Étude de l'état immunitaire des vaches laitière atteintes de la paratuberculose bovine

Universite de Sherbrooke

*

Etude de l’etat immunitaire des vaches laitiere atteintes de la paratuberculose bovine

par

Pier-Luc Dudemaine Departement de biochimie

Memoire presente a la faculte de medecine et des sciences de la sante en vue de l’obtention du grade de maTtre es sciences (M.Sc.) en biochimie

Sherbrooke, Quebec, Canada 23 juillet 2013

Membres du jury devaluation

Nathalie Bissonnette (Biochimie, Universite de Sherbrooke) Martin Bisaillon (Biochimie, Universite de Sherbrooke)

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RESUME

*

Etude de i ’etat immunitaire des vaches laitiere atteintes de la paratuberculose bovine par

Pier-Luc Dudemaine Departement de biochimie

Memoire presente a la faculte de medecine et des sciences de la sante en vue de l’obtention du grade de maitre es sciences (M.Sc.) en biochimie, Faculte de medecine et des sciences

de la sante, Universite de Sherbrooke, Sherbrooke, Quebec, Canada, J1H 5N4

La paratuberculose bovine, ou maladie de Johne, est une maladie inflammatoire intestinale chronique provoquant d’importantes pertes economiques chez les producteurs de ruminants du monde entier. Que ce soit chez la vache laitiere ou de boucherie, ces pertes sont causees majoritairement par une diminution de la capacite de reproduction, la baisse de production laitiere et l’amaigrissement des vaches qui perdent ainsi beaucoup de valeur a 1’abattage, en plus d’etre sujettes a une reforme precoce. Outre les pertes economiques, le potentiel de transmission a l’humain est un facteur non negligeable en plus d ’un risque de contamination de la chaine alimentaire. Cette maladie est causee par une bacterie intracellulaire obligatoire nommee Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP). II n ’existe actuellement aucune strategic efficace pour combattre 1’infection chez les animaux atteints. L’evolution lente de la maladie fait en sorte que les signes cliniques apparaissent tardivement, soit plusieurs annees (4 a 7 ans) apres l ’infection initiale. Au cours de cette progression, les animaux infectes commencent a excreter le pathogene dans leur environnement. Les animaux atteints deviennent infectieux et peuvent contaminer d’autres congeneres, ainsi que leur propre veau. Afin de permettre aux producteurs d’eliminer les vaches atteintes avant qu’elles n’atteignent ce stade, il s’avere important d ’etablir un diagnostic precoce. Actuellement, ce n’est qu’en phase sous-clinique avancee que les tests diagnostiques sont plus sensibles, soit 2 a 3 ans apres le debut des excretions fecales chez les animaux infectes. L’incomprehension du manque de sensibilite des tests de depistage et de 1’evolution de cette maladie justifient les efforts de recherche dans ce domaine en vue de mieux comprendre les reponses immunitaires impliquees dans cette maladie. En effet, une meilleure connaissance des processus d’inflammation chronique pourrait aider a developper des outils diagnostiques complementaires. Nos resultats suggerent une deregulation de la reponse immunitaire. Ainsi, en etudiant les composantes et caracteristiques du sang provenant de vaches infectees, il nous a ete possible d ’observer que les niveaux de cytokines plasmatiques telles l’interleukine 17 et Posteopontine se trouvent secretees a differents niveaux chez les vaches atteintes de paratuberculose bovine. De plus, Panalyse de la capacite de leur serum a soutenir efficacement la proliferation des cellules mononucleees du sang peripherique revele que le serum de vaches infectees interfere pour attenuer la proliferation cellulaire. II semble qu’un constituant du serum provoque une diminution de la reponse immunitaire chez les vaches malades. Les resultats offrent une appreciation des dereglements immunitaires provoques par la paratuberculose bovine.

Mots cles : Paratuberculose bovine / Maladie de Johne / Mycobacterium avium subspecies

TABLE DES MATIERES

RESUM E...ii

TABLE DES MATIERES... iii

LISTE DES FIGURES... v

LISTE DES ABREVIATIONS...vi

INTRODUCTION...7

1. LA PARATUBERCULOSE B O V IN E ... 7

1.2. La decouverte de la m aladie... 7

1.3. Culture de la bacterie...7

1.4. Dissemination de la maladie et ses h o te s...8

1.5. Evolution de la paratuberculose... 9

1.6. Le diagnostic de la m aladie...9

1.7. La prevalence de la m aladie... 11

2. LE SYSTEME IMMUNITAIRE...12

2.1. Role et composantes... 12

2.2. La reponse immunitaire in n ee...15

2.3. La reponse immunitaire adaptative... 16

2.4. Les lymphocytes T auxiliaires (Th)... 16

2.5. Role des lymphocytes T auxiliaires... 19

2.6. Regulation negative de 1’ inflam m ation... 21

3. PATHOGENESE DE LA PARATUBERCULOSE...21

3.1. Infection initiale...21

3.2. Initialisation de la reponse im m unitaire... 23

3.3. L’evolution de la paratuberculose bo v in e...24

3.4. Genes de susceptibilite a la paratuberculose... 25

3.6. Objectifs et hypotheses...27

AVANT-PROPOS DU PREMIER ARTICLE... 29

RESUME DU PREMIER ARTICLE... 31

PREMIER ARTICLE...33

AVANT-PROPOS DU DEUXIEME A R T IC L E ... 66

RESUME DU DEUXIEME ARTICLE... 71

DEUXIEME ARTICLE...74

DISCUSSION ET CONCLUSION... 99

REMERCIEMENTS... 103

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Schema des progeniteurs immuns...14 Figure 2 : Molecules impliquees dans le developpement des lymphocytes T auxiliaires.... 18 Figure 3 : Voies de differenciations des lymphocytes T naifs en lymphocytes T effecteurs20 Figure 4 : Schema representant 1’invasion tissulaire de plusieurs bacteries intestinales 22

LISTE DES ABREVIATIONS

ADN Acide desoxyribonucleique

CCS Cote de cellules somatiques

CD4/CD8 Locus de differentiation 4 et 8

CMH Complexe majeur d’histocompatibilite

CPA Cellule presentatrice d ’antigene

ELISA Essai d’immuno-absorption enzymatique

HSC Cellules souches hematopoi'etiques

IFN-y Interferon-gamma

IL Interleukine

MAP Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis

NK Cellules "natural killer"

