,
"
--
---
---'Localisation différentielle des lymphocytes B matures et de leurs précurseurs dans la moelle
·osseuse de souris ifradiées
•
•
..
'-@
par Claire Léveilléun mémoire
SOUQI1S conformément aux exigences du diplôme de
Maitre en Sciences de l ' Un~ versité McGill
.D.apartement de Médecine
Div~sion de Médec~n~ Expérimentalê
Université McGill Maros 1986
. ,
.'
J
;, :•
Localisa~ion différentieile des lymphocytes B matures
~t
de\leurs prêcurseurs dans la moelleosseuse de souris irradiées'
.,.
;,
•
)
,par Claire Lév~illé
un mémoire soumis conformément
aux exigences du diplôme de
.
Maitre en Sciences de l'Université McGill
Département Qe Médecine
,
Division de Médecine Expérimentale .
Universit~ McGill Mars 1986
\
,;
).
« RÉSUMÉ ABSTRACT REMERCIEMENTS TABLE DES FIGURES TABLE DES TABLEAUX, PRÉFACETABLE DES MATIERE~
CHAPITRE 1 INTRODUCTION
1. Lymphopolêse et myélopol~se 2. Ontogénie des lymphocytes 8
\1
..
o3. Formation des lymphocytes B chez l'adulte 4. Formation~des lymphocytes B fonctionnels.
6~ Conclusions générales
CHAPITRE 2 Localisation différentielle des lymphocytes 8 et de leurs précurseurs dans la moelle osseuse des eouris irradiées
•
,1. Introduction 1'
2. Matériels et Mé~des 3. R~sultats
2.1 essai des lymphocytes '8
2. 2 E~imination des lymphocytes B par
l'irradiation_léthalè des souris 1
"
2.3 Récupération des lymphocytes B injectés,
2.3.1 Récupération des lymphocytes B matures de rate
~
2.3.2 Récupération des lymphoèytes B de la moelle
2.3.3 Cinétiques de récupération des lymphocytes B 1 / / / / / / s
•
l-
l' i ~f.
.
.
' 0\.'•
t 3. Injection de sous-population de cellules de moelle'/1'
3.1 FractiQns de petites ceJ-lules
3.2 Fractions de grosses cellules 4. Discussion
4.1 Essai des lymphocytes S
4.2 Disparition des lymphocytes B ch~z les souris
irradiées \
4.3 Mlgration des lymphocytes B dans la moelle d~s receveurs
4.4 Migration des lympl;locytes B de moelle dans la rate
-4.5 Maturation des précurseurs 5. Conclusions
..
CHAPITRE 3 Discussion générale
BIBLIOGRAPHIE ABBRÉVIATIQNS 1 • J . t • .~
.
----,
1 ~ ~.
,J
,.
.
.--
: i \1 ~ l, l' (, i,l ~ Il RÉSUMÉ..
,,
•
\, 1\.
La moelle osseuse gént!re un grand nombre de petitslymphocytes B. Les lymp~ocytes B nouvellement prod\lits
a
partir de p~écurseurs en prolifération passent par une~période
•
de maturation qui est accompagnée d'importants changements au .
,
"niveau des molécules exprimées à la surface des cellules et au
niveau de la réactivité aux mi togênes et aux antigènes., A une
étape de leur différenciation, les lymphocytes B quittent la
,
.
moelle et migrent vers les organes lymphoïdes périphériques,
particuliêrement 'la rate. Le passage de la mo~lle à la rate
pou,rrait être contrôlé géné.tiquement et dépendre dl une
propriété membranaire des lymphocytes, propriété exprimée â une
étape p~écise de leur développement. Afin de mettre en
évidence cette propri~té, nous avons comparé 1; efficac'ité dès
lymphocytes B et de leurs précurseurs à se relocaliser dans 'la
moelle Osseuse de receveurs irradiés. Les résultats de là
prése<>n~e étude montrent que les l,ympho,cytes B matures et l~urs
"précurseurs possèden~ des propriétés différentes de migration.
Comme les lymphocytes matures se relocalisent moins
efficacement dans 'la moelle osseuse que les plus jeunes, il
semblerait que leur émigra~ion so~t déterminée par ,une perte
d'affinité
~ou:è
'te tissus de, ,léi',moellePl~t~'
que par une .simple expulsion. ,
.
, 11
"1
"(
...
-,
REMERCIEMENT
',-.
'" 'Je voùdrais exprimer ma reconnaissance aux personnes
qui ont contribué
ârendre cette étude
p~ssible,spécialement
Au Dr. H. Goldsmith
~tiu Dé~artementde Médecine
(Université McGill)
"
Au Dr. Louis Lafleur pour son appui constant pendant
cette étude
"
Au Dr. Noëlla DesLauriers et Ginelle Mercier de
notre 9roupe de recherche
âl'Institut Armand
/ i'
Fràppier .
A Colette-Dufour pour son assistance technique au.
centre de Recherche de'-"'L
1Hôtel-Dieu de Québec
Au Conseil de Recherches
Méd~calespour son appui
financier
•
A
mes parents pour leur soutien copstant pendant
.
cette étude
ë - ~1
Et finalement
a~xOrs. A. Ford-Hutchinson et
J.Evans
de
~erckFrosst
~anada po~rleur appui pendant la
rédaction de ce mémoire.
\~J(
, / " , 1 .,
1•
';,
.
-1"'
,
« , ?,
-~-~ ----~~-Table des figures Fig.l Fig.2 - Fig.3 Fig.4 , ,Fig./S Fig" ~ Fig.7 Fig.8 J ! ~ Fig.9 Protocol~ expérimental (. li>
Cinétique de la réponse en PFCTIgM des cellules de rate st1mulées par le LPS
Effet de l'irradiation léthale des souris sur les lymphocytes B et la cellularité de la rate
Récuperat10n des lymphocytes B dans 'la moelle
et
la
ratet.dcs receveurs en fanct10n du tempsaprês l'injection de cellules de moelle
"-ProfUs de sédimentation des lymphocytes B
et des précurseurs
...
1
"Cinétiques de l~' activité des lymphocytes B de la
moelle osseuse chez les receveurs de petites
...--cellules de moelle
,
Cinétiques de l'activité des lymphocytes B de la
rate chez les receveurs de petites cellules de 1
moelle
Réapparition de l'activité des lymphocytes B dans
la moelle'osseuse chez 1es r~ceveurs de grosses
cellules- de moelle
R~apparition de l'activité des lymphocytes B dans ,
la rate che~ les receveurs de grossè s cellules de
moelle L)
1
Il ; p. 16 p. 19 p. 23 p. 34.
p .. 36 ,/il p. 38...
p. 3,9 p. 41 p. 42\ ' J 7 t
--
-~••
f Table de tableaux Tableau 1-Tableau 2 Tableau 3....
Tablea.u 4 Tab1eau 5 ,Tableau 6 , , ri )Effet synerqistique .de l'addition de l'extrait
d'agar sur les cellules stimulées par le LPS P·21
Récupération des lymphocytes B et des cellules
de/ rate après l'injection â des receveurs P·26
...
Récupération des lymphocytes B de la rate
après 1 'inj~ctl.on de cellules de rate à des
recè-veurs irradiés 48 heures plus tôt P·28
Récupération de~ lymphocytes B après l '
injec-tion de cellules de moelle p.30
,
Réponse polyclonale des cellules de moelle normale
en présence de cellules de moelle et de ra~e âe
souris irradiées
Récupération des cellules de moei~e
•
"
•
,•
t! " "-P·31 P·32 , 11J
..
.' ~.J..
11,
.
• ",..,
/.
