COMPARAISON ENTRE LA DISTRIBUTION DESPROJECTIONSDU NOYAU RÉTICULAIRE LATÉRAL AVECLES COMPARTIMENTS DES
CETJ.UT.esDE PURKTN.IE DANS
LE CORTEX CÉRÉBET.T.EUX DURATADULTE
LYNN COUILLARD
Mémoire présenté pour l'obtention
du grade maître ès sciences (M.Sc.)
ÉCOLE DES GRADUÉS UNIVERSITÉ LAVAL
Août 1993
À LucilU, Stéphane et SLudrée-Stfe^andrine, ainsi qu 'à (a mémoire de mon père CJérard
Il a maintenant été établi, par plusieurs études anatomiques, physiolo giques et biochimiques, que les composantes du cortex cérébelleux, telles que les cellules de Purkinje et les afférences des fibres moussues, sont organisées selon une compartimentalisation parasagittale. Dans le but d’établir si les li mites de ces diverses zones longitudinales se conforment à un même plan d'organisation, nous avons comparé, chez le rat adulte, la distribution de la projection cérébelleuse des fibres moussues du noyau réticulaire latéral (NRL), obtenue par l’injection d’un traceur antérograde, à la compartimenta tion des cellules de Purkinje révélée par l’anticorps monoclonal mabQ113. Nos résultats suggèrent que les afférences réticulocérébelleuses démontrent une subdivision parasagittale plus fine que celle établie par les cellules de Purkinje. Il s’avère donc possible que ce raffinement des afférences du noyau réticulaire latéral corresponde fonctionnellement aux microzones du cervelet suggérées par Oscarsson (1976), et que des mécanismes compétitifs puissent conduire à cette fine subdivision.
SUMMARY
It has been established, from many anatomical, physiological and bio- chemical studies, that cerebellar components, like the Purkinje cells or the mossy fiber afferents, hâve a parasagittal organization in the cerebellum. To détermine whether the limits of those longitudinal patterns share a common organizational plan we hâve compared in the adult rat the distribution in the cerebellum ofthe latéral reticular nucléus mossy fibers, displayed by an ante-rograde tracer, with the Purkinje cell compartments revealed by the monoclo nal antibody mabQ113. The results indicate that reticulocerebellar terminal fields show a finer parasagittal subdivision of cortical territory, resulting in a mediolateral subdivision of Zebrin I Purkinje cell compartments. It is thus possible that this refinement ofthe LRN afferents functionally corresponds to the microzone concept suggested by Oscarsson (1976), and that compétitive me- chanisms lead to this finer subdivision.
J’adresse des remerciements sincères à mon directeur de thèse, le Dr Richard Hawkes pour m’avoir prodigué de judicieux conseils, en plus d’avoir fait preuve d’une imperturbable patience à mon égard.
J aimerais également exprimer ma reconnaissance au Dr Claude Gravel et au Dr Nicole Leclerc pour les nombreuses discussions qui ont été profitables à l’élaboration de cette thèse, et pour leurs indispensables recommandations techniques qui m'ont épargné temps et découragement.
Je remercie également Line Thivierge et René Boucher pour leur pré cieuse contribution au chapitre de l’illustration du présent mémoire, ainsi que Suzanne Bilodeau et Marie Simard pour la dactylographie de ce mémoire.
Finalement, j’aimerais remercier le Dr Raymond Marchand et le direc teur du centre de recherche, le Dr André Parent pour leur excellente collabo ration.
TABLEDESMATIÈRES
Page Avant-propos... ü
Table des matières... iii
Liste des figures... v
Introduction générale... 1
1. Mossy liber projections from the latéral reticular nucléus hâve a parasagittal band distribution in the granularlayer of the rat cerebellar cortex: Glomerular distribution, compared with the Purkinje cell compartments... 15
1.1 ABSTRACT... 16
1.2 INTRODUCTION... 17
1.3 MATERIALS AND METHODS... 20
1.3.1 Wheat germ agglutinin-horseradish peroxidase conjugate injections in the latéral reticular nucléus... 20
1.3.2 Perfusion and sectioning... 20
1.3.3 Histochemical and immunocytochemical staining.... 20
1.3.4 Distribution of LRN terminal fïelds and Purkinje cell compartments: three-dimensional reconstructions.... 21
1.4 RESULTS... 23
1.4.1 General considérations... 23
1.4.2 Injection sites... ... 24
1.4.3 General distribution of labelled LRN mossy fïbers and terminais... 25
1.4.4 Description of interdigitized maps of analyzed territories... 26
1.4.4.1 LobuleIlia dorsal (animal #53)... 26
1.4.4.2 LobuleIlia dorsal (animal #54)... 27
1.4.4.3 Lobule Iliaventral (animal #53)... 27
1.4.4.4 Lobule Iliaventral (animal #54)... 28
1.4.4.5 Lobule Illbdorsal (animal #53)... 28
1.4.4.6 Lobule Illb dorsal (animal #54)... 29
1.4.4.7 LobuleIllb ventral (animal #53)... 29
1.4.4.8 Lobule Illb ventral (animal #54)... 30
DISCUSSION... 31
Conclusion... 54
LISTE DES FIGURES
Page Fig. 1: Zebrin I distribution in the cerebellum... 36 Fig. 2: WGA-HRP labelled mossy fîber rosettes in the granular layer
of the cerebellum... 38 Fig. 3: Précisé mossy fîber compartment boundaries and WGA-HRP
labelled mossy fîber axons... 40 Fig. 4: Frontal section of WGA-HRP injection site in the right latéral
reticular nucléus and its alternate section counterstained with neutral red from animal #53... 42 Fig. 5: Frontal section of WGA-HRP injection site in the left latéral
reticular nucléus and its alternate section counterstained with neutral red from animal #54... 44 Fig.6: Comparison of the distribution of reticulocerebellar afferents
with Zebrin I bands in lobules Ilia and Illb from animal #53.. 46 Fig. 7: Comparison of the distribution of reticulocerebellar afferents
and Zebrin I bands in subséquent frontal sections of lobules
Ilia and Illb from animal #53... 48 Fig. 8: Comparison of the distribution ofreticulocerebellar afferents
with Zebrin I bands in lobules Ilia and Illb of animal #54... 50 Fig. 9: Comparison of the distribution of reticulocerebellar afferents
with Zebrin I bands in subséquent frontal sections of lobules
Le cervelet du rat adulte, facilement disponible et dont l'organisation histologique et cytologique est relativement simple et bien documentée (Palay et Chan-Palay, 1974), s'avère un matériel expérimental avantageux pour l'étude de projections neuronales dans le système nerveux central.
En effet, le cortex cérébelleux d'un rat adulte se divise en quatre couches ne comportant que cinq types principaux de neurones. La couche la plus externe, la couche moléculaire, s'étend de la pie-mère à l’apex des cellules de Purkinje et comprend principalement l'arbre dendritique de ces dernières. La couche moléculaire comprend aussi les cellules étoilées, les cellules à corbeille, les fibres grimpantes et les dendrites des cellules de Golgi. Les fibres parallèles, provenant des cellules granulaires, cheminent transversalement dans la partie superficielle de la couche et font synapse avec les épines situées au niveau des branches terminales des dendrites des cellules de Purkinje (Gray, 1961; Larramendi et Lemkey-Johnston, 1968; Mugnaini, 1972).