NOD-2 Domaine d ’oligomerisation nucleotidique-2

NR AMP 1 Proteine des macrophages associee a la resistance naturelle-1

OPN Osteopontine

PBMC Cellules mononucleees du sang peripherique

PCR Reaction de polymerisation en chaine

qRT-PCR Transcription inverse quantitative

ROS Especes reactives oxygenees

SNP Polymorphisme de nucleotide unique

SPP1 Phosphoproteine secretee-1

STAT Transducteur de signal et activateur de transcription

TCR Recepteur des cellules T

TGF-P Facteur de croissance transformant-beta

Th Lymphocytes T auxiliaires

TNF-a Facteur de necrose tumoral-alpha

INTRODUCTION

1. LA PARATUBERCULOSE BOVINE

1.2. La decouverte de la maladie

Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) est 1’agent causal de la

paratuberculose bovine, egalement appele maladie de Johne. Ce nom a ete decerne en l’honneur du Dr Heinrich Albert Johne qui proceda, avec l’aide du Dr Langdon Frothingham en 1894, a la toute premiere description clinique et necropsique de la maladie (Johne, 1895). Ils identifierent a ce moment une bacterie acido-resistante a l’interieur des lesions granulomateuses intestinales d’une vache affectee. En 1906, Bernhard Bang a etabli qu’il existe une difference entre la tuberculose et la paratuberculose (Manning et Collins, 2010). II parvint a provoquer de la fievre et des plaies suintantes en injectant une preparation proteique provenant d ’une souche aviaire chez des vaches atteintes de la paratuberculose, sans toutefois y parvenir chez les vaches atteintes de la tuberculose. Ces dernieres reagissaient seulement a la tuberculine preparee cette fois de Mycobacterium

bovis qui est 1’agent causal de la tuberculose chez les bovins. Cette experience demontra

que le betail presentait une reaction immunitaire en reponse au pathogene recueilli chez les oiseaux et non en reponse au pathogene bovin causant la tuberculose. De ces resultats, avant m£me d’etre capable de cultiver la bacterie, il avait ete etabli que la maladie de Johne etait apparentee a la mycobacterie pathogene retrouvee chez les oiseaux et non au pathogene bovin associe a la tuberculose. Des lors, le nom de paratuberculose etait attribue a cette mycobacterie responsable de la maladie de Johne.

1.3. Culture de la bacterie

Ce n’est qu’en 1912 que la premiere culture de la bacterie fut reussie a l’aide d ’un milieu enrichi d ’une preparation de Mycobacterium phlei tue par la chaleur. Cette decouverte fortuite fut realisee par le scientifique britannique Frederick William Twort qui observa la croissance de petites colonies bacteriennes autour de celles creees par M. phlei un bacille se retrouvant communement dans le foin (Manning et Collins, 2010). C ’est a ce moment qu’il

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fut etabli que M. phlei apportait un quelconque element nutritif essentiel a la croissance de

Mycobacterium enteriditis chronicae pseudotuberculosae bovis Johne’ tel qu’il la nomma.

Cet element essentiel est la mycobactine J qui sert de siderophore (De Voss et al., 2000, Quadri et al., 1998) necessaire a 1’incorporation du fer chez la bacterie. Dans ces memes travaux, il proceda a la demonstration de l’effet de causalite de la paratuberculose par la confirmation des postulats de Koch. Baptisee Mycobacterium paratuberculosis, elle fut officiellement incriminee comme l’agent etiologique de la maladie de Johne pour la premiere fois dans l’edition initiale du Bergey’s Manual o f Determinative Bacteriology en 1923. La venue de 1’ere de la genetique au courant des annees ‘90 permit la reclassification de la bacterie en une sous-espece de la famille de Mycobacterium avium, d ’ou son nom actuel Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis.

1.4. Dissemination de la maladie et ses hotes

La paratuberculose se retrouve principalement chez les ruminants, meme si des evidences indiquent clairement 1’infection chez plusieurs autres especes animales, notamment le renard, le lapin et le raton laveur (Beard et al., 2001, Corn et al., 2005). La transmission la plus frequente se fait de maniere horizontale, soit d ’un animal a l’autre par la voie feco- orale. Cependant, le pathogene peut egalement emprunter une voie dite verticale, generalement par l’ingestion de colostrum contamine (Nielsen et al., 2008, Streeter et al., 1995). Selon certaines etudes, la transmission in utero serait aussi possible (Sweeney et al., 1992, Whittington et Windsor, 2009). Le pathogene est capable de survivre jusqu’a un an dans l’environnement, hors de son hote (Larsen et Miller, 1978), augmentant ainsi les risques de contamination des congeneres. Les methodes de propagation enumerees favorisent generalement une dispersion du pathogene de maniere intra-troupeau strictement. Cependant, les echanges frequents d ’animaux entre les troupeaux ainsi que le contact avec une faune sauvage infectee accroissent la probability d’une propagation inter-troupeaux. Effectivement, considerant que les daims (Pavlik et al., 2000, Riemann et al., 1979), les cerfs (Fawcett et al., 1995, Power et al., 1993), les wapitis (Manning et al., 1998, Rohonczy et al., 1996) et plusieurs autres ruminants sont presents dans l’environnement entourant les fermes, ces animaux infectes deviennent des vecteurs de propagation. Le risque de contamination par la faune sauvage est reel. Ces risques ne sont pas seulement presents en

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Amerique du Nord, mais bien a 1’echelle internationale, puisque des etudes ont demontre la presence d’animaux contamines sur tous les continents.

1.5. Evolution de la paratuberculose

Suivant l’infection initiale via les voies enumerees precedemment, la maladie progresse generalement selon 3 etapes. La premiere etant le stade d ’infection dite silencieuse, c ’est-a- dire que l’hote est infecte, mais ne presente aucun signe clinique de la maladie et n ’excrete pas le pathogene dans l’environnement. Cette periode etant tres variable, les animaux demeurent a ce stade de la maladie habituellement pendant 4 a 5 ans. II est a noter que les nouveau-nes de moins d ’un an sont plus susceptibles de contracter la maladie (Windsor et Whittington, 2010), bien que ce soit contredit dans certaines etudes. Au cours du deuxieme stade dit sous-clinique, le pathogene commence generalement a etre excrete dans les feces des animaux atteints en plus d’y avoir apparition de signes precurseurs de la maladie. Ces signes sont habituellement des diarrhees intermittentes, une baisse de production laitiere en plus d ’une cachexie, malgre que l’appetit de l’animal soit maintenu. C ’est au cours de ce stade que la plupart des vaches sont initialement diagnostiquees. Dependamment de la methode diagnostique utilisee, la detection peut survenir a differents moments au cours de la phase sous-clinique.

A

ce moment, les vaches sont generalement agees entre 5 et 7 ans, quoique certains animaux excretant des plus grandes quantites de bacteries dans leurs feces peuvent etre diagnostiquees bien avant cet age (Pradhan et al., 2011). Le troisieme stade se nomme la phase clinique, periode ou les signes cliniques de la maladie s’intensifient au point ou toutes les defections sont sous forme de diarrhees chroniques, une production laitiere drastiquement reduite et un amaigrissement extreme et ce, sans perte d ’appetit. Malheureusement, jusqu’a ce jour, la seule issue possible pour les animaux atteints de cette maladie incurable est une reforme prematuree.

1.6. Le diagnostic de la maladie

Les outils diagnostiques les plus couramment utilises se repartissent selon deux groupes. Les outils directs incluent les techniques de culture bacterienne de MAP et 1’amplification par PCR de sequence specifique au pathogene a partir de feces. Les outils indirects quant a eux ont pour but la detection d’anticorps diriges contre MAP produits par les hotes infectes.

