Evaluation de deux nouveaux outils pour l'étude d'échantillons biologiques par spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire: -La RMN HR-MAS (High-Resolution Magic Angle Spinning): une technique d'analyse d'échantillons bruts ; -La Métabonomique: une

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en vue de l’obtention du

DOCTORAT DE L'UNIVERSITE DE TOULOUSE Délivré par l’Université Toulouse III – Paul Sabatier

Ecole doctorale Sciences de la Matière Spécialité: Chimie Biologie Santé.

Présentée et soutenue par

Delphine BON

le 11 décembre 2007

Evaluation de deux nouveaux outils pour l’étude d’échantillons biologiques par spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire:

-La RMN HR-MAS (High-Resolution Magic Angle Spinning): une technique d’analyse d’échantillons bruts;

-La Métabonomique: une méthode d’analyse statistique des spectres pour la recherche de signatures métaboliques.

Directeurs de thèse: Dr. Franck Desmoulin et Pr. Myriam Malet-Martino.

JURY

Président M. Robert Martino Professeur à l’UPS Toulouse

Rapporteurs Mme Anne-Marie Delort DR CNRS Clermont-Ferrand

Mme Roxanne Deslauriers DR CNRC Winnipeg (Canada)

Examinateurs Mme Michelle Gué Professeur à l’UPS Toulouse M. Martial Piotto Ingénieur chez Bruker Biospin Wissembourg

M. Franck Desmoulin CR INSERM Toulouse

Groupe de RMN Biomédicale, Laboratoire de Synthèse et Physicochimie de Molécules d'Intérêt Biologique (LSPCMIB) - UNIVERSITE PAUL SABATIER - UMR CNRS UPS 5068 - Bât 2R1 - 118, route de Narbonne - 31062 Toulouse Cedex 9.

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m’avoir accueilli.

Je remercie Anne-Marie Delort et Roxanne Deslauriers d’avoir accepté de juger mon travail et d’en avoir été les rapporteurs. Merci à Michèle Gué et à Martial Piotto pour leur participation au jury de cette thèse ainsi qu’à Robert Martino pour avoir accepter de présider le jury.

Merci à Myriam Malet-Martino et Robert Martino qui m’ont permis de réaliser mon travail de thèse dans leur groupe. Je les remercie pour leur bienveillance et leur aide au quotidien.

Un grand merci à Franck Desmoulin qui m’a encadré au côté de Myriam pendant ces 3 années. Je le remercie pour sa gentillesse, sa disponibilité, sa patience, son aide en toute circonstance et bien sûr pour son esprit « holistique ».

Merci à tous les autres membres du groupe de RMN Biomédicale pour leur présence et leur bonne humeur. Joëlle, Brigitte, Véronique, ça a été un réel plaisir de travailler à votre contact. Merci à Rémi et Olivier pour leurs conseils avisés d’ex-thésards. Un petit coucou spécial à Saleh qui a partagé avec moi les joies et les soucis du labo pendant ces 3 ans. Un grand merci aussi à Denis qui a su répondre présent aux moments critiques pendant la dernière année, je lui souhaite bon courage et plein de bonheur pour la fin de sa thèse. Un petit message de bienvenue à Stéphane et à Sacha qui ont rejoint l’équipe récemment.

Je remercie aussi les membres du service commun de RMN (Stéphane, Marc, Pierre et Yannick) qui m’ont aidé à « dresser » les spectromètres, même si les choses ont parfois été compliquées.

Un grand merci à tous mes amis, Freddy et Rodolphe en première ligne avec qui j’ai parcouru un certain nombre d’années et sans qui je n’aurais pas fait ce parcours. Merci pour tous ces moments. Sans oublier bien sûr Julie, Clément, Stéphanie, Damien, Adrien, Aline, Yiqian, Ghis et Bruno, Olivier.

Enfin un grand merci à mes parents et à mon frérot pour leur soutien de tous les jours. Merci à tout le reste de la famille et enfin, une petite pensée pour ceux qui sont partis.

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TABLE DES MATIERES. ABREVIATIONS. ... 5 INTRODUCTION GENERALE. ... 7 PARTIE EXPERIMENTALE. ... 13 1. Produits chimiques. ... 15 2. Matériel. ... 15

3. Préparation des échantillons. ... 15

3.1 Ver endogéique Aporrectodea caliginosa ... 15

3.2 Larve Harpalus rufipes... 16

3.3 Tissus biologiques... 16

3.4 Végétaux. ... 17

3.5 Préparation des cellules de glioblastomes. ... 17

3.6 Protocole d’extraction... 18

4. RMN ... 19

4.1 Ver endogéique Aporrectodea caliginosa. ... 19

4.2 Larve de carabe Harpalus rufipes. ... 20

4.3 Tissus biologiques bruts... 21

4.4 Extraits biologiques... 23

5. Analyse statistique... 25

CHAPITRE 1: La RMN HR-MAS: une technique d’analyse d’échantillons bruts. ... 27

Introduction. ... 29

1. Historique de la RMN HR-MAS... 30

2. Principe de la technique... 31

2.1 Interactions et effets prédominants dans un milieu anisotrope. ... 31

2.1.1 L’anisotropie en RMN... 31

2.1.2 Représentation d’un système de spins nucléaires dans un champ magnétique. ... 31

2.1.3 Interactions dipolaires. ... 32

2.1.4 Susceptibilité magnétique... 33

2.1.5 Anisotropie de déplacements chimiques. ... 35

2.1.6 Couplages quadripolaires... 36

2.1.7 Cas particulier des échantillons hétérogènes multiphasiques. ... 36

2.2 Types d’interaction dans le cas des échantillons biologiques... 37

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3. Les différentes applications de la RMN HR-MAS. ... 41

3.1 Applications de la RMN HR-MAS en chimie. ... 41

3.2 Applications de la RMN HR-MAS en biologie. ... 43

3.2.1 Etude des composés membranaires en suspension aqueuse. ... 43

3.2.2 Cellules... 44

3.2.3 Tissus... 45

3.2.4 Agronomie. ... 46

3.3 Conclusion... 47

4. Evaluation de la RMN HR-MAS à travers l’étude de différents types d’échantillons biologiques: avantages et limitations. ... 48

4.1 Effet de la mise en rotation de l’échantillon à l’angle magique. ... 48

4.1.1 Cas du ver Aporrectodea caliginosa non dépuré... 48

4.1.2 Cas des tissus biologiques... 49

4.2 Matériel adapté à l’analyse de faibles volumes. ... 52

4.3 Effet de la vitesse de rotation. ... 52

4.4 Effet de la température. ... 55

4.5 Stabilité des échantillons au cours du temps. ... 56

4.6 Problèmes liés aux échantillons biologiques. ... 59

4.7 Observation simultanée des métabolites hydrosolubles et des lipides... 62

4.7.1 Les lipides... 62

4.7.2 Les métabolites hydrosolubles. ... 63

4.7.3 Attribution des signaux... 65

4.8 Quantification des métabolites. ... 69

4.8.1 Choix des paramètres d’acquisition... 70

4.8.2 Quantification de solutions standards par RMN HR-MAS. ... 71

4.8.3 Quantification des métabolites présents dans le tissu rénal par RMN HR-MAS.. 72

5. Analyse du ver Aporrectodea caliginosa par RMN HR-MAS. ... 79

6. Analyse de la larve de carabe Harpalus rufipes par RMN HR-MAS. ... 88

CHAPITRE 2: La Métabonomique: une méthode d’analyse statistique des spectres pour la recherche de signatures métaboliques... 103

Introduction ... 105

1. Les méthodes statistiques... 107

1.1 Méthodes statistiques uni/bivariées. ... 107

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1.1.2 Le test de Student... 107

