LOCALISATION ET CIBLAGE DE LA PROTEASE DE L' ADENOVIRUS DE TYPE 2
par
PASCALE LABRECQUE
Département de microbiologie
Mémoire présenté à la Faculté de
Médecine en vue de l'obtention du grade de Maître ès Sciences (M.Sc)
l+I
Acquisitions and Direction des acquisitions et Bibliographie Services Branch des services bibliographiques
395 Wellington Street 395, rue Wellington Ottawa, Ontario Ottawa (Ontario)
K1A ON4 K1A ON4
The author has granted an
irrevocable non-exclusive licence
allowing the National Library of
Canada to reproduce, loan,
distribute or sell copies of
his/her thesis by any means and
in any form or format, making
this thesis available to interested
persons.
The author retains ownership of
the copyright in his/her thesis.
Neither the thesis nor substantial
extracts from it may be printed or
otherwise reproduced without
his/her permission.
Your hie Votre référence
Our me Notre rè/éfenœ
L'auteur a accordé une licence
irrévocable et non exclusive
permettant
à
la Bibliothèque
nationale
du
Canada
de
reproduire, prêter, distribuer ou
vendre des copies de sa thèse
de quelque manière et sous
quelque forme que ce soit pour
mettre des exemplaires de cette
thèse
à
la disposition des
personnes intéressées.
L'auteur conserve la propriété du
droit d'auteur qui protège sa
thèse. Ni la thèse ni des extraits
substantiels de celle-ci ne
doivent être imprimés ou
autrement reproduits sans son
autorisation.
ISBN 0-315-93028-4
thèse et inscrivez le code numérique approprié dans l'espace réservé ci-dessous.
:Bio \og\e
SUJET
Catégories par sujets
HUMANITÉS ET SCIENCES SOCIALES
COMMUNICATIONS ET LES ARTS
Architecture ... 0729 Beaux-arts ... 0357 Bibliothéconomie ... 0399 Cinéma ... 0900 Communication verbale ... 0459 Communications ... 0708 Danse ... 0378 Histoire de l'art ... 0377 Journalisme ... 0391 Musique ... 0413 Sciences de l'information ... 0723 Théâtre ... 0465 ÉDUCATION Généralités ... 515 Administration ... 0514 Art ... 0273 Collèges communautaires ... 0275 Çommerce ... 0688 Çconomie domestique ... 0278 Çducation permanente ... 051 6 Çducation préscolaire ... 0518 Education sanitaire ... 0680 Enseignement agricole ... 0517 Enseignement bilingue et murticulturel ... 0282 Enseignement industriel ... 0521 Enseignement primaire ... 0524 Enseignement professionnel ... 07 47 Enseignement religieux ... 0527 Enseignement secondaire ... 0533 Enseignement spécial ... 0529 Çnseignement supérieur ... 07 45 Evaluation ... 0288 Finances ... 0277
Formation des enseignants ... 0530
Histoire de l'éducation ... 0520 Langues et littérature ... 0279 Lecture ... 0535 Mathématiques ... 0280 Musique ... 0522 Orientation et consultation ... 0519 Philosophie de l'éducation ... 0998 Physique ... 0523 Programmes d'études et ensei_gnement ... 0727 Psychologie ... 0525 Sciences ... 0714 Sciences sociales ... 0534 Sociologie de l'éducation ... 0340 Technoli>gie ... 0710 LANGUE, LITTÉRATURE ET LINGUISTIQUE Lant;'é~éralités ... 0679 Anciennes ... 0289 Linguistique ... 0290 Moaemes ... 0291 Littérature Généralités ... 040 l Anciennes ... 0294 ComP.Orée ... 0295 Med1évale ... 0297 Moderne ... 0298 Africaine ... 0316 Américaine ... 0591 Anglaise ... 0593 Asiatique ... 0305 Canadienne !Anglaise) ... 0352 Canadienne Française) ... 0355 Germanique ... 0311 Latino-américaine ... 0312 Moyen-orientale ... 0315 Romane ... 0313 Slave et est-européenne ... 0314 SCIENCES ET INGÉNIERIE SCIENCES BIOLOGIQUES Agriculture Généralités ... 0473 ~w~:~:~~~ -~ïi~h~~1.;g;~··· 0205 alimentaire ... 0359 Çulture ... 0479 Eleva~e et alimentation ... 0475
Exf?lo1tation des Réturages ... 0777
Pathologie animale ... 0476 Patholc;>gie v~' étale ... 0480 Ph siologie v étale ... 0817 s7iculture et aune ... 0478 Technologie du bois ... 07 46 Biologie Généralités ... 0306 Anatomie ... 0287 Biologie (Statistiçiues) ... 0308 Biol~ie moléculaire ... 0307 Botanique ... 0309 Çellule ... 0379 Ecologie ... 0329 Entomologie ... 0353 Génétique ... 0369 Limnologie ... 0793 Microbiologie ... 0410 Neurologie . . ... 0317 Océanographie ... 0416 Physiologie ... 0433 Radiation ... 0821 Science vétérinaire ... 0778 Zoologie ... 0472 Biophysique Généralités ... 0786 Medicale ... 0760
SCIENCES DE LA TERRE Biogéochimie ... 0425 GéOchimie ... 0996 Géodésie ... 0370 Géographie physique.. . . ... 0368 Géologie . .. . . .. ... . . ... .. ... . . .... 0372 Géopliysique . .. . . .. .. . . ... 0373 Hydrol99ie ... 0388 Minéralogie ... 0411 Océanographie physique ... 0415 Paléobotanique ... 0345 Paléoécologie ... 0426 Paléontol99ie ... 0418 Paléozoologie ... 0985 Palynologie . .. . . . ... 0427 SCIENCES DE LA SANTÉ ET DE L'ENVIRONNEMENT Économie domestique ... 0386 Sciences de l'environnement ... 0768 Sciencés de la santé Généralités ... 0566
Administration des hipitaux .. 0769
Alimentation et nutrition ... 0570 Audiologie ... 0300 Chimiotliérapie ... 0992 Dentisterie... . ... 0567 Développement humain . . . 07 58 Enseignement . .. ... .. .. . . . .. . . . 0350 Immunologie ... ... . .. 0982 Loisirs ... 0575 Médecine du travail et thérapie ... 0354 Médecine et chirur~ie ... 0564 Obstétrique et gynecologie ... 0380 Ophtalmologie . . ... 0381 Orthophonie .. .. .. . ... . . .. .. . . 0460 Pathofogie . . ... 0571 Pharmacie ... 0572 Pharmacolog_ie ... 0419 Ph~iothérap1e . . .. .. . .. .. . . . 0382 Radiologie ... 057 4 Santé mentale ... 0347 Santé publigue ... 0573 Soins infirmiers ... 0569 Toxicologie ... 0383 PHILOSOPHIE, RELIGION ET THEOLOGIE Philosophie... ... ... 0422 Religion Généralités ... 0318 Çlergé ... 0319 Etudes bibliques ... 0321
Histoire des religions ... 0320
Philosophie de la religion ... 0322 Théologie ... 0469 SCIENCES SOCIALES AnthroP,Ologie Archéoli>gie . ... .. .. . ... 0324 Culturelle ... 0326 Physique ... 0327 l;lroit ... 0398 Economie Généralités ... 050 l Çommerce-Affaires ... 0505 Çconomie agricole ... 0503 Economie du travail ... 0510 Finances ... 0508 Histoire ... 0509 , Théorie ... 0511 Çtudes américaines .. . ... 0323 Çtudes canadiennes ... 0385 Etudes féministes ... 0453 Folklore ... 0358 GéograP,hie. .. . . ... .. .. .. . .. . . ... 0366 Gérontol99ie ... 0351
Gestion des affaires Généralités ... 0310 Administration ... 0454 Banques ... 0770 Comptabilité . . ... . 0272 Marl<eting ... 0338 Histoire Histoire générale . . ... 0578 SCIENCES PHYSIQUES Sciences Pures Chimie Genéralités ... 0485 Biochimie ... 487 Chimie agricole ... 07 49 Chimie anariigue ... 0486 Chimie minerale ... 0488 Chimie nucléaire ... 0738 Chimie organique ... 0490 Chimie pharmaceutique .... 0491 Physique ... 0494 Polr.mÇres ... 0495 Raéliation ... 0754 Mathématiques ... 0405 Physi~ue Généralités ... . . ... 0605 Acoustique ... 0986 Astronomie et astrophysique ... 0606 Electronique et électricité ... 0607 Fluides et plasma . . ... 07 59 Météorologie ... 0608 Optique ... 0752 Particules (Physique nucléaire) ... . . ... 0798 Physique atomique .. .. . . .. 07 48 Physique de !'état solide ... 0611
Physique moléculaire . . . ... 0609 Physique nucléaire ... 0610 Radiation ... 0756 Statistiques . . ... 0463 Sciences Appliqués Et Technologie Informatique ... 0984 Ingénierie Généralités ... 0537 Agricole ... 0539 Automobile ... 0540
Ici ?>Io lq:I
U·M-1
CODE DE SUJET Ancienne . ... . . . ... 0579Médiévale... . .. .. . . . .. .. . . . 0581
Moderne ... 0582
Histoire des noirs... .. . ... 0328
Africaine ... .. . . ... 0331 Çanadienne ... 0334 Etats-Unis ... ... .. .. . . ... 0337 Européenne ... 0335 Moyen-orientale . .. . .. . .. . . .. 0333 Latino-américaine. . ... . 0336
Asie, Australie et Océanie .. 0332
Histoire des sciences ... 0585
Loisirs ... 0814 Planification urbaine et régionale . . . . .. . . .. .. . ... 0999 Science palitique Géneralités . . .. ... ... 0615 Administration publique. . ... 0617 Droit et relations internationales . .. . . .. . 0616 Sociologie Généralités . . . . ... .. .. . . . . .. 0626