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La methode utilisee pour y parvenir est l’ELISA applique sur le plasma, le serum ou le lait. Tel que mentionne precedemment, les outils diagnostiques ne permettent presentement pas la detection avant que 1’animal soit dans un stade avance de la phase sous-clinique, meme pour la culture fecale qui s’avere habituellement etre un diagnostic plus hatif (Sweeney et al., 2006). Pour l’essai ELISA, le diagnostic est etabli par la detection d ’anticorps diriges contre le pathogene qui se trouvent en circulation dans le sang ou secretes dans le lait. Ainsi, pour obtenir un resultat positif dans ces derniers tests, Tanimal doit avoir produit une reponse immunitaire humorale contre le pathogene intracellulaire, ce qui survient generalement apres le debut de 1’excretion de celui-ci dans les feces. D ’autre part, la specificite des outils diagnostiques avoisine 100% pour la culture fecale et 99% pour les ELISA (Whitlock et al., 2000). Cependant, la sensibilite differe grandement d’un essai a l’autre et d’un systeme a l’autre. Dans le cas de la culture fecale, la sensibilite a rarement ete determinee, puisqu’elle necessite l’analyse en necropsie. C ’est pourquoi la culture bacterienne est generalement utilisee comme reference. Cependant quelques etudes ont procede a la comparaison entre la culture de MAP dans les feces et celle provenant de tissus intestinaux apres necropsie et la sensibilite de detection dans les feces est approximee autour de 50% (Sockett et al., 1992, W hitlock et al., 2000). Ce faible taux de detection obtenu par la culture du pathogene dans les feces est justifiee par quelques exigences. En premier lieu, le pathogene doit se retrouver en nombre suffisant dans les feces pour permettre sa detection. Puis s’ajoute a cette contrainte le succes de l’etape de disinfection des feces. Cette derniere etape est critique, puisqu’elle doit favoriser la destruction de tout organisme pouvant nuire a sa detection tout en permettant a MAP de survivre. La difficulte majeure de la culture bacterienne de MAP vient du fait que le pathogene possede une croissance tres lente, soit un temps de double-vie de 3,5 jours comparativement a 15 minutes pour Escherichia coli et de 20 minutes pour Staphylococcus aureus. En consequence, la culture d ’une duree de 6 a 8 semaines ne doit pas etre souillee par un contaminant dont la croissance serait plus rapide que celle de MAP. De ce fait, il est generalement admis qu’une validation par PCR doit confirmer les cas positifs. En ce qui a trait a l’analyse serologique, il s’agit d ’une approche indirecte. L ’ELISA est beaucoup moins sensible, puisqu’il determine si l’hote a produit une bonne quantite d ’anticorps contre le pathogene. La nature meme des pathogenes intracellulaires rend la production

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d ’anticorps chez l’animal tres ardue. En effet, la mission des mycobacteries est de demeurer imperceptible par le systeme immunitaire de l’hote le plus longtemps possible et ainsi prolonger leur survie a l’interieur des cellules. Ce qui explique pourquoi l’ELISA serologique detecte les vaches generalement plus tardivement que la culture fecale (Woodbury et al., 2008). En effet, avant le debut de l’excretion significative dans les feces, le pathogene reussi a dejouer le systeme immunitaire de l ’hote retardant du meme coup la production d’anticorps specifiques au pathogene. L ’avantage des techniques utilisant 1’ELISA est de livrer des resultats beaucoup plus rapidement en plus de faciliter l’echantillonnage. Neanmoins leur sensibilite est tres reduite comparativement a la culture fecale, approximee autour de 30% (Collins et al., 2005, McKenna et al., 2005). Dependamment du test utilise, cette sensibilite peut monter pres de 50% en ayant une specificite reduite a 85% (Collins et al., 2005). II est a noter que les sensibilites pour les ELISA sont calculees par rapport a la culture fecale et non la culture de tissus lors de la necropsie. On presume ainsi que leur sensibilite est deux fois moindre.

1.7. La prevalence de la maladie

La prevalence reelle de la paratuberculose est difficile a evaluer compte tenu de la faible sensibilite des tests diagnostiques. D ’autre part, ce ne sont pas tous les laboratoires qui utilisent les memes outils diagnostic. En considerant que les sensibilites sont tres differentes d’un test a l’autre et que les laboratoires n ’utilisent pas tous les memes tests, il est evident que la prevalence apparente calculee dans un cas utilisant la culture fecale est tres divergente de celle calculee en utilisant un ELISA serologique. De plus, le seuil critique etabli pour un diagnostic positif differe d ’un laboratoire a l’autre. Par exemple, pour la detection directe de la bacterie dans les feces, un laboratoire pourrait decider que l’obtention de dix colonies isolees est suffisante pour declarer 1’animal positif, alors qu’un autre laboratoire peut etablir ce seuil a cinquante colonies. Dans le dernier cas, la certitude de ne pas avoir de faux-positif est tres grande, par contre la sensibilite est reduite de beaucoup. Pour ces raisons, on retrouve presentement de grands ecarts selon les etudes dans la prevalence calculee des troupeaux infectes. Cette prevalence est de l’ordre de 20 a 30% dans certaines etudes (Dieguez et al., 2007, Good et al., 2009) alors que d ’autres rapportent des prevalences apparentes aussi elevees que 70% (Lombard et al., 2013, Pozzato et al.,

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2011). Les sensibilites dans ces etudes varient entre 30 a 45%, ce qui explique difficilement les tres grands ecarts rapportes. L ’etude la plus interessante a ce jour a ete produite par le departement de l’agriculture des Etats-Unis au niveau national en utilisant qu’un seul laboratoire de diagnostic pour normaliser les resultats (Lombard et al., 2013). En ajustant les resultats par rapport a la sensibilite et la specificite des tests, ils estiment que la prevalence reelle des troupeaux laitiers comptant au moins un animal positif dans sa cohorte aux Etats-Unis serait au-dela de 90%. II est certain que la prevalence des troupeaux infectes varie d’un pays a 1’autre, puisque la regie des troupeaux est differente, la grosseur des fermes varie et la faune sauvage environnante n ’est egalement pas la meme. Cependant, a defaut d ’avoir une etude pancanadienne approximant la prevalence des troupeaux atteints par la paratuberculose, il est envisageable qu’elle puisse s’apparenter a celle calculee pour les fermes americaines. En prenant en consideration ces faits rapportes, il est flagrant que la paratuberculose est une maladie dont il faut se preoccuper d ’avantage pour assurer une diminution de la propagation et ainsi prevenir les risques non nuls de zoonose.

En resume, la paratuberculose bovine continue de se repandre partout dans le monde et les efforts mis pour restreindre la propagation sont peut-etre vains tant et aussi longtemps que les outils diagnostiques ne permettront pas d’obtenir une meilleure sensibilite. Cette difficulte a developper de tels tests est probablement causee par une reponse immunitaire humorale incoherente. Les prochains chapitres permettront de mieux comprendre les principes regissant la production d ’une reaction immunitaire efficace en reponse aux agents pathogenes.

2. LE SYSTEME IMMUNITAIRE

2.1. Role et composantes

Lors d’etudes sur les infections causees par un organisme comme MAP, il est important de bien comprendre les mecanismes immunitaires, specifiques ou non, impliques dans la reponse de l’hote pour ameliorer la comprehension globale de la reponse face au pathogene etudie. Ce faisant, il sera plus aise d’elaborer des strategies efficaces pour controler la progression de la maladie a l’interieur de 1’hote et eventuellement parvenir a obtenir un

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traitement efficace. Cette section aura pour but d ’introduire les roles du systeme immunitaire ainsi que les principaux types cellulaires impliques et leurs fonctions.

Pendant leur croissance, les vertebres developpent un systeme immunitaire leur permettant de se defendre contre 1’invasion d ’agents pathogenes viraux, bacteriens, fongiques ou parasitaires. Le systeme immun a pour but de detecter les organismes ayant fait intrusion chez l’hote, empecher leur propagation et permettre leur elimination. Pour y parvenir, ce systeme complexe emploie deux types de defenses, soit une reponse non specifique et une specifique, respectivement nommees les reponses immunitaires innee et adaptative. Elies ont des fonctions tres differentes, mais complementaires. Elies sont toutes deux necessaires pour conserver l’etat sain de 1’hote. Les cellules impliquees dans chacune de ces reponses proviennent d’un precurseur commun situe dans la moelle osseuse nomme cellule souche hematopoietique (HSC, Figure 1).