Les corps cellulaires des cellules de Purkinje composent la seconde couche du cortex cérébelleux. Ces somas sont disposés en une monocouche et sont entourés par les collatérales descendantes des axones des cellules à corbeille qui forment un "panier" autour des corps cellulaires des cellules de Purkinje (Cajal, 1911; Hâmori et Szentâgothai, 1965; Palay et Chan-Palay, 1974). On y retrouve également les somas des cellules gliales de Bergman.
Enfin, la couche la plus interne est la couche granulaire, située entre la couche des cellules de Purkinje et la matière blanche. Elle est composée principalement d'un grand nombre de petites cellules granulaires qui font synapse avec les rosettes terminales des fibres moussues (Gray, 1961; Palay et Chan-Palay, 1974; Hamori et Somogyi, 1983). Cette couche comporte aussi les cellules de Golgi, plus grosses que les cellules granulaires, mais aussi moins nombreuses, dont les axones font également synapse avec les dendrites des cellules granulaires. Le complexe synaptique, formé tout d’abord de la rosette d une fibre moussue sur laquelle font synapse de nombreuses extrémités dendritiques des cellules granulaires, ainsi que de nombreux boutons des axones des cellules de Golgi, a été nommé "glomérule synaptique" (Held, 1897,
2 tiré de Palay et Chan-Palay, 1974; Cajal, 1911). De plus, la couche granulaire est traversée par les axones des cellules de Purkinje se dirigeant vers la matière blanche, et par les fibres grimpantes et les axones des cellules granulaires montant vers la couche moléculaire. Enfin, à l'aide de microphotographies de préparations traitées à la coloration de Cajal, Eccles, Ito et Szentâgothai (1967) ont estimé à environ 65% l'espace occupé, dans la couche granulaire, par le soma des cellules granulaires et à environ 30% celui occupé par les glomérules synaptiques. Un dernier 5% de cet espace serait occupé par des éléments autres que ceux ci-haut mentionnés. Ito a établi à environ 112 le nombre de dendrites de différentes cellules granulaires formant des synapses avec un seul glomérule.
Finalement, sous-jacente à la couche granulaire, on retrouve la matière blanche. Celle-ci comprend des fibres myélinisées telles que les axones efférents des cellules de Purkinje et les axones afférents des fibres grimpantes et des fibres moussues. On retrouve également des cellules gliales.
Parmi les cinq principaux types cellulaires du cortex cérébelleux, voyons maintenant plus en détails ceux qui sont concernés par la présente étude, soit la cellule de Purkinje, la cellule granulaire et la cellule de Golgi. Puis, nous terminerons cette révision sommaire de la cytologie du cervelet par la description des "glomérules synaptiques" de la couche granulaire et des fibres moussues qui les composent, ces fibres étant, avec les fibres grimpantes, une source principale différences au cortex cérébelleux.
-Cellulesde Purkinje
Les cellules de Purkinje donnent au cervelet sa cytoarchitecture caractéristique par le fait qu’elles sont alignées en une couche monocellulaire, que leur arborisation dendritique ne s'étend que dans le plan sagittal et par le fait que leur axone constitue la seule voie efférente du cortex. Ces cellules multipolaires ont un soma plutôt oval ou en forme de poire, d'environ 16 à 30 |im de diamètre et de 21 à 40 pm de long (Inukai, 1928; Mugnaini, 1972). De plus, le corps cellulaire est caractérisé par la présence d'un grand noyau vésiculaire présentant un nucléole basophile et des corps de Nissl petits et irréguliers. Les cellules de Purkinje sont aussi très riches en lysosomes et en
mitochondries, et contiennent des microtubules ainsi que des neurofilaments (Palay et Chan-Palay, 1974).
Le pôle apical des corps cellulaires peut donner naissance à un, voire même quatre troncs dendritiques (Cajal, 1911; Palay et Chan-Palay, 1974). Ces derniers s'étendent jusqu’à la surface de la couche moléculaire, en se subdivisant en dendrites secondaires et tertiaires à mesure qu'ils atteignent le sommet de la couche. Ces nouvelles branches dendritiques se déploient parallèlement à la surface du folium et sont munies de nombreux petits "ramuscules terminaux" (Cajal, 1911) ou "spiny branchlets" (Fox et Barnard, 1957), eux-mêmes munis d’épines dendritiques (Cajal, 1891). C'est sur ces épines que de multiples fibres parallèles viennent former des synapse alors que les troncs dendritiques secondaires et tertiaires reçoivent plutôt des afférences des cellules étoilées, des cellules à corbeille, et des fibres grimpantes (Mugnaini, 1972; Palay et Chan-Palay, 1974).
L'axone de la cellule de Purkinje émerge du pôle basal du corps cellulaire et traverse la couche granulaire pour se diriger vers la matière blanche. Cet axone possède un segment initial dépourvu de gaine myélinisée, s'étendant sur environ quarante à cinquante micromètres à partir du corps cellulaire. Sur sa partie myélinisée, l'axone donne naissance à des collatérales à partir du troisième ou quatrième noeud de Ranvier (Cajal, 1896). Celles-ci remontent à travers la couche granulaire et se divisent en plusieurs branches qui iront former des synapse au niveau des dendrites et du corps cellulaire des cellules de Purkinje avoisinantes, ou au niveau des corps cellulaires des cellules de Golgi et des dendrites des cellules granulaires (Palay et Chan- Palay, 1974).
Enfin, mentionnons que le neurotransmetteur de la cellule de Purkinje est l'acide gamma-aminobutyrique (GABA) (Ito, 1978; Tran et Snyder, 1979).
■ Cellules granulaires
Ces cellules, totalisant un nombre considérable dans le cervelet de rat, soit 9.9 x 107 (Smoljaninov, 1971), et représentant un des plus petits neurones du système nerveux, occupent la couche granulaire du cortex cérébelleux et
4 fournissent environ un tiers de la masse totale du cervelet (Ito, 1984). Smoljaninov (1971) a, par exemple, établi un rapport de 250 cellules granulaires pour chaque cellule de Purkinje chez le rat. Les cellules granulaires sont aussi caractérisées par le fait qu'elles soient les seuls neurones connus à détenir une action excitatrice parmi les autres neurones du cortex cérébelleux. En effet, les données cumulées jusqu'à maintenant indiquent que le L-glutamate serait un neurotransmetteur des cellules granulaires (Tran etSnyder, 1979; Smith, 1981).
Mais la densité des cellules granulaires, 3.2 x 10^ cellules granulaires par mm^ (Smoljaninov, 1971; Lange, 1975), et leur action excitatrice unique ne sont pas les seules particularités de ces cellules. En effet, leur soma démontre une forme globuleuse d'environ 5 à 8 |im de diamètre et ne comportant essentiellement qu un gros noyau rond fortement basophile (Fox et Barnard, 1957; Palay et Chan-Palay, 1974). Le corps cellulaire semble aussi dépouvu de corps de Nissl et ne contient que peu de mitochondrie (Mugnaini, 1972; Palay et Chan-Palay, 1974).