" PréfaceLes lymphocytes B ont une espérance de vie courte s ' i l s ue son~ pas activés par un antigène et doivent donc être continuellement p!(odui ts il partir de précur"seurs. Chez les 'souris adultes, les" lymphocytes B sànt
produ~
ts
dans la moelle ~ osseuse où H's complète~t la majeur~ partie de leur maturatlon,et migrent 'subséquemment vers la rate et les organes lympholdes périphériques où ils expriment leur compétence; ,
Cette dernière ~tape, le passage de la moelle â la rate, semble se produire, seulement à une étap~- avancée de la différenciation des lymphocytes. Si l'émigration ne se prpduit pas au hasard, elle pourrait résulter de l'expulslon
progres-~~ ~ ~
sive des lymphocytes h?rs d'un compart~ment de la moelle, ou'
, .t'
bien elle pourrait être sous contrôle génétlque et dépendre d"une propriété intr~nsèque des lymphocytes .
Cette proprlété pourral. t se manifester par
l'expres-1
sion ou la ; dlspa.cit~on de molécules à la surface des cellules.., cé qui "représenteral t
de matùration dans le
t~nce.
/~-v
un marqueur pour une des dernières étapes
f •
p:roceJsu~ de l' express~on de leur
compe-Ce mémoi!e présente les résultats d' expér iences qui avaient pour but de m~eux 'comprendre cette dernlêre étape de différenclatipn des lymphocytes B.
~ "
Dans le premler chapltre, tious allons revoir brlê-vement les études qUl ont établl' la relation. directe entre ~a +ymphopoièse et l'hémopoièse, suivi d'une description de
,
"'"
l ' ontogénèse .des lymphocytes B et de leur régénération,,'chez la
• _ . ':. ocr
souris adulte. Dans' la quatrième partle de l ' lntr.oduct~'on, nous
r
•
~résentons différents systèmes eXpérime~taux de l'étude
fonctionnelle de la différenciation des lymphocytes B (Chapitre
1
1.4A, 1.4B). Enfin, nous présentons certaines .hypothèses
v
concernant les mécanisme~ qui contrôleraient la formation et, la
'-J matura t~on des lymphocytes B chez l ' adul te (chapi tre 1. 6) .
Dans la part~e expêrimentale, nous décrivons le système
"
,
utilisé '0' les expér~ences témoins' fai tes pour le valider et les
résultats obtenus (chapitre 2). 'Après une discuss~on
spécifique aux résultats, nous présentons une dtscussion
générale sur les dernières étapes de maturation des lymphocytes B (chapi tre 3).
..
.
'•
,.
\
l
•
•
-l
Chapltre l
Introduction
1.1 Lymphopoièse et myelopoièSQ.
L'exlstence de cellules souches communes à toutes les cellules sangulnes a été présumée depuls longtemps même Sl la preuve formelle de celle-ci n'a été a~quise que graduellement et relativement récemment. Il est malntenant bien établl
qu'une cellule souche hématopoïétique plurlpotente peut, après une période suffisante, regénérer le système lymphoïde de même que le système myélo1de, lorsque injectée à des receveurs irradiés (Metcalf et Moore 1971: P~lllips et al. 1977).
La relation entres les cellules souches pluripotentes et les cellules myéloïdes et lymphoïdes a été étudiée avec des cellules marquées cytogénétiquement (Abramson et al. 1977; paige et al. 1981). Dans ces études, on a mis en évidence des cellules souches pl~ripotentes, des cellules souches capables de se développer en érythocytes, granulocytes, macrophages et mégacaryocytes (cellules souches myéloïdes) et des cellules souches restrelntes à la ligne lymphocytalre T.
Le développement d'~ssals ln vitro, tels la formatlon de colonies, et les cultures de cellules à long terme, a permls de démontrer l'exlstence de cellules souches unipotentes, des cellules restrelntes à une I1gnée de différenciatlon (Metcalf 1977a,b; Tlll et McCulloch 1980). U~e cellule souche
restrein-te à la 11gn~e lymppocytalre B a ëté mlse en évidence récemment
,
par Kurland et al. (1984), dans un système de culture à long terme.
,
f j )-
.
, ~"
,
2
Donc, les cellules ~ouches plurlpotentes,
caractérlsées par leur capacité d'autorenouveilement et leur potentiel dej dlfférenciatlon, générera lent des cellules souches
plus restrelntes dans leurs VOles de dlfférenclatlon (ex. cellules souches myéloïdes), ces dernlères donnant naissance â des cellules restrelntes à une Ilgnée de dlfférenclation.
1.2 Développement ontogénlque des lymphocytes a.
Des populatlons morphologlquement et fonctionnel-lement dlstinctes dos lymphocytes a ont été placées dans une séquence développementale selon l'ordre de leur apparition pendant l'ontogénie.
-Les lymphocytes B sont premièrement détectés pendant l"ontogénle aux sltes de l'hématopolese générale tels, le foie
.,
et la rate (Owen et al.1975, 1977; Andre,,· et Owen 1978).Chez la sourlS~ les premlêres cellules morpholo-giquement caractérlsées de la lignée lymphocytalre B
appa-4
ra~ssent dans le foie vers les lliême et 12ième jours de , ,
gestation (Raff 1977). Ces cellules sont de grosses cellules en prolifératlon (Owen et al. 1977) qui possèdent une falble
, +
quanti té de chalne lourde)J dans leur cytoplasm~ (cp )
(Burrows et al. 1979; Siden et al. 1979),mais qUl n'exprlment pas d'lmmunoglobuline à leur surface (s)l-)(Raff et al. 1976). Les cellules Pré-a, cp + s)J-, sont par la SUlte présentes dans la rate (~31ême Jour) et la moell~ osseuse (141ême jour J
(Andrew et Owen 1978). De 1 à 2 Jours après l'apparltion des grosses cellules Pré-B, des petites cellules pré-a,
cp
+ sp-, au repos, sont détectées dans ces dI'9a..n.~:. (Owen et al. 1976,,
•
'-
"...
1977; Andrew et Owen 1978). Les premières cellules B s I9+ apparaissaient dans le foie fétal vers le 16ième jour de
3
.; + gestation, soit de 4 à 5 Jours après les cellules pre-~ cp
sp~ (Andrew et Owen 1978; Raff et al. 1976).
Des études fonctIonnelles combinées à l'ut~lisat~on d'antIcorps monoclonaux ont démontré que des précurseurs I9-, différents des cellules souches plur~potentes et'des cellules souches myéloïdes sont présentes dans le foie fétal (pa~ge ~ ~. 1981; Kincade 1981, Klncade et al. 1981). Ces cellules peuvent se dlfférenclcr, chez les receveurs irradlés en lympho-cytes B formant des colonies ln vitro. L'existence de d~ux
populat~ons de précurseurs S1g- a été suggérée p'ar ces
expériences.
Des précurseurs lmmédiats des cellules B ont été, dé~ectés dans le fOle fétal dès le 13ièrne jour de gestation. Ces précurse~rs requièrent une pé~ioqe de maturatlon de 6 à 7
jours chez les receveurs irradiés pour répondre in VlVO à une stimulatlon antigénlque (Phl11ips et Melchers 1976), 'et ils ré-pondent tardlvement à une stimulatIon LPS ln vltro (Melchers 1977.a,b).
Les lymphocytes B fonctionels qUI répondent immédia-tement à une stimulation antigénique in vit~~ (Phil11PS et
,
.
Melchers 1976) de même que les lymphocytes B formant des colo-nies (KIncade et al. 1976) sont présents dans le fôie fétai dès le l6ième Jour.