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myeloblastes. Ces demiers peuvent ensuite donner les cellules granulocytaires, dont font partie les basophiles, les neutrophiles et les eosinophiles, mais egalement les cellules monocytaires qui peuvent se differencier en macrophages (Parham, 2003). Pour ce qui est des cellules dendritiques, elles peuvent etre produites par Pune ou 1’autre des lignees lymphoides et myeloides (Manz et al., 2001). Quant a la lignee lymphoide, elle produit les lymphocytes B, les lymphocytes T ainsi que les cellules " natural killers" (cellules NK).

2.2. La reponse immunitaire innee

La reponse innee represente les premiers mecanismes de defense de Porganisme. La protection initiale est assuree par les barrieres physiques, soit la peau, les muqueuses, ainsi que certains aspects chimiques et biochimiques en Poccurrence Pacidite de Pestomac et les enzymes digestives. La flore bacterienne presente sur la peau et les muqueuses est egalement consideree comme une barriere physique, puisqu’elle protege Porganisme des microorganismes pathogenes en leur faisant concurrence. Plusieurs types de cellules immunitaires sont partie integrate de la reponse innee, car sans repondre specifiquement, elles vont phagocyter les agents pathogenes en general et proceder a leur destruction. Du nombre, on compte les granulocytes neutrophiles, basophiles et eosinophiles. Les monocytes engendreront les macrophages et les cellules dendritiques, des types cellulaires necessaires pour activer la transition de la reponse immunitaire innee vers une reponse immunitaire adaptative. Ces deux types de cellules vont ingerer les agents pathogenes, les detruire, puis eduquer les cellules lymphoides pour que celles-ci produisent une reponse specifique contre le pathogene. La degradation des agents pathogenes par les macrophages s’effectue a l’aide des lysosomes presents dans le macrophage. Apres que la cellule ait phagocyte les bacteries, celles-ci se retrouvent a l’interieur de vesicules appelees phagosomes. Lors de la maturation des phagosomes, ceux-ci fusionnent avec les lysosomes. Le contenu des vesicules lysosomales etant compose d ’enzymes et de produits antimicrobiens en plus de comporter un pH acide contribuera a la degradation de tout organisme present a l’interieur du phago-lysosome. Le recrutement de pompes a protons a la membrane du phagosome coopereront egalement a acidifier le milieu interne de la vesicule de fusion (Sun-W adaet al., 2009).

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2.3. La reponse immunitaire adaptative

La reponse adaptative debute au moment ou les cellules presentatrices d ’antigenes (CPA) ont digere le pathogene et presentent a leur surface les complexes majeurs d ’histocompatibilite (CMH) liant un peptide provenant du pathogene. Les cellules appelees lymphocytes T provenant de la lignee lymphoide sont chargees de reconnaitre ces complexes a l’aide du recepteur des cellules T (TCR) et d ’engendrer la reponse immunitaire requise. S’il s’agit d ’un pathogene intracellulaire, le peptide sera lie a un CMH de classe 1 (CMH-I), alors que dans le cas d ’un pathogene extracellulaire, le peptide sera lie a un CMH de classe 2 (CMH-II). Ainsi, deux types cellulaires differents, provenant de la lignee lymphocytaire, seront aptes a reconnaitre le CMH-I ou le CMH-II. Dans le cas ou un CMH-I est presente a la surface de la CPA, ce sont les lymphocytes T ayant le co- recepteur CD8 qui seront capables de reconnaitre ce CMH-I et ils amorceront une reponse de type cytotoxique. Lorsque 1’antigene est presente via un CMH-II, le processus est totalement different. Generalement il sera reconnu par les lymphocytes T munis du co- recepteur CD4 qui assureront la mise en place de la reponse immunitaire la plus efficace possible. Pour y parvenir, une interaction avec la CPA est necessaire. Apres liaison du CMH-II avec le TCR, un signal est envoye a la CPA qui procedera a la secretion de cytokines. Les cytokines sont les proteines qui assurent une communication entre les cellules du systeme immunitaire. Par exemple, certaines, telles que 1’interleukine 8 (IL-8), servent d’agents chimio-attractants (Van Damme et al., 1989), d’autres telles que l ’IL-2, amorceront une proliferation cellulaire (Ettinghausen et al., 1985), alors que l’IL-12 et l’IL- 4 servent de signal de differenciation cellulaire (Hsieh et al., 1993).

2.4. Les lymphocytes T auxiliaires (Th)

Suivant le signal transfere par les recepteurs de surface des CPA (CMH-I ou CMH-II), celles-ci produiront une gamme de cytokines tres differentes selon le type de reponse immunitaire requise. Ainsi, s ’il s’agit d ’un pathogene extracellulaire, la reponse immunitaire etablie sera une reponse humorale. II y aura done production d ’anticorps diriges contre le pathogene pour le neutraliser et favoriser sa degradation par les macrophages. La neutralisation se fait par opsonisation, e ’est-a-dire que les anticorps vont se Her en grand nombre au pathogene et ainsi former un complexe immun qui sera mieux

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reconnu par les cellules ayant pour role de degrader les agents pathogenes. Dans le cas d ’un pathogene intracellulaire, il y aura favorisation de la voie cytotoxique ayant pour but d ’enrayer la presence de cellules infectees. Pour assurer l’activation d’une reponse adequate selon le genre d’infection en place, le systeme immunitaire s’est muni d ’un type cellulaire mediant l’activation d ’une voie ou de l’autre. Ces cellules font partie de la lignee des lymphocytes T exprimant le recepteur CD4 et elles sont appelees lymphocytes T auxiliaires (Th). Jusqu’a tout recemment, deux types de lymphocytes Th etaient connus, soit les types 1 (Thi) et les types 2 (Th2>. Au cours des demieres annees, les Thn, Th9 et Th22 furent

decou verts, cependant leurs roles sont moins bien connus. Les cellules T h l7 sont cependant les plus etudiees des trois derniers types decouverts, ayant ete identifiees comme etant impliquees dans une multitude de maladies inflammatoires chroniques telles que les maladies intestinales inflammatoires (colon irritable) (Caprioli et al., 2008), la maladie de Crohn (Brand, 2009) ainsi que l’arthrite rhumatoide (van Hamburg et al., 2011).

Pour bien comprendre le role des lymphocytes T auxiliaires, il est utile de connaitre leur developpement. Tout d ’abord, avant d ’avoir rencontre un CMH-I sur une CPA qui est complementaire a leur TCR, les lymphocytes T CD4 sont dits nai'fs, car ils ne se sont pas encore differencies en cellules effectrices. Une liaison efficace des lymphocytes T nai'fs au CMH-I ou CMH-II de la CPA aura pour effet d’amorcer la secretion de cytokines, tel que mentionne precedemment. Ces cytokines different selon le signal re9u d ’un CMH-I ou d ’un

CMH-II. Dans le cas d’une liaison d ’un lymphocyte T naif au CMH-I, la CPA percevra le signal de devoir produire l’IL-12. Cette cytokine a pour effet d ’initier la differenciation du lymphocyte T naif en lymphocyte Thi, en plus d’inhiber la possibility d ’une differenciation en lymphocyte Th2. L’inhibition de la voie Th2 se fera via la secretion d ’interferon-gamma

(IFN-y). L ’effet contraire se produit lors d ’une liaison a un CMH-II qui resulte en la secretion d ’IL-4 stimulant la differenciation du lymphocyte T naif en lymphocyte Th2

effecteur tout en restreignant la voie T hi (Ouyang et al., 1998). Ces mecanismes d ’inhibition d’une voie pendant l’activation de l’autre sont regules par l’acetylation (Fields et al., 2002) et la methylation (Jones et Chen, 2006) des histones d ’un locus particulier empechant la liaison du facteur de transcription associe a cette voie. Les infections ou les causes menant a la differenciation des lymphocytes en T hg, Thn et Th22 sont moins bien etablies.