La cellule granulaire moyenne comporte trois à cinq dendrites (deux à sept en cas extrêmes) pour une longueur moyenne d'environ 13.6 qm (Palkovits et al., 1971a). Ces dendrites, s'étendant dans toutes les directions à partir du corps cellulaire, ne forment des synapses qu'au niveau de leur extrémité distale et ne sont habituellement pas ramifiées. Des digitations terminales, à la structure particulière en forme de "serres d'oiseaux", émergent à l'extrémité des prolongements dendritiques et entrent en contact avec les fibres moussues des glomérules cérébelleux. Les dendrites des cellules granulaires comportent également un important système tubulaire, ainsi que des corps lamellaires (Eccles et al., 1967; Mugnaini, 1972).
Quant à 1 axone de ces cellules, il est plutôt mince, non-myélinisé, et prend son origine du corps cellulaire ou, le plus souvent, d'une des dendrites. Après avoir atteint la couche moléculaire, étant peut-être guidé par la verticalité des fibres de Bergman (Mugnaini et Forstr0nen, 1966, 1967; Rakic,
1971), 1 axone se divise en deux branches en démontrant une bifurcation à la forme d’un "T". Ces branches, d’un diamètre moyen d'environ 0.2 pm chez le chat (Palkovits et al., 1971b), s'étendent surune largeur moyenne d’environ .08
à 3.0 mm à partir de leur origine (zone de bifurcation) (Schild, 1980). Elles sont appelées fibres parallèles, étant donné leur trajectoire dans l'axe du folium. Ainsi, ces fibres constituent un réseau très dense sur toute l'épaisseur de la couche moléculaire, formant des synapses "en passant" avec l'arborisation dendritique des cellules de Purkinje qu'il traverse dans leur plan sagittal. Les fibres parallèles entrent aussi en contact avec les dendrites des cellules étoilées, à corbeille et de Golgi. Ces nombreuses synapses sont formées à partir d excroissances des fibres parallèles contenant des vésicules sphériques ayant un diamètre d'environ 260 à 440 Â (Palay et Chan-Palay, 1974), une ou deux mitochondries et des microtubules.
-Cellulesde Golgi
Occupant la couche granulaire, ces cellules peuvent être subdivisées en au moins trois sous-groupes ayant des propriétés caractéristiques différentes (Eccles et al., 1967). Palay et Chan-Palay (1974), quant à eux, identifient chez le rat adulte deux principaux types de cellules de Golgi: celles de grande taille, prédominant dans la partie supérieure de la couche granulaire et celles de petite taille occupant la partie inférieure de cette couche. Dans cette étude, nous nous attarderons a la description des cellules de Golgi les plus grosses (9- 16 pm de diamètre; Ito, 1984), aussi nommées cellules de Golgi typiques.
Les cellules de Golgi forment une population neuronale comparable, en nombre, à celle des cellules de Purkinje (Palkovits et al., 1971a; Lange, 1974). Biochimiquement, elles sont caractérisées par l'absence de cytochrome oxidase (Marani, 1982b). Leur corps cellulaire, presqu'aussi gros que celui de la cellule de Purkinje, peut donner naissance à deux, ou même huit troncs dendritiques s étendant plus ou moins radialement autour du soma. Cette dernière caractéristique permet de distinguer la cellule de Golgi typique de la cellule de Purkinje, puisque ces deux types de cellules sont très près les unes des autres: la grosse cellule de Golgi se retrouve à peu de distance sous la rangée des cellules de Purkinje (Palay et Chan-Palay, 1974). Les dendrites des cellules de Golgi peuvent rester comprises dans la couche granulaire, ou s'étendrent jusqu'à la surface de la couche moléculaire (Larsell et Jansen, 1972; Mugnaini, 1972). Leur degré de branchement varie et les plus petites dendrites comportent de petites épines distribuées irrégulièrement le long du prolongement (Eccles et al., 1967). Les ramifications dendritiques de la cellule
6 de Golgi forment des synapses avec les fibres parallèles en constituant la majeure partie des synapses axodendritiques (Ito, 1984). Quelques-unes de ces dernières sont aussi formées par les axones des cellules étoilées ou à corbeille, et par les collatérales des axones des cellules de Purkinje. En raison de leur ressemblance à de grosses châtaignes, les fibres moussues et les fibres grimpantes forment, avec la cellule de Golgi, des synapses axosomatiques dites "en marron" (Chan-Palay et Palay, 1971; Palay et Chan-Palay, 1974).
Mais la caractéristique la plus distinctive des cellules de Golgi se rapporte à leurs axones: de un à trois prolongements axonaux émergent du corps cellulaire ou des dendrites primaires et se divisent dichotomiquement à angle droit à peu de distance de leur origine (Palay et Chan-Palay, 1974). La couche granulaire comporte ainsi un plexus axonal dense pour lequel... " il est presqu'impossible de suivre la totalité de l'arborisation, tant sont abondantes, flexueuses et entortillées ses ramifications...." (Ramon y Cajal, 1890). Les boutons axonaux de la cellule de Golgi forment des synapses sur les dendrites des cellules granulaires à l'intérieur de zones denses situées à la périphérie du glomérule (Ramon y Cajal, 1911; Fox et al., 1965) Le neurotransmetteur vraisemblablement utilisé est le GABA (Tran et Snyder, 1979; Kingsbury et al.,
1980; Hetzel et Smith, 1981). Au pourtour des glomérules, les axones des cellules de Golgi s'amincissent et ne mesurent qu'environ 0.2 pm d'épaisseur (Palay et Chan-Palay, 1974). Ils ne contiennent alors que des neurofilaments, des microtubules, quelques mitochondries et des vésicules synaptiques.
Le périkaryon de cette cellule comprend un noyau excentrique, amplement invaginé, et a la forme la plus irrégulière des noyaux des cellules du cortex cérébelleux. Le nucléole est gros et rond. On observe aussi, dans le corps cellulaire, des microtubules, des mitochondries en périphérie du noyau et de nombreux corps de Nissl distribués dans un volumineux cytoplasme (Palay et Chan-Palay, 1974).
Quant aux dendrites des cellules de Golgi, elles sont composées des mêmes organites que ceux du corps cellulaire, avec une distribution plutôt linéaire. Cependant, à mesure que les dendrites se ramifient, la distribution de ces organites devient périphérique, les corps de Nissl disparaissent et les microtubules deviennent plus évidents (Palay et Chan-Palay, 1974).
- Le glomérule cérébelleux ou "synaptique”
Cette entité complexe, que l'on retrouve dans toute l'épaisseur de la couche granulaire, n est pas un type cellulaire, mais plutôt une association synaptique très perfectionnée. En effet, le glomérule cérébelleux se compose toujours dune rosette des fibres moussues, fibres que nous décrirons dans la section ultérieure, et de prolongements dendritiques de plusieurs cellules granulaires, prolongements aux extrémités particulières en forme de "serres d oiseaux décrites précédemment. De nombreux boutons axonaux des cellules de Golgi viennent aussi s'apposer à ces ramifications dendritiques pour y faire synapse. Lensemble de ces éléments est entouré d'une mince couche de cellules gliales, laquelle met en évidence le caractère unitaire du glomérule cérébelleux.