Les lymphocytes B réactifs au LPS, répondant en 5 jours par formation de PFC-IgM ln vitro, ne sont détectables dans le fOIe et la rate qu'à la naissance (~elchers 1977a,bi
l '
1
\ '
r
--(
J 4
Melchers 1979). Les lymphocytes B répondant en 3 jours à une stimulation antigénique in vitro ne sont ainsi détectés dans la rate qu'A la naissance (Rosenbûrg et Cunningham 1976).
Of
Au moment où l'hématopoïese cesse dans le foie, les
,
.
cellules Pré-B et les lymphocytes B dispara~ssent au~sl de cet organe (Cooper et Lawton 1979; Melchers 1977a,b; Ph1111pS et Melchers 1976). pendant la V1e adulte, la moelle osseuse
devient le site act~f de la format10n des lymphocytes B (Rosse 1976; Osmond 1980; Landreth et al.1981ù).
1.3 Formation des lymphocytes B chez l'adulte.
Des études extens1ves de cinétiques des cellules
1ym-phoide chez l'adulte ont révél~ que la moelle osseuse produit et expôrte un grand nombre de petits lymphocytes (revue Osmond
8
1975; Rosse 1976). Environ 10 pet1t,s lymphocytes sont
produits chaque Jour dans cet organe (Osmond 1975). Osmond et Nossal (1974) ont montré qu'environ 50% des pet~ts lymphocytes de l~ moelle expr1maient une quantIté varIable ma~s détectable
d'Ig de surface.
,
,Des études d~ c1nétlques comb~nant l~ marquage de DNA et l'Identlf~cation des cellules avec des ant1-Ig
(125I-anti Ig, immunofluorescence ou rosett·e) ont démontré que
....
âe grosses cellules Ig- en prolifération généralent de grosses cellules Pré-B
cp+sp-
(Landreth et àl. 1981a). Les pet~tsr
lymphocytes nouvellement formés acqulèrent sIgM au cours d'une
•
période de maturat~on post-mitotique dans les 3 à 4 premiers jours suivant leur- formation (Osmond et Nossal 1974; Yang et
!le
1978; Landrethret al. 1981ai Yoshlda et al. 1984), la densité de ces moléculès à la surf~ce des cellules augmentant•
-,
!
r
-avec l'âge (Osmond ~t Nossal 1974; Yang et al. 1978). Ces études suggèrent fortem;nt une relation parent-fille entre les grandee cll1ules pré-a> les petites cellules Pré-B et les pètits lymphocytes B. De plus, L'élimination des cellules· en prolifération chez les souris traitées à la cyclophosphamide est suivie par la réappari~ion des grandes ce~lules Pré-B, de l A 2 jours plus tard par celle des petits Pré-B et suivie 3 jours après, par les lymphocytes B (Burrows et al. 1978).
Les lymphocytes B nouvellement produ~ts quittent la moelle pendant· leur période de maturation ct ~igrent vers la rate (Osmond 1979). Les lymphocytes B pourraient quitter la moelle sans rr901r acqu1s ~eur maturité en récepteurs, pour-suivant leur maturation qans la rate (Ryser et Vassali 1974: Osmond 1975; Yang et al.1978) après quoi ils migreraient vers les organes lymphoïdes.périphériques (Osmond 1979).
1.4.1 Etude fonctionnelle de la formation des lymphocytes B.
Les lymphocytes B sont fonctionnellement définis par leur capacité de répondre à une stimulàtion par un antigène ou par un m1togène en produisant des cellules sécrétr1ces
d'anti-•
corps ou d'immunoglob~lines. Dans ce contexte, les précurseurs se caractérisent par l~ur besoin d'un période de maturat~on ~ vivo (Lafleur e~ al. 1972; P~~llips et Melchers 1976; paige et al. 1981) ou ~n vitro (Melchers 1977a,b; Lau et al. 1979: Des1aurlers et al. 1980, 1982; Kincade et al. 1981) avant de répondre à ces stimulat1ons. l
1.4.1 Etudes 1n V1VO.
.
.
Lafleur et'fal. (1972) ont été les premiers à mettre
.,
•
.
,(
1
6
l'
en évidence dans la moelle et la rate une population de
cellules qui requièr_ent une période de maturation de 6
â
7jours chez les receveurs pour répondre à une stimulation a~ti
génique in viyo. Dpns le même essai, les petits lymphocyteS B
répondent immédiatement à la stimulation antigénique. Les,
cellules Pré-B ain~i définies sont des grosses cellules dont ~a
maturation est Inhibée par des anti-Ig (Lafleur et al. 1972).
i 1
, /
Kincade et ses collaborateurs ont identifié des
popu-lations de cellul~s qui peuvent restorer chez les souris
immùnodéficientes la population de lymphocytes B formant des
colonies in vitro (Kincade 1981; paige et al. 1981). ces.
+
cellules ne sont pas.Ig et ne sont pas associées de près au~
cellules souches pluripotentes et aux cellules souches
myéloldes (paige et al. 1981). Une de ces populations définies
par des anticorps monoclonaux génère les lymph9cytes B (CFU-B)
pendant une période allant jusqu'à 6 semaines après l'1njec~ion
des bellules (Sincade 1981). L'autre popul~tion est associée
aux cellules Pré-B Cfl+ sp
(Landr~th
et al. > 1981b) etrespon-sable de la génération de lymphocyte~ B au cours deslO
premiers jours suivant l'injection des cellules aux souris
immunodéficientes (Kincade et al. 1981: Kincade 1981; paige et
al. 1981).
,
-Rusthoven
et~iPS
(1980) ont suggérél'ex~stence
de cellules prépré-B d'après les cinétiques de fegénération des
cellules Pré-~ et des q:::ellules B chez les souris traitées 'à
Î.
l'hydroxyurée .
.
;Burrows et al. (1978) ,ont montré que les cellules
Pré-B il' étaient pas' affectées par le traitement des sourlS avec
des anti-IgM même si le développement des lymphocytes B était
1.
,
(• 1
..
empêChé et que les cellules pré-B gardaient leur potentiel de
différenciation en lymphocytes B réactifs au LPS in vitro.
En résumé, ces études ont permis de mettre en
é~idence 3 populations de précurseurs soient, des cellules
préPré-B, peu matures; des cellules Pré-B sIg- ~t des cellules
+
B immatures sIg • '
1.4.2 Étude,~n vitro. (~J
",
Lau et al. (1979) on,t mon~ré ~e de grail'd~.s , cellules de moelle peuvent maturer en 4 à 5 jours de culture
iÏ\
vitro en cellules capables de produire une réponse en PFC-IgMap\~s
5 jours de stimulation par le ·LPS. Une analyse de la cinétique de maturation de ces précurseurs a indiqué que les grandes cellules se Différenc1aient premièrement 'en cellules de taille interméd1aire et finalement en petites cellules (Lau et al. 1979) .Deslauriers et al. (1982b) ont mis en éVldence de grandes ce~lules de moelle en prol1fération, cer~aines expri-mant sIgM et d'autres pas, ces cellules répondant tardivement à
+
une stimulation par le LPS in vitro. De grandes cellules sIgM répondant en 5 jours de culture à une stimulation LPS en
présence d'extrait d'aga~) (EA) ont qussi été identifiées dans ces cultur~s de cellules de moelle (Deslaurie~s et al. 1982b) •
••
/ " , t1 7 ,-, , J ,-,
Kincade et al' (1980) ont démontré que les cellules de
moelle qui génèrent en 48 h in vitro des lympho~ytes B formant
des colonies (CFU-B) sont des qr~ndes cellules sIgM-.
c:smond et al,.. (1984) ont montré qué les cellules
pré-B
PNA + précédement associées aux cellules cp + -sp
(Osmond etOwen. 1984) génèrent des lymphocytes B réact~fs au LPS, les
petites cellules maturant rapidement (l, à 3 jours) et l~s
grandes cellules pouvant soutenir la production de lymphocytes B jusqU'à 8 jours in vitro.