19

2.5. Role des lymphocytes T auxiliaires

Suite a leur differenciation, les lymphocytes T auxiliaires subissent une etape de proliferation intense appelee expansion clonale, dont les particularites ne seront pas exposees. Cette etape est tout de meme cruciale pour engendrer une reponse immunitaire la plus efficace possible. Suite a cette expansion, les lymphocytes T auxiliaires executeront le role pour lequel ils ont ete crees, c ’est-a-dire agir en tant que mediateurs de l’immunite. En ce sens, lorsqu’ils se rendront a nouveau au site d ’infection, ils s’y rendront en grand nombre et procederont a l’activation de differents types cellulaires selon leurs competences dans le genre de reponse requise. Dans le cas d ’une infection intracellulaire, ce sera les lymphocytes T CD8 qui seront actives (Nagata et Koide, 2010) a proceder a la destruction des cellules infectees (Figure 3). Lors des reponses cytotoxiques, les macrophages seront egalement actives a degrader un maximum de bacteries avant qu’elles n ’aient le temps d ’etablir l’infection (Janeway et al., 2001). D ’une maniere semblable, lorsqu’un pathogene extracellulaire procedera a l’invasion d’un hote, les lymphocytes Th2 actives stimuleront les

lymphocytes B a produire des anticorps (figure 3) a 1’aide de recepteurs de surface et de cytokines.

21

2.6. Regulation negative de l’inflammation

Suite a l’induction d ’une reponse immunitaire, l’arrivee d ’un bon nombre de cellules immunitaires aura pour effet de generer une inflammation. Cette inflammation est necessaire pour resoudre le plus rapidement possible 1’infection, cependant si elle persiste, elle sera nefaste a l’homeostasie du tissu dans lequel elle se trouve. Un groupe de cellules dont il n’a pas encore ete question est responsable de ce desequilibre. II s’agit des granulocytes. Plusieurs types cellulaires en font partie, dont les neutrophiles en grande majorite, mais egalement les eosinophiles et les basophiles. La lignee des granulocytes est la plus destructrice, car lors de leur arrivee au site d ’infection, ces cellules remplies de molecules antimicrobiennes procederont a 1’excretion de plusieurs produits reactifs dans le milieu extracellulaire. Ces produits tels les reactifs oxygenes (ROS), les gelatinases, du lyzozyme, de la proteinase-3 auront pour effet d’induire des degats considerables aux tissus avoisinants (Bergamini et al., 2004). C ’est pour cette raison qu’un type de lymphocytes T existe dans le but d ’attenuer la reaction d ’inflammation quelque temps apres son induction, pour ainsi reduire les risques de destruction tissulaire. Ces cellules se nomment les lymphocytes T regulateurs (Treg). Comme mentionne precedemment, quelques heures apres l’induction de la reponse immunitaire, les lymphocytes Trt>g procederont a l’expression de cytokines ayant pour fonction de desamorcer les types cellulaires ayant produit l ’etat d’inflammation (Massa et al., 2007). Ainsi, les cytokines anti-inflammatoires telles que l’IL-10 ainsi que le TGF-P seront produites par les lymphocytes Trt?g et inhiberont les cellules Thi et Th2(Fiorentino et al., 1991, van Scott et al., 2000). En regulant negativement

les cellules secretant les cytokines pro-inflammatoires, le systeme immunitaire essaie d ’eviter la creation de foyers inflammatoires. Cependant, dans les cas ou les CPA ne cessent de produire le signal indiquant la presence de corps etrangers, il arrive que Faction des lymphocytes Tregne soit pas assez efficace pour controler l’inflammation.

3. PATHOGENESE DE LA PARATUBERCULOSE

3.1. Infection initiale

Tel que mentionne precedemment, l’infection par MAP se fait le plus souvent via Fingestion de matieres contaminees. Ainsi, le pathogene se retrouve dans le tractus

gastro-23

Suivant son intrusion dans les plaques de Peyer, le pathogene sera pris en charge par les macrophages et les cellules dendritiques charges de proceder a 1’education du systeme immunitaire. Cette education evite de creer des reactions immunitaires indesirables contre les bacteries commensales, tout en s’assurant de proceder a une clairance efficace des bacteries potentiellement pathogenes. En temps normal, les macrophages ont pour objectif de digerer les agents pathogenes et de proceder a la presentation antigenique aux lymphocytes T. Cependant, une aptitude de MAP est de parvenir a echapper aux mecanismes de degradation et arrive de ce fait a se nicher a l’interieur des macrophages et s ’y reproduire tranquillement sans activer le systeme immunitaire. II a ete etabli que MAP interfere lors de la fusion du phagosome au lysosome, ce qui compromet l’apport d ’enzymes ainsi que 1’acidification du phagosome necessaire a la degradation des pathogenes (Kuehnel et al., 2001, Sturgill-Koszycki et al., 1994). Le processus d ’autophagie est egalement sabote et les macrophages ainsi deroutes ne procederont pas efficacement a la destruction de MAP qui en profite pour s’y multiplier lentement. Neanmoins, les macrophages parviennent a amorcer une reponse innee, probablement par l ’activation de recepteurs membranaires reconnaissant les patrons membranaires bacteriens lors de la liaison de MAP a ceux-ci (Machugh et al., 2012, Weiss et al., 2008). Cela a pour effet d ’induire un appel de monocytes au site d’infection qui provoquera une inflammation locale. Des ce moment, la formation de granulomes est amorcee etant donne la colonisation massive des plaques de Peyer par les cellules immunitaires. Grace a cet appel de cellules, MAP se retrouve avec une grande quantite de monocytes et macrophages a infecter dans un endroit tres restreint, ce qui favorisera la progression de l ’infection. De surcroit, le pathogene evite ainsi d’avoir a se deplacer hors des plaques de Peyer et risquer de provoquer une reponse immunitaire acquise efficace dirigee contre lui. Ce phenomene d ’inflammation locale aura pour effet de causer l’epaississement des muqueuses intestinales qui est une caracteristique observee lors de necropsies des animaux en phases avancees de la maladie de Johne.

3.2. Initialisation de la reponse immunitaire

Des l’implantation de MAP dans les plaques de Peyer, le systeme immunitaire de l’hote semble se deregler. Les experts ne s’accordent toujours pas pour etablir le mecanisme

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general. Certains d’entre eux pretendent qu’une phase pro-inflammatoire serait mise en place dans les premiers jours suivant l’entree du pathogene dans le tissu intestinal (Coussens, 2001). Cette inflammation serait provoquee par une secretion intense de cytokines pro-inflammatoire telles que TNF-a, IL -1P et IL-6 par les macrophages ayant reconnu MAP a l’interieur des plaques de Peyer (Coussens, 2001). Certains autres proposent plutot une periode d’inhibition du systeme immunitaire par la secretion massive d’IL-10 (Stabel et Robbe-Austerman, 2011) par les lymphocytes T regulateurs dans le but de permettre a MAP d ’entrer dans les macrophages sans produire de reponse immunitaire aigiie. Le second modele etant beaucoup plus recent, il est tres peu decrit et pour cette raison ce sera le premier modele qui sera decrit plus en detail. Toutefois, afin de bien comprendre 1’integration des resultats obtenus lors du projet, il est crucial de garder en tete que le modele presentement accepte pourrait etre appele a subir des modifications.