Ce dernier est de forme ovoïde ou polyédrique avec un diamètre d’au plus 20 gm (Eccles et al., 1967). Il est occupé, en son centre, par la rosette d une fibre moussue, cette spécialisation synaptique en forme d'excroissance bulbeuse d'où émergent plusieurs petites ramifications (Palay et Chan-Palay, 1974). Cette rosette peut apparaître le long d'une fibre moussue, aux branchements des collatérales, ou à son extrémité (Ramon y Cajal, 1911). Elle se développe le plus fréquemment aux noeuds de Ranvier, mais ne constitue pas nécessairement une terminaison de la fibre moussue puisque cette dernière peut quitter le glomérule à son pôle opposé et retrouver sa gaine de myéline (Eccles et al., 1967; Palay et Chan-Palay, 1974). La rosette d'une fibre moussue contient de nombreux neurofilaments, quelques microtubules et plusieurs mitochondries, en plus des vésicules synaptiques sphériques (Muganini, 1972; Palay et Chan-Palay, 1974). Le neurotransmetteur utilisé par la majorité des fibres moussues demeure inconnu (Hetzel et Smith, 1981), bien que quelques-unes de ces fibres aient été identifiées comme étant cholinergiques (Kan et al., 1980).
Enfin, mentionnons que le glomérule cérébelleux, complexe synaptique de structure standard, se compose d'éléments présynaptiques, soit la rosette d une fibre moussue et les boutons axonaux des cellules de Golgi, et d éléments postsynaptiques, soit les prolongements dendritiques des cellules granulaires (Ito, 1984).
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■ Les fibres moussues
Caractérisées par leurs terminaisons en forme de mousse à l'intérieur de la couche granulaire, les fibres moussues composent les deux tiers des axones myélinisés du cervelet. Tout au long de leur course dans la matière blanche, les axones de ces fibres émettent des collatérales, autant que 20 à 30, pouvant se projeter dans plusieurs folia avoisinants (Ramon y Cajal, 1889; 1890; 1911). Une seule fibre moussue "couvre" donc une vaste étendue du cortex cérébelleux, étendue pouvant même se superposer au territoire innervé par une fibre voisine. De plus, les fibres moussues constituent la source principale différences au cervelet, et chacune de ces fibres produit jusqua environ 16 rosettes, ces dernières étant leurs terminaisons spécifiques décrites précédemment, qui contactent quelques 28 dendrites des cellules granulaires. Par conséquence, chaque fibre moussue rejoint une moyenne d'environ 448 cellules granulaires (Ito, 1984). Cette vaste divergence des fibres moussues pourrait nous laisser supposer que l'information qu'elles véhiculent s'étend de façon diffuse pour un territoire donné. Cependant, une simulation sur ordinateur, basée sur des paramètres morphologiques et fonctionnels recueillis jusqu à ce jour sur les différents neurones corticaux de la grenouille, a permis de démontrer qu'il en était autrement. En effet, cette simulation des connexions cellulaires entre les fibres moussues et les cellules granulaires suggère qu'un faisceau de fibres moussues déchargent sur un certain groupe de cellules granulaires (Pellionisz et al., 1977). Il semblerait donc que malgré l'absence de caractéristiques morphologiques distinctives, les différents relais synaptiques fibre moussue-cellules granulaires" pourraient agir fonctionnellement de manière spécifique (Ito, 1984).
De façon générale, on distingue 2 classes de fibres moussues: celle comprenant les axones des fibres ayant un diamètre d'environ 1.5 pm, et celle des axones ayant un diamètre approximatif de 0.4 pm (Palay et Chan-Palay, 1974). Selon ces auteurs, les fibres moussues les plus minces donnent naissance au même type d'excroissances bulbeuses que les fibres plus épaisses. Une étude faite parBrodai et Drabl0s (1963), démontre cependant que la majorité des terminaisons des fibres moussues des lobules postérieurs du cervelet de rats et de chats adultes seraient différentes de celles du reste du cortex cérébelleux: ces terminaisons seraient plus massives et plus grossières
que celles observées dans les autres lobules. Par contre, Palay et Chan-Palay (1974), affirment ne pas avoir constater une telle différence dans leurs préparations et attribuent plutôt ces changements d'aspect aux méthodes d'imprégnation (Golgi).
Quant à la distribution des fibres moussues au cortex cérébelleux, des différences sont clairement observées selon la source des afférences. Par exemple, les projections de la voie spinocérébelleuse dorsale se regroupent en régions corticales plus petites que celles provenant de la voie spinocérébelleuse ventrale (Lundberget Oscarsson, 1960; 1962). De plus, et pour un même lobule, certaines terminaisons, telles que celles des fibres de la voie réticulo-cérébelleuse, sont plus abondantes dans les régions situées près de la surface du cortex cérébelleux, alors que d’autres fibres, comme celles de la voie spinocérébelleuse dorsale, sont en plus grand nombre dans la région basale du lobule. Ces deux sources de fibres ont même une distribution préférentielle à l'intérieur de la couche granulaire, les fibres d'origine spinale projetant dans la partie inférieure de la couche, et inversement pour celles d'origine réticulaire (Eccles et al., 1967).
Les premières données sur l’origine des fibres moussues furent obtenues par Miskolczy (1931), à l'aide de la dégénération secondaire, qui mit en évidence les fibres d'origine spinale. Mais c’est Szentâgothai (1962), qui démontra, en utilisant la procédure de Nauta, que les projections réticulo-cérébelleuses sont des fibres moussues. Mentionnons simplement que les fibres moussues sont d'origine vestibulaire, pontique, spinale et réticulaire (Ito, 1984).
Les fibres moussues d'origine réticulaire sont celles qui intéressent la présente étude, et plus particulièrement les afférences provenant du noyau réticulaire latéral (NRL). Situé dans la moelle allongée, près de l’olive inférieure, ce noyau se divise en trois parties: magnocellulaire, parvicellulaire et subtrigéminale situées respectivement en position médiane, latérale et rostrale (Brodai, 1956). La taille des neurones du noyau réticulaire latéral varie de moins de 10 pm à plus de 60 pm, la majorité des neurones ayant une taille inférieure à 40 pm (Dietrichs et Walberg, 1979). Ce noyau reçoit de 1 information du cortex cérébral, de structures supraspinales, mais surtout de
10 la moelle épinière; il agit donc en tant que voie spinocérébelleuse indirecte (Ito, 1984). Quant aux projections qu’il émet vers le cervelet, Clendenin et al. (1974b) auraient démontré électrophysiologiquement que les cellules du NRL distribuées à travers les parties parvi- et magnocellulaires envoient des terminaisons au lobe antérieur ainsi qu’aux lobules pyramis et paramédian. Dietrichs et Walberg (1979) soutiennent cependant que ces projections sont bilatérales, avec une prédominance homolatérale, la bilatéralité étant davantage 1apanage des cellules projetant au lobe antérieur (Clendnin et al., 1974a). Une étude, comportant l'utilisation de la peroxidase du raifort (Brodai, 1975), révèle, entre autres, que la zone médiane du NRL (magnocellulaire) projette dans la partie caudale du lobe antérieur. Des résultats plus récents (Dietrichs et Walberg 1979) démontrent plus particulièrement que les neurones du NRL, qui envoient des terminaisons dans le vermis du lobe antérieur du cervelet, sont localisés dans les parties médiane et rostrale du noyau (magnocellulaire et subtrigéminale), alors que ceux projetant dans les zones intermédiaire et latérale du cortex se situent caudalement et latéralement à l'intérieur de la partie magnocellulaire. Toutes ces données revêtent une certaine importance pour la présente étude quant au choix du lobule à analyser et à la quantité de traceur à injecter dans ce noyau; ces détails seront présentés plus loin.