Aide el bien-àtre social . .. . 0630
Criminologie et établissements pénitentiaires ... . . 0627 r;>emograRhie ... .. . . ... 0938 Etudes de I' individu et , de la famille ... 0628
Etudes des relations interethniques et des relations raciales ... 0631
Structure et développement social . . . . . . ... 0700 Théorie et méthodes. . ... 0344 Travail et relations industrielles . ... . 0629 T ransp,orts . . . .. . . ... 0709 Travail social ... 0452 Biomédicale . . ... 0541 Chaleur et ther mc9Ynamique ... . 0348 Conditionnement (Emballage) ... .. . ... . 0549 Génie aérospatial ... 0538 Génie chimique ... 0542 Génie civil ... . . ... 0543 Génie électronique et électrique ... 0544 Génie inélustriel . ... . . .. 0546 Génie mécanique ... . ... 0548 Génie nucléaire . . . ... 0552
ln~énierie des systêimes. . . . 0790
Mecanique navale . . ... 0547
Métallurgie ... . . . ... . . 07 43 Science des matériaux ... 0794
Technique du pétrole ... 0765 Technique minière ... . .. 0551 Techniques sanitaires et municipales... . . ... 0554 Technologie hydraulique ... 0545 Mécanique appliquée ... 0346 Géotechnologie ... 0428 Matières P.lastiques (Technologie) ... . . . .. 0795 Recherche opérationnelle .. . . . . 0796
Textiles et tissus (Technologie) .... 0794
PSYCHOLOGIE Généralités .. .. .. . .. . . . . .. ... . .. 0621 Personnalité... . . ... . . 0625 Psychobiologie... ... . 0349 Psychologie clinique . ... . .. 0622 Psychologie du comP,ortement .. 0384 Psychologie du dévelopJl!!ment 0620 Psychologie exP,érimentale ... 0623 Psychologie industrielle ... 0624 Psychologie phxsiolog1que .... . . 0989 Psycholo~ie sociale ... 0451 Psychometrie ... .. .. . . . .. . . ... 0632
@
SUBJECT TERM
Subject Categories
THE HUMANITIES AND SOCIAL SCIENCES COMMUNICATIONS AND THE ARTS
Architecture ... 0729 èr:,~~s~o?.: :: :: ::::: :: :: :: :: ::::: :: ::: :::: 8~b6 Dance ... 037B Fine Arts ... 0357 Information Science ... 0723 Journalism ... 0391 Libral)I Science ... 0399 Mass Communications ... 070B Music ... 0413 Speech Communication ... 0459 Theater . . . ... 0465 EDUCATION General ... 0515 Administration ... 0514
Adult and Continuing ... 0516
Agriculture! ... 0517
Ait ... 0273
Bi lingual and Multicultural ... 02B2 Business ... 06BB Community College ... 0275
Curriculum and Instruction ... 0727
Early Childhood ... 051 B Elementary ... 0524
Finance ... 0277
Guidance and Counseling ... 0519
Health ... 06BO Higher ... 07 45 History of .... .. .. . . .. ... .. .. .. . . ... 0520
Home Economies ... 027B Industriel ... 0521
Language and Literature . .. ... 0279
Mathematics ... 02BO Music ... 0522 PhilosoP,hy of ... 099B Physical ... 0523 Psychology ... 0525 Reading ... 0535 Religious ... 0527 Sciences ... 0714 Secondary ... 0533 Social Sciences ... 0534 Sociolqgy of ... 0340 Special ... 0529 Teacher Training ... 0530 Technology ... 0710
Tests and Measurements ... 02BB Vocational ... 07 47 LANGUAGE, LITERATURE AND LINGUISTICS Lan~~e~al ... 0679 Ancien! ... 02B9 Linguistics ... 0290 Mèélern ... 0291 Literature General ... 0401 Classical ... 0294 Comparative ... 0295 Med1eval ... 0297 Modern ... 029B African ... 0316 American ... 0591 Asian ... 0305 Canadien !English) ... 0352 Canadien French) ... 0355 English ... 0593 Germanie ... 0311 Latin American ... 0312 Middle Eastern ... 0315 Romance ... 0313
Slavic and East European ... 0314
THE SCIENCES AND ENGINEERING
BIOLOGICAL SCIENCES Agriculture General ... 0473Agronomy . . ... 02B5 Animal Culture and Nutrition ... 0475
Animal Pathologx ... 0476
Food Science anél T echnology ... 0359
Forestry ana Wildlife ... 047B Plant Culture ... 0479
Plant Patholc;>gy ... 04BO Plant Physiology ... OB 17 Range Management ... 0777 WoOd Technology ... 0746 Bioldl!neral ... 0306 Anatomy . . . . . . . . ... 02B7 Biostatistics . . . ... 030B Botany .. . . . .. .. . . . . . . . ... 0309 Cel!... . ... 0379 Ecologx ... ... .. . . . ... 0329 Entomology ... 0353 Genetics . .. . .. .. . . .. .. . . . . 0369 Limnology ... 0793 Microbiology ... 0410 Molecular ... 0307 Neuroscience ... 0317 Oceanography ... 0416 Physiology . .. . . .. . .. . . ... 0433 Radiation ... OB21 Veterinary Science ... 077B Zoology ... 0472 Biophysics General ... 07B6 Medical ... 0760 EARTH SCIENCES Biogeochemistry ... 0425 Geochemistry ... 0996
~~~~
.:·:::::::::::::::::::::::::.: .. :::
g~~~
Geopliysics .. .. . . .. .. .. .. .. . . ... 0373 Hydrology . . . . .. . . . ... 03BB Mineralogy ... 0411 Paleobotany ... 0345 Paleoecology .. . . ... 0426 Paleontolc;>gy ... 041 B Paleozoology... .. .. . .. .. .. . . . . ... 09B5 Palynol99)' . . ... 0427 Physical Geography . . . . . . . .. 036B Physical Oceanography ... 0415HEALTH AND ENVIRONMENTAL SCIENCES Environmental Sciences ... 076B Health Sciences General ... 0566 Audiology ... 0300 Chemotherapy ... 0992 Dentistry ... 0567 Education . . ... 0350 Hospital Management ... 07 69 Hu man Development ... 07 5B lmmunology ... 09B2 Medicine and Surgery ... 0564
Mental Health ... 0347
Nursing ... 0569
Nutrition ... 0570
Obstetrics and Gynecology .. 03BO Occupational Health and · Therapy ... 0354 Ophthalmology ... 03B 1 Pathology ... 0571 Pharmacology ... 0419 Pharmacy ... 0572 Physical Therapy ... 03B2 Public Health .. .. .. . . . . .... 0573 Radiology ... 057 4 Recreation ... 0575
PHILOSOPHY, RELIGION AND THEOLOGY Philosophy ... 0422 Religion General . .. ... . .. .. . . ... 031 B Biblical Studies ... 0321 Clergy ... 0319 History of ... 0320 Philosophy of ... 0322 Theology ... 0469 SOCIAL SCIENCES American Studies ... 0323
Ant'A~~~ogy
... 0324 Cultural ... 0326 Physical ... 0327 Business Administration General ... 0310 Accounting ... 0272 Banking ... 0770 Management ... 0454 Marketing .. .. . .. . . . ... 033B Canadien Studies ... 03B5 Economies General ... 0501 Agricultural .. . .. .. . . . . . .... 0503 Commerce-Business ... 0505 Finance ... 050B History. ... .... . . . ... . . . . 0509 Labor ... 0510 Theory ... 0511 Folklore . . . . . . . . .. . ... 035B GeograP,hy ... 0366 Gerontology ... 0351 History General ... 057B Speech Pathology .. . . ... 0460 Toxicology ... 03B3 Home Economies . . . . .. . . ... 03B6 PHYSICAL SCIENCES Pure Sciences Chemistry Gene rai . . .. .. . .. . . . . . ... 04B5 Agriculture\. ... .... . . . . . 07 49 Analytical ... 04B6 Biocliemistry . . . . . ... 04B7 lnorganic ... 04BB Nuclear . . . . .. . . ... 073B Organic ... 0490 Pharmaceullcal ... 0491 Physical ... 0494 PofY.mer ... 04 9 5 Raaiation ... 0754 Mathematics . . . . .. . .. . ... 0405 Physics General . .. .. .. . .. . . ... 0605 Acoustics . . .. . . . ... 09B6 Astronomy and Astrophysics ... 0606 Atmospheric Science ... 0608 Atomic ... 07 48 Electronics and Electric1ty .... 0607Elementary Particles and High Energy ... 0798
Fluicf and Plasma ... 0759
Molecular ... 0609 Nuclear ... 0610 Optics ... 0752 Radiation ... 0756 Sol id State ... 0611 Statistics ... .... . . ... 0463 ApP,lied Sciences ~plied Mechanics ... 0346 Computer Science ... 0984
1.----.1.----.1.----.1----.1
U ·MI
SUBJECT CODE Ancient ... 0579 Medieval ... 0581 Modem ... 0582 Black ... 0328 African ... 0331Asie, Australie and Oceania 0332 Canadien . .. .. . . ... 0334 European ... 0335 Latin American ... 0336 Middle Eastern ... 0333 United States ... 0337 History of Science ... 0585 Law ... ··· ... 0398 Political Science General ... 0615
International Law and Relations .. . . .. .. . .. . .. . . 0616 Public Administration ... 0617 Recreation . . ... OB 14 Social Work ... 0452 Sociology Gene rai .. .. .. .. . . . .. .. . .. .. . . 0626
Criminology and Penology ... 0627
DemograP,hy ... 0938
Ethnie anél Racial Studies . . 0631 Individuel and Family Studies ... 0628
Industriel and Labor Relations ... 0629