1.2 Méthodes statistiques multivariées ... 108

1.2.1 Analyse en composantes principales (ACP)... 108

1.2.2 Classification... 110

1.2.3 Analyse de la variance (ANOVA)... 110

1.3 Conclusion sur les méthodes statistiques. ... 111

2. Logiciels et technique analytique utilisés. ... 111

2.1 Logiciels utilisés. ... 111

2.1.1 Logiciel AMIX. ... 111

2.1.2 Logiciel développé sous R. ... 111

2.2 Technique analytique: la RMN. ... 112

2.3 Remarques concernant l’utilisation des données RMN pour le traitement statistique par ACP. ... 113

2.3.1 Taille de la matrice. ... 113

2.3.2 Incidence de la variabilité du pH... 116

2.3.3 Prétraitement des spectres. ... 116

2.3.4 Mise en évidence des échantillons atypiques. ... 116

2.4 Développement d’outil statistique pour la combinaison des données de différentes origines. ... 119

2.4.1 Normalisation et criblage des variables. ... 120

2.4.2 Combinaison de variables de différentes origines. ... 121

3. Application à la recherche de marqueurs métaboliques caractéristiques de la résistance à la radiothérapie des glioblastomes. ... 124

3.1 Introduction. ... 124

3.2 Analyse métabonomique par RMN de lignées cellulaires de glioblastomes humains. ... 125

3.2.1 Récupération et extraction des cellules... 125

3.2.2 Attribution des signaux... 127

3.2.3 Analyse quantitative. ... 133

3.2.4 Zone des composés à choline. ... 134

3.2.5 Effet de la confluence. ... 135

3.2.6 Recherche d’un marqueur métabolique discriminant le phénotype radiorésistance vs phénotype radiosensible... 138

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4. Analyse métabonomique des modifications précédant l’insuffisance cardiaque chez le

rat SHHF obèse... 144

4.1 Introduction. ... 144

4.2 Analyse des extraits hydrosolubles. ... 145

4.3 Analyse des extraits organosolubles. ... 149

4.4 Analyse combinée des données... 151

4.5 Conclusion... 153

CONCLUSION GENERALE. ... 155

BIBLIOGRAPHIE. ... 159

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ABREVIATIONS.

15 N Azote-15 13 C Carbone-13 19 F Fluor-19 31 P Phosphore-31 1 H Proton-1 Ace Acétate

ACP Analyse en Composantes Principales ADP Adénosine diphosphate

Ala Alanine

AMP Adénosine monophosphate

ANOVA "ANalysis Of Variance" (Analyse de la variance)

Asp Aspartate

ATP Adénosine triphosphate

CCM Chromatographie sur Couche Mince CDCl3 Chloroforme deutéré

Cho Choline

"Cho" Composés à choline (Cho, PC, GPC) COSY COrrelation SpectroscopY

CP Composante Principale CPMG Carr-Purcell-Meiboom-Gill

Cr Créatine

"Cr" Composés dérivés de la créatine (Cr, PCr et créatinine) CV Coefficient de Variation

D2O eau deutérée

DMEM "Dulbecco's Modified Eagle's Medium" (milieu de Eagle modifié par Dulbecco)

For Formiate GABA γ-Aminobutyrate Gln Glutamine Glu Glutamate Gly Glycine GPC Glycérophosphorylcholine GPE Glycérophosphoryléthanolamine GSH Glutathion His Histidine

HR-MAS "High-Resolution Magic Angle Spinning" (haute résolution avec rotation à l’angle magique) β-HB β-Hydroxybutyrate IC Insuffisance Cardiaque Ile Isoleucine IR Infrarouge Lac Lactate Leu Leucine LM Lipides Membranaires Lys Lysine

MAO Monoamine oxydase MPA Acide méthylphosphonique MyoI Myo-Inositol

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NAAG N-acétylaspartylglutamate NAC N-acétylcystéine

α, β, et γ-NTP

Phosphore α, β, et γ des nucléotides triphosphates

α, β-NDP Phosphore α et β des nucléotides diphosphates PC Phosphorylcholine PCr Phosphocréatine PDE Phosphodiester PE Phosphoryléthanolamine Phe Phénylalanine Pi Phosphate inorganique PL Phospholombricine PME Phosphomonoester

PSM Poste de Sécurité Microbiologique PtCho Phosphatidylcholine

RF radiofréquence

RMN Résonance Magnétique Nucléaire RR Radiorésistant

RS Radiosensible

ScylloI Scyllo-Inositol

SHHF rat "Spontaneous Hypertensive Heart Failure rat" (rat spontanément hypertendu et développant une insuffisance cardiaque)

Succ Succinate

SVF Sérum de Veau Fœtal

T1 Temps de relaxation longitudinale T2 Temps de relaxation transversale

Tau Taurine

TCB 1,3,5-trichlorobenzène

Thr Thréonine

TMPS-d6 acide 3-(triméthylsylil)-1-propane sulfonique-d6 TMS Tétraméthylsilane

Tyr Tyrosine

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De la chimie à la biologie, la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) est devenue un outil analytique indispensable pour l’analyse de mélanges tels que des extraits biologiques ou ceux provenant de la chimie sur support solide.

Cette technique analytique permet l’observation de tous les composés grâce à l’obtention d’un signal de précession libre pour un noyau donné, à la seule condition que ce noyau possède un spin nucléaire non nul. Dès lors que la molécule ou le mélange étudié contient ce noyau, il est possible d’obtenir un signal RMN. A titre de comparaison, il est nécessaire que les molécules présentes dans l’échantillon soient susceptibles d’être séparées et ionisées pour pouvoir être observées par spectrométrie de masse. La RMN permet d’obtenir une représentation «totale» d’un mélange, sans préparation, au lieu d’une analyse moléculaire ciblée correspondant à la détection spécifique de chaque constituant.

Cependant, il existe certains obstacles à l’utilisation de la RMN pour l’analyse des mélanges: d’une part, sa faible limite de sensibilité et, d’autre part, un problème de dynamique de concentrations. Malgré l’augmentation de la puissance des aimants et l’utilisation de cryosondes qui ont permis un gain en sensibilité d’un facteur 3 ou 4, la RMN reste une technique analytique peu sensible. En effet, sa limite de détection est de l’ordre de la nanomole, nettement supérieure à celle de la spectrométrie de masse qui est de l’ordre de la fentomole. Cependant, c’est la seule technique permettant l’observation globale et non destructive des composés présents dans l’échantillon sans préparation ni a priori sur leurs structures.

L’analyse des échantillons biologiques par RMN a longtemps été limitée, pour des raisons de technique RMN et d’intérêt scientifique, à l’observation des noyaux phosphore-31 (31P) et carbone-13 (13C) principalement. La RMN 31P est la seule méthode permettant la mesure du potentiel de phosphorylation et du pH intracellulaire de manière non invasive sur les cellules ou les organes1. La RMN 13C combinée à l’utilisation de substrats sélectivement enrichis en 13C a permis de mettre en évidence de nouvelles voies ou de nouveaux cycles métaboliques2. Bien qu’étant ubiquitaire et plus sensible, le noyau d’hydrogène (proton, 1H) n’a été que plus tardivement utilisé pour l’analyse des tissus biologiques. En effet, la RMN 1H n’a pu se développer qu’en compensant sa faible distribution spectrale (qui est de 12 ppm) par une meilleure résolution des signaux, c'est-à-dire grâce au développement d’aimants générant des champs magnétiques supérieurs à 5 Tesla. De plus, il était impératif de pouvoir éliminer le signal des hydrogènes de l’eau qui correspond à 111 mol.L-1. Ceci devint possible avec l’élaboration de séquences d’élimination sélective du signal de l’eau et l’augmentation de la dynamique des convertisseurs analogiques digitaux des spectromètres.

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Ces améliorations techniques et méthodologiques ont rendu aisée l’observation du 1H pour analyser les métabolites présents dans les cellules ou les tissus. Cependant, certaines caractéristiques comme la variation de pH entre différents compartiments des échantillons ou l’existence d’inhomogénéités de susceptibilité magnétique concourent à un élargissement des signaux et/ou à leur recouvrement. Par conséquent, l’obtention de spectres de haute résolution permettant une quantification correcte des métabolites nécessite le plus souvent une extraction préalable des composés présents dans les cellules ou les tissus. Ces extractions permettent d’obtenir, d’une part, les métabolites hydrosolubles et, d’autre part, les métabolites organosolubles. L’analyse est réalisée de manière séparée sur ces deux fractions limitant la superposition des signaux et éliminant les effets des différences de susceptibilité magnétique. De plus, concernant la fraction hydrosoluble de l’extrait, le pH peut être modifié de manière à discriminer particulièrement certains composés dans le spectre. Cependant, il faut considérer que l’extraction des composés se réalise avec un certain rendement et que ces composés peuvent être altérés durant la procédure d’extraction. Dans l’absolu, l’extraction conduit à une perte d’informations potentielles sur la compartimentation et la complexation des métabolites.