Mais la signification de cette spécialisation morphologique et fonctionnelle des fibres moussues du NRL demeure matière à discussion. Künzle (1975) et Chan-Palay et al. (1977) ont cependant poussé plus avant nos connaissances sur ce noyau en démontrant, par traçage axonal autoradiographique, un profil de projections en zones longitudinales à travers le lobe antérieur, profil ressemblant à celui des projections des fibres grimpantes.
En fait, plusieurs études anatomiques, physiologiques et biochimiques ont révélé une distribution parasagittale des diverses projections au cortex cérébelleux. Les résultats de recherches sur la myéloarchitecture du cervelet chez le chat (Voogd, 1964), le furret (Voogd, 1969) et la souris (Marani, 1982a), 1 étude de dégénération antérograde des projections corticonucléaires chez le lapin (Van Rossum, 1969), et celle utilisant la peroxidase du raifort comme traceur rétrograde chez le chat (Voogd et Bigaré, 1980), établissent un profil de
sept principales bandes parasagittales. En fait, tant les fibres grimpantes que les fibres moussues exhibent une distribution en forme de bandes longitudinales à travers le cortex cérébelleux (Ekerot et Larson, 1973; 1980; Rushmer et al., 1980; Brodai et Walberg, 1977; Chan-Palay et al., 1977; Eisenman, 1981; Robertson et Laxer, 1981; Rubiaet Tandler, 1981; Robertson et al., 1982; Yaginuma et Matsushita, 1986; Heckroth et Eisenman, 1988). De plus, plusieurs marqueurs intrinsèques révèlent une activité enzymatique ayant ce type de distribution spatiale: la cytochrome oxidase (Hess et Voogd, 1986; Leclerc et al. 1990 ), la 5'-nucléotidase, marqueur des cellules gliales de la couche moléculaire (Scott 1965; 1969; Marani, 1982b; Eisenman et Hawkes, 1989), et l'acétylcholinestérase, utilisée chez le rat, le singe et le chat (Ramon- Moliner, 1972; Brown et Graybiel, 1983; Boegman et al., 1988), dévoilent une alternance de bandes positives et négatives, organisées dans le sens antéropostérieur du cervelet. L'immunocytochimie a aussi permis d'observer l'organisation hétérogène et compartimentale du cortex cérébelleux. Ainsi trois populations distinctes de cellules de Purkinje ont pu être identifiées chez le lapin, le rat et la souris, à l'aide d'anticorps dirigés contre la GAD (enzymes de synthèse du GABA) la motiline et la taurine (acide sulfînique de cystéine décarboxilase) (Chan-Palay et al., 1981; Chan-Palay et al., 1982; Nilaver et al., 1982). L immunoréactivité de ces cellules forme, en effet, un profil en minces bandes parasagittales, à l'intérieur du vermis des lobules I à IV.
Plus récemment, la production d'anticorps monoclonaux, selon la technique de Kôhler et Milstein (1975), a permis de franchir une autre étape pour comprendre la signification de la compartimentalisation, tant anatomique que fonctionnelle, du cortex cérébelleux. Dans cette optique, un anticorps monoclonal a été élaboré dans nos laboratoires (Hawkes et al., 1985; Hawkes et Leclerc, 1987), que l'on a baptisé mabQ113 (anticorps dirigé contre un antigène nommé Zebrin I), et qui révèle une organisation en sept bandes parasagittales des cellules de Purkinje. Ainsi, les bandes immunopositives sont identifiées par la lettre " P+ ", et débutent avec une première bande, au centre du vermis: Pl+. Suivent, de chaque côté du vermis, les bandes P2+,P3+> etc...jusqu'à P7+ dans chacun des hémisphères (Fig. 1). Cet anticorps se lierait à un polypeptide encore inconnu et ayant un poids moléculaire d'environ 120 KD. Ce polypeptide n'est apparent que dans un certain groupe de cellules de Purkinje, et se retrouve sur le corps cellulaire, les dendrites et
12 leurs épines, ainsi que sur les axones et leurs collatérales. De plus, les bandes de cellules positives pour l'anticorps sont symétriques pour chaque hémi cervelet et fortement reproductibles d’un animal à l'autre. L'intensité du marquage semble aussi plus élevée dans le vermis que dans les hémisphères cérébelleux. Les bandes de cellules de Purkinje immunopositives sont séparées entre elles par des bandes similaires de cellules immunonégatives (Hawkes et al., 1985; Hawkes et Leclerc, 1986; 1987).
Faisant suite à cette découverte, des études comparatives ont été entreprises afin d'établir une correspondance possible entre la compartimentalisation des cellules de Purkinje et celles de diverses composantes cérébelleuses, dévoilées antérieurement (Gravel et al., 1987; Boegman et al., 1988; Eisenman et Hawkes, 1989; Leclerc et al., 1990 ). Les résultats ont tous démontré que les limites des compartiments de cellules de Purkinje se superposent aux limites des compartiments obtenus pour d’autres éléments du cervelet: AChE, 5'-nucléotidase, cytochrome oxidase et projections olivocérébelleuses. Toutes ces études tendent aussi à démontrer que la distribution de Zebrin I correspondrait aux plus fines divisions parasagittales présentes au cervelet. Cependant, l'étude de Gravel et Hawkes (1990), portant sur la comparaison de la distribution des fibres moussues spinocérébelleuses avec la compartimentalisation des cellules de Purkinje, révélée par mabQ113 chez le rat, a démontré des résultats quelque peu différents. En effet, la distribution des projections de ces fibres moussues définit des zones parasagittales plus petites que la compartimentalisation des cellules de Purkinje. De plus, la topographie des terminaisons axonales serait différente pour certains lobules, en considérant les faces dorsale ou ventrale de ces derniers (par rapport à la matière blanche, sur une coupe en plan frontal). Dès lors, il semblerait que la compartimentalisation des fibres moussues, dans le cervelet, soit soumise à des règles plus complexes que nous devons élucider.