Public and Social Welfare .... 0630
Social Structure and Development ... 0700
Theory and Methods ... 0344
Transportation . .. . . . . . . . .... 0709
Urban and Regional Planning .... 0999
Women's Studies ... 0453 Engineering General . . . .. . . . . . . . 0537 AerosP,Cce ... 0538 Agricultural .. . ... 0539 Automotive .. . . . . . . .. . . 0540 Biomedical . . . . . . . .. . . 0541 Chemical ... 0542 Civil ... 0543
Electronics and Electncal .. 0544
Heat and Thermodynamics ... 0348
Hydraulic .... . ... .. ... . 0545 Industriel ... 0546 Marine .... . ... 0547 Materials Science ... 0794 Mechanical ... 0548 Metallurgy ... 0743 Mining ... 0551 Nuclear . . . . . . . . . .. 0552 Packaging . . . ... . . . . . . 0549 Petroleum ... 0765
Sanital)I and Municipal .. . 0554
System Science . . . . ... 0790 Geotechnology ... 0428 Operations Research ... 0796 Plastics T echnology ... 0795 Textile T echnology ... 0994 PSYCHOLOGY General ... 0621 Behavioral . . . .. . ... ... .. 0384 Clinical ... 0622 Developmental ... 0620 Experimental ... 0623 Industriel . . . .. .. . .. . .. . . . . .. . . .. 0624 Personality ... 0625 Physiolpa1cal ... 0989 Psychob1ology ... 0349 Psychometrics ... 0632 Social ... 0451
LISTE DES FIGURES . . . iv
LISTE DES TABLEAUX ... vi
ABREVIATIONS . . . vii RESUME ... X INTRODUCTION . . . 1 DESCRIPTION DE PROJET . . . 17 MATERIELS ET METHODES . . . 19 A. ACTIVITE DE LA PROTEASE 1. SOURCES DE PROTEASE ... 19 1.1 Lysats bactériens . . . 19 1.2 Protease purifiée . . . 19 2. SUBSTRATS ... 20 2.1 Substrat tsl . . . 20
2.2 Recherche informatisée de substrats . . . 20
2.3 Ovalbumine . . . 20
2.4 Protéine p VII canin . . . 21
2.5 Marquage à l'iode125 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 21 3. ESSAIS PROTEOLYTIQUES . . . 21
4. GEL DE POLYACRYLAMIDE SDS-PAGE ... 22
B. ETUDE DU PHENOTYPE DE TSl 6. CEILULES ET INFECTION VIRALE ... 22
9. ESSAIS DES PROTEASES NUCLEAIRES IN VITRO . . . 23
10. TRANSFERT SUR l\.ffiMBRANE DE NITROCELLULOSE (WESTERN BLOT) .... 24
11.IMlVIUNODETECTION ... 24
C. LOCALISATION DE LA PROTEASE 12. ETAT DE SOLUBILITE DE LA PROTEASE . . . . . . . . . 24
13. EXTRACTION DES MATRICES NUCLEAIRES . . . . . . . . . . 25
D. ENCAPSIDATION DE LA PROTEASE 14. LIAISON DE LA PROTEASE A L'ADN . . . . . . 25
14.1 RECHERCHE INFORMATISEE DE MOTIF DE LIAISON A L' ADN DANS LA PROTEASE DE L' ADENOVIRUS . . . . . . . . . 25
14.2 ADN ... 25
i. p194 . . . . . . . . 25
ii. AP2... 26
iii. néo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
iv. ADN génomique d'ad2 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 26 v. Enzymes de restriction . . . . . . . . . . . . . 27
vi. Purification de bandes d' ADN à partir de gel d'agarose . . . . . . . . . . . . . . . 27
14.3 SOURCE DE PROTEASE . . . . . . 27
14.4 FILTRE DE RETENTION (FILTER BINDING) . . . 27
14.5 GEL DE RETARDATION (GEL RETARDAT/ON) . . . 28
B. ETUDE DU PHENOTYPE DE TSl . . . 34 C. ENCAPSIDATION DE LA PROTEASE . . . 48 DISCUSSION . . . 56 CONCLUSION . . . 71 REMERCIEMENTS ... 73 BIBLIOGRAPHIE . . . 74
Figure 1 : Modèle d'une particule d'adénovirus . . . 4
Figure 2 : Alignement des séquences des protéases de différents sérotypes . . . 10
Figure 3 : Profil de clivage de l'ovalbumine par la protéase recombinante . . . 32
Figure 4 : Profil de clivage de l'ovalbumine par la protéase recombinante purifiée . . . 33
Figure 5 : Extraits de noyaux de cellules infectées par a~ts1 et a~ts1 • • • • • • • • • • • • • • 36 Figure 6 : Essais in
vitro
impliquant des extraits cytoplasmiques et nucléaires en présence du substrat tsl-[35S] (essais en Trans) ... ~ . . . 38Figure 7 : Effet du cofacteur pVI-C sur les extraits de noyaux de cellules infectées par ad2ts1 • . . . 39
Figure 8 : Effet de l' ADN sur l'activité protéolytique des cellules infectées par a~wt . . . 41
Figure 9: Effet del' ADN sur l'activité protéolytique des extraits nucléaires de cellules infectées par ad2ts1 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 42 Figure 10: Effet de la DNase I sur l'activité de la protéase purifiée en présence de pVII canin . . . 43
Figure 11: Etat de solubilité de la protéase . . . 45
Figure 12: Extraits des matrices nucléaires des cellules infectées (ad2ts1 et ad2wt) et non-infectées . . . 4 7 Figure 13: Essai de liaison à l' ADN par la technique de gel de retardation . . . 50
Figure 14: Etude de l'interaction p194-protéase . . . 51
Figure 15: Etude de l'interaction néo-protéase . . . 53
Tableau 1 : Adénovirus humains . . . 2
Tableau II : Classification des protéases . . . 6
Tableau fil: Protéases virales . . . 8
Tableau IV : Protéines adénovirales clivées par la protéase . . . 12
Ad ADN AP2 ARN ARN-m BSA Da DBB DMEM DTI EDTA g
ms
iTP Adénovirus Adénovirus de type 2Mutant ts1 de l' adénovirus de type 2 humain Acide déoxyribonucléique
Fragment d' ADN correspondant au site de liaison de la protéine AP2 Acide ribonucléique
ARN messager
Albumine sérique de boeuf Dalton
Tampon de liaison à l' ADN (DNA binding buffer) Milieu Eagle modifié par Dulbecco
Dithiothreitol
Ethy lènediamine tétraacétate Unitée de force centrifuge Histone
Mutant ts1 de l' adénovirus qe type 2 humain
Intermédiaire entre le précurseur de la protéine terminale et la protéine terminale mature
kd Kilodalton
Leu Leucine
m Ci Millicurie
Mock Extrait de cellules non-infectées
MOI Multiplicité d'infection (multiplicity of infection)
néo Fragment d'ADN correspondant aux nucléotides 966 à 1223 du gène Néo
ng nanogramme
NP-40 Nonidet P-40 nts nucléotides
p194 Fragment d' ADN correspondant aux nucléotides 194 à 358 du génome d'a~
PAGE-SDS Gel de polyacrylamide-sulfate dodécyl de sodium p.b. Paire de bases
PFU Unité de formation de plage (Plaque forming unit) pl Point isoélectrique
pLAM Vecteur ne comportant pas le gène de la protéase pLPV Vecteur comportant le gène de la protéase
PMSF Phénylméthylsulfonylfluorure
Pro Praline
pTP Précurseur de la protéine terminale liée à
1'
ADNPN
PoidsNolumep VII Précurseur de la protéine virale VII SDS Sulfate dodécyl de sodium
TAE Tampon Tris-acétate et EDTA TBE Tampon Tris-HCI et acide borique TE Tampon Tris-HCl lOmM, EDTA 1 mM
TP
ts
uM v/v
wt
Protéine terminale (Terminal protein) Thermosensible
Mutant ts1 de !'adénovirus de type 2 humain Microcurie
Micromolaire \Tolume/volume Type sauvage
par
PASCALE LABRECQUE
Mémoire présenté au département de Microbiologie en vue de l'obtention du grade Maîtrise ès Science (M.Sc.)
Faculté de Médecine. Université de Sherbrooke.
RESUME
Les adénovirus comme plusieurs autres virus complexes, encodent une protéase qui est nécessaire à leur maturation et à leur infectivité. Les premières évidences d'une telle activité protéolytique remontent à 1976, lorsque le mutant thermosensible aclits1 a été isolé. Lorsqu'il est placé à une température non-permissive, le mutant ts1 est déficient dans la maturation des protéines précurseures rendant le virus non-infectieux. Pour cette raison, la protéase adénovirale est une cible de choix pour le développement d'agents antiviraux spécifiques contre la classe entière des adénovirus, la séquence de la protéase étant hautement conservée à travers les différents sérotypes.
Le développement de tels traitements nécessite une bonne compréhension de l'activité de l'enzyme. Nous avons mis au point un système d'essai enzymatique simple constitué de la protéase purifiée et de l'ovalbumine, laquelle contient un site de clivage spécifique à la protéase adénovirale. A l'aide de ce système nous avons tenté de vérifier le rôle du cofacteur pVI-C (Mangel et al., 1993; Webster et al., 1993) et de l' ADN (Mangel et al., 1993) au niveau de l'activité protéolytique. Nous avons conclu que la protéase purifiée dans notre laboratoire dans les conditions que nous utilisons n'a pas besoin de ces cofacteurs pour être active.