Depuis une dizaine d’années, la RMN HR-MAS (High-Resolution Magic Angle Spinning: haute-résolution avec rotation de l’échantillon à l’angle magique) a été proposée pour l’analyse des tissus biologiques. Elle permet une amélioration de la résolution des spectres 1H obtenus à partir d’échantillons biologiques bruts. Cette technique permet la détection, dans un échantillon de tissu intact, de l’ensemble des métabolites hydro- et organo-solubles, ce qui évite l’extraction et permet d’envisager l’obtention d’informations analogues à celles qui seraient obtenues dans le tissu in situ. L’amélioration de la résolution des spectres ainsi qu’une excellente sensibilité sont les arguments qui ont amené de nombreuses équipes, dont la nôtre, à faire l’acquisition d’une sonde HR-MAS.

Ainsi, il est possible d’obtenir le profil «spectral» d’un échantillon caractérisé par la variation de l’intensité du signal en fonction des fréquences mesurées sur un spectre RMN. Dans le cas des échantillons biologiques, les signaux proviennent des métabolites et ce profil est donc synonyme de profil «métabolique». La caractérisation d’un échantillon par son profil «métabolique» a entraîné des recherches sur les modifications des profils dans les tissus, cellules, plasma ou urine afin de proposer des marqueurs spécifiques de perturbations induites par une pathologie, un traitement chimique ou physique.

Les progrès de l’informatique et l’apparition de nouveaux outils statistiques en combinaison avec des méthodes d’analyse délivrant un grand nombre de données ont permis l’émergence de nouvelles disciplines comme la Génomique fonctionnelle (autrement appelée

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Transcriptomique), la Lipidomique, la Protéomique et la Métabonomique. Ces disciplines visent à différencier des groupes d’échantillons en fonction de données discriminantes et à effectuer des études sur les réponses d'un système biologique exposé à des perturbations environnementale, biochimique ou génétique.

La première partie de cette thèse est consacrée à l’évaluation de la RMN HR-MAS appliquée à l’analyse de tissus biologiques. Les avantages de cette méthode seront exposés à travers l’étude d’échantillons biologiques d’origine variée (prélèvements de tissus, cellules, animaux). Cependant, ces avantages méritent d’être mis en perspective: (i) à la lumière de la pratique expérimentale acquise à ce jour, (ii) en fonction de la nature et de l’origine de l’échantillon analysé et (iii) selon l’objectif expérimental fixé. Les résultats obtenus par cette méthode seront comparés à ceux obtenus à partir de l’analyse par RMN conventionnelle des extraits de tissus.

La deuxième partie de cette thèse est consacrée à la recherche de marqueurs métaboliques à l’aide d’outils statistiques d’analyse de données issues de spectres RMN. Nous avons réalisé l’étude métabonomique comparée de cellules de glioblastomes de phénotypes radiorésistant (RR) et radiosensible (RS). Cette étude a permis de mettre en évidence des marqueurs caractéristiques de la radiorésistance. L’analyse en composantes principales (ACP) et la combinaison de données normées, provenant de spectres obtenus à partir du même individu, ont permis la caractérisation des modifications métaboliques induites par une pathologie (obésité chez le rat) et la caractérisation du phénotype (variétés de courge).

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1. Produits chimiques.

Les solvants utilisés sont de qualité analytique.

Les produits chimiques utilisés pour réaliser les ajouts de standards (pour les attributions des signaux) proviennent de la société Sigma-Aldrich.

2. Matériel.

Mixeur: IKA WERKE Ultra-Turrax T8 avec une tige de 5 mm de diamètre. Lyophilisateur: Labconco Lyph.Lock4.5.

Speed’Vac: Concentrator SAVANT.

Compteur de cellules: Z1™ Series COULTER COUNTER. Centrifugeuse: Sigma-202MK.

pH mètre: CyberScan 500

Electrode de mesure: Mettler Toledo InLab 422

Logiciel d’acquisition, de traitement et d’analyses des données RMN: WINNMR, XWINNMR, TopSpin, Mestrec, Amix, R.

3. Préparation des échantillons.

3.1 Ver endogéique Aporrectodea caliginosa

Les vers de terre Aporrectodea caliginosas ont été prélevés dans un potager du sud-ouest de la France (Embernou, 43°45’N, 1°38’ E). Les animaux ont été maintenus dans la terre argilo-siliceuse du lieu d’origine, dans l’obscurité et à 14 ± 1°C jusqu’au moment de leur analyse effectuée dans les 12 h suivant le prélèvement.

Avant l’analyse, les animaux sont placés entre deux papiers humidifiés avec de l’eau distillée afin d’éliminer les éventuels restes de terre. Les vers entiers mesurent 7,6 ± 0,6 cm et pèsent 592 ± 91 mg (n=7).

Pour l’analyse des vers entiers avec une sonde RMN conventionnelle, trois animaux sont immergés dans une solution aqueuse d’éthanol 5% (v/v) servant de sédatif durant 5 minutes puis placés dans un tube de 10 mm de diamètre avec 3 mL d’une solution aqueuse à 5% d’éthanol (v/v).

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Pour l’analyse par RMN HR-MAS, les animaux sont séparés en trois parties:

• une partie antérieure de 185 ± 68 mg (n=5) • une partie médiane de 225 ± 70 mg (n=5) • une partie postérieure de 177 ± 48 mg (n=5).

Un fragment de ver est placé dans le rotor HR-MAS 4 mm qui est ensuite complété avec du D2O.

3.2 Larve Harpalus rufipes.

Les larves du carabe Harpalus rufipes ont été prélevées dans un potager du sud-ouest de la France (Embernou, 43°45’N, 1°38’ E). Les animaux ont été maintenus dans la terre argilo-siliceuse du lieu d’origine, dans l’obscurité et à 14 ± 1°C jusqu’au moment de leur analyse effectuée dans les 12 h suivant le prélèvement.

Deux récoltes ont été effectuées, une au printemps et une en hiver. Les animaux de printemps mesurent 11,3 ± 1,0 cm et pèsent 31 ± 8 mg (n=5) et ceux d’hiver 13,4 ± 0,7 cm pour 36 ± 5 mg (n=5).

Les animaux vivants sont placés dans le rotor HR-MAS 4 mm qui est ensuite complété avec du D2O.

3.3 Tissus biologiques.

Des rats mâles Wistar ont été utilisés pour les expériences de comparaison RMN conventionnelle et RMN HR-MAS. Ils proviennent de l’animalerie de Rangueil (Toulouse, France). Les prélèvements de tissu font 77 ± 20 mg (n=9) pour les expériences avec la sonde conventionnelle et 33 ± 4 mg (n=9) pour les expériences avec la sonde HR-MAS.

La même race de rat a été utilisée pour les autres expériences RMN HR-MAS sur le tissu rénal. Les prélèvements font 19 ± 6 mg (n=3) pour la quantification par RMN HR-MAS et 21 ± 7 mg pour la quantification directe, 13 ± 3 mg (n=12) pour les mesures de T1 et T2. Des rats mâles de souche Sprague Dawley ont été utilisés pour l’étude de l’effet néphroprotecteur de la pargyline. Ils proviennent de l’unité INSERM U388, Pharmacologie Moléculaire et Physiopathologie Rénale IFR31, CHU Rangueil. Les échantillons font en moyenne 13 ± 3 mg (n=12).