Nous tenterons donc de préciser les connaissances déjà acquises en établissant la topographie de fibres moussues provenant d'une source différente, celle de la projection du noyau réticulaire latéral, et nous
examinerons sa correspondance possible avec la compartimentalisation de Zebrin I+'_ chez le rat adulte.
1. Mossy fïbers projection from the latéral reticular nucléus hâve a parasagittal band distribution in the granular layer of the rat cerebellar cortex: Glomerular distribution compared with Purkinje cell compartments.
Lynn COUILLARD and Richard HAWKES
Départaient of Biochemistry and Laboratory of Neurobiology Faculty of Medecine, Laval University
Sainte-Foy, Quebec, Canada
Key words: Latéral reticular nucléus (LRN), mossy fîber, cerebellum, sagittal distribution, monoclonal antibody.
Running title: Mossy fîber distribution in the rat cerebellum. Projections from the LRN to the rat cerebellum.
1. 1 ABSTRACT
Parasagittal parcellation of the cerebellar cortex has been demonstrated in numerous studies using, for instance, histochemical and immunological techniques, rétrogradé and anterograde transport of tracers, somatotopic mapping and electrophysiological recording. We hâve shown in previous studies that the distribution of a monoclonal antibody recognizing Zebrin I correlated with acetylcholinesterase, 5'-nucleotidase and cytochrome oxidase activities in the cerebellum. Furthermore, we observed that the longitudinal zonation of Zebrin I revealed by mabQ113 resulted from its récognition of a spécifie subset of Purkinje cells. We hâve injected an anterograde tracer into the latéral reticular nucléus (LRN) to compare the distribution ofthis mossy fiber source with the Purkinje cell compartments, using.the distribution of Zebrin I as a reference frame. Analysis of lobule Ilia and Illb ofthe anterior lobe vermis demonstrates that LRN terminais are generally concentrated beneath half of Zebrin I non-immunoreactive areas, forming parasagittal- oriented bands in the granular layer. While the lower thoracic-higher lumbar (LTHL) mossy fîbers terminate beneath the Purkinje cell bands Pi+ and P3+, terminais from the LRN were absent of these two areas, suggesting a possible complementarity of both projections. Interestingly, a constantly dense and clear eut LRN mossy fiber band extends over the latéral half of the ipsilateral Purkinje cell band P2+ and the médial half of the P2’ band, leading to a further subdivision of the Zebrin I domains. Thus, these results seem compatible with the microzone concept suggested by Oscarsson (1976).
Many anatomical, electrophysiological and biochemical studies hâve demonstrated that the mammalian cerebellar cortex is divided into parasagittal bands and patches. Some intrinsic markers, such as acetylcholinesterase (AChE) staining in rats (Boegman et al., 1988), cats (Ramon-Moliner, 1972; Marani and Voogd, 1977; Marani, 1982b; Brown and Graybiel, 1983) and monkeys (Hess and Voogd, 1986) hâve confîrmed this finding. Other histochemical stains were done using cytochrome oxidase, a marker ofail types of cells,(Hess and Voogd, 1986; Leclerc et al., 1990) and 5 ’-nucleotidase, which stains glial cells in the molecular layer, (Scott, 1963; 1964; 1965; 1969; Marani, 1982b; Eisenman and Hawkes, 1989). The architectural heterogeneity of the cerebellum has also been revealed using antibodies against cysteine-sulfinic acid decarboxylase (Chan-Palay et al., 1982), and an antibody against synthetic porcine motilin which selectively stains a subset of Purkinje cells (Chan-Palay et al., 1981; Nilaver et al., 1982).
The development of monoclonal antibodies has also provided prime tools to reveal the cerebellar compartmentation. MabQ113 (anti-Zebrin I) recognizes a polypeptide of apparent molecular weight 120 kDaltons in a subset of Purkinje cells (Hawkes et al., 1985). It reveals immunoreactive cells organized into parasagittal bands extending throughout the anteroposterior extent of the cerebellum, separated by non-immunoreactive cell bands. The immunopositive bands are identified by the letter " P+ ", with a first Purkinje cell compartment, in the middle of the vermis: P]+. On each side of the latter are P2+, P3+, etc... up to P7+ in the hemispheres (Fig. 1). A total of seven confîrmed bands can be shown in each hemicerebellum, and this pattern is highly reproducible from animal to animal (Hawkes et al., 1985; Hawkes and Leclerc, 1987). Antigenic heterogeneity in the Purkinje cell population can also be demonstrated with another monoclonal antibody produced in our laboratory: anti-zebrin IL Sharing the same properties as mabQ113, anti-zebrin II has an apparent molecular weight of 36 kDaltons and has been studied in the fîsh and in the rat (Brochu et al., 1990). Ail these data provide important dues as to the architectural organization of the cerebellum. But studies using retrograde/anterograde transport of tracers, or electrophysiological mapping hâve revealed that a parasagittal functional
18 organization also exists for the afferent and efferent pathways, including studies on the climbing fiber projections from the inferior olive (Voogd, 1964; 1969, Oscarsson, 1969; 1980; Van Gilder and O'Leary, 1970; Armstrong et al., 1974, 1982, Courville, 1975; Brodai et al., 1975; Brodai, 1976; 1980; Oscarsson and Sjolund, 1977; Groenewegen and Voogd, 1977; Chan-Palay et al., 1977; Courville and Faraco-Cantin, 1978; Andersson and Oscarsson, 1978a,b; Brown, 1980; Eisenman, 1981; Beyerl et al., 1982; Eisenman et al., 1983; Sotelo et al., 1984), and those on various mossy fiber afferents (Voogd, 1969; Scheibel, 1977; Chan-Palay et al., 1977; Yaginuma and Matsushita, 1986). The climbing and the mossy fiber sources send projections to the molecular and the granular layers respectively, and are distributed according to a parasagittal band-like topographical organization (Gravel et al., 1987; Gravel and Hawkes, 1990).
Therefore, the diversity of compartmentation maps existing in the cerebellar cortex raises the question ofthe interrelation between structure and function in the cerebellum. Actually, the answer to such a question is still unknown because of the lack of data. An important step towards the understanding of the relationship existing between structure and function cornes from studies comparing the distribution ofclimbing and mossy fibers afferent projections with the Purkinje cell compartments as revealed by anti-Zebrin I (mabQ113: Gravel et al., 1987; Gravel and Hawkes, 1990). Using Zebrin I as a frame of reference, small injections in the inferior olivary complex hâve demonstrated that the boundaries of climbing fïbers compartments are superposed on those of the zebrin 1+ Purkinje cell clusters. Gravel and Hawkes (1990) also found that the mossy fiber spinocerebellar projection, which is more concentrated in the vermis from lobules II to V and in lobule VIII, is comparable to the parasagittal band-like organization of Purkinje cells présent in the cerebellum. As a matter offact, some terminal field boundaries coïncide well with the Zebrin I compartments. But this is not true for ail the mossy fiber and Zebrin I compartments of a same lobule. Discrepancies observed between some mossy fiber and Zebrin I compartment boundaries may hâve resulted from collaterals originating from other mossy fiber sources. Indeed, the latter fibers may hâve different patterns of distribution in the cerebellar cortex. Moreover, Gravel and Hawkes (1990) noted that the spinocerebellar terminais observe a complex distribution which is different for
the dorsal and ventral aspects of the folia in some lobules. This particular distribution ofspinal projections could be due to an intrinsic lamination of the white matter during postnatal development. Thus, the more dorsal spinal axons could hâve been naturally guided to the dorsal aspect of the lobule, and vice versa for the more ventral spinal axons (Gravel and Hawkes 1990, Fig. 15). Other mossy fibers projections such as the latéral reticular nuclei (LRN) hâve been investigated in the cerebellum (Künzle, 1975; Russchen et al., 1976; Chan-Palay et al., 1977). These projections reveal a longitudinal organization in the granular layer of the cerebellar cortex, but no comparison has been made with a reference frame such as Zebrin I parasagittal bands. Consequently, the présent study will try to establish the relationship between Zebrin I +/- compartmentation (mabQ113) and LRN mossy fiber terminal fields in the cerebellum.