Une étude sur le phénotype de ts1 nous a conduit à des résultats différents, démontrant l'importance de pVI-C et de 1' ADN dans les extraits nucléaires des cellules infectées par ad2ts1
et acliwt. La capacité de la protéase de ts1 d'interagir avec le cofacteur suggère que la mutation
pourrait avoir engendré une mauvaise localisation ou la séquestration de l'enzyme mutante de manière à ce qu'elle ne puisse être encapsidée et ne puisse procéder à la maturation des protéines virales. Des résultats préliminaires concernant l'état de solubilité et la localisation à la matrice nucléaire des protéases ts1 et wt n'ont pas permis de les distinguer. Toutefois nous avons
démontré que la protéase de type sauvage peut lier l'ADN de façon non-spécifique. Lorsqu'on aura purifié la protéase de ts1 on sera en mesure de vérifier si la déficience qu'elle démontre au niveau de l'encapsidation s'explique par une incapacité à lier l' ADN.
L' ADENOVIRUS
L'adénovirus a été découvert en 1953, à l'époque où d'énormes efforts avaient été déployés afin d'isoler des agents impliqués dans des infections respiratoires virales aiguës, qui à cette période, représentait un énorme problème clinique et économique. On compte aujourd'hui plus de 100 espèces dont au moins 50 sont d'origine humaine, les autres affecte une très grande diversité d'animaux (Weber, 1990).
Les adénovirus causent différentes pathologies des vertébrés selon le sérotype impliqué. Chez l'humain, il provoque des amygdalites, des pharyngites, des pneumonies, des maladies respiratoires aiguës, des grastroentérites aiguës, des conjonctivites, des kérato-conjonctivites et des fièvres pharyngo-conjonctivales principalement chez les jeunes enfants et les regroupements militaires (Tableau I) (Horwitz, 1990). Il est aussi un membre non-négligeable des agents viraux qui amènent des complications graves chez les patients qui ont reçu des greffes et chez les sidatiques en phase avancée (Pillay et al., 1993; Kramer et al., 1993).
Chez le chien, les sérotypes 1 et 2 causent respectivement des hépatites et des infections respiratoires pouvant mener à la mort de l'animal. Certains sérotypes causent aussi beaucoup de dommages aux poulets, aux bovins ainsi qu'à plusieurs autres espèces animales à grande importance économique et environnementale. Des observations chez les rongeurs ont démontré un caractère oncogénique chez certains sérotypes mais aucun cas ne fut identifié dans des cancers humains.
L'adénovirus est un virus icosahédral et non-enveloppé contenant un génome à ADN double-brins et linéaire d'environ 36 Kb qui se réplique dans le noyau de la cellule. Ce sont les
1 2 3 4 5 6 7 7a 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 Prototype strain Ad71 Ad6 0.8. R167 Ad75 Ton 99 Gomen S-1058 Trim Hicks J.J. Slobitski Huie A.A. De Witt Ch38 Ch79 Ch22 D.C. 587 931 1645 2711 2732 3153 BP-1 BP-2 BP-4 BP-5 BP-6 BP-7 1315/63 H.H. D.J. Compton Holden 275 GW LJb 0335 Dugan/HoviX Tak ADENOVIRUS HUMAINS Source Adenoid Adenoid Nasal washing Throat washing Adenoid Tonsils Throat washing Throat swab Eye swab Stool Eye swab Stool Stool Stool Throat swab Eye swab Eye swab Eye swab Anal swab Conjunctiva Conjunctiva Conjunctiva Conjunctiva Conjunctiva Conjunctiva Anal swab Anal swab Anal swab Anal swab Anal swab Anal swab Stool Anal swab Anal swab Urine
Lung and kidney Stool Eye Stool Stool Stool Stool Stool Diagnosis Hypertrophied tonsils and adenoids Hypertrophied tonsils and adenoids Common cold (volunteer)
Primary atypical pneumonia Hypertrophied tonsils and adenoids Hypertrophied tonsils and adenoids Pharyngitis
Undifferentiated respiratory infection Epidemic keratoconjunctivitis Rheumatoid arthritis?
Conjunctivitis
Paralytic polio (type 1 poliovirus also recovered) Nonparalytic polio?
Healthy child
Acute respiratory disease Conjunctivitis (early trachoma?) Conjunctivitis (early trachoma?) Conjunctivitis (early trachoma ?) Niemann-Pick disease? Trachoma Early trachoma? Trachoma Trachoma Trachoma Trachoma No specific illness No specific illness No specific illness No specific illness No specific illness No specific illness Healthy child Healthy child Healthy child
Rena! transplant recipient Rena! transplant recipient Enteritisc Keratoconjunctivitisd Bronchopneumonia Bronchitis• Gastroenteritis' Gastroenteritis' Healthy child11
Tableau I: Citation de 42 sérotypes humains et les pathologies auxquelles ils sont reliés. Selon Horwitz, MS. dans Fields, B.N. et al. Virology. Raven Press, N.Y. 1990 p.1726.
sérotypes 2 et 5 humains qui ont été les plus étudiés jusqu'à ce jour, d'ailleurs le génome de !'adénovirus de type 2 (a~ a complètement été séquencé.
L' adénovirus est formé du core et de la capside. On peut d'ailleurs identifier, à la Figure 1, les protéines majeures de la capside soient l'hexon (Il), le penton (III) et la fibre (IV). De plus 4 autres protéines mineures (Ilia, VI, VIII et IX) sont associées avec les hexons ou les pentons, selon des rapports stochiométriques. Ces protéines confèrent une stabilité à la capside, forment des liens avec les protéines du core et ont un rôle dans l'assemblage des virions.
Le core des virions inclut une protéine liée aux extrémités 5' de l' ADN, la protéine terminale (TP), reconnue pour jouer un rôle au niveau de la réplication de l' ADN de !'adénovirus. Une structure semblable à la chromatine est formée par l' ADN dans les virions, grâce en majeure partie, à la protéine pVII. Tout comme !'histone, la protéine pVII est très basique et riche en arginine. Les protéines V et X semblent aussi contribuer à la structure formée par l'ADN.
Les adénovirus ont aujourd'hui plusieurs applications, surtout grâce à l'unité de transcription E3, laquelle peut être délétée et remplacée par un ADN étranger sans nuire à la viabilité du virus en culture de cellules. Plusieurs études sont en cours afin d'utiliser ce groupe de virus comme vecteur lors d'immunisation contre une variété d'autres agents (Horwitz, 1990; Morin et al., 1987). Les deux dernières années ont témoigné d'une forte hausse de l'utilisation de vecteurs adénoviraux comme modèles expérimentaux pour les fins de la thérapie génique. Le fait que les adénovirus infectent la plupart des types cellulaires sans nécessiter que les cellules soient en division, combiné avec des titres élevés et une grande efficacité de transfert de gène obtenu avec les recombinants d'adénovirus, font de ce dernier un système très prometteur pour
MODELE D'UNE PARTICULE D'ADENOVIRUS --Ill P - - -
ma
~~---V -...:::::~~ VI Terminal Protein "--+---+--- VIIFigure 1: Modèle pour démontrer la localisation des protéines du virion de !'adénovirus de type 2. Selon Ginsberg, RS. dans Dulbecco,R. et Ginsberg, RS. Virology. J.B. Lippincott company, Philadelphia, 1988 p.151.
la thérapie génique humaine in vivo (Kozarsky et Wilson, 1993).
GENERALITES SUR LES PROTEASES
En 1942, Rudolf Schoenheimer a reconnu que la protéolyse était importante pour le maintien de la concentration des protéines à un niveau stable (Schoenheimer, 1942). Toutefois, les biochimistes ont récemment observé des taux de dégradation variant selon les conditions physiologiques, suggérant que des mécanismes de contrôle doivent nécessairement exister (Schimke et Doyle, 1970; Goldberg et Dice, 1970; Goldberg et St-John, 1976). Il est maintenant évident que les réactions protéolytiques jouent un rôle clé non-seulement dans la régulation du taux de protéines intracellulaires, mais aussi dans le contrôle de plusieurs autres fonctions biologiques comme la digestion et la translocation des protéines, la maturation des hormones, la réponse immunitaire, l'inflammation, la coagulation sanguine, le contrôle de la pression sanguine et plusieurs autres (Holzer et Heinrich, 1980).
L'activité protéasique semble omniprésente puisqu'elle a été détectée chez plusieurs genres de bactéries, de protozoaires, de moisissures, de levures et de cellules d'eukaryotes supérieurs, de même que dans les virus (North, 1982; Jones, 1984; Bond et Butler, 1987). Indépendamment de leur origine, toutes les enzymes protéolytiques peuvent être cataloguées en 4 groupes: les aspartates-protéases, les métallo-protéases, les cystéines-protéases et les sérines-protéases. Certains inhibiteurs permettent d'associer une protéase à la famille à laquelle elle appartient (Tableau Il) (Kay et Dunn, 1990).
Dans le cycle de vie d'un grand nombre de virus, les protéases virales sont généralement impliquées dans le clivage de polyprotéines afin de produire les composants structuraux et
non-CLASSIFICATION DES PROTEASES
Type of.
Examples
Diagnostic inhibitors
active site
Aspartic
pepsin, gastricsin,
renin, cathepsin D,
. pepstatin.
cathepsin E.
Cysteine
papain, cathepsin L,
E-64; cystatins,
cathepsin B,
leupeptin,
cathepsin H.
p-chloromercu
ri
benzoate.