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Des rats SHHF ont été utilisés pour l’étude de l’obésité sur l’insuffisance cardiaque. Ils proviennent de l’unité INSERM UPS U586, Institut Louis-Bugnard, Université Paul-Sabatier, CHU Rangueil. Les échantillons font en moyenne 91 ± 39 mg (n=20).

Pour l’analyse des tissus biologiques bruts, deux types d’expériences ont été effectués, celles avec la sonde HR-MAS et celles avec une sonde conventionnelle large bande inverse (BBI, Bruker).

Pour les expériences HR-MAS, le rotor 4 mm adapté à un volume de 50 µL a été choisi. Le rotor ainsi que ses éléments sont placés sur un lit de carboglace. Un volume de 10 µL d’une solution froide de TMPS-d6 (3-(triméthylsylil)-1-propane sulfonique-d6) à 10 mmol.L-1 est placé au fond du rotor. Puis, l’échantillon congelé est inséré dans le rotor avant sa fermeture. Le rotor est conservé dans la carboglace jusqu’à l’analyse. La pesée de l’échantillon est effectuée en faisant la tare avec l’ensemble des éléments du rotor.

Pour les expériences avec la sonde conventionnelle, un tube équipé d’inserts de susceptibilité magnétique adaptée aux milieux aqueux (Shigemi Inc., USA) a été utilisé pour l’observation des tissus dans la sonde. Le tissu baigne au centre de 200 µL d’une solution 5 mmol.L-1 de TMPS-d6 dans D2O (0,9% NaCl p/v).

Les expériences sur le tissu frais reprennent le même protocole mais sur lit de glace au lieu de carboglace et l’échantillon est placé dans le tube ou le rotor durant les 5 minutes qui suivent le prélèvement.

3.4 Végétaux.

Trois variétés de courges potagères ont été analysées: Potimarron et Bleu de Hongrie de l’espèce Cucurbita maxima et Butternut de l’espèce Cucurbita moshata. Les échantillons ont été obtenus par carottage au centre de la partie charnue du fruit. Le cylindre obtenu de 3 mm de diamètre interne et 14 mm de longueur fait 80 ± 7 mg (n = 9). Il est inséré dans le rotor HR-MAS 4 mm qui est ensuite rempli de D2O.

3.5 Préparation des cellules de glioblastomes.

Les cellules sont fournies par le Département de Radiothérapie-Centre de Lutte Contre le Cancer Claudius Regaud. Nous avons travaillé avec quatre lignées cellulaires, deux lignées radiorésistantes (U87 RR et SF763 RR) et deux lignées radiosensibles (U251 RS et SF767

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RS). Le nombre de manipulations et la quantité de cellules obtenue sont présentés dans le tableau suivant:

Cellules Nombre de points Nombre de cellules par

boîtes (millions) U87 RR (confluence 60%) 5 3,8 ± 0,4 U87 RR (confluence 80%) 5 6,0 ± 1,5 U87 RR (confluence 100%) 5 4,8 ± 1,1 U251 RS (confluence 60%) 5 4,6 ± 1,6 U251 RS (confluence 80%) 5 7,8 ± 1,8 U251 RS (confluence 100%) 5 14,3 ± 4,4 SF763 RR (confluence 60%) 6 4,7 ± 0,8 SF767 RS (confluence 60%) 6 4,8 ± 1,2

Les cellules sont ensemencées dans des boîtes de culture de 140 mm de diamètre de manière à obtenir à quatre jours 60%, 80% ou 100% de confluence (paramètre défini visuellement par l’expérimentateur). Elles sont ensuite maintenues dans le milieu de culture constitué de DMEM contenant 10% de L-glutamine (p/v), 4,5 g.L-1 de D-glucose et 10% de SVF (sérum de veau fœtal) (v/v). L’incubation se fait à 37°C pendant 4 jours au bout desquels le milieu de culture est enlevé. Les cellules sont rincées avec 10 mL de sérum physiologique froid (4°C) puis elles sont décollées de la boîte par trypsinisation (1 mL de trypsine par boîte pendant 1 minute). Elle sont reprises 2 fois dans 10 mL de sérum physiologique froid et centrifugée. Une série d’expériences a été réalisée en décollant les cellules par grattage et non pas par trypsinisation. Les résultats ne sont pas présentés mais sont identiques à ceux obtenus avec la méthode de trypsinisation (n=3). Les cellules sont comptées. Le culot est ensuite repris dans un mélange chloroforme/méthanol/eau dans des proportions volumiques finales de 8/3/2 pour subir une extraction.

3.6 Protocole d’extraction

Certains échantillons (cellules et tissus) ont été soumis à un protocole d’extraction rapide permettant de séparer simultanément les métabolites hydrosolubles des lipides121. Brièvement, l’échantillon est mixé à froid (4°C) en présence d’un mélange chloroforme/méthanol/eau dans des proportions volumiques de 8/3/2. Après centrifugation à 10°C et séparation des phases,

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les solvants sont évaporés pendant 1 heure au Speed-Vac et lyophilisés; les résidus des différentes fractions sont stockés à -80°C. Avant l’analyse RMN, la fraction aqueuse et la fraction organique sont reprises dans un solvant deutéré, respectivement 550 µL de D2O ou

550 µL de tampon borate 12,5 mmol.L-1 pH 8,5 (5 ou 10 µL de TMPS-d6 10 mmol.L-1) et 600 µL de CDCl3 (5µL de TCB 100 mmol.L-1).

Remarques dans le cas des cellules:

Les cellules sont reprises dans 3 mL de CHCl3/CH3OH: 2/1 (v/v). Elles sont mélangées 2

minutes au vortex. Puis 1 mL d’eau milliQ est additionné. Après 5 minutes dans la glace, on ajoute à nouveau 6 mL de CHCl3/CH3OH: 2/1 (v/v) puis 1 mL d’eau milliQ et 2 mL de

CHCl3. L’échantillon est mélangé au vortex et laissé au repos 20 minutes avant centrifugation

à froid.

Remarque dans le cas du tissu ventriculaire cardiaque:

Les échantillons congelés sont broyés dans l’azote liquide au pilon dans un mortier en porcelaine avant d’être mixés et de subir l’extraction. Le volume total d’extraction est de 6,5 mL.

Remarque dans le cas du tissu rénal.

Le volume total d’extraction est de 4,1 mL.

4. RMN

Hormis les expériences 2D réalisées sur les extraits cellulaires, tous les spectres ont été réalisés avec un spectromètre Bruker ARX puis Avance 400 (Bruker Biospin, France) à un champ magnétique de 9,4 Tesla.

4.1 Ver endogéique Aporrectodea caliginosa.

Spectres RMN 31P:

Enregistrement des spectres à 161,98 MHz.

Utilisation d’une séquence simple d’impulsions (90°)-acquisition avec découplage du proton. Température d’acquisition: 14°C.

Fenêtre spectrale: 16,6 kHz. Taille du FID: 32K.

(24)

Temps d’attente entre les impulsions (d1+AQ): 1,2 s. Nombre d’accumulations: 1024.

Temps d’acquisition: 12 min.

Traitement du signal: augmentation de la résolution digitale à 64K et apodisation du signal avant transformée de Fourier (25 Hz).

Pour les expériences avec la sonde conventionnelle, les déplacements chimiques sont calibrés par rapport au signal du MPA (acide méthylphosphonique) qui sert de référence externe placée dans un capillaire coaxial et dont le déplacement chimique est de 30,3 ppm.

Pour les expériences HR-MAS, les spectres ont été réalisés avec une vitesse de rotation de 1 kHz et les déplacements chimiques sont calibrés par rapport au signal des PDE (phosphodiesters) comme référence interne à 0,82 ppm.

4.2 Larve de carabe Harpalus rufipes.

Spectres RMN HR-MAS 1H.

Utilisation d’une séquence simple d’impulsions (90°)-acquisition avec présaturation du signal de l’eau.

Température d’acquisition: 14°C. Fenêtre spectrale: 9,6 kHz. Taille du FID: 32K.

Les expériences ont été réalisées avec une vitesse de rotation de 4 kHz.

Les déplacements chimiques sont calibrés par rapport au signal des omégas-3 comme référence interne à 0,95 ppm.