3.3. L ’evolution de la paratuberculose bovine

Selon la theorie proposant une phase pro-inflammatoire en debut d ’infection, la reponse immunitaire en place dans ces premiers temps serait une reponse de type Thi. Elle est representee par un potentiel eleve de secretion d ’IFN-Y par les cellules mononucleees isolees du sang peripherique (PBMC) mises en culture, puis stimulees avec une culture de MAP soniquee (Stabel, 1996). Afin d ’evaluer le type de reponse en place, le dosage d’lFN- y ainsi que de 1TL-10 suite a la stimulation a couramment ete utilise (Coussens et al., 2004, Stabel, 2000). Une secretion d’IFN-Y etant attribute a une reponse de type Thi et celle d ’IL- 10 etait associee a une reponse de type Th2- Le ratio IL-10/IFN-y ainsi obtenu appuyait

l’augmentation de la reponse de type Th 2 au cours de la progression de la maladie. Selon ce

theoreme, les vaches presentent d’abord une reponse de type Thi qui serait remplacee par une reponse de type Th2 au fur et a mesure que la maladie evolue. Cette hypothese est

egalement appuyee sur le fait qu’au debut de la maladie la grande majorite des vaches infectees ne presentent aucune reponse humorale vis-a-vis du pathogene. Puis dans les annees suivant l’infection, les anticorps diriges contre MAP se retrouvent peu a peu dans le sang des animaux infectes et ceux-ci deviennent ainsi positifs au test diagnostique serologique. Cependant, au moment d ’etablir les ratios IL-10/IFN-y, la secretion d ’IL-10 etait attribute a tort aux lymphocytes Th2- La decouverte des lymphocytes Treg a depuis

25

change la vision de l’IL-10 et il a ete etabli que cette cytokine serait plutot majoritairement secretee par les lymphocytes Treg (Maynard et al., 2007). Aucune etude n’a repris le ratio IFN-y avec IL-4 qui est dorenavant connu comme etant une cytokine specifiquement secretee par les lymphocytes Th2- Toutefois, depuis quelques annees, des etudes tendent a

demontrer 1’implication les lymphocytes Thn dans la chronicite de la maladie. Cet aspect est d’autant plus interessant que plusieurs maladies inflammatoires chroniques humaines sont une consequence du dereglement de l’equilibre des lymphocytes Thn- Entre autre, l’arthrite rhumatoi'de, les maladies inflammatoires intestinales et la maladie de Crohn.

3.4. Genes de susceptibilite a la paratuberculose

Comme c ’est le cas pour plusieurs infections bacteriennes et virales, il existe des mutations dans certains genes ayant pour consequence d ’augmenter la susceptibilite a l’infection par MAP. La majorite des genes portant de telles mutations sont relies a l’immunite. Certaines mutations surviennent dans des genes agissant au niveau de la detection de pathogenes, en l’occurrence les recepteurs Toll-like (Mucha et al., 2009) et NOD-2/CARD15 (Pinedo et al., 2009, Ruiz-Larranaga et al., 2010). D ’autres sont impliques directement dans la reponse immunitaire tel BoLA-DRB3 (Rastislav et Mangesh, 2012), dont la proteine fait partie du groupe des MHC-II responsables de la presentation d ’antigenes extracellulaires. Des proteines sont egalement essentielles pour inhiber la croissance bacterienne a l’interieur des macrophages pendant les phases d ’infection initiales notamment NRAMP1 (Paixao et al., 2007). D est interessant de noter que NRAMP1 est un gene affecte par des polymorphismes menant a sa defaillance dans les cas de maladies inflammatoires intestinales humaines egalement (Stewart et al., 2010). Les polymorphismes ne se limitent pas aux genes essentiels pour la detection du pathogene ou l’inhibition de sa proliferation. Certaines mutations ponctuelles ont ete retrouvees dans des genes codants pour des proteines ayant un role dans 1’orchestration d ’une reponse immunitaire efficace. Par exemple, le recepteur de l’IL-10 possede une region polymorphique associee a une susceptibilite accrue pour la paratuberculose (Verschoor et al., 2010).

Par ailleurs, il existe des genes qui semblent inferer une susceptibilite non pas a MAP en particulier, mais aux mycobacteries en general. C ’est le cas de 1’osteopontine qui est une proteine aux multiples facettes encodee par le gene SPP1. Effectivement, l’osteopontine est

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impliquee dans un grand nombre de processus, que ce soit dans la cicatrisation (Liaw et al., 1998), le remodelage tissulaire (Kohan et al., 2009) ou bien meme dans 1’activation precoce des lymphocytes T (O'Regan et al., 2000, Patarca et al., 1989). Des etudes ont demontre que des souris transgeniques dont le gene SPP1 a ete inactive possedent une plus grande susceptibilite a l’infection par des pathogenes intracellulaires (Nau et al., 1999). Dans le cas de la paratuberculose, l’osteopontine pourrait s’averer importante puisqu’elle semble jouer un role crucial dans la detection ou le controle des mycobacteries (Karcher et al., 2008). Etant donne son implication a activer precocement les lymphocytes T dans le cas d ’infection, cette proteine est potentiellement une cible de choix pour les pathogenes desirant se cacher sans etre detectes. En resume, les genes proferant une susceptibilite accrue aux infections a MAP prennent part a differentes etapes regissant la reponse immunitaire face aux pathogenes. Dans le meme ordre d’idee, plusieurs mutations peuvent egalement inferer une resistance accrue a 1’infection par MAP. II n’en demeure pas moins qu’un animal ayant une mutation dans un gene lui procurant une susceptibilite accrue ne se retrouvera pas assurement infecte apres ingestion de matieres contaminees. En effet, l’implantation ou non de la maladie repose sur une multitude de facteurs notamment la susceptibilite genetique.

3.5. Zoonose de la paratuberculose

Au cours de la derniere decennie, il s’est tenu un grand debat a savoir si MAP etait potentiellement transferable a l’etre humain en causant sensiblement les memes signes cliniques que ceux apparents chez les bovins. II a ete clairement etabli que la bacterie peut se retrouver en quantite detectable dans les feces d ’etres humains (Tuci et al., 2011), cependant il n’est pas aussi evident de faire un parallele entre la presence de MAP dans les feces et une maladie inflammatoire intestinale humaine. La maladie de Crohn chez l’humain presente des similarites avec la paratuberculose bovine et a souvent ete etudiee pour tenter d’arriver a definir si MAP etait un acteur potentiel dans le developpement de cette maladie. Des mutations conferant une susceptibilite a la maladie dans des genes relies a 1’immunite contre les mycobacteries comme NOD-2 (Ferwerda et al., 2007), IL23R (Yamazaki et al., 2007) ainsi que ATG16L1 (Massey et Parkes, 2007) laissent croire qu’une bacterie telle que MAP pourrait etre impliquee dans cette maladie. II est interessant

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de constater que ces memes genes sont egalement associes a une susceptibilite accrue pour la paratuberculose chez les bovins. Par contre, plusieurs aspects rendent l’association directe plutot ardue. Tout d ’abord, Bull et al. (Bull et al., 2003) ont detecte la presence de la bacterie dans 26% des patients controles remettant en perspective toute association entre la maladie et la presence de MAP. De plus, il aurait ete logique de retrouver une plus grande proportion de fermiers atteints de la maladie de Crohn sur les fermes ou la paratuberculose est presente. Cependant, les ratios de personnes atteintes ne different pas de la population ne se retrouvant pas en contact direct avec ces animaux (Jones et al., 2006). Par ailleurs, meme s’il est complique d’etablir avec certitude une relation entre 1’infection par MAP et le developpement d’une maladie intestinale, la presence de la bacterie vivante dans le sang de patients atteints de la maladie de Crohn ou de colite ulcereuse represente un plus grand pourcentage que chez les patients sains (Naser et al., 2004).