Meta lie:..
collagenases, meprin;
EDTA, phenanthroline,
. thermolysin,
EC
24.11
phosphoramidon.
Serine.~
trypsin-like,
DFP, Ieupeptin,
chymotrypsin-Jike,
DFP, chymostatin,
elastase-like.
DFP, elastatinal.
Tableau II: Classification des protéases en 4 groupes selon des inhibiteurs caractéristiques. Tiré de Kay et Dunn, 1990.
structuraux matures essentiels à la réplication et l'assemblage des particules virales. Elles sont aussi responsables de la régulation du cycle infectieux en produisant, précisément dans le temps, la bonne proportion de protéines nécessaires à la poursuite de l'infection (Houde, 1990).
Les protéases virales les plus connues sont regroupées dans le Tableau
m.
On les retrouve surtout au niveau des virus à ARN et de plus en plus chez les virus à ADN dont !'adénovirus, les caulimovirus (Kay et Dunn, 1990), les hepadnavirus (Kay et Dunn, 1990), les poxvirus (Yang et al., 1988b) et les papovirus (Bowen et al., 1984). Etant donné que les virus à ADN produisent des ARN messagers monocistroniques par épissage, donc n'expriment aucune polyprotéine, la protéase encodée par ces virus semble jouer un rôle différent de ceux déjà mentionnés.En encodant sa propre protéase, le virus peut de cette façon, éviter les restrictions que la protéase de l'hôte pourrait lui conférer. C'est probablement la raison majeure pour laquelle les différentes familles de virus ont développé leur propre système enzyme-substrat hautement spécifique (Krausslich et Wimmer, 1988). Ces enzymes sont toutefois des cibles de choix pour d'éventuels traitements chimiothérapeutiques. Tout inhibiteur spécifique contre un processus protéolytique viral spécifique qui n'interfère pas avec le métabolisme cellulaire de l'hôte peut être d'une importance capitale dans le développement d'agents antiviraux contre une famille entière de virus.
PROTEASE ADENOVIRALE
L' adénovirus, comme plusieurs autres virus complexes, encode une protéase, laquelle est nécessaire à la maturation et à l'infectivité du virus. Cette dernière a été proposée suite à l'isolement du mutant thermosensible atlits1 en 1976 (Weber, 1976), lequel était défectif dans la
PROTEASES VIRALES
Virus Genetie Name/ Proteinase
material protein type
Adeno DNA Adeno 23K serine
Toga RNA Sindbis nsP2 serine
(Alpha) RNA Semliki forest serine
(Pesti) RNA Bovine Viral
Diarrhoea serine
Flavi RNA Yellow Fever NS3 serine?
Pi corna RNA Polio 2A cysteine
(Entero/ RNA Rhino 2A cysteine
Rhino) RNA Polio 3C cysteine
RNA Rhino 3C cysteine
RNA Hepatitis A 3C cysteine
(Cardio) RNA EMCV3C cysteine
(Aphtho) RNA FMDV LProtein cysteine?
FMDV3C cystcine
Corno RNA Cowpea Mosaic 24K cysteine
Poty RNA Tobacco Etch Nia cysteine
RNA Plum Pox Nia cysteine
Retro RNA HIV-1 PR as partie
RNA HIV-2 PR as partie
RNA MoMLVPR as partie
RNA HTLV-1 PR as partie
RNA BLV PR aspartic
RNA RSVPR aspartic
RNA MAVPR as partie
Caulimo DNA Cauliflower Mosaic as partie?
Hepadna DNA Hepatitis B as partie?
Tableau ID: Liste des protéases virales les mieux caractérisées. Tiré de Kay et Dunn, 1990. Il est à noter que la protéase est d'adénovirus est maintenant classifiée comme une protéase de type cystéine.
maturation des protéines Ilia, VI, VII, VIII, 1 lk et de la protéine terminale (fP), à température non-permissive, menant ainsi à un virus non-infectieux. La mutation de ts1 a été localisée, par
des expériences de recombinaison et de séquençage, dans l'unité de transcription tardive L3. Cette mutation ponctuelle correspondant à la transition d'un C en T, changeant une proline en leucine, est située dans le cadran de lecture d'un gène codant pour une protéine de 23kd (Yeh-Kai et al., 1983).
La preuve formelle de l'existence de cette protéase fut établie avec la démonstration de clivages in vitro, des protéines précurseurs virales en présence de l'enzyme exprimée et purifiée dans E. coli (IIoude et Weber, 1990b; Anderson, 1990).
Le gène a été séquencé dans 12 sérotypes adénoviraux différents. L'alignement des séquences en acides aminés traduites à partir des séquences d' ADN (Figure 2) démontre une grande conservation entre ces dernières. Toutefois, aucune homologie significative n'a pu être démontrée avec toute autre protéine connue (Faxing et Weber, 1993).
PROPRIETES DE LA PROTEASE AD2 SPECIFICITE DE SUBSTRAT
Contrairement à la majorité des protéases connues, la protéase de !'adénovirus semble avoir une activité très limitée. C'est-à-dire qu'elle effectue son activité protéolytique que selon certaines séquences spécifiques correspondant à:
(M,I,L)XGG-X ou (M,I,L)XGX-G
Ces sites ont été proposés suite à une étude effectuée par Webster et al. (Webster et al., 1989) à l'aide d'une variété d'octapeptides synthétiques et de virions d'adénovirus fragmentés comme
ALIGNEMENT DES SEQUENCES DES PROTEASES DE DIFFERENTS SEROTYPES AJW-1 BAV-3 BAV-7 CAN-1 H12 H2 H3 H4 H40 H41 KAV-1 AAV-1 BAV-3 BAV-7 CAN-1 H12 H2 H3 H4 840 ·• H41 KAV-1 AAV-1 BAV-3 BAV-7 CAN-1 H12 H2 H3 H4 H40 H41 KAV-1 26 44 54 71 MS---GTTETQLRDLLSSKHLRHRFLGVFDKSFPGFLDPHVPASAIVNTGSRASGGMHWIGFAFDPA.AGRCYMFDPFGWSDQICLWELYRVKYNAFKRR M---GSREEELRFILHDLGVGPYFLGTFDKHFPGFISKDRMSCAIVNTAGRETGGVHWLAMAWHPASQTFYMFDPFGFSDQKLKQIYNFEYQGLLKR MS---GLSEKEVFLLLSSLQCTHGFLGTFDCRFPGFINKVKVQTAIINTGPREQGGIHWIALAWDPKSYQMFIFDPLGWKNDQLMXYYKFSYSNLIKR MAEG---GSSEEELRAIVRDLAVTPFFLGTFDKRFPGFISSQRITCAVVNTAGRETCGVHWLAMAWNPRSKTFYMFDPFGFSDSKLKQVYSFEYEGLLRR M---GSSEQELTAIVRDLGCGPYFLGTFDKRFPGFVSRDRLSCAIVNTAGRETGGVHWLAFGWNPKSHTCYLFDPFGFSDQRLKQIYQFEYESLLRR M---GSSEQELKAIVKDLGCGPYFLGTYDKRFPGFVSPHKLACAIVNTAGRETGGVHWMAFAWNPRSKTCYLFEPFGFSDQRLKQVYQFEYESLLRR MTCGSGNGSSEQELKAIVRDLGCGPYFLGTFDKRFPGFKAPOKLACAIVNTAGRETGGEHWLAFGWNPRYNTCYLFDPFGFSOERLKQIYQFEYEGLLRR MAA----GSGEQELRAIIRDLGCGPYFLGTFDKRFPGFKAPHKVACAIVNTAGRETCGEHWLAFAWNPRSNTCYLFDPFGFSDQRLKQIYQFEYEGLLRR M---GSSEQELVAIVRELGCGPYFLGTFDKRFPGFKAPHKLACAIVNTAGRETGGVHWLALAWNPKNRTCYLFDPFGFSDERLKQIYQFEYEGLLKR M---GSSEQELVAIARDLGCGSYFLGTFDKRFPGFKAPNKLACAIVNTAGRETGGVHWLALAWNPKSHTCYLFDPFGFSDERLKQIYQFEYEGLLKR M---GSSETELRQLVADLGIGS-FLGIFDKHFPGFISVNKPACAIVNTASRETGGVHWLAMAWYPTSSTFYLFDPFGFSDRKLQQVYKFEYERLLKR * • * ••• • •••• * •• • •• •• • • • • * • • • 104 122 170 182 TGLRQ-PDRCFTLVRSTEAVQ---CPCSA.ACGLFSALFIVSFDRYRSKPMDGNPVIDTVVGVKHENMNSPPYRDILHRNQERTYYWWTJCNSAYFRAHQ SALTSTADRCLTLIQSTQSVQGPN---SA.ACGLFCCKFLHAFVRWPLRAMDNNPTMNLIHGVPNNMLESPSSQNVFLRNQQNLYRFLRRHSPHFVJOIA SAL-SSPOKCVKVIKNSQSVQ---cTCAGSCGLFCVFFLYCFYKYKSNAFKNCLFQSLYGSIPS---LTPPNPTNLHKNQDFLYKFF.IŒltSLYFRQNE SAIASTPDRCVTLAKSNETIQGPN---SA.ACGLFCCKFLHAFVNWPONPFNHNPTMGPLKSVPNYKLYOPTVQHVLWENQEKLYKFLEKNSAYFRAHA SALAATKDRCVTLEKSTQTVQGP---FSA.ACGLFCCKFLHAFTHWPDHPKDKNPTMDLLTGVPNCMLQSPQVVGTLQRNQNELYKFLNSLSPYFRHNR SAIASSPDRCITLEKSTQSVQGP---NSA.ACGLFCCKFLHAFANWPQTPKDHNPTMNLITGVPNSKLNSPQVQPTLRRNQEQLYSFLERHSPYFRSHS SALA-TKDRCITLEKSTQSVQGP---RSA.ACGLFCCKFLHAFVHWPDRPKOGNPTKKLVTGVSNSKLQSPQVQPTLRRNQEVLYRFLNTHSSYFRSHR SALA-TKDRCVTW-KSHQTCRVRVGRCGFSA.ACSTAC---AWPT-PMDKNPTMNLLTGVPNGKLQSPQVEPTLRRNQEALYRFLNSHSAYFRSHR SALASTPOHCITLIKSTQTVQGP---FSA.ACGLFCCKFLHAFVNWPTSPMERNPTMDLLTGVPNSKLQSPQVVPTLRHNQERLYRFLAQRSPYFQRHC SALASTPDHCITLVKSTQTVQGP---FSA.ACGLFCCKFLHAFIHWPSNPMEQNPTMDLLTGVPNSKLQSPQVEPTLRRNQERLYRFLTQHSPYFRRHR SAVSSSSSKCVTLVKSHQTVQGPH---SA.ACGLFCVLFLAAFGKYPQNPKNNNPIMGPIEGVPNDQMFNPCYTKTLYRNQQWVYSYLNKNSLYFRLHV
.