(25)

4.3 Tissus biologiques bruts.

Spectres RMN 1H

• Comparaison sonde HR-MAS et sonde conventionnelle.

Utilisation d’une séquence simple d’impulsion (30°)-acquisition ou d’une séquence d’écho de spin CPMG avec un temps d’écho de 120 ms couplées à une séquence de présaturation du signal des protons de l’eau.

Température d’acquisition: 5°C. Fenêtre spectrale: 8 kHz.

Taille du FID: 32K.

Les expériences HR-MAS ont été réalisées avec une vitesse de rotation de 2,5 kHz.

• Comparaison de certains paramètres.

Utilisation d’une séquence simple d’impulsion (90°)-acquisition avec présaturation du signal des protons de l’eau.

Taille du FID: 32K.

(26)

Différentes séries d’expériences ont été effectuées (voir annotations sur les figures):

• vitesses de rotation: de 1 à 6 kHz • températures: de: 0, 5 ou 10°C.

• Temps d’attente entre les impulsions: 1 à 8 s.

• Calcul des T1.

Utilisation d’une séquence d’inversion-récupération. Température d’acquisition: 5°C.

Fenêtre spectrale: 6 kHz. Taille du FID: 32K.

Temps d’attente entre les impulsions (d1+AQ): 4,7 s. Délai entre les impulsion ʌ et ʌ/2: 0,1 à 10 s.

Nombre d’accumulations: 64. Nombre d’incréments: 64 Temps d’acquisition: 10 h.

Les expériences ont été réalisées avec une vitesse de rotation de 2,5 kHz.

• Calcul des T2.

Utilisation d’une séquence séquence d’écho de spin CPMG avec des temps d’écho variant de 0,4 à 400 ms couplée à une séquence de présaturation du signal des protons de l’eau.

Taille du FID: 32K.

(27)

Spectres RMN HR-MAS 31P.

• Comparaison tissu frais et tissu congelé.

Utilisation d’une séquence simple d’impulsions (30°)-acquisition avec découplage du proton. Température d’acquisition: 5°C.

Fenêtre spectrale: 12 kHz. Taille du FID: 16K.

Les déplacements chimiques en 31P sont calibrés par rapport au signal du Pi (phosphate inorganique) comme référence interne à 2,2 ppm.

Les expériences ont été réalisées avec une vitesse de rotation de 2,5 kHz.

4.4 Extraits biologiques.

Spectres RMN 1H.

Utilisation d’une séquence simple d’impulsions (90°)-acquisition couplée à une séquence de présaturation du signal des protons de l’eau.

Température d’acquisition: 298 K.

Fenêtre spectrale: 6 kHz pour les extraits aqueux et 4 kHz pour les extraits organiques. Taille du FID: 32K.

Temps d’attente entre les impulsions (d1+AQ): 4,7 s pour les extraits aqueux et 5 s pour les extraits organiques.

Nombre d’accumulations: 256.

Temps d’acquisition: 20 min pour les extraits aqueux et 22 min pour les extraits organiques. Traitement du signal: augmentation de la résolution digitale à 64K et apodisation du signal avant transformée de Fourier (0,3 Hz).

(28)

Les déplacements chimiques sont calibrés par rapport au signal du TMPS à 0 ppm pour les extraits aqueux et par rapport au CDCl3 à 7,26 ppm pour les extraits organiques.

Expériences 2D.

Les expériences 2D réalisées sur les extraits cellulaires ont été effectuées avec un spectromètre Avance 500 équipé d’une cryosonde TCI.

• Séquence cosypr.

Enregistrement des spectres à 500 MHz.

Utilisation d’une séquence de corrélation homonucléaire 1H/1H couplée à une séquence de présaturation du signal des protons de l’eau.

Température d’acquisition: 298 K. Fenêtre spectrale: 4 kHz *4 kHz. Taille du FID: 1024.

Nombre d’expériences: 512 Temps d’acquisition: 9 heures.

• Séquence HMBC.

Enregistrement des spectres à 500 MHz pour le proton et 125 MHz pour le carbone.

Utilisation d’une séquence de corrélation hétéronucléaire 1H/13C à travers plusieurs liaisons. Température d’acquisition: 298 K.

Fenêtre spectrale: 5 kHz *25 kHz. Taille du FID: 1024.

Nombre d’expériences: 512. Temps d’acquisition: 10 heures.

(29)

• Séquence HSQC.

Enregistrement des spectres à 500 MHz.

Utilisation d’une séquence de corrélation hétéronucléaire 1H/13C à travers une seule liaison. Température d’acquisition: 298 K.

Fenêtre spectrale: 5 kHz *25 kHz. Taille du FID: 1024.

Nombre d’expériences: 512. Temps d’acquisition: 8 heures.

Les déplacements chimiques sont calibrés par rapport au signal du TMPS-d6 à 0 ppm.

5. Analyse statistique.

Les données RMN sont introduites dans le logiciel de traitement AMIX (Bruker) et les spectres sont échantillonnés par pas (voir tableau). La numérisation des intensités des spectres fournit une table croisant les variables avec les individus. Les analyses statistiques sont réalisées avec le logiciel AMIX ou le logiciel R.

Echantillons Zone étudiée Pas (ppm) Nombre d’individus.

Cellules 4,5/0,5 0,01 20 (10RS et 10RR) Tissu rénal 4,5/0,5 0,01 12 (4*3) et 10 4,8/0,5 ppm en 1H 0,01 Courge 10/-20 ppm en 31P 0,1 9 (3*3) Cellules 4,5-0,5 0,01 30 échantillons (15 U87 RR et 15 U251 RS) Cellules 4,5-0,5 (exclusion 1,91/1,93 et 1,30/1,35) 0,01 32 (10 U87, 6 SF763, 10 U251 et 6 SF767) 4/1,3 ppm pour les extraits aqueux 0,04

Cœur 6/0,5 ppm pour les extraits organiques (exclusion 3,34/3,40 et

4,12/4,24 ppm

0,01

(30)

(31)

(32)

(33)

Introduction.

Dérivant des sondes utilisées en RMN du solide, les sondes RMN HR-MAS ont été développées, dans un premier temps, afin d’assurer le suivi des réactions de synthèse et de permettre l’étude structurale des semi-solides (gels). Leur utilisation a par la suite été étendue à l’analyse de tissus biologiques d’origine animale ou végétale. Cette technique de RMN consiste à faire tourner rapidement l’échantillon sur lui-même à un angle de 54,7° par rapport au champ magnétique principal Bo (appelé angle magique).

Dans la première partie, nous décrirons brièvement les bases théoriques de la RMN avec rotation de l’échantillon à l’angle magique. Ensuite, nous présenterons les applications de cette technique dans de nombreuses disciplines ainsi que ses développements méthodologiques. Puis, au vu de l’intérêt croissant ces 10 dernières années de la RMN HR-MAS pour l’exploration des tissus biologiques et de son utilisation en métabonomique, en particulier sur les tissus pathologiques humains, nous avons tenté d’évaluer cette technique sur un large éventail expérimental allant de l’étude in situ d’animaux introduits vivants (ver, larve) à l’analyse de biopsies d’organes.

(34)

1. Historique de la RMN HR-MAS.

La première constatation expérimentale de l’effet de l’inclinaison du tube en rotation fut réalisée en RMN du sodium-23 (23Na) par Andrew et al. 3 qui montrèrent, en mesurant la largeur du signal du chlorure de sodium pour des angles de rotation compris entre 50 et 100°, un affinement maximum du signal pour un angle de 54,7°. Cette étude confirma, expérimentalement, la valeur théorique de l’angle magique de 54,7°. L’affinement du signal dans le cas présent correspond à l’élimination des effets des couplages quadripolaire et dipolaire sur le signal.

Dans le même temps, des expériences réalisées par RMN du fluor-19 (19F) sur du fluorure de calcium ou du téflon, en faisant tourner les échantillons à des angles de 0°, 54,7° et 90° par rapport au champ Bo, ont mis en évidence la présence de bandes latérales de rotation sur les spectres. Ces bandes latérales, caractéristiques d’une anisotropie résiduelle (inhomogénéités de champ), ne disparaissent que si l’on augmente suffisamment la vitesse de rotation4.