Howard et al. (1978) ont identifié une population de
grandes cellules SIgM+' en prolifération qui répondent en 8
jour$ à une stimulation antigénique in vivo alo~s qUe ,les
peti~s lymphocytes B répondent en 3 jours à une stimulation antigénique in vitro.
Klinman èt al. (1979) ont aussi décrit des
+
lymphocytes B sIg dans la rate de sour~s adulte, ces cellules
~
maturant en 24 h ln ViV~~
En résumé, les études in vitro ~nt permis de
caractériser fonctio~nellement les grosses cellules Pré-B, une
populatlon de grosses cellules de moelle qui requiert une période de maturation de quelques jours. pour exprimer les
caractérlstiques fonctionnelle1 de~ ly~phocyte~ ~ matures 'et de
, +
.mettre
ery
évidence une population de grandes cellules sIgM ,'ce~
ceillules, immatures' étant présentes clan;' la moelle et" la /rate des sOQris adultes.
.t , 1 \ ( , 1 8' se
·
, .' 1,.
..
91.5 Régulation de la formation des ,lymphocytes B.
~
."
Les mecan~smes qui contrôlent la formation et la maturation des lymphocytes B sont peu connus. Les lymphocytes
B
ont une vie courte (48 à 72 hl à moins d'être activês par un antigène. (Freitas et al. 1981). Le nombre total: de lymphocytesB est maintenu à un niveau stable, la production balançant la perte (Osmond 1980).
Il est généralement accepté q~e les éléments
(cellules, matrice) à l'~ntér~eur des organes hématopolétiques sont essentiels au soutien et au contrôle de la format~on et de la maturation des cellules hématopolétiques (Fl~edner et Calvo 1978; Cline et Golde 1979; Trentin 1978; Kincade et al. 1981: Osmond' et al. 1981).
La production de. lymphocytes B ne semble pas être contrôlée par l~ populat~on des lymph~cytes B matures 'comme 1 '-indique la production normale de pet~ts lymphocytes' chez les souris tra~tées avec des antilU (Osmond et al. 1981). La
- "
production des lymphocytes B ne semble pas non plus être sous le contrôle des. facteurs thymiques ou des cellule~ T (van
Muiswinkel et ai. 1975; Osmond et al. 1981). Ii Des' études
compa-ratives de la product~on de lymphocytes B ~hez les souris axénique's et chez les souris stimulées avec un antigène ont révélé un n~veau basal de production contrôlé par des facteurs
locaux (Osmond.~t al 1981). Le taux de production des
lympho-~ytes B .serait normalement stimulé non spéc~fiquement lPar des
facteurs de l'environnement v~a des facteurs ~ocaux (Fulop et Osmond- 1983a, 1983b). Une ampolific'ation non spéc~fique des clones de'lymphocy~es B dans la rate a aussi été proposée par
\.
1
, '
'.
\
,
Howard e~ ses collaborateurs (Howard et al. 1978~ Shortman ~t
Howard 1979). plusieurs,résultats indiquent que les
macro-phages seraient responsables.ae la production des facteurs
.
10
locaux non spécifiques (Shortmàn et Howard 1979; Kincade et al. ,_
/ ~981; Fulop et Osmond 198~b).
1.6 Conclusions,générales.
"
Les lymphocytes B originent des cellules souches
pluripotentes. Ces dern~ères,donnent naissance à des cellules
70uches plus restreint~s dans leur potentiel de
différencia-,tion. Chez la souris adulte, comme p~u de cellules souches
sont normalement, en proliférat~on, ,lès lymphocytes B, comme les
autres cellules hématopoïétiques, sera lent regénérés à partir,
de.cellules souches unipotentes (Quesenberry et Levitt 1978).
Plusieurs populations de cellules de la lignée des
lymphocytes B ont été définies: de grandes cellules 19-, en
prolifération; des grandes cellules Pré-B, c.)l + S)l qui
acquièrent sIgM et la réactivlté à dlfférents mitogène&
~ns
les premiers jours (1 à 4) suiv.ant leur formation; de grandes
cellules SIgM+ en prolifération qui sont présentes dans la
moelle et la rate de~ sourlS adultes et qui pourraient
repré-senter une étapé intermédiaire entre les-Pré-B et les lympho-cytes B exprimant différentes combinaisons de marqueurs de
surface et poss~dant différentes réactivités aux m1togènes.
Les petlts lymphocytes B produits dans la moelle n'y demeurent que quelques jours après quoi ils'migrent dans la
rate où ils résident de l à 2 jours avaht de poursuivre leur
migration vers les organes' lympholdes périphériques (Yoshida et
Os'mond 1978; Osmond 19799.
\ '
) ,
.
\..
,
r Chapitre 2 " ,....
2.0 Mi ~a~on différentielle précurseurs dans la rnoel i,.rradiées."
B et de leurs les souris
11
Chez lajouris adulte, les lymphocytes B, à cause de leur courte pério
pe
survie, sont cont1nuellement regénérés dans la moelle osseuse et exportés ve~s les organes lymphoïdes pérlphériques. L'étape de maturation des lymphocytes B carac- . térisée par l'émigration de la moelle n'est pas blen déflnie.( ~
..
Des expériences de marquage in vivo des petits lymphocytes de moelle avec des marqueurs radioactifs ont lndiqué gue plusieurs petits lymphocytes quitta~ent la moelle rapidement, peu
d'heures (12 h) aprèsf leur formation (Brahlm et Osmond 1976) et
il a été suggéré que les lymphocytes B q~ittaient la moelle au hasard au cours de la pér10de rde maturat10n postmltotlque'
(Osmond 1979). D'autee part, plusleurs études ont suggéré que la migration des lymphocytes B était dépendente du dévelop-,pement de ces cellules (Ropke et Everett 1974; Strober 1975,
1977; Brahim et Osmond 1976; Yoshida et Osmond 1978). On peut supposer que les lymphocytes B qu~ttent la moelle àu moment où
ils acquièrent les propriétés nécessaires à cette migration. cette p~opriété peut être associée à l'expression de molécules â la surface des cellules et pourralt ca~actériser les lympho-cytes B matures ayant acquis un certaln potent1e~ fonctionnel.
/{
Les expériences présentées 1C1 avaient pour but de mieux comprendre cette étape de maturation des lymphocytes B ql,l' est ~eur passage de la moell,e à la raté. :pour ce faire, nous avons ut1l1Sé ~n sy~tème de transfert de cellules à des
'
..
i '. t "
-J f t/ 1 ( 12animaux, irradiés où la distributibn de populations de lympho-· cytes B entre la moelle et la rate a été déterminée, selon la source ou l'état de différenc~ation ~nit~al.
t:.
Les lymphocytes B ont été détectés dans un essai fonctionnel ln vitro, soit la stimulatl0n polyclonale et la mesure de la réponse en PFC-IgM produite par le? cellules stimulées. Les lymphocytes B matures 'sont caractérlsés par leur réponse à une stimulation LPS en 5 jours de culture
~ ,..--."..,
(Andersson et al. 1977ai Deslaurlers et al. 1980). Des
lymphocytes B ~mmatures peuvent être mis en éV1dence dans ce
~est par l'addition d'extrait d'agar aux cultures stimulées par le LPS (Deslaur iets et ~t. 1980, 1982b),. La dlfférence entr.e la_réponse des cellules à ,une stimulation LPS et la réponse à une stimulation LPS+EA permet de déterminer le degré de
"
"ma~urité des ~opulations ?e lymphocytès B (Deslaurle~s et al.