. . .
.
.
.
..
.
.
.
:· EELRRETALNALPENHV--- 206 a.a. AQIEADTAFDKMLTN--- 204 a.a. EYIVSNTKIGLIKSHI--- 202 a.a. AAIKTRTAFNK-LKQ--- 206 a.a. ERIEKATSFTKMQNGLK--- 206 a.a. AQIRSATSFCHLKNM--- 204 a.a. ARIERATAFDRMDMQ--- 209 a.a. ARIEKATAFDRMNQDM--- 201 a.a. ERIKKATAFDQMKNNM--- 205 a.a. ERIEKATAFDQMKNAQVLFHNKIFY 214 a.a. ELIIOtNTAFDKLLVRK--- 204 a.a. *Figure 2: Alignement des séquences de protéases adénovirales, humaine (H), canine (Can), murin (Mav), bovin (Bav) et de l'avian (Aav). L'alignement fut effectuée par le programme CLUSTAL V, en utilisant des intervalles de pénalité fixes ou variables de 10. La numérotation est accordée selon la séquence de l'ad2 (H2). Puisque l'ad5 diffère de l'ad2 que par un H à la position 63, il n'est pas inclus. (*)Conservé à travers toutes les séquences, (o) substitutions conservées. Tiré de Faxing, C. et Weber, J.M, 1993.
source d'enzyme. Le Tableau IV montre une énumération des protéines adénovirales pour lesquelles le ou les sites de clivage ont été déduits ou confirmés. Certains de ces sites furent vérifiés par des clivages in vitro. Tous les clivages obtenus avaient été prévus (Weber, 1990). Le
séquençage des régions N-terminales des produits de clivage des protéines pVI, pVII et llk a permis de confirmer les sites qui avaient été déduits à partir des séquences (Weber, 1990). Aucun site de clivage a été identifié à l'intérieur de la protéase (Anderson, 1990).
On observe dans le virion, des protéines qui possèdent un ou plusieurs sites de clivage mais ne sont pas clivées par la protéase. On suppose que ces sites pourraient être inaccessibles à l'enzyme, lors de la maturation du virus. C'est le cas par exemple de l'hexon (Il) où l'on a observé que ces sites de clivage, dans la structure quaternaire de la protéine, sont inaccessibles de l'intérieur du virion. Ces derniers pourraient être clivés lors de la décapsidation d'une infection subséquente (Weber, 1990).
La conservation de la spécificité de clivage à travers les différents sérotypes nous permet d'effectuer des essais in vitro avec une enzyme d'un sérotype et des substrats de sérotypes
différents (Houde et Weber, 1990a). La protéase adénovirale peut aussi cliver des substrats non-viraux, tels l'actine, l'ovalbumine, le cytochrome c et le fibrinogène. Mais en général, ces protéines doivent être dénaturées à la chaleur avant d'être utilisées dans les essais enzymatiques afin d'augmenter l'efficacité de clivage (Tihanyi et al., 1993).
PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES
La protéase de l' adénovirus est une protéine monomérique de 24 838 Da ne portant pas de modification postraductionnelle et de lien disulphide mesurable (Tihanyi et al., 1993).
PROTEINES ADENOVIRALES CLIVEES PAR LA PROTEASE
Peptide cleaved~
Virus Prote in• Cleavage Site Pl in vitro in vivo
H2° pVII (197) MFGG AKKR 24 Yes Yes
pVIII(227) LAGG FRHR 111 Yes
pVI(250) MSGG AFSW 33 Yes Yes
" IVGL GVQS 239 Yes llK (79) MAGH GLTG 26 LTGG MRRA 31 Yes MRGG ILPL 50 Yes pTP (668) MRGF GVTR 172 Yes MGGR GRHL 180 Yes LGGG VPTQ 314 No MTGG VFQL 346 No pIIIa(585) LGGS GNPF 570 L-l-52K(415) LAGT GSGD 351
Hl2 pVI (265)4 LNGG AFNW 33 Yes
" IVGL GVKS 254 Yes
11K(72 )4 LTGN GRFR 27 Yes
" MKGG VLPF 42 Yes
pVII4 AXTR Yes
pIIIa' GNPF Yes
H41 pVIII (233). LAGG SRHV 111
pVI' IVGL GVKS
CANl pVII ( 132 )1 LFGG AKQK 23
Tableau N:
a
Le nombre d'acides aminés des protéines précurseurs est donné dans les parenthèses. b Un tiret, indique que le site de clivage n'a pas été confirmé de manière directe, comme leséquençage ou par clivage in vitro du peptide relié.
c Les sites de clivages des protéines PVI, p VII, p VIIl et L-1-52K de H5 sont identiques à celles de H2 (J. Chroboczek, F. Bieber and B. Jacrot, Virology 186, 280 (1992).
d P. Freimuth and C.W. Anderson Virology 193,348 (1993). e N. Pieniazek, and R.B. Luftig, Nucl. Acids Res. 17, 5398 (1989).
f C.I.A Toogood, R. Murali, R. Burnett and R.T. Hay J. Gen. Virol. 70, 3203 (1989). g F. Cai, and J.M. Weber, Virology 193, 986 (1993).
h J.M. Weber, F. Cai, R. Murali, and R.M Bumett, J. gen. Virol. in press, (1993). Tiré de Weber, J.M et Tihanyi, K (1993 preprint).
L'activité spécifique est de 12,9 nn101-1 min-1 nmo1-1• Son point-isoélectrique (pl) est de 10,59 et son activité est optimale à pH neutre (Tihanyi et al., 1993).
Il a été observé que la protéase copurifie avec le core des virions matures, dans les noyaux des cellules infectées (Anderson, 1990).
ACTIVATION
L'expression et la purification de la protéase dans les systèmes de E. coli et de baculovirus ont permis de caractériser l'enzyme dans des systèmes simples, de manière à éviter les problèmes d'interprétation engendrés par les facteurs multiples des systèmes complexes. Les systèmes simples ont permis de conclure que la protéase de !'adénovirus est une protéase du type cystéine grâce à des études réalisées en présence d'inhibiteurs spécifiques à cette classe de protéases. Ce fut toutefois une surprise générale lorsqu'il a été observé que l'enzyme pure, en présence d'un substrat pur spécifique, n'avait aucune activité protéolytique. Il a alors été suggéré que la protéase nécessitait la présence d'un cofacteur pour son activité enzymatique. Le cofacteur est un produit de clivage de la protéase de 11 aa provenant de la région C-terminale de la protéine pVI: Nllz-GVQSLKRRRCF-COOR Il n'est pas encore clair comment le peptide active l'enzyme ou s'il est absolument nécessaire pour le clivage de d'autres substrats protéiques adénoviraux. La région de p VI a été séquencée dans plusieurs sérotypes et apparait comme étant très conservée (Tableau V) (Weber, soumis). Parmi les études effectuées sur ce sujet, Anderson et al. (Mangel et al., 1993) mentionnent que certains polymères négatifs, dont l' ADN et l' ARN, semblent augmenter l'activité enzymatique de la protéase d'au moins 10 fois (Mangel et al., 1993). L'utilisation de l' ADN comme cofacteur de protéase est sans précédent En raison de leur
SEQUENCES DU COFACTEUR pVI-C
virus
peptideH2
GVQSLKRRRCF
H5
GVQSLKRRRCF
H12
GVKSLKRRRCY
H41
GVKSLKRRRCY
Mavl GLQPIKRRRCFTableau V: Séquences des peptides pVI-C agissant comme cofacteur de la protéase. Tiré de Weber, J.M et Tihanyi, K. 1993 (preprint).
.
1
r
1 11
•
..
.
•
•
1
-1besoin apparent d'un cofacteur (Mangel et al., 1993; Webster et al., 1993) et de leur séquence en acides aminées (aa), les endoprotéases adénovirales représentent une toute nouvelle classe d'enzymes protéolytiques.
SITE ACTIF
Si la protéase adénovirale se conforme à sa classe cystéine, son site actif devrait être composé d'une cystéine, d'une histidine et d'un aspartate (Beynond et Bond, 1989). Toutefois, on observe que dans la famille des papaïnes seulement une cystéine et une histidine semblent impliqués dans la catalyse (Baker et Drenth, 1987).