3.6. Objectifs et hypotheses

Dans le projet qui m ’a ete attribue, les objectifs etaient de mieux comprendre la destabilisation du systeme immunitaire survenant lors d’infection par MAP en premier lieu. L ’hypothese que les cellules immunitaires isolees du sang peripherique se comporteraient de maniere differente en presence de serum de vaches infectees en comparaison a du serum de vaches saines a ete emise. Dans un deuxieme temps, la concentration serologique de certaines cytokines a ete mesuree afin de mesurer des differences entre les groupes de vaches etablis lors du diagnostic. Effectivement, un aspect fort interessant de l’etude est que lors du diagnostic, deux outils ont ete utilises, ce qui a permis la classification des vaches en trois groupes. Les vaches diagnostiquees negatives par les deux tests, les vaches positives uniquement en culture fecale et finalement les vaches diagnostiquees positives par les deux methodes, soit la culture fecale et le depistage serologique (ELISA). Etant donne que 1’ELISA detecte les vaches qui sont en general dans un stade plus avance de la maladie, celles-ci ont ete considerees dans un groupe distinct. L ’hypothese soutenant le dosage des cytokines sanguines etait que la progression de la maladie n’apportait pas vraiment une derive d’une reponse Thi vers Th2 au cours de l’infection, mais qu’il y aurait probablement

une implication des lymphocytes Thi7, comme c ’est le cas pour plusieurs maladies

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a l’infection par le pathogene apporterait une precision quant a savoir s’il etait possible que certaines voies lymphocytaires soient preferentiellement mise en place des les premieres heures suivant l’infection par MAP. L’osteopontine sanguine a ete mesuree pour arriver a determiner s’il etait possible qu’elle soit impliquee dans le developpement de la chronicite de la maladie.

AVANT-PROPOS DU PREM IER ARTICLE

Haplotypes of the bovine osteopontin gene affect the level of OPN secreted into milk and the host macrophage immune response

Auteurs de Particle : Pier-Luc Dudemaine, Karin Alain, Catherine Thibault et Nathalie Bissonnette

Statut de Particle : Soumis la revue BMC Genomics le 6 mai 2013 avec le numero de soumission 1900205853973017.

Avant-propos :

La premiere ebauche d ’un article qui fut amalgame dans un second temps a un deuxieme a ete redigee par Pier-Luc Dudemaine. La fusion des deux etudes fut effectuee par Mme Nathalie Bissonnette. Concernant le travail experimental, 1’organisation des phases animates et le travail attribue a la mise au point de l’outil de dosage (ELISA) ainsi que la quantification de l’osteopontine ont ete effectuees par M. Pier-Luc Dudemaine. L ’optimisation de la methode d’isolement de macrophages differencies a partir de monocytes sanguins a egalement ete realisee par M. Pier-Luc Dudemaine. Mme Karin Alain avait clone et caracterise les haplotypes du gdne SPP1. Les constructions de vecteurs, les transfections ainsi que l’optimisation de la methode qRT-PCR sont le travail de Mme Catherine Thibault, assistante de recherche.

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RESUME DU PR E M IER ARTICLE

L’article porte sur l’etude de l’expression de l’osteopontine (OPN) dans le lait, le sang et les macrophages bovins, en relation avec les variations genetiques situees dans son promoteur. L ’osteopontine, codee par le gene SPP1, est associe a l’imumunite et consideree comme une cytokine impliquee au debut de 1’infection bacterienne. Plusieurs polymorphismes (SNP) ont ete recenses dans la sequence entourant le gene et une grande proportion de ces polymorphismes se retrouvent dans sa region promotrice. II a ete rapporte que la genetique du promoteur pourrait influencer la sante de la glande mammaire, puisque certains haplotypes (H3) du gene presentent une cote de cellules somatiques (CCS) plus elevee que d’autres (Alain et al., 2009). La CCS represente le nombre de cellules somatiques infiltrees dans le lait et elle augmente drastiquement lors d ’infections bacteriennes intra-mammaires, ce qui en fait un indicateur de sante de la glande mammaire. Ainsi, sachant que certains haplotypes semblent demontrer une plus grande susceptibilite aux infections, il est envisageable que les taux d ’OPN dans le lait et le sang varient. Consequemment, il serait fort possible que son expression soit regulee differemment selon la presence de SNP situes au site de reconnaissance de facteurs de transcription. La proteine etant abondamment secretee dans le lait, le genotype du promoteur a potentiellement un effet sur la production de la proteine dans le lait. Egalement, l’OPN etant un facteur immunitaire ayant un role lors des infections bacteriennes, il serait possible que les polymorphismes influencent la reponse immunitaire face aux pathogenes, dont celui causant la paratuberculose bovine.

Dans un premier temps, la genetique du promoteur de l’OPN ne semble pas influencer la production de lait, puisqu’il n’y a aucune difference entre les trois haplotypes etudies. II est tout de meme interessant de noter qu’en fin de lactation, il semble y avoir une tendance a produire plus de lait pour les vaches ayant la genetique H lxH 4. Lors de l’analyse en immunobuvardage de la proteine provenant du lait, aucune difference entre les isoformes presents n ’a ete observee, indiquant que 1’etat de la proteine secretee ne change pas au cours de la lactation.

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Au niveau de la concentration d’OPN dans le lait, les vaches genotypees H lxH 4, H lx H l et H2xH3 presentent des differences au niveau des concentrations dans le lait. Pendant la periode couvrant les semaines 25 a 30 de lactation, les niveaux sont plus eleves chez les vaches ayant l’haplotype H lxH 4 (P < 0.05). Etant donne la tendance a produire plus de lait en fin de lactation pour les vaches H lxH 4, la comparaison de la quantite totale produite est interessante. Cette donnee correspond a la concentration multipliee par la quantite de lait produite et presente des differences qui s’etendent jusqu’a la fin de la lactation, soit la semaine 37 (P < 0.05). Le plasma quant a lui ne presente pas de difference entre les haplotypes au cours de la lactation en plus d ’avoir un taux basal tres constant, demontrant que 1’augmentation dans le lait ne provient pas d ’une augmentation de la concentration sanguine.

L ’analyse de l’expression de genes chez les macrophages bovins en reponses a differents stimuli a montre que la genetique de 1’OPN etait potentiellement liee a son expression en reponse a certaines stimulations in vitro. II a egalement ete possible de montrer un lien hypothetique entre la genetique du gene SPP1 et d ’autres proteines impliquees dans les reponses immunitaires, telles que l’IL-6 et NOD-2. Cet aspect amene une facette tres interessante de la regulation de l’immunite, puisque l’OPN est une molecule ayant des roles sur plusieurs types cellulaires distincts.