1980, 'l982b). En effet les précurseurs des lymphocytes B 'ne répondent pas ~mmédiatement aux stimulations polyclonales in
- ,
vitro mais peuvent le-faire après un période d'incubation de quelques jours in vivo ou ln ,vltro (paige et a1.l979, 1981; Kincade 1981; Deslaùriers et al. 1982a).
~Les caractérlstiques des lymphocytes B répondant dans
;l"
le test fonctionnel sont présentées au chapitre 2.2.1.
,·Les propriétés de migration des populations de lym-phocytes B ont été étudiées après l'injection de cellules de la
~at-;'
etde
la moelle(C~j
tre, ,2.2. 3.~.
2.2.4). _ Les populations de lymphocytes B matures et depricurseurs peuvent être sé~arées physiquem~nt selon la taille des cellules. Les lymp~ocytes B matures sont des pet~tes
.'
/
l'
13
~ellules et les précurseurs des grosses cellules (Lafleur et al. 1972: Phillips et Melchers 1976; Deslauriers et al. 1980;
-
-Osmond 'et al. 1984). Les propriétés ,de migratlon des
lymphocytes B matures et de leurs précurseurs ont été étudiées respectivement chez les receveurs de petites et de grosses cellules de moelle(Chapltre 2.3.1 et 2.3.2).
2.1 Matériel et Méthodes A
->l
2'.1 Animaux
Des souris mâles C~H/NrIBr et BD~ de 7 à 15 semaines, achetées des Fermes et Laboratoires Canadiens d'Elevage Ltée '(St-Constant P.Q.), ont ét~ gardées sous une hotte à flux laminalre. Des rats Sp~ague-Dawley (F~mes et Laboratoires Canadlens d'Elevage Ltée) des deux sexes et pesant entre 50 et
200 g ont été utilisés comme donneurs de cellules du thymus.
2.1.2 Irradiation
Les souris ont été irradiées totalement avec 950 rads en utilisant un appareil Phillips â irradiatlot\ à 175 K,f e;... ,1
15 mA avec ~n filtre d'aluminium de O,5mrn. Le taux
d'lrradl-ation étalt de 35 rads/mip.
,
2.1.3 Préparation des suspensions de cellules
Les suspensions de cellules de rate-ou de moelle os-seuse de sourlS et du thymus de rat ont été préparées dans un
solutio~ .,·s'lline balancée Ear,le (EBSS) (Glbco) â la température de la pi~. Les cellules ont été lavées trois fois dans le EBSS. La viabillté des cellules a été déterminée par la métho-de d'excluslon du bleu métho-de Trypan.
/
/" /
,
14, Les cellules uti~'Sées dans le test des lymphocytes
&
ont été diluées à la conce tration appropriée dans le RPMI 1640(Gibco) ou dans le milieu
e
Dulbecco modifié par Iscove (Gibco) additlonné de pénicillin7
(5000 unités/ml), de strep-tomycine (500 ug/ml) (Laboratoire Flow), de 18% de sérum de veau fétai (Laboratolre Flow), de 2-mercaptoéthanol (5 x 10-5 M) et de 10mM d'HEPES (dans le RPMI 1640).
2.1.4 Essai des lymphocytes 8
La présence des lymphocytes B dans les suspensions de cellules de rate et de moelle osseuse a été vérifiée ln vitro par la stlmulation polyclonale. Les cellules sont mises en culture à 5 x 104, 1,5 x 105 ou 5 x 105 cellules / ml comme indiqué à chaque expérience. Des cultures tripl~s de 0,1 ml'
-,
ont été préparées en mélangeant des volumes égaux de cellules d'essai et de cellules de thymus de rat (4 x 106 cellules/mIl et 0.01 ml d'extrait d'agar (EA) (50 ug/ml flnal) (Klncade ~ al. 1976) et/ou de LPS (E. Coli 02686 Difco) (40ug/rnl final). Les cultures ont été incubées dans 10% CO
2' 7% 02'et 8% N2 dans des boites hurnidlfiées et gardées à 37° C.
~es cellules sécrétant des IgM (PFC-IgM) ont été détectées par la méthode de Jerne modiflée par 'Molinaro et al.
(1975). Des globules rouges de mouton ont été enrobés avec des anticorps de lapin anti-IgM de souris en utLlisant le CrC1
3 ~ (Golde et Fudenberg 1967). Les cellules récupérées des cul-tures ont été incubées avec les glob~les sensibillsés dans d'agar ose à 370 C dans des boîtes de Pétris de 35 mm. Un antisérurn de lapin anti-IgM de souris a été ajouté et 1'incubatl0n s~~t poursuivie pour-l heure après quoi le complément de cobaye a été aJouté po~r l heure .
..
75%
•
"
\
2 . 1. 5 _E_s_s_a_i_[_· _'
~
__ c_e_l_l_u_l_e_s_m_a_r_q ... u_é_e_s __ a_u_51-Chrome15
L'essal des cellules'marquées au 51-chrome a été ef-fectué selon la méthode de Bainbridge et Gowland (1966) et Zatz et Lance (1970). Les cellules en ~uspenslon ont été
mar-51- 8
quées avec 25 ~Cl Cr/10 cellules. Les globules rouges ont été élim1nés ~ar une expos1t1on brève à une solutl0n
hypotonlque. Après le marquage des cellules, le nombre de cellules dans la suspension a été aJusté à 2 x 106 cellules vlables par ml et 0,5 ml a été injecté par VOle intravelneuse à des souris lrradiées. Deux et 24 heures après l'lnjection, la rate et les fémurs des receveurs ont été' prélevés et la,
radioactlvité de ces organes mesurée. La radiactlV1té récupérée des organes a été ex~rirnée en pourcentage de la G
radioactivité d'un échantillon de eellules marquées pris au moment de l ' inj ection.
2.1.6 Protocole expérimental
Le protocole expérimental est présenté à la figure 1.
Un ou 2 x 107 cellules de rate ou de moelle ont été injectées à des groupes de souris 2 â 4 heures après l'irra-diation. A un temps donné après l ' inj'ection, la moelle (2 fémurs) et/ou la rate sont prélevées et la présence des lympho-cytes 8 vérlfiée dans l'essai des lympholympho-cytes B invJ. tro.' On' assume que le nombre de PFC-IgM mesuré après 5 Jours de culture est proportlonnel au nombre de lymphocytes B présents dans la suspensio? analysée. La fractlon des lymphocytes B récupé~ée dans un organe est calculée en di visant l' actl Vl té totale de
l'organe par l'actlvlté totale ln]ectée. L'actlvité par cul-ture a été extrapolée à la moelle femofale ou à la rate.
,
"
TRANSFERT DES CELLULES
}
~ .
CUL TURE DES CELLULES
ESSAI DE PFC IgM
,
PROTOCOLE ~PERlMENTAL
( Cellules de moelle ou de r.te
( 950 rads)
jJ
OOOQo
o
-1)o
~
TEHPSG
l
5 jours CELLULES RECUPEREESl
p~c-rgM/ CULl'DRE ~ Stimulnion mi togdnique ,16 ),-•
-
c t...
1
---17
Les témoins consistent en cellules de moelle et de rate de souris irradiées et non reconstituées, et de souris normales. Le pourcentage de récupération des lymphocytes B injectés est calculé selon la méthode de $~m~novi tch et al.
(1963). L'activité fémo~ale a ét6 extrapolée â la moelle osséuse totale en util~sant la donnée de Cherven~ck et al.