L'alignement de séquences des endoprotéases de 12 adénovirus parmi lesquels certains sont très distants en terme d'évolution, dont l'homme et le poulet, nous démontre qu'une seule histidine est conservée, H54 et 2 cystéines C104 et C122 (Figure 1) (Cai et Weber, 1993).
Des mutations introduites dans ces résidus et ailleurs, combinées à des essais de liaison au E64, suggèrent les résidus H54 et C104 comme membres du site actif. Aucun candidat pour le troisième résidu n'a été proposé.
L'identification des résidus critiques du site actif est importante dans l'étude de la structure secondaire et tertiaire de l'enzyme, afin de déterminer des inhibiteurs potentiels appropriés pour la chimiothérapie d'infections adénovirales.
ROLE DANS L'INFECTION DU VIRUS
La protéase de !'adénovirus est encapsidée durant l'assemblage du virus et il semble que les protéines précuseures soient clivées durant ou subséquemment à l'assemblage du virion
(Weber, 1990).
Suite aux connaissances acquises sur les protéases au cours des dernières années, plusieurs questions nous viennent encore à l'esprit. Par exemple, par quel mécanisme la protéase reste inactive jusqu'à son association avec les virions matures (Weber, 1990)?
Les protéines adénovirales connues clivées par la protéase, c'est-à-dire ma, pTP, llk(mu), L1-52K, p VI, p VIT et p VIII sont toutes présentes dans le virion lors de sa maturation.
La nécessité du cofacteur peptidique pourrait être critique au niveau du contrôle de l'activité protéolytique juste avant l'encapsidation de l'enzyme de manière à prévenir les clivages précoces. Bien que la fonction précise de ces clivages de maturation reste inconnue, des études avec ts1 ont démontré que le clivage n'est pas nécessaire à l'assemblage du virus. Cependant, ces virions ne sont pas infectieux puisqu'ils ne peuvent se décapsider (Weber, 1976; Mirza et Weber, 1980; Mirza et Weber, 1979; Miles et al., 1980).
Le phénotype de ts1 est en accord avec l'hypothèse que le clivage de maturation serait la
dernière étape menant une particule virale à l'infectivité (Weber, 1990; Weber, 1976).
Donc une fonction possible serait la préparation des virions à la décapsidation dans une infection subséquente. Elle pourrait aussi permettre la libération des virions complets de leur ancrage sur la matrice nucléaire par le clivage des précurseurs des protéines terminales, lesquelles sont liées de façon covalente à l' ADN destiné à être encapsidé (Khittoo et al., 1986; Challberg et Kelly, 1981; Fredman et Engler, 1993).
DESCRIPTION DE PROJET
d'essai enzymatique simple (substrat-enzyme purifiée), nécessaire à l'étude de l'activité de la protéase de l' adénovirus de type 2 ( ad:i).
En seconde partie, le phénotype de ts1 est étudié afin de mieux comprendre le rôle de la protéase de l'a~ dans l'infectivité du virus. Plus particulièrement, la localisation de l'enzyme
mutante par rapport à l'enzyme de type sauvage, fait l'objet de cette section.
En dernière partie, on aborde la question de l'encapsidation de la protéase dans les virions. Cet aspect pourrait expliquer une partie du mécanisme de contrôle de l'activité protéolytique afin de prévenir la maturation précoce.
Le but ultime de ces études est de mieux comprendre la protéase d'ad2 afin d'espérer développer éventuellement des agents antiviraux spécifiques à la classe des adénovirus.
A. ACTIVITE DE LA PROTEASE
1. SOURCES DE PROTEASE 1.1 Lysats bactériens
pLPV: vecteur comportant le gène de la protéase (Bourbonnière, 1990) pLAM: vecteur contrôle (Bourbonnière, 1990)
La séquence codante de la protéase de l' adénovirus de type 2 a été sous-clônée dans pLAM, un vecteur d'expression modifié de pRIT2T, sous le contrôle du promoteur pL (I'ihanyi et al., 1993). Les plasmides recombinants furent transfectés et sélectionnés sur des cellules N99CI+ qui expriment le répresseur CI lambda sauvage de façon constitutive. Les plasmides sélectionnés ont été transférés dans les cellules AR120 afin de maximiser l'expression. AR120 est dérivé de N99 et est CI+ (Mottet al., 1985). L'induction par l'inactivation de CI+ peut être engendrée par l'acide nalidixique (80ug/ml) ou via le mécanisme SOS lorsque les cellules atteignent une haute densité (Mottet al., 1985).
1.2 Protéase purifiée
La protéase sous forme purifiée a été utilisée dans la majorité des essais. La purification de l'enzyme a été effectuée à partir du système prokaryote (pLPV/AR120), selon la méthode décrite précedemment par Karoly Tihanyi (I'ihanyi, 1993).
La pureté a été évaluée selon la proportion de protéase détectée sur gel SDS-PAGE coloré au nitrate d'argent (Bollag et Edelstein, 1991) par rapport aux autres protéines lorsqu'un
échantillon concentré provenant de la dernière étape de purification a été chargé en excès sur le gel. Par exemple l'apparition d'une seule bande correspondant à la protéase nous indiquait que la protéase avait une pureté de 99-100%. Il faut toutefois tenir compte que la technique a une limite de détection minimale de lng ce qui indique que des protéines présentes à une concentration inférieure dans l'échantillon ne seront pas détectées. Généralement leur proportion par rapport à la protéase dans l'échantillon est négligeable d'où nous en n'avons pas tenu compte dans la majorité des essais.
2. SUBSTRATS 2.1 Substrat ts1
Les virions d'ad2tsi-39°C marqués à la methionine-35S, purifiés et fragmentés constituent le substrat sur lequel les essais de l'activité protéasique ont été effectués. La préparation de ces virions a été décrite précédemment (Weber, 1976).
2.2 Recherche informatisée de substrats
La liste des protéines possédant le site de clivage spécifique à la protéase a été obtenue de la banque de données,
Swissprot.
2.3 Ovalbumine
L'ovalbumine (Sigma) fut dissoute dans un tampon TE (Tris lümM pH 7.0, EDTA lmM), marquée à l'iode125 (Markwell et Fox, 1978) et dénaturée à la chaleur 5 minutes avant d'être utilisée dans les essais d'activité protéolytique.
2.4 Protéine pVII canin
La protéine adénovirale précurseure VII d'origine canine fut clonée, exprimée et purifiée
à l'aide du kit Xpress System Protein Purification de Invitrogen corporation.
2.5 Marquage à l'iode125
Le marquage des protéines à l'iode125 fut réalisée selon une technique décrite par Markwell (Markwell et Fox, 1978), avec l'utilisation de l'IODO-GEN comme agent iodant. L'IODO-GEN a été préféré au chloramine T en raison de sa plus grande délicatesse de son efficacité. Suite au marquage, une dialyse de 24 heures à température ambiante, fut effectuée contre un tampon TE afin d'éliminer l'iode libre. Les protéines marquées furent utilisées pour les essais d'activité protéolytique dans les 3 jours suivant le marquage en raison d'une dégradation rapide observée après ce temps.
3. ESSAIS PROTEOLYTIQUES
Tous les essais protéolytiques ont été effectués dans un tampon TE (Tris lOmM pH 7,0, EDTA lmM), sauf lorsqu'indication contraire. Les réactions ont été arrêtées par la solution de lyse (Houde, 1990) et chargées sur un gel SDS-PAGE (section 4). Les résultats ont été révélés
à l'aide d'une autoradiographie de ces gels. Lorsque le substrat ts1-met[35S] (section 2.1) a été utilisé, 1 'activité protéolytique a été évaluée selon le taux de protéines p VII transformées en VII. Dans les cas de substrats tels l'ovalbumine et pVII canin, l'activité a été estimée selon le taux de disparition du substrat de départ ou l'apparition de produits, dans les réactions où l'enzyme a été ajoutée par rapport aux réactions où elle était absente.
L'enzyme pure a été ajoutée à raison d'environ 600 ng par réaction. Toutefois la proportion de molécules actives et dans la bonne conformation n'a pas encore été évaluée. Les
extraits bactériens exprimant la protéase ont été ajoutés à environ 1 ug par réaction. Les réactifs suivants ont été ajoutés dans certaines réactions:
i. pVl-C ~-GVQSLKRRRCF-COOH) (Coast Scientific S.D.), a été préparé dans l'eau
nanopure stérile en prenant soin de limiter l'oxidation (forme réduite). Pour obtenir la forme oxydée, nous avons placé le peptide en solution à l'air au moins 24 heures à la température de la pièce. Les concentrations utilisées variaient de 0 à 64uM.
ii. DNase I (Pharmacia LKB Biotechnology), a été ajoutée selon des quantités variant de 0 à lOOOng.
4. GEL DE POLYACRYLAMIDE SDS-PAGE
Les gels ont été faits selon la méthode de Maizel (Maizel, 1969) sur des appareils SE 600 de Hoefer Scientific Instruments. La concentration de polyacrylamide a été de 12,5% dans tous les essais de ce travail.
B. ETUDE DU PHENOTYPE DE TSl
6. CELLULES ET INFECTION VIRALE
Des cellules de type Hep-2 (Moore et al., 1955) ont été cultivées dans des pétris de culture cellulaire (lOOmm) dans du milieu DMEM (Dulbecco et Freeman, 1959) avec 10% v/v de sérum de veau. La couche monocellulaire a été infectée lorsqu'elle atteignait 80 à 95% de
confluence avec une multiplicité d'infection (MOI) de 10 unités de formation de plage/cellule (PFU, plaque forming unit). Ensuite la concentration de sérum de veau a été abaissée à 2.5% v/v. L'incubation des cellules durant l'infection a été faite à 39°C.