1.3 MATERIALS AND METHODS
1.3 1 Wheat germ agglutinin-horseradish peroxidase (WGA-HRP) copjugate injectionsin the latéralreticular nucléus (LRN).
Six adult rats between 250 and 350 g body weight were anesthetized using chloral hydrate (lml/kg) and immobilized in a stereotaxic apparatus. Posterior neck muscles and the posterior atlanto-occipital membrane were removed to expose the medulla oblongata and the obex. Following Paxinos and Watsons' stereotaxic coordinates, a unilatéral injection at the site of the latéral reticular nucléus was performed with a 30 degree angular approach from the back. 30 ni of a 3% saline solution of WGA-HRP were injected using a 1 pl Hamilton syringe. Depending on the position of the arteries, the animais received the injection on the right orthe left side of the medulla.
1.3.2 Perfusion and sectioning
Animais overdosed with sodium pentobarbital were fixed, 48 hours after the injection, by transcardiac perfusion. A volume of 100 ml of a 0.9% saline solution was first passed through the ascending aorta, followed by 300 ml of Graham and Karnovsky's fïxative solution consisting of 1% formaldéhyde and 1.25% glutaraldehyde in phosphate buffer (PB:0.1M, pH 7.4). A final wash was also performed using 100 ml of PBS in order to remove the fixative solution from the circulation. Immediately after perfusion, the brain and the cervical part of the spinal cord were dissected. The anterior lobe of the cerebellum and the medulla, which contained the injection site, were then frozen on a stage micro tome and eut at 50 pm in the coronal plane. Serial sections ofboth tissues were stored in cold PBS for histochemical and immunocytochemical staining. 1.3.3 Histochemical and immunocytochemical staining
The anterogradely transported peroxidase to the cerebellum, as well as the peroxidase in the injection site, were revealed using tetramethylbenzidine (TMB) as chromogen (Mesulam,1982). Sections were then dehydrated through a graded éthanol sériés and mounted in Permount. Alternated sections of the cerebellum were prepared for immunocytochemistry while sections from the medulla were conterstained with neutral red. The monoclonal antibody anti- Zebrin I, which selectively recognizes a polypeptide présent in a subpopulation
of Purkinje cells (Hawkes et al., 1985; Hawkes and Leclerc, 1987), was used as a reference frame to compare the distribution ofLRN terminais and Purkinje cell compartments, in the cerebellum. Alternated sections were first incubated overnight in the monoclonal antibody diluted 1:1000 with a 5% solution of milk in 0.4M PBS pH 7.4. Following 3 rinses of 10 minutes each in PBS 0.1M pH 7.4, spécifie antibody binding was detected by incubating sections for 2 hours in peroxidase-conjugated rabbit-anti-mouse immunoglobulins diluted 1:200 in a 5% solution of milk in 0.2M PBS pH 7.4. After 3 other rinses in PBS, immunoreactivity was revealed using TMB (Mesulam, 1982), and sections were then dehydrated before being mounted in Permount.
1.3.4 Distribution of LRNterminalfîelds andPurkinjecell compartments: three-dimensional reconstruction.
Primarily, a sériés of consecutive sections of the anterior lobe displaying well defined bands of mossy fiber terminal fîelds was chosen. In order to identify the section levels with respect to lobulation, caméra lucida drawings were produced from the alternated sections tested for zebrin I. Drawings were aligned as regards to the outlines of the molecular layer, their blood vessels and general contours before being digitized with a graphie tablet. A mid- vermal sagittal view was then obtained using the 3-dimensional reconstruction software package (PC3D:Jandel Scientifîc, CA), and served to illustrate the région of the anterior lobe that had been analyzed and reconstructed.
Reconstruction in the cerebellar vermis of the distribution ofLRN
terminal fîelds and Zebrin I+ Purkinje cell compartments was also performed with caméra lucida drawings. A first set of drawings, including again
outlines of the molecular layer and blood vessels, served for the Zebrin 1+ Purkinje cell compartments identification. Another sériés of caméra lucida drawings, using alternate sections reacted with TMB without antibodies and which included here the granular layer and blood vessels, was performed at the same magnifîcation to identify the LRN terminal fîeld distributions. In both cases, a dash delineated the Zebrin I compartmentation's and LRN terminal fîeld's width at the junction of the granular and molecular layer. After being checked at higher magnifîcation, the two sets of drawings were
22 aligned and digitized using the graphie tablet in order to be processed with the 3-D reconstruction software.
1.4 1 General considérations.
We hâve compared the zonal organization of LRN terminais to that of the immunopositive and négative populations of Purkinje cells, présent in the adult rat cerebellar cortex, using interdigitized maps. The vermis of lobules III A and III B were analysed because both Purkinje cell and LRN terminal lontitudinal bands were more évident in those lobules, and despite the presence ofLRN mossy fiber bands in the intermediate cortex (Fig. 3A).
Findings were based on two computerized comprehensive reconstructions, while four other animais were used to verify the generality of the conclusions. Interdigitized maps were used to describe the results because of the possibility tovisualize the two types of parasagittal bands throughout the longitudinal extent of lobule III A and III B. Moreover, this method, employing caméra lucida, has permitted to better discriminate particular structures such as LRN clusters. Consequently, photomontages (Figs. 6 to 9) were used to illustrate typical results, while interdigitized maps served to analyse cumulated data.
According to Paxinos (1985) and Hrycyshyn et al. (1982), lobule III of the anterior lobe receives abundant projections from different parts ofthe LRN, but mainly from the border area located between its parvocellular and magnocellular divisions. Based on these considérations, we hâve therefore chosen to analyse only lobule III.
Typically, LRN projections to the rat cerebellar vermis are distributed as three to fïve parasagittal bands flanked on each side of the immunopositive Zebrin I Pi+ band. However, a lower number of bands were observed on the contralatéral side since the most latéral band was usually missing from the LRN projection patterns.
Finally, a detailed description of each of the analysed territories is included in the results because of the possibility then offered to better estimate the value of the general features summarized in the discussion. Moreover, a
24 global description would not involve many significant particularities and thus, would not permit to establish interindividual différences.