(1968) qui ont est~mé (Ille un fémur contient 5,9% de la moelle totale.
2.1. 7 séparat~on des cellules par sé4~meritation à un 9
Les cellules de moelle ont été séparées par séd1men-tation à un 9 comme décr~ t par Miller et Phillips (1970) et modifié par Deslùuriers et al. (1980). Après une sédimentation de 4 h à 40 C, '5 fract10ns ont été formées selon la v1tesse de .\ -sédimentation des cellules: Fraction A (s::::: 2,3-),3 mm/hl,
~ fraction B (s
=
3,3-4,3 mm/h), fraction C (5 ::0; 4,3-5,3 mm/hl,Fract~on 0 (s
=
5,3-6,3 mm/hl, Fract~on E (s=
6,3-7,3 mm/hl. Dans les exp~riences de reconst~tution, un volume f~xe de ,chaque fraction a ét6 in] ecté à des groupes de receveursirradiés, chaque souris-recevant 1/26 d'un fraction part~cu
liêre, (25 sour1s/fract1on + 1 témo1n jour 0 l'.
+
2.1.8 El1mination des cellules
sIgM-+
Les cellules sIgM ont été éliminées par adhérence sur des pétrJ .. s recouverts cl,' ant.:.corps purifiés ant~-IgM de
J 1
souri-s selon la méthode de Wyso-::ki et Sato (1978). Après deux passages sur les Pétr1s anti-IgM, les 4'cellules non adhérentes
o~t
été récupérées et diluées dans le milieu dec~-"lture ~
la concentration appropriée selon la concentration initiale des., cellules. " -, --, , , e'.
(.
~: ,<, 9
1.82.1.9 Essai de dilution limite pour-les lymphocytes B
La fréquence des lymphocytes B réactifs au mitogène LPS et à LPS+EA a été déterminée selon l'essai de dilution !imi te décr i t par Andersson et al. (1977).
2.2 Résultats
2.2.1 Essa]. des lymphocxtes B
Dans les condl.tion~ de cu1.ture décrites à la section p-récédente (Matériel et MétHodes) la réponse polyclonale en
, 1
PFC-IgM des cellules de rate stimulées par le LPS est maximale .au jour 5 de culture (~ig.2) .
La réponse en PFC-IgM des cellules de rate et de moelle stimulées par le LPS est augmentée par l'addition d'extrait d'agar (EA), (tableau 1). L'extrait d'agar seul n'induit pas la production de PFC-IgM même .après 9 jours de culture (résultats non présentés).
tI '
Par l'analyse de dilution limite nous avons déterminé la fréquence des cellules de rate et 'de moelle qui répondeht â la stimulatl.on par le LPS et à la stimulation par LPS+EA en produisant des PFC-IgM en 5 Jours de culture. Les résultats indiquent qu'environ l cellule de moelle sur 90 est réactive au LPS et enVl.ron l cellule sur 55 eGt réactive à LPS+EA chez les
1 souris BDFI (t:ableau 1). Dans la tat,e, la fréquence des
cellules réactives à LPS+EA est de 1. çell uie sur 9 (tableau 1.). "
, -,
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F1IUre 2 , 1061
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l 2 3 7 8 9J ours de cul ture
•
Figure 2. Cinétique de la r~ponse i~ vitro en PFC-IgM des cellules de rate stimulées par le LPS.
Moyenne géométrique de ,3 cultures
~
2 x 103cel~
Iules1
culture) pour ohaque point.Souris C3H/NrBIr. -".
.
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i9 \•
.' -,)
•
.
, " 20 ..
''La ntajprité des -cellules' qui répondent dans le test'
fonctionnel adh~rent aux pétris prétraités avec'des anti"-IgM ,
(tableau 1). L'analyse de dilution limite a ~ndiqué que 94%
des cellules fonctionnelles de moelle adhèrent aux Pétris
anti~IgM. En supposant que 10% des cellules de moelle sont
+
sIgM (Andcrsson et al. 1977b~ Benner et al. 1981)j environ 1
cellule B sur 9 serait réactive au LPS et 1 cellule B sur 5
serai
t<~téacti
ve au LPS+ EA dans la moelle des sour1S BOFI.obtient des résultat.s similaires pour les cellules 'B de rate
On
supposant que 50% des cellules de rate sont
al. 1977b).
+ '
sIgM (Andersson
en et
c~s résultats indiquent que les cellules que nous dé~
tectons dans notré essai fonctionnel sont des lymphocytes B ,
+
sIgM. tes fréq4ences de cellules de rnqelle et de rate qui
sont"'réactives au LPS sont 'similaires à celles rapportées par
Andersson ét al. (1977b) et Benner,et al. (1981). \ " ' "
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l ' )~
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Tableau. lEs's~i fonctionnel des lymphocytes B
'Source des Mitogêne PFC-IgM/cu1.ture
" 3 cellule Mqel1e2 LPS 290
±
130 (5)1 Osseuse EA 0 LPS+EA 668 + 188 ( 5) l' -Rate 4 LPS 233 + 9S.(5) EA 0 LPS+EA 405 + 97 ( 5) Rate 4 LPS ' 390 ( 1) normale ,LPS+EA 513 (1) Rate 5 LPS 0 (1) sans B LPS+EA 15 (1) 1- -( nombre d'expériences \ Frêqüence des répondeurs 1/89 ( 3 ) 1/2500 1/55 ( 3 ) 1/19 ( l ) 1/9 ( 3 ) .!2- Culture de cellule de moelle ixl03
cellules}cultur~
3- Sour 1.S BDF l "
4- Culture de cellules'
de
rate' : 250 cellules / culture57 Cellules nonadhérentes après 2 passages sur des ~étris
)
,
,-, "
'li
,
2.2.2 Elimj,.nation des lymphocytes B par 1 ' irradiati~n léthale ~ des souris
Des exper~ences préliminaires ont permis de
détermiI':er la dose optimale ct 1 irradiation à ,950 rads. Cette
dose permet une survie de la majorité des souris jusqu'à 8
,
jours 'après l'irradiation et permet de réduire l ' activité des lymphocytes B endogènes à moins de 0,1%, de l ' actiyi té normale de la rate (fig. 3) et de la moelle (non présenté),
Les èinétique!:; de l ' activi té de lymphocytes B de la rate des souris irradi~es léti1a1ement' indiquent que les lympho"" cytes B disparaissent rapidement de la rate (fig. 3). Quatr,e heures après l'irradiation, seulement 0,08% de l'activité -normale LPS et LPS+EA était détectée dans la rate. L'activité continuai t de diminuer jusqu'au jour 5 après l'irradiation et augmentait àprês' le, jour 5 pour àtteindre un plateau à 0,02% de l'activité normale. La iéponse des cellules de moelle-aux
stimulations LPS et LPS+EA n'était pas significative (moins de 10 PFC/5xl05 c'ellules de 'moelle) 4 et ,24 h apr'ès' l'
~rradiation
et demeura1 t à m01ns' de 0,005% ,de la réponse normale de la moelle de 3 à 8, j ours après l ' irradiation. '~Le nombre de cellules viables dans la rate et la mùe11e diminuait, aussi rap~dement après, l'irradiation (fig. 3). De 4h à 3 jours après l ' l.rradiation,' le nombre de cellùles viables de la rate passait de 20% de la valeur normale ~ moins de 0,4% et demeura1t à moins de 1,0 % de la valeur normale
jusqu 1 au 8ième jour. La cl.n,étiq,ue de cel~ulari té de la moelle
~es souris irradiées et no~ reconstituées suivait un patron siml.laire (non présenté) .
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u.1-JOun après l'irradiation
Fi'gure 3. E·ffet de l'irradiation léthale des souris sur les lymphocytes B et la cellularlt~ de la rate.