Finalement, il a ete possible d ’observer que la genetique du promoteur de l’OPN amene des differences d ’activite en reponse au facteur de transcription SP1. Effectivement, les haplotypes etudies presentent des differences au niveau des activites de la region promotrice lors de l’ajout de SP1. Ainsi, il est possible de constater qu’il existe bel et bien une relation entre la genetique du promoteur et son activite, et ce au niveau genotypique, mais egalement au niveau phenotypique represente par la secretion dans le lait.

PREM IER ARTICLE

Running head: HAPLOTYPES AND OSTEOPONTIN SECRETION INTO MILK

Title: Haplotypes of the bovine osteopontin gene affect the level of OPN secreted into milk and the host macrophage immune response

P. L. Dudemaine,* C. Thibault,f K. Alain,* and N. Bissonnette*!

*Departement de biochimie, Faculte de medecine et des sciences de la sante, Universite de Sherbrooke, Sherbrooke, QC, Canada J1H 5N4

fDairy and Swine Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food Canada, Sherbrooke, QC, Canada JIM 1Z3

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Abstract

Background. Osteopontin (OPN) is found in nearly all body fluids and secreted by a variety of cells and tissues. The role of OPN as a cytokine was first described as an early component of the T-cell activation factor. Enhanced in T cells, OPN recruits macrophages at the infection site and improves cell-mediated immunity by inducing secretion of Tm cytokines. OPN is now recognized as an important proinflammatory cytokine with pleiotropic functions that include pathogen clearance and wound healing. In a previous study, we identified haplotypes of the OPN gene and found that OPN genetics was associated with the milk somatic-cell score of the Holstein breed of dairy cattle. This parameter is used to estimate the genetic value of the number of somatic cells in milk as an indicator of udder health. Our study assessed whether the genotype of the OPN gene promoter had an impact on transcriptional activity, immune response, or the level of OPN secreted into milk.

Results. Cows were grouped according to the OPN haplotypes associated with a high (H2xH3), average (H lx H l), or low (H lxH 4) somatic-cell score. Plasma concentration and the amount of OPN secreted in milk were measured throughout lactation. As the OPN level increased in late lactation, H lxH 4 cows associated with a low estimated breeding value for somatic-cell score secreted greater amounts of OPN into milk and their macrophages were less prone to sustain a higher level o f SPP1 and proinflammatory IL-6 transcripts under challenged conditions. The influence o f DNA polymorphisms on the promoter activity of the OPN gene was confirmed in vitro.

Conclusions. An inverse correlation between the OPN milk level during late lactation and the breeding value estimated for somatic cells was found, with an elevated OPN level associated with a lower SCS being favorable. The early T-cell activator and leukocyte recruitment properties of OPN during late lactation may be beneficial for reducing the incidence of infection during the transition period. When coupled with proven udder-health management programs, genetics that influence the immune-cell response in milk could help reduce mastitis or other health problems associated with the transition period.

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Background

Osteopontin (OPN) is a secreted glycoprotein with cell-binding properties that regulates activities through integrin (Liaw et al., 1995) or other cell receptors such as the CD44 immune ligand (Khan et al., 2005). Since it was first identified as a component of mineralized tissues (e.g. bone), the phosphoglycoprotein OPN has been found secreted into numerous body fluids (e.g., saliva, plasma, bile, and milk) and by cells into a variety of tissues, including kidney, pancreas, brain, uterus, and several glands. Moreover, OPN is expressed in activated macrophages, lymphocytes, and natural killer cells (Patarca et al., 1993; Murry et al., 1994; Li et al., 2003). A variety of stimuli, including tumor necrosis factor-a, interleukin (IL)-1 p, IL-10, interferon gamma (IFN-y), and lipopolysaccharide (LPS), are able to upregulate OPN expression (Denhardt and Noda, 1998; O'Regan and Berman, 2000; Li et al., 2003; Konno et al., 2006), but little is known about the impact of OPN gene variants on OPN expression in milk and in macrophages, the latter being a critical cell type in the development and modulation of immune responses. Several biological implications have been attributed to OPN, notably involvement in the initiation of the migration of macrophages and DCs to inflammation sites (Nau et al., 1997; Giachelli et al., 1998; Renkl et al., 2005). Because OPN induces key early type-1 factors produced by activated T cells, it was initially considered a Thi cytokine (Singh et al., 1990), which was later confirmed by studies using OPN knockout mice that shown reduced T Hi immune response and increased susceptibility to mycobacterial infection (Nau et al., 1999). In addition to its significance to immunity (Wang and Denhardt, 2008), OPN may have a broader integrative function, given that it influences wound healing (Liaw et al., 1998; Saika et al., 2007), cell survival and proliferation (Cho and Kim, 2009; Chiodoni et al., 2010), and tissue homeostasis (Qu and Chaikof, 2010). While expressed in several organs, OPN is highest in milk, assessed at 18 mg/L in dairy cows (Schack et al., 2009), and is 10 times higher in colostrum (Kumura et al., 2004). It has been suggested that the abundance of OPN in milk can be accounted for by the bioactivity of this protein and its roles in newborn immunity (Schack et al., 2009). Osteopontin’s potential to interact with ubiquitously expressed multiple cell-surface receptors makes it an active player in many physiological processes.

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While osteopontin, a secreted intracellular protein, was found to be essential for mammary- gland development (Nemir et al., 2000), its reported pleotropic roles suggest that OPN has a broader impact. Indeed, genetic variants of the OPN gene (SPP1) affect milk production and local immunity, as suggested by genomic studies (Schnabel et al., 2005; Alain et al., 2009). A previous study reported the detection of this abundant transcript early on in mastitis (Alain et al., 2009). Four DNA single-nucleotide polymorphisms (SNPs) were identified using the estimated breeding value (EBV) of the somatic-cell score (SCS), which is the most reliable information on udder health status and mastitis resistance (Heringstad et al., 2008). Three SNPs are located in the promoter of the SPP1 gene, defining the haplotypes H I, H2, and H3, which are the most common (93%) haplotypes in the Holstein bull population (Alain et al., 2009). The fourth SNP, located in the 3’ untranslated region (UTR), defines the minor allele H4 (5%), which shares the same genotype of the HI promoter. As OPN is thought to be a potential candidate gene for both production and immune traits, we hypothesized that haplotypes of the OPN gene promoter would influence the secretion of the protein into milk. Thus, cows carrying haplotypes associated with a high (H lxH 4) or low (H2xH3) EBV for SCS— which is an indicator of udder health— would exhibit differences not only for the OPN milk content but also with respect to immune response. Given OPN’s importance in many physiological processes, studying the impact of genetic variations on OPN secretion and the immune response contributes to our understanding of the mechanisms driving mammary-gland homeostasis. Taken together, all signs point toward an important role for OPN in the lactation process, hence this study’s importance and relevance.

RESULTS

M ilk yield a n d composition

Days in milk did not differ between the H lxH 4 (322 ± 26), H2xH3 (313 ± 26), and H lx H l (298 ± 25) groups (P = 0.411). The amount of lactose, protein, or fat (yield and percentage) and somatic cell count did not differ overall by genetic group (data not shown). Daily milk yield increased, and milk yield peaked at nearly 50 days in milk, with no difference by group (P > 0.527; Figure 1). Thereafter, a gradual decrease in milk production was