Doskoþilová et al.5 reprennent simplement la théorie du solide afin de mettre en évidence les différences de susceptibilité pouvant exister au sein d’un échantillon. Ils montrèrent, sur un modèle hétérogène simple, un solvant placé dans le rotor avec des billes de verre, une élimination des effets des différences de susceptibilité magnétique. Garroway et al.6 confirment ce même effet sur un autre type de modèle hétérogène. Ils utilisèrent un rotor avec deux compartiments dans lesquels sont placés une solution de TMS dans du méthanol et la même solution en présence d’une solution paramagnétique.

Ces expériences réalisées il y a plus de 20 ans ont démontré l’effet «magique» de la rotation de l’échantillon à l’angle de 54,7° sur les couplages dipolaires, quadripolaires et sur les différences de susceptibilité magnétique.

(35)

2. Principe de la technique

7-10

.

2.1 Interactions et effets prédominants dans un milieu anisotrope.

2.1.1 L’anisotropie en RMN.

Dans un liquide, l’environnement autour d’une molécule est en moyenne isotrope c'est-à-dire que son environnement est le même dans toutes les directions de l’espace. Si on considère deux orientations possibles pour une molécule par rapport au champ magnétique Bo, le passage d’une position à l’autre peut se faire avec une fréquence plus ou moins grande. Dans un liquide, cette fréquence est de l’ordre de 1012 Hz et donc nettement supérieure à celle du phénomène de RMN. Dans ce cas, on admet qu’on a affaire à un milieu isotrope. Pour simplifier, on parle de milieu isotrope si toute grandeur dont relèvent les spectres RMN est moyennée dans toutes les directions de l’espace.

Pour pouvoir qualifier l’isotropie d’un milieu:

• les mouvements moléculaires doivent être très rapides par rapport aux variations des

interactions affectant les spins nucléaires;

• la molécule observée doit pouvoir adopter toutes les directions de l’espace.

Par opposition aux liquides, les solides (poudres ou cristaux) sont anisotropes puisque les mouvements moléculaires sont ralentis, voire inexistants.

2.1.2 Représentation d’un système de spins nucléaires dans un champ magnétique.

On peut décrire un système de spins nucléaires introduit dans un champ magnétique Bo par les perturbations qu’il subit dans ce champ. Il existe deux sortes d’interactions: celle liée à la présence du champ magnétique (effet Zeeman) et celles qui lui sont propres.

Faisons brièvement un inventaire des hamiltoniens que l’on doit considérer pour un système donné. Q CSA D J z H H H H H Hˆ ₌ ˆ ₊ ˆ ₊ ˆ ₊ ˆ ₊ ˆ

(36)

Avec:

• Hˆ : hamiltonien total. • Hˆ : hamiltonien Zeeman. _z

• Hˆ_J: hamiltonien du couplage scalaire. • Hˆ : hamiltonien dipolaire. _D

• Hˆ_CSA: hamiltonien d’anisotropie de déplacement chimique. • Hˆ : hamiltonien quadripolaire. _Q

En milieu isotrope, seuls les déplacements chimiques et les couplages indirects (couplages scalaires J) ne sont pas moyennés et vont être représentés sur le spectre.

En milieu anisotrope, en plus des déplacements chimiques et des couplages indirects, d’autres phénomènes et interactions peuvent apparaître:

• les interactions dipolaires (hamiltonien dipolaire)

• les différences de susceptibilité magnétique (hamiltonien Zeeman)

• l’anisotropie de déplacement chimique (hamiltonien d’anisotropie de déplacement

chimique)

• les interactions quadripolaires (hamiltonien quadripolaire).

Chacun de ces phénomènes étant à l’origine d’une augmentation spécifique de la largeur du signal, l’élimination de l’effet d’un phénomène conduit à une amélioration de la résolution.

2.1.3 Interactions dipolaires.

Les interactions dipolaires proviennent du couplage dans l’espace des moments magnétiques de deux noyaux (dipôles magnétiques).

L’énergie d’interaction dipolaire (ED) entre deux noyaux i et j peut être définie par la relation:

) 1 cos 3 ( 2 3 − ∝

µ

θ

ij D r E

(37)

Avec:

• ȝ: moment magnétique

• r : distance entre les deux noyaux i et j considérés _ij •

θ

: angle entre le vecteur ij et le champ Bo.

L’interaction dipolaire dépend donc:

• de l’angle entre le vecteur internucléaire et l’axe du champ magnétique appliqué • de la position relative des deux spins i et j c'est-à-dire de la distance internucléaire

Par conséquent:

• En phase liquide, comme θ varie constamment et rapidement puisque l’orientation des

molécules varie au cours du temps, l’ensemble des couplages dipolaires est moyenné à zéro.

• En phase solide, θ est fixe et les couplages dipolaires deviennent les interactions

principales. On obtient donc des spectres avec des signaux très larges.

Pour éliminer les couplages dipolaires, il faut que (3cos2

θ

−1)=0 soit θ =54,7°. Ainsi, si on place le système en rotation à un angle de 54,7°, on annule les effets des interactions dipolaires.

2.1.4 Susceptibilité magnétique.

La susceptibilité magnétique caractérise la faculté d'un matériau à s'aimanter sous l'action d'un champ magnétique. En présence d'un champ magnétique, les différents moments magnétiques électroniques ou nucléaires vont se distribuer sur différents niveaux d'énergie. Pour le 1H dont le spin a pour valeur ½, l'aimantation peut prendre deux positions dites parallèle ou anti-parallèle. L'état parallèle étant de plus basse énergie, il est le plus peuplé. Cette différence de population dans le milieu est à l’origine de l’aimantation nucléaire macroscopique, notée Mo.

Cette aimantation Mo est proportionnelle à l'intensité du champ magnétique externe Ho dans le cas d’un milieu isotrope. Le coefficient de proportionnalité, notéχ_m, définit la susceptibilité magnétique du milieu considéré.

(38)

o H o

M& =

χ

_m &

Lorsque le milieu est anisotrope, la susceptibilité magnétique n’est pas la même dans toutes les directions de l’espace et constitue un des éléments responsables de l’élargissement des raies. Dans ce cas, le champ d’induction magnétique Bo

& devient: o H o M o H o

B& =

µ

₀( & + & )=

µ

₀(1+

χ

_m) &

avec

µ

₀la perméabilité du vide.

o

B& varie donc en fonction du matériau étudié, c'est-à-dire en fonction des différentes

susceptibilités magnétiques. Si l’on considère un échantillon anisotrope comme un ensemble de régions ayant différentes susceptibilités magnétiques, alors pour chaque région, le champ magnétique efficace est représenté à la fois par le champ magnétique externe Ho et par une contribution provenant des susceptibilités magnétiques macroscopiques donnée par la relation: Ho H π α)χ_v 3 4 ( − = ∆ Avec: •

χ

_v: susceptibilité du volume v

•

α

: facteur qui dépend de la forme de l’échantillon

Les variations de susceptibilité magnétique peuvent être écrites suivant:

Avec:

• k: facteur géométrique

•

θ

: angle entre la direction de l’axe de rotation de l’échantillon et le champ

magnétique Bo.

Tout comme les interactions dipolaires, les variations de susceptibilité magnétique ∆s

peuvent annuler si (3cos2

θ

−1)=0 soit θ =54,7°. ) 2 1 cos 3 ( 3 ) 1 3 ( 4 − 2 − − = ∆ = ∆ πχ k θ Ho H s v

(39)

2.1.5 Anisotropie de déplacements chimiques.

Chaque noyau possède un environnement chimique (donc électronique) qui lui est propre. Il existe de faibles variations du champ magnétique ressenties par le noyau. Le champ ressenti n’est donc non plus le champ Bo mais un champ efficace Beff:

) 1 ( −σ = − =Bo Blocal Bo Beff Avec:

•

σ

: constante d’écran dont la valeur varie en fonction de l’environnement local (autres

noyaux, effets électroniques, solvants…).