• 1
Activité LPS+EA mesurée au jour 5 d~ culture,
Culture 5 de ce Il ules de ra te ( 2,5 x 103 ) de sour is
C3H/NrBlr.
Moyenne de 3 à 6 expériences.
La viabilité des cellules a été déterminée par le test d'exclusion du bleu de trlpan .
23
..
J-\
24En concl~siôn, l'irradiation à 950 rad~ permet
d'foliminer la majorité des lymphocytes B de la rate et de la . moelle (plus de 99,9%). L~ disparition rapide des ~ymphocytes
B permettra de détecter les lymphocytes ~ injectés aux receveurs et ceux prodults à partir des précurseurs chez l'hôte
.-2.2.3 Récupération des lymphocytes B lnjectés
Pour déterminer la proportion des lymphocytes B in-jectés qui se loge dans la moelle et/ou la rate des receveurs, des cellules de moelle ou de rate ont été lnjectées à des
souris irradiées. Deux et 24 heures après l'injection, l'acti-vité de lymphocytes B de la moelle et/ou de la rate des rece-veurs a été mesurée par le test in vitro des lymphocytes B. Les résultats sont exprlmés en pourcentage.
2.2.3.1 Récupératlon des lymphocytes B matures de rate
Un ou 2 x 107 cellules de rate ont été injectées
~
des groupes de 3 à 5 recèveurs lrradlés. Le pourcentage de récupération des lymphocytes B dans la rate a été évalué comme décrit ci-haut. Des résultats'èimilaires ont été obtenus pour les 'deux doses de cellules inj ecté~s. La moyenne des résultats de 4 expériences est présentée au tableau 2.~ prês de 13% des lymphodytes B injectés a été récupéré dans la rate des receveurs 2 h après l'injection. A 24h, on ne récupérait que 6% des lymphocytes B. Des résultats ldentlques ont été obtenus p~ur les deux stimulations polyclonales du test
fonctionnel. 1
/
Le pou.rcentage de récjération des lymphocytes B
\
(
_.r
-l/25
)l
~f '
"--J
diminuait de 50% entre 2h et 24h. Pendant la même période, le nombre de cellules viables dans la rate diminuait de ·75%
(tableau 2). Afin de
voir si
les cellules injectées dispa-raissent de la rate avec l'ensemble des cellules de l'hôte, desIl 1 d - SIc ' - i . t ' t l
ce u es e rate marquees au r ont ete nJec ees e e
pourcentage de récupération de l'activité SlCr a été évalué 2h et 24h après l'injection. La cinétique de l ' activi té 51Cr ne
su~va~t pas celle des lymphocytes B ni celle des cellules
'l.
viables de la rate. (tabl~au 2). ~
.'
o •
"
i"
Tableau 2
~écupération des ce~lules de rate dans la rate des
receveurs irradiés ESSAI .",. RECUPERATION ( % ) 2 h 24 \
\
Activité de \,
26 h LPS 12,6+
2,4 (4 ) 6,2!
1,1 (4) 2. lymphocytes 84 Activité 51 Cr LPStEA Cellules viables , (nombres) , témoin 13,4 + 3,2 (4).,
,
24,9 ! 2,8 (2}5 + 1,2 22 ~ 7% + 6, 3 - 0,'9 (4) + 25,1 - ,2,5 (2) '+ 6 3,0 - 2,0 x 10 i-4') + 5,6 - 3,7 %'1 - Récupération (%) de l' activi té des cellules inJectées
2 - ( ) indique les expé~iences
3 - Les essais sont décrits à la sect~on Matériel et Méthodes
4 - Culture : 5 x 10 4 cellules de rate / ml
5 - 5 souris/expérience:
Sour~s
C3H/NrIBr"
,
•
27
)
Puisque les
rés~ts
des expériences précédentesn'expliqu~ient
pas ladim~ution
del'act~vité
dans la rate des .' ,\:.".eceveurs, nous avons inject.é des cellules de rate à des sourispréirradiées' de 48 h (tableau 3). A ce moment, le taux de ~
diminution de la cellularité est faible et le nombre de cel-lules dans la rate est bas(f~g.3). Chez ces receveurs, nous récupérions 6,5 % des lymphocytes B 2 h après l'.injection et 2,5% après 24 h, soit une diminut~on de 60% des lymphocytes B récupérés.
, Les résultats indiquent que seulement une petite fraction des lymphocytes B matures se loge ~~alement dans la rate (2h) et que 50% de ces lymphocytes B disparaissent de la rate des receveurs dans les 22h qui suivent et ce indépen-damment de l'ensemble des cellules.
2.2.3.2 Récupération des lymphocytes B de la moelle
La proport~on des lymphocytes B de la moelle qui se logent dans la moelle et la rate des rfl~eveurs a été déterminée comme décrit à la section précédente.
"
Dans la moelle dés receveurs, moins de 1% des lympho-cytes B matures réact'ifs au LPS était récupéré l.ni tialement
(2h) {tableau 4). A 24 h, la récupératlon des lymphocytes B matures était de 3%. La rkcupération des lymphocytes B
réactifs à LPS+EA était .de 2,5% à 2 h et de 9% à 24h.
L'acti-)
v~té de la moe~le des receveurs à 24h éta~t toujours de 3 à 5 fois ~lus grande que celle mesurée à 2h pour les deux stimula-tions du test fonctionnel.
\
"
, Î \ 1.
Tableau 3
Récupération des lymphocytes B ,dans la rate de receveurs préirradiés de 48 h ) , 28 RECUPERATION (%) 2
n
24 h Activité LPS 5,4 2,1 Activité LPS+EA.., 6,0 2,5Ré"sultats d "une expérience. Souris C3HjNrIBr.
.
,
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)
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29 ~ •
Dans la rate de ces mêmes receveurs, environ 13% des lymphocytes B matures éta1t récupéré à 2h et à 24h après l'ln-jection de cellules de moelle (tableau 4). Pour les cellules détectées par la stlInulation LPS+EA, la récupération était de 16,5% à 2h et de 20% à 24h, différence gui n'est pas statisti-quement signiflcatlve.
L'actlvlté en lymphocytes B de la moelle des rece-veurs étal t plus falble que celle de la rate, partlcu~lèrement
2 h après l'inJection. Afln de VOlr Si les cellules lrradlées
de l ' hôte peuvent Inoduler la réponse in vitro des lymph~cyt.:!s
B, des cellules de moelle normale ont été mises en culture en présence d'un nombre_ croi~sant de cellules de mo~lle et de rate de souris préirradiées d(~. 2 h. et de 24 h. Les résultats
-présentés au tableau 5 indiquent que les cellules de l' hôte n'affectent pas de façorl signlficative la' réponse ln vitro pes lymphocytes B de la mo~lle normale.
• -<:>
Afin de voir si les cellules de moelle peuvent mlgrer dans la moelle des receveurs, nous avons inJecté des cellules d e moe Il e marquees au - 51 Cr et etermlne d- - 1 a recuperat~on - - , d e
l , acttvlte ' - 51 Cr d ans 1 a moe Il d e es receveurs. Comme on peut e 1 voir au tableau 6, enVlron 23% de l;actlvité 51Cr était
récupérée dans l~ moelle 2 h et 24 heure après l'injection des I l 1 - - , d I t d " , , - 51
ce u es. La recuperatlon ans a ra e e J. act1 Vi te Cr
était de 17%. Ces résultats indiquent que les cellules de
moelle'peuvent se localiser dans la moelle des receveurs. Nous avons aUSSi déterminé le pourcéntage de récupérat10n d'une autre population définie de cellules, les CFU-S de ,la moelle. Deux heur_es après l ' l n je ct ion, 9% des CFU-S était récupéré de la moelle et 13% dans la rate (tableall 6).