7. MARQUAGE DES PROTEINES VIRALES IN VIVO
Les protéines virales ont été marquées in vivo à la méthione-[35S] (Amersham) de la 22ième heure d'infection jusqu'à la 24ième heure, à raison de 75Ci par millilitre (ml), la température ayant toujours été maintenue à 39°C.
8. EXTRACTION DES NOYAUX
L'extraction des noyaux des cellules infectées et non-infectées a été effectuée selon la méthode décrite précédemment (Houde, 1990). Les extraits nucléaires et cytoplasmiques ont été conservés 24 heures à 4°C avant leur utilisation.
9. ESSAIS DES PROTEASE NUCLEAIRES
IN
VITROLes noyaux isolés de cellules infectées et non-infectées ont été soniqués pendant 5 secondes à 40 cycles (Sanie Dismembrator-Artek Co.) juste avant d'être ajoutées aux réactions. Les extraits nucléaires non-marqués ont été incubés en présence du substrat (ad2ts1-[35S]) selon différentes conditions. Quant aux extraits marqués à la méthionine-[35S] in vitro, ils ont été incubés seuls selon différentes conditions. Les réactions ont eu lieu dans un tampon TE (Tris lOmM pH7,0, EDTA lmM) et incubées durant 16 heures, aux températures 4°C et 40°C selon les indications. Dans certains cas le cofacteur pVl-C et de la DNaseI ont été ajoutés. Les
réactions ont été arrêtées par addition de la solution de lyse-SDS (Houde, 1990) et bouillies durant 3 minutes. L'activité protéolytique a été détectée en mesurant la conversion de la protéine pVII en VII sur gel de SDS-PAGE de 12,5% (section 4).
IO.TRANSFERT SUR MEMBRANE DE NITROCELLULOSE (WESTERN BLOT)
Le transfert des protéines à partir de gel de polyacrylamide SDS-P AGE sur membrane de nitrocellulose (Hybond-C, Amersham) par le système d'électro-transfert polyblot de la compagnie Hoefer scientific instruments (HSI) a été effectué tel que décrit par le fabricant
11.IMMUNODETECTION
L'immunodétection a été réalisée grâce à un anticorps polyclonal de lapin préparé à partir de la protéase de type sauvage purifiée exprimée dans E. coli, par le vecteur pLPV. Les
complexes antigènes-anticorps ont été détectés avec de la protéine-A iodinée par la méthode de chloramine-T. Cette technique peut détecter des concentrations de protéines de 50-lOOpg (Bers and Garfin, 1985).
C. LOCALISATION DE LA PROTEASE
12.ETAT DE SOLUBILITE DE LA PROTEASE
Les extraits de noyaux ont été incubés selon différentes conditions durant 16 heures à 40°C. Ils ont ensuite été centrifugés à 10 OOOrpm durant 5 minutes. Les surnageants ont été séparés des culots. Ces derniers ont été resuspendus dans un volume de tampon (Tris lOmM pH 7.0, lmM EDTA) égal au volume du surnageant (50ul). Les échantillons de culots et de
surnageants ont ensuite été soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS-PAGE (section 4) et transférés sur une membrane de nitrocellulose. La présence de protéase dans ces échantillons a été révélée par une immunodétection (section 11).
13. EXTRACTION DES MATRICES NUCLEAIRES
Cette méthode a été effectuée tel que décrit précédemment (Khittoo et al., 1986). Contrairement à ce qui avait été fait en 1986, la présence de ts1 a été révélée par un transfert sur nitrocellulose suivit d'une immunodétection (section 10 et 11) au lieu d'un test d'activité des matrices nucléaires en présence du substrat ts1-[35S].
D. ENCAPSIDATION DE LA PROTEASE
14.LIAISON DE LA PROTEASE A L' ADN
14.1 Recherche informatisée de motif de liaison à l' ADN dans la protéase de l'adénovirus Une recherche informatisée à l'aide de la banque de données GENE BANK, a été effectuée
afin d'identifier des sites potentiels de liaison à l' ADN dans la séquence de la protéase, tels que
l'hélice-tour-hélice et les doigts de zinc. 14.2 ADN
i. p194: Cet ADN provient du plasmide pBES (N. Stow CSHl0.10.1980) qui contient l'extrémité de gauche (0 à 9%) du génome de l 'Ad2. A partir de ce plasmide nous avons amplifié par PCR (Innis et al., 1990) la région correspondant au domaine d'encapsidation, c'est-à-dire entre les nucléotides 186 et 380 à l'aide des amorces suivantes:
p194 5': 5'-CCGGTGTATACGGGAAGTGA-3' p194 3': 3'-TCCACGTAAACGGTCAAAGT-5'
Toutes les réactions ont eu lieu dans un volume de lOOul contenant: Tris lOmM pH 7,5, 50mM NaCl, lOmM MgC12 et 1,5 mM deoxynucleotides triphosphates (dNTP). Les cycles de température du PCR se sont déroulés selon les conditions suivantes: la dénaturation initiale du brin matrice a duré 90 secondes à 92°C. La température a ensuite été abaissée à 55°C pour favoriser l'hybridation de l'amorce et ce pendant une durée de 90 secondes. La température a de nouveau été augmentée jusqu'à 72°C pendant 3 minutes, pour permettre la polymérisation (élongation). Après ce premier cycle, on a procédé avec 30 cycles semblables à ce dernier (Saiki, et al., 1988).
ii. AP2 : Oligonucléotide de 26 paires de bases portant le site de liaison du facteur de transcription AP2, fournie par Promega dont le numéro de catalogue est: E3211.
iii. néo : Oligonucléotide de 254 paires de bases correspondant à la région 966 à 1223 nucléotides du gène néo. L'amplification par PCR de cette région à partir de la construction N2 fut réalisée à l'aide des primers suivants:
néo 5': 5' -ATGACCGACCAAGCGACGCC-3' néo 3': 3'-GCTGCTGGTTTCCTGGATGC-5'
Le programme de PCR ainsi que les conditions de réaction sont exactement les mêmes que ceux utilisés ci-haut pour p194.
iv. ADN GENOMIQUE Ad2 : La purification de l'ADN viral a été réalisée tel que décrit précédemment (Houde, 1990) et digéré à l'aide des enzymes de restriction Hind fil et Nco 1 (Pharmacia ).
v. ENZYMES DE RESTRICTION:
Les sites de restriction de p194 et de néo ont été identifiés à l'aide du programme "Cyborg".
Les enzymes de restrictions nécessaires aux manipulations de l' ADN ont été obtenues de sources variées (Pharmacia, Promega) et utilisées selon les directives des manufacturiers.
vi. PURIFICATION DE BANDES D'ADN A PARTIR DE GEL D'AGAROSE:
Les produits de PCR ont été séparés sur un gel d'agarose 1 % Nusieve 2%, dans un tampon TAE (Maniatis et al., 1989). L'extraction et la purification des bandes d'ADN ont été réalisées selon le Sephaglas BandPrep Kit de Pharmacia.
14.3 SOURCE DE PROTEASE
La protéase sous forme purifiée (section 1.2) a été utilisée dans les essais portant sur la liaison de la protéase à l' ADN, à raison d'environ 600ng par réaction, la proportion de molécules dans la bonne conformation étant inconnue.
14.4 FILTRE DE RETENTION (FILTER BINDING)
ADN-protéines de l' ADN libre en utilisant des filtres de nitrocellulose (Ausubel et al., 1992).
Les filtres de nitrocellulose (Amersham Hybond-C extra) ont été traités selon la méthode décrite par Moran (Rikitake et Moran, 1992) et entreposé dans le tampon DBB (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 10% glycérol, 50 mM KCl, 0.1 mM Dithiothreitol et 0.1 mM PMSF) décrit dans cette méthode. Cependant le PMSF a été omis puisqu'il est un inhibiteur important de protéase. Les
échantillons ont été préparés avec le tampon DBB et différentes concentrations de protéines variant de 1X10-12M à 1X10-7M Nous avons utilisé le BSA (Boehringer) comme contrôle négatif et !'histone (Sigma) comme contrôle positif. La protéase a été préparée tel que décrit ci-haut. Nous avons utilisé 10 ng d' ADN génomique d'a~ fragmenté pour une série de réactions et 15
ng d'ADN néo pour l'autre série. Les ADN ont été marqué radioactivement en utilisant un système à amorce multiple (Amersham, Multiprime DNA labelling System, RPN 1601).
Les réactions ont eu lieu dans un volume final de 20ul à 37°c durant 30 minutes. Ensuite le volume a été complété à 200ul avec le tampon DBB et filtré à l'aide de l'appareil de microfiltration Bio-Dot SF de BIO-RAD. Deux lavages de lml de tampon DBB furent nécessaires pour chaque puit, afin d'être sûr que l'ADN libre ne restait pas sur le filtre. Les
filtres de nitrocellulose furent séchés à l'air et autoradiographiés.
14.5 GEL DE RETARDATION (GEL RETARDATION)
La méthode de gel de retardation (Hennighausen et Lubon, 1987) permet de déterminer si une protéine donnée lie l' ADN de façon spécifique ou non-spécifique.
Les réactions ont eu lieu dans un volume final de 20ul (20% Glycérol, 5 mM MgCl:z, 2.5 mM EDTA, 2.5 mM DTT, 250 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 600 ng Protéase et 1 ng
d' ADN cible). Ces échantillons ont été incubés 20 minutes à température de la pièce. Les échantillons ont été soumis à une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide-bisacrylamide (40:1) non-dénaturant de 4%. La migration a eu lieu sur des appareils SE 600 de Hoefer Scientific Instruments. Les gels ont ensuite été séchés et autoradiographiés.