Si une molécule possède différentes orientations figées dans l’espace, un même noyau de cette molécule ne va pas ressentir le même champ magnétique local. En effet, un même spin va pouvoir ressentir différentes constantes d’écran en fonction de son orientation par rapport à l’environnement. Ainsi, le signal obtenu sera non plus un signal fin, mais la somme d’un ensemble de signaux fins caractéristiques de chaque orientation.

Pour une molécule de symétrie sphérique, le déplacement chimique est indépendant de l’orientation moléculaire. Pour une molécule asymétrique, le déplacement chimique dépend donc de l’orientation. Le champ magnétique ressenti par le noyau varie en fonction de l’orientation de la molécule dans le champ magnétique. Le spectre RMN d’une distribution aléatoire d’orientations fixées, telles que dans un solide, va ressembler à la figure 1.1. Le signal le plus intense, dans les champs faibles, correspond à une orientation privilégiée de la molécule par rapport à Bo. Dans un liquide, le champ est moyenné à cause des mouvements rapides de la molécule et on obtient des signaux fins et symétriques.

Figure 1.1: Allure simplifiée d’un spectre RMN d’une molécule en milieu anisotrope en

(40)

Le déplacement chimique est fonction de deux valeurs. Une constante d’écran isotrope et une constante d’écran anisotrope. En phase liquide, la deuxième valeur est nulle. En phase solide, cette valeur est fonction de (3cos2_θ ₋1)_{. Elle peut donc s’annuler si}

° =54,7

θ .

2.1.6 Couplages quadripolaires.

Les couplages quadripolaires concernent les noyaux dont le spin est supérieur à ½. Leurs effets sont d’autant plus importants que l’atome possède davantage d’électrons; ils agissent sur la relaxation du noyau et élargissent fortement les raies. Ils concernent la distribution du nuage électronique de l'atome. Lorsque celle-ci est non sphérique (distribution asphérique de charges électroniques), il se crée un gradient de champ électrique dans la molécule. Ainsi, les noyaux interagissent à la fois avec Bo et ce gradient. Le couplage quadripolaire ne contribue pas au signal observable dans les conditions de notre étude. Malgré tout, ce type de couplage peut être éliminé grâce à la rotation de l’échantillon à l’angle magique.

2.1.7 Cas particulier des échantillons hétérogènes multiphasiques11,12.

Dans le cas de systèmes multiphasiques, les variations de susceptibilité au sein de l’échantillon se manifestent de deux manières:

• une composante dipolaire dans la région la plus hétérogène qui entraîne

l’élargissement des signaux et qui peut être annulée grâce à la rotation à l’angle magique,

• une partie isotrope propre à chaque phase et résultant en différents déplacements

chimiques et pour laquelle la rotation à l’angle magique ne peut rien.

Comme l’expliquent Chen et al.11, on peut schématiser ce phénomène en imaginant une sphère: le champ à l’extérieur de la sphère est un chevauchement d’un champ statique et d’un champ dipolaire et le champ à l’intérieur de la sphère est un champ homogène de valeur différente (associé à la susceptibilité magnétique de la sphère). La composante dipolaire élargit le signal et les composantes isotropes entraînent une différence de déplacement chimique. La rotation rapide à l’angle magique élimine la composante dipolaire, ce qui résulte en un champ homogène à l’extérieur de la sphère. Cependant, la rotation ne permet pas

(41)

d’éliminer les contributions isotropes à l’intérieur et à l’extérieur de la sphère. On observera donc deux signaux.

On sait que la composante dipolaire est fonction de (3cos 2θ−1) alors que les différences de susceptibilité magnétique entre les deux phases peuvent être reliées à une différence de déplacement chimique de la manière suivante:

χ ν θ ν = − ∆ ∆ 0 2 ) 2 sin 1 ( Avec:

• ∆

ν

: différence de déplacements chimiques

•

θ

: angle entre la direction de l’axe de rotation de l’échantillon et le champ

magnétique Bo

• ∆ : différence de susceptibilité magnétique entre les deux phases du système χ • ν₀: fréquence

La rotation à l’angle magique ne permet donc pas d’annuler ce terme puisque pour

° =54,7 θ , ∆ν = ν0∆χ 3 2 .

2.2 Types d’interaction dans le cas des échantillons biologiques.

La grande diversité des échantillons biologiques rend le type et l’importance relative des interactions ressenties par un système de spin très variables d’un échantillon à l’autre. Par conséquent, l’élimination des effets de ces interactions sur l’amélioration du signal de RMN est fonction des caractéristiques de l’échantillon. Le tableau 1.1 relève de façon très simplifiée les types d’interaction susceptibles d’être rencontrés dans cette diversité biologique qui va des liquides tels qu’urine, plasma, extrait à l’animal entier.

(42)

Tableau 1.1: Récapitulatif des types d’interaction anisotrope pouvant exister dans différentes

sortes d’échantillons biologiques par rapport à un solide ou un gel (+ ou -: présence ou absence de l’interaction dans le milieu considéré ; * : en présence d’un noyau de spin supérieur à ½).

Chimie Biologie

Solides Gels Animaux Tissus

biologiques Cellules Liquides (extraits, fluides) D Hˆ ++++ +++ ++ - - - CSA Hˆ ++++ +++ +++ ++ ++ - Q Hˆ * ++++ +++ ++ + + + MAS HR-MAS 2.3 L’équipement HR-MAS.

Une sonde HR-MAS possède les mêmes caractéristiques générales qu’une sonde dédiée à l’analyse exclusive des solides. La RMN HR-MAS ne nécessitant pas une largeur spectrale aussi importante que la RMN du solide, les sondes HR-MAS s’adaptent sur les spectromètres de RMN liquide dont la puissance d’émission RF est plus faible. De plus, alors que la largeur des signaux obtenus en RMN du solide rend la présence d’un canon de shims et d’un canal de lock superflue, ces modules sont nécessaires en RMN HR-MAS pour obtenir une résolution semblable à celle des liquides.

La sonde HR-MAS utilisée pour ce travail est équipée d’un canal qui permet l’acquisition de spectres 1H et 19F et d’un canal 31P. De plus, elle possède un canal deutérium (2H), utilisé comme signal de référence pour compenser la dérive du champ magnétique principal, et d’une bobine de gradient dont l’axe principal est parallèle à l’axe du stator. Un système pneumatique couplé à la sonde assure les fonctions de basculement du stator, d’entraînement et d’éjection du rotor. De plus, une unité de régulation de température permet d’ajuster la température entre -20 et 70°C.

La sonde peut se décomposer en deux parties. Une partie centralisant toute la connectique (Figure 1.2) et une partie correspondant à la tête de mesure qui comporte le stator avec ses antennes d’émission-réception (Figure 1.3).

(43)

Figure 1.2: Partie connectique de la sonde HR-MAS. (a) canal 1H/19F, (b) canal 31P, (c)

canal 2H, (d) gradient, (e) chauffage, (f) mesure de la température, (g) entrées pneumatiques pour le basculement du stator, la rotation et l’éjection du rotor, (h) réglage de l’impédance des antennes RF, (i) réglage micrométrique de l’angle de basculement du stator.

Figure 1.3: Tête de mesure de la sonde HR-MAS.

Les rotors (longueur: 18 mm; diamètre externe: 4 mm) sont essentiellement composés d’un tube en zirconia (oxyde de zirconium) et de pièces en Kel-f® (Polychlorotrifluoroéthylène, PCTFE) offrant différents volumes utiles. Les trois configurations possibles ont été utilisées, c'est-à-dire une sphère de 12 µL, un ovoïde de 50 µL ou un cylindre de 92 µL. Les rotors de 12 et 50 µL sont composés de quatre éléments. Après la mise en place de l’échantillon et du solvant deutéré dans le tube, un insert servant à limiter la partie supérieure du volume utile est descendu dans le tube. Le volume utile est ensuite isolé de la partie supérieure du tube en bouchant l’orifice de cet insert avec une vis de 1 mm. Enfin, le montage du rotor se termine en plaçant un capuchon faisant office de turbine sur le tube (Figure 1.4).

a f c d b e g h i

Stator avec rotor en place.