Q
'-'1
'"
•
o
30 "
Tableau 4
Récupérat~Qn- des lymphocytes B de moelle'
Organes du receveurl \... 1 , Activité de lymphocytes 82 LPS "kS+EA LPS LPS+EA pourcentage de
Récu~ation
2 h 24 h 12,7!
O,7(3)3 13 • 4 -+ 0, 6 ( 3) + 16,5 3,4(5) 20,1 + 4,8(5) Il ,2,9 + 2,3(3) + 2,6 - 1,4(4) 9,1 -+ 5,8(4)1- Souris C3H/NrIBr. 3 â 5 squris par expé~i~nce
~
2- Cul tu{e~
5 x 104cellule~
/ ml3- Nombr~. ,d', expériences
.
)"
•
, 31
Tableau 5
\
..
1 •
1
Cocultures de cellules de moelle et de rate de souris
irradiées avec des cellules de moelle de souris no+males3
Tl Q~antüé rclat1ve PFC-IgM/ culture 4
Cellules 1rrad./nor. LPS LPS+EA
Irra'd. Nor. 2 ~ Moelle Moelle 0 l 150 340 2 1 120 400 10 1 200 . 460 4 H Rate Moelle 0 l 150 340 2 l 215 350 '5 1 185 390 '- 10 ,1 145 330 Moelle Moelle 0 l 150 340 2 1 121 542 5 1 153 366 10 1 122 480 24 fi Rate Moelle 0 1 150 ]40 / 2 1 127 ~OO 5 1
ISO
290 " 10'--\
l 185 5801- Heures depu1s l t 1rrad1at10n
,-\
~f 2- 500 cellules 'de moelle normale par culture
3:- souris C3H/NrIBr
4- PFC-IgM mesurées après, 5 Jours de culture
\
Résultats" dfune'expérl.ence repr,ésentat1 ve
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32
Tableau 6
1Récupération
des~ellules
de moelle4
Receveurs
2
H~ération
(
,
)24 H
~SSAI Organes des,.
Activité Rate 18,4
51Cr
Mpel1e 24,4
Essa~s - v9i~ Matériel
et
MéthodesSouris C3H/NrIBr 5 souris/interval " , \ : i t
-,
+ - 2,0 16,5 + - 1,6 + 4,5 22~7+
~,2 -'. -..
d ·. l
-
.
33
,
2.2.3.3 Cinétiques de récupération des lymphocytes B
Avec une cinétique plus longue, on peut voir qu~ la proportlon des lymphocytes a,récupérée dans la moelle et la rate diminue
ent}c_l~s'Jo~rs J
et 3 suivant l'injection des cellules (fig.4). Le taux de diminution des ~ymphocytes Bpr~sents dans la moelle était de 0,6 et dans la rate i l était de 0,75. Entre le jour 3 et le jour S, l'actlvlté de la moelle augmentait alors qu'elle demeurait au même nlveaU dans la rate.'
Les cinétiques de cçllular~té de la moelle c~ de la rate 'des receveurs montralent une disparition plus raplde des ,cellules que Gelle des lymphocytes
B
(fig.4). Les résultatssuggèrent donc que les lymphocytes B disparùlssent rapldement . de la moelle et de la rate des receveurs et ce indépendamment
de l'ensemble des cellu~es de ces' organes.
1 \
2.3 Injection de sous-populations de cellules de moelle
Des sous-population de cellules de là lignée de diftérenciation ges lymphQCytes B peuvent être séparées
"
physiquement selon la taille des, cellules (Lafleur et al. 1972:
,
Phillips et Melchérs 1976; Des1auriers~et al. 1980).
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2 h l 2 3 4 5Jours apr~s le transfert
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Figure 4. Récupération ,des lymphocytes B dans la moelle
et
la rate 4es receveurs ~n fonctIon du temps apr~sl 'in je clion de cellules de moelle.
Cultures de 2,5 x 10 3 cellules. 3 receveurs ( souris C3H/NrBlr )/ jour. Moyenne de 2 expériences.
Les cellules vIables ont été déterml'nées par
exclu-~ion du bleu de trypan.
Carré vlde - activité de lymphocytes B dans la moelle Carré pleln.- ,cellules viables dans la moelle
Cercle - actlvi~é de lymphocytes B dans la rate-Rond - cellul~s viables dans la rate
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35
ÇJ
Les cellules de moelle ont été séparées selon leur vitésse de sédimentation à un 9 (Matériel et Méthodes). Cinq
,
-fractions ont été formées selon leur vitesse de séd~mentation (Fraction
A,s
Fraction C, s ""..
2,3 4, 3 3,3 mm/hi Fract~on B,s-= 3,3 - 4,3 mm/h: - 5~3 mm/h; Fraction D, s ~ 5,3 - 6,3 mm/hi Fraction E, s lymphocytes B fractions ont =: 6,3 a été aussi- 7,3 mm/hl. L'act~vité in~tiale des mesurée dans chacune des fract~ons. Les été inJectées à des 9roupes de receveurs 'irrad1és, chaque receveur ay~nt !eçu 1/26 d'une fraction
particuliare. L'activité de lymphocytes B de ln moelle de ~~s receveurs 11 été mesurée 12,5 Jours après l'lnjectl0n de~
cellules. Comme on peut le voir ~ la figure 5, l'activité
~nitiale de lymphocytes B était maximale dans le5 fractlons " (
de peti tes cellules (8 ~ 4,3 mm/h) alors qu'après 12,5 Jours d' incu-bation ~n V1VO, l'activ~té sc retrouvait dans,le~ fractions de grosses cellules (s > 4,3 mm/h). Ces résultats sont similaires à ceux rapport~s dans la llttérature (Lafleur et al. 1972:
Deslauriers et al._ ~980; paigc et al. 1979).
2.3.1 Fract~ons de pet~~es cellules
Les-résultats des expériences précédentes ont montrê que les lymphocytes B qu~ répondent imméd~atement dans le test
fonct~onnel sont en roajon,té des ~etites 'cellules (f1g. 5). Les cipétiques de réçur:>érat~on des lymphocyte,s B ont lridlqué gue les lymphocytes B disparaissent de la moe~le et de la rate'des receveurs quelques jours après leur injection (fig.4). Afin de suivre les lymphocytes B chez les receveurs sans la
complica-1 tion de l'arrivée. de nouveaux lymphocytés produits par les précurseurs, nous avons injecté d~s petites cellules de moelle â des receveurs 1rradiés et évalué l'actiVité de lymphocytes B
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u -< .1 .1 2 3 4 5 6 7 3 4 5 6 7 ·5 ( mm/h ) 5 ( mm/h )Figure 5. Profils de sédimentation des lymphocytes B et de leurs' précurseurs.
Fig. SA : Activité LPS des lymphocytes 8 de la moelle des receveurs 12,5 jours après l'injection dès fractions de cellules de moell~ ( carré) et activité initiale ( jour 0 ) des fractions ( rond ). Fig. SB : Activité LPS+EA des lymphocytes D de la moelle des receveurs 12,5 jours après l'injection des cellules ( carré) et activité initiale des fractions ( jour 0 ) ( r~d_). , \ Les résultats sont exprimés en pourcentaBc ( 7. ) de la r~ponse LPS totale de la moelle normale en fonc-tlon de la cellularité de la moelle des rece'veul's ( jour 12,5 ) ou du nombre de cellules de moelle ; inj'ectées ( jour 0 ). Culture de 2,5 x LOJ cellules.