. Il a récemment été montré que suite à l’invasion, le complexe RhopH1/clag3-RhopH2-RhopH3 est retrouvé à la membrane plasmique du globule rouge et y forme un pore afin de favoriser l’import de nutriments pour le développement du parasite98,100,101.
Les protéines RON
Parmi les protéines retrouvées dans la région du cou des rhoptries, l’on retrouve la famille de protéines RON (« Rhoptry neck protein ») formée par RON1 à 6. Contrairement aux protéines du bulbe, ces protéines ont un rôle précoce et bien défini lors de l’invasion. Il a en effet été montré qu’elles sont impliquées dans la formation de la jonction serrée en formant un complexe avec la protéine de micronèmes AMA1 (« apical membrane antigen 1 »). Suite à leur sécrétion, les protéines RONs sont transloquées dans la membrane de l’érythrocyte pour ensuite former un complexe avec la protéine micronèmale AMA1. La jonction serrée ainsi formée entre la membrane du parasite et celle du globule rouge permet de solidifier l’attachement, une étape cruciale dans le processus d’invasion102,103.
Les protéines Rh
Un autre groupe de protéines, des adhésines, localisées au cou des rhoptries est la famille RBL (« Reticulocyte binding-like »). Le génome de P. falciparum code pour cinq larges protéines RBL (>200kDa) nommées Rh1, 2a, 2b, 4 et 5. Ensemble, ces protéines jouent un rôle essentiel dans la liaison directe avec les récepteurs de surface de l’érythrocyte. Cette interaction adhésine-récepteur serait importante pour induire une cascade de signalisation afin de susciter la formation de la jonction serrée104,105.
La protéine RAMA
Finalement, RAMA (« Rhoptry-associated membrane antigen ») est une protéine atypique qui possède un groupement GPI (Glycosylphosphatidylinositol) à son extrémité C-terminale. Contrairement aux autres protéines de rhoptries, elle est exprimée de façon précoce et semble être impliquée à la fois dans l’invasion, mais aussi dans la biogenèse des rhoptries. Des études ont révélé que RAMA est exprimée avant la formation de rhoptries et est accumulée dans le système de sécrétion, à l’appareil de Golgi. De plus, au moment opportun, elle est en mesure d’y lier des protéines de rhoptries (les complexes LMW et HMW) suggérant ainsi un rôle dans le transport de protéines vers les rhoptries106. RAMA a aussi été détectée à la surface des globules rouges suite au relâchement
1.3.1.2 Les micronèmes
Les seconds organites apicaux sécrétoires sont les micronèmes. Ces dernières, beaucoup plus petites et allongées que les rhoptries, sont réparties de part et d’autre de celles-ci (Figure 8). La sécrétion de protéines de micronèmes dès les premiers instants de l’invasion est principalement associée aux évènements d’attachement. Parmi les protéines les plus étudiées, on retrouve les protéines AMA1 et EBA175. Tout d’abord, AMA1 est une protéine essentielle impliquée dans l’attachement du parasite à sa cellule hôte. Suite au contact initial avec l’érythrocyte, AMA1 interagit avec la protéine RON2 afin de former la jonction serrée108. Il a aussi été proposé que sa présence à la jonction serrée
entraînerait le relargage de protéines de rhoptries109.
Ensuite, on retrouve la protéine EBA175 qui interagit avec la protéine Glycophorine A à la surface du globule. Elle fait partie de la grande famille des EBL (« Erythrocyte binding-like ») dont fait aussi partie la protéine PfEMP1. Cette famille est caractérisée par la présence de domaines « Duffy binding-like » (DBL) riches en cystéines et habituellement impliqués dans les interactions avec les cellules hôtes110,111.
1.3.1.3 Les granules denses
Finalement, les granules denses (GD) sont les derniers organites à sécréter leur contenu lors de l’invasion. De forme plutôt ronde, ces organites contienent des protéines qui vont exercer des fonctions lors des dernières étapes de l’invasion : la formation et le développement de la VP. De ce fait, la majorité des protéines de GD vont être sécrétées à l’intérieur de la VP nouvellement formée112.
La première protéine de GD identifiée et la plus caractérisée est la protéine RESA (« Ring-infected Erythrocyte Surface Antigen »)113. Elle est sécrétée dans la VP une fois l’invasion terminée puis est
transportée via le translocon PTEX (« Plasmodium translocon of exported protein ») jusqu’au cytoplasme de l’érythrocyte114. Elle interagit alors avec la protéine spectrine de l’hôte de façon à
stabiliser la membrane de l’érythrocyte afin d’éviter sa dégradation115,116.
1.3.2 L’invasion du globule rouge
L’invasion du globule rouge par le mérozoïte est une étape critique qui est accomplie par les effecteurs contenus dans les organites du complexe apical. La sous-compartimentalisation et la sécrétion ordonnée sont primordiales afin de coordonner précisément les différentes étapes menant à l’établissement du cycle érythrocytaire. Ce processus d’invasion peut être décortiqué en 4 étapes : l’attachement, la réorientation, l’invasion et la post-invasion (Figure 9)117,118.
Figure 9 : L’invasion du globule rouge (Adaptée de 119)
1o L’étape d’attachement
Suite à la rupture du schizont, les mérozoïtes libérés dans le sang sont exposés à un environnement faible en ions potassium. Ce stimulus extérieur entraîne une augmentation de la concentration cytosolique en calcium. Cette hausse du niveau de calcium interne déclenche la translocation de protéines de micronèmes à la surface du mérozoïte. Parmi ces nouvelles protéines de surface, on retrouve les protéines EBA175 et AMA1. Leur sécrétion permet de restaurer le niveau basal en calcium en plus de provoquer le relâchement des protéines de rhoptries Rh à la surface120.
Parallèlement, les mérozoïtes nouvellement expulsés sont non motiles et vont passivement diffuser dans le milieu jusqu’à ce qu’ils rencontrent un globule non infecté. Le premier contact entre le parasite et la cellule cible s’effectue via les protéines de surface du mérozoïte MSP (« merozoite surface protein ») et plus particulièrement la protéine MSP1. Il s’agit de la protéine la plus abondante à la surface du mérozoïte, où elle est attachée par une ancre GPI121. Ce premier contact est de faible
affinité et permet au groupe de ligands EBL/Rh d’entrer en jeux. Ces groupes de ligands sont fonctionnellement redondants et définissent un ensemble de voies d’invasion alternatives selon les récepteurs présent à la surface de l’érythrocyte. Parmi ces paires ligands-récepteurs on retrouve EBA175/Glycophorine A pour la voie dépendante de l’acide sialique ou encore Rh4/Récepteur de complément 1, une voie indépendante de l’acide sialique111,122. Ces étapes de reconnaissance et