(44)

Figure 1.4: Équipement servant à la mise en place de l’échantillon dans le tube (a) guide de

mise en place de la turbine, (b) extracteur de turbine, (c) tube avec insert inférieur, (d) inserts supérieurs montés sur vis d’insertion, (e) bouchon à visser sur l’orifice de l’insert supérieur, (f) tournevis adapté, (g) turbine.

a b c d e g f

(45)

3. Les différentes applications de la RMN HR-MAS.

Les expériences RMN HR-MAS permettent d’étudier des échantillons dont les propriétés se situent entre celles des liquides et celles des solides. Ces échantillons peuvent être des lipides, des polymères sous forme de gels, des membranes, des résines, des petites molécules fixées sur des substrats à faible mobilité, des produits de l’agronomie (aliments), des cellules ou encore des tissus biologiques. Nous présenterons certaines des applications de la RMN HR-MAS rencontrées dans la littérature dans le domaine de la chimie et de la biologie.

3.1 Applications de la RMN HR-MAS en chimie.

La RMN HR-MAS permet en synthèse organique, par exemple, de résoudre l’analyse structurale de polymères de haut poids moléculaire ou de suivre des réactions d’élongation de molécules greffées sur support solide. Ce suivi peut devenir complexe en particulier dans le domaine de la chimie combinatoire. L’intérêt de la RMN HR-MAS dans ces disciplines est souligné par les exemples qui suivent.

La synthèse organique sur support solide est un domaine de la chimie qui connaît un fort développement. Elle permet en effet de faciliter les étapes et d’améliorer les rendements de synthèse. La chimie sur support solide consiste à faire croître des molécules préalablement greffées sur une matrice telle que des résines ou des billes. L’ensemble molécule-support peut être décomposé en trois zones formant un système anisotrope:

• La première zone est la matrice solide qui constitue le corps principal du support. Ce

support est en général une résine, c’est-à-dire un polymère plus ou moins réticulé (exemples des résines de Merrifield13 ou de Wang14).

• La seconde zone est un bras espaceur chimiquement inerte à l’extrémité duquel se

trouve le groupe fonctionnel qui sert à ancrer la molécule à synthétiser.

• Enfin, la troisième zone est la molécule à synthétiser.

Un des freins au développement de la synthèse organique en phase solide fût le manque de techniques permettant l’analyse directe de l’ensemble molécule-matrice. En effet, la caractérisation des molécules synthétisées en phase solide consiste le plus souvent à analyser la molécule séparée de son support. Dans ce cas, les méthodes d’analyse classiques

(46)

telles que la CCM, la RMN liquide haute résolution ou la spectrométrie de masse peuvent être utilisées. Ces méthodes, bien que très efficaces, nécessitent cependant la destruction du support et prennent beaucoup de temps. Mais, que ce soit en spectrométrie de masse ou en spectroscopie IR, peu de matériel est nécessaire pour l’analyse.

L’analyse directe de l’ensemble molécule-matrice a pu être réalisée tout d’abord par des méthodes qualitatives de contrôle basées sur des tests colorimétriques (ninhydrine)15 ou en utilisant la spectroscopie IR16 ou Raman17, puis par des méthodes quantitatives avec la spectrométrie de RMN ou la microspectroscopie IR à transformée de Fourier (FT-IR)18-19. En ce qui concerne la RMN, la large dispersion spectrale des signaux du carbone a permis d’utiliser la RMN liquide conventionnelle du 13C pour observer l’ensemble molécule-matrice20-21. Cependant, la faible sensibilité de cette méthode et l’importante largeur de raie des signaux, due à l’anisotropie du système molécule-support, en font une méthode peu utilisée. L’observation par RMN d’autres noyaux plus sensibles tels que le 19F ou le 31P a aussi été réalisée22-23. Des largeurs de raies importantes combinées à la faible dispersion spectrale des signaux du 1H n’ont pas permis d’utiliser la RMN conventionnelle pour l’étude de tels systèmes.

La première expérience de RMN HR-MAS 1H et 13C sur des résines gonflées a été réalisée par Stöver et Fréchet en 198924. Ces auteurs ont montré que l’on pouvait obtenir des spectres RMN haute résolution de l’éphédrine liée à une résine de polystyrène gonflée dans du chloroforme deutéré. Fitch et al. 25 réalisent aussi l’acquisition de spectres RMN HR-MAS de l’ensemble molécule-matrice gonflé dans du DMSO-d6 et comparent les spectres obtenus dans un tube de 5 mm avec une sonde classique aux spectres réalisés avec une rotation de 2 kHz à l’angle magique. En 1996, Keifer et al.26 font une comparaison des spectres d’une molécule greffée sur une résine de Wang obtenus avec différentes sondes: (i) haute-résolution liquides (ii) solides (CP-MAS) et (iii) HR-MAS. Que ce soit en 1H ou 13C, la meilleure résolution est obtenue avec les sondes HR-MAS.

Un des avantages de la RMN HR-MAS est la possibilité de déterminer précisément le pourcentage d’impuretés formées au cours d’une réaction chimique sur différents supports solides27. Toutefois, malgré sa grande efficacité pour étudier des milieux hétérogènes, la qualité des spectres obtenus est hautement liée au support et au solvant utilisé28. Généralement, le solvant sera celui utilisé pour la synthèse ou son équivalent deutéré.

La synthèse en phase solide est un outil intéressant pour la synthèse de molécules complexes mais aussi pour l’obtention de banques de molécules de façon combinatoire29-30. Elle consiste au greffage de petites molécules organiques sur un support (généralement des

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billes de résines) et à faire grandir la molécule à partir de ce support par ajout de plusieurs réactifs dans une même étape afin de multiplier le nombre de produits finaux et ainsi générer des banques de molécules. L’analyse de telles réactions pose les mêmes problèmes que ceux décrits précédemment et la RMN HR-MAS semble être une technique adaptée au suivi réactionnel de synthèse combinatoire. La chimie combinatoire est très développée notamment pour la synthèse d’oligonucléotides, de peptides ou de polysaccharides par exemple31.

3.2 Applications de la RMN HR-MAS en biologie.

De 1972 à aujourd’hui, la RMN HR-MAS a été utilisée pour l’analyse d’échantillons très variés allant des systèmes biologiques complexes aux produits de l’agronomie. Certains de ces travaux ont contribué aux évolutions et améliorations ou à la mise en évidence de certains biais de la méthode d’analyse par RMN HR-MAS.

3.2.1 Etude des composés membranaires en suspension aqueuse.

En 1972, Chapman et al. 32 montrent que la rotation de l’échantillon à l’angle magique permet d’améliorer sensiblement la résolution de spectres 1H de lécithines en suspension aqueuse, en particulier avec l’affinement du signal provenant des groupements triméthylamine. Haberkorn et al. 33 obtiennent les premiers spectres haute résolution par RMN

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C et 31P sur des lipides membranaires dans les mêmes conditions. La résolution obtenue est suffisante pour permettre une attribution complète des carbones des lipides. En 1997, Zhou et al. 34 propose un protocole de préparation des échantillons pour l’étude de la dispersion des lipides grâce à l’utilisation d’ampoules de verre sphériques à placer dans le rotor.

Ces premiers travaux ont ouvert la porte à des nombreuses études sur les systèmes membranaires que ce soit sur les lipides35-39, les lipopolysaccharides ou les peptides constitutifs ou associés aux membranes biologiques40-45. Dans tous les cas, les produits sont étudiés en milieu aqueux afin de mimer l’environnement cellulaire. De plus, de nombreuses séquences bidimensionnelles révélant les corrélations internucléaires et intermoléculaires ont été appliquées pour les attributions des signaux et l’étude structurale.

Ces différents travaux ont permis de mettre en avant l’intérêt de la RMN HR-MAS pour l’étude de ces biomolécules dans leur environnement d’origine et ont initié les travaux HR-MAS réalisés sur les cellules et les tissus.