Spécifie abbreviations were used to describe the analysed territories, for exemple, 53L3AD represents the dorsal face (D) of lobule III A (L3A) in animal #53.
1.4.2 Injection sites
Ail the LRN WGA-HRP injections were performed according to Paxinos and Watson's atlas. Because of the position of the vertébral arteries, somes animais, such as rat #53, recrived an injection on the right side (Fig. 4B) while others, such as animal #54 received one on the left side (Fig. 5B). Since the LRN is very small, volumes of tracer (30 ni) were large enough to ensure global reach of ail its neurons.
Frontal sections of both sites (animais #53 and #54) were processed with TMB and showed a similar stretch of the tracer over adjoining areas. Alternate sections of the medulla counterstained with neutral red (Figs. 4A, 5A) allowed us to establish that the rostrocaudal extension of injection sites was similar for ail animais, with a total lenght of approximately 1750 gm for both animal #53 and #54. Based on the position of the inferior olivary nucléus (Paxinos and Watson, 1986) and on that ofthe LRN (Kapogianis et al., 1982), the neutral red counterstained sections permitted to establish that the injection sites almost reached the mid-olivary levai, point at which therostral part of the LRN terminâtes, and included LRN's most caudal part. Furthermore, this pôle of the LRN is composed entirely of the parvocellular division, while the magnocellular part, which begins a few micrometers rostrally, constitutes the greater mass of this nucléus.
However, parts of different mossy fiber sources may hâve been reached since the amount of tracer was large: the rostroventrolateral and caudoventrolateral reticular nucléus, the médial part ot the spinal trigeminal nuclei, the gigantocellular and intermediate reticular nucléus, the parvocellular reticular nuclei and part a part of the ambiguus nuclei.
1.4.3 General distribution oflabelledLRN mossy fîbers and terminais.
In the rat, LRN labelled fîbers sweep upwards along the latéral surface of the medulla into the ipsilateral inferior cerebellar peduncle and pass through the cerebellum between the latéral and interpositus nuclei. LRN labelled fîbers travel within the white matter above the deep cerebellar nuclei, and some axons terminate in the ipsilateral latéral and interpositus nuclei while the majority of LRN mossy fîbers terminate within the ipsilateral granular cell layer of the cerebellar cortex.
Most areas of the cerebellar cortex receive fîbers from the LRN which terminate in narrow sagittal bands, and the most abundant projection terminâtes within the anterior lobe vermis and lobule 8 (pyramis) of the posterior lobe. The LRN projection is topographically arranged and conducts information which is employed in the cerebellar control of motor activity (Chan-Palay et al., 1977; Eisenman, 1982; Hrycyshyn et al., 1982). The dorsal aspect ofthe LRN sends a modest inputto the cerebellar hemispheres.
The caudal lobules of the anterior lobe vermis receive fîbers from neurons within the more médial LRN, while cells more laterally situated in the LRN send fîbers to the more rostral lobules of the anterior lobe. Thus, lobules 4 and 5 receive inputs mostly from the magnocellular division, but also from the subtrigeminal division of the LRN, and lobules 2 and 3 receive inputs mainly from cells lying between the parvocellular and magnocellular divisions of the médial LRN.
Moreover, there appears to be overlapping of pools of neurons which Project to the three main subdivisions of the cerebellum: the anterior and posterior lobe vermis and the hemispheres. Indeed, Payne (1983) found collateralization between LRN projections to the simple lobule and adjacent Crus I using the fluorochrome double labeling technique. Consequently, it appears that each mossy fiber can divide repeatedly into divergent collaterals projectingto both side of the cerebellum.
The LRN is primarily involved in the spinoreticulocerebellar pathway, but appears to be also an intermediate relay in the spino-olivocerebellar
26 pathway: a minor projection from the LRN terminâtes in the contralatéral inferior olive (Brown etal., 1977).
Neurons of the LRN hâve not demonstrated to be noradrenaline or adrénaline containing cells, but there are indications that some LRN neurons are proline (Cuénod et al., 1982) and possibly serotonin (Hunt and Lovick, 1982) containing cells.
1.4.4 Descriptions of interdigitized maps of analysed territories 1.4.4.1 53L3AD
The dorsal face of the lobule IIIA reveals an arrangement of five main parasagittal mossy fiber bands. These bands extend throughout the thickness ofthe granular layer and are found across the vermis and in the inter médiate cortex. Concerning the zebrin 1+ bands, a médian Pl+ is flanked on each side by P2+ while we hâve considered P3+ and P4+ (in the 3D reconstructions) on the ipsilateral side (right side). Pl+ is 1 to 2 Purkinje cells wide, P2+ is 2 to 3 while P3+ and P4+ are 3 to 5 cells wide.
Mossy fiber bands overlap positive and négative Purkinje cells bands: for example, P2+ on the contralatéral side for which the mossy fiber band is almost centered beneath the latter, but extends also under the latéral half of Pi". On the ipsilateral side, P2+ is divided by two mossy fiber bands that run more or less parallel in the sagittal plane, and extend to the latéral half of Pi' for one band and to the médial half ofP2" for the other. In the région of the intermediate cortex, P4+ is also overlapped by two bands ofmossy fibers, but the latter seem to cross at the medio-rostrocaudal level. The only exceptions are P1+ and P3+ for which no LRN terminal fîelds run under zebrin 1+ compartments (except for the most caudal part of P3+). In addition, the mossy fiber terminal fields seem to be larger in the caudal portion of this lobule. The clearest and most dense mossy fiber band is located in the ipsilateral cortex and overlies the latéral halfof P2+ and the médial halfof P2".
1.4.4.2 54L3AD
In lobule IIIA ofthis animal, only three mossy fiber bands of the dorsal face could be clearly identified. Terminais on the ipsilateral side (left side) form a very broad band between P1+ and P2+, extending almost through the Pl" compartment within the rostral and médial portion ofthe lobule. A second latéral field of LRN projection stretches sagittally on the ipsilateral side between P2+ and P3+. At the rostral level of the lobule, this band extends through the médial half of P2- while it stretches out under the latéral half of P2" at the caudal level.
On the contralatéral side, the rostral portion of the lobule contains terminais centered beneath the Pl" band, but compartments widen in the médial rostrocaudal part. Likewise, this mossy fiber band stops at this level of the lobule and no LRN terminais seem to project in the caudal portion.
In the vermis, however, fîve zebrin I+ Purkinje cell bands run sagittally across the molecular layer of lobule IIIA dorsal, with P1+ astride the midline and two others distributed longitudinally on each side. The most latéral Purkinje cell bands, P3+, are larger than P1+ and P2+ but their latéral limits are more difficult to clearly defîne and their immunoreactivity is much weaker.
1.4.4.3 53L3AV
In animal #53, the LRN projection to the ventral aspect of lobule IIIA demonstrates a pattern ofbands that is similar to those of the dorsal aspect. Indeed, five Zebrin 1+ compartments could be digitalized sagittally towards the lobule, and five mossy fiber bands could also be delineated. On the ipsilateral side (right), a clear eut and dense terminal field of labelled rosettes runs parasagittally under the latéral half of P2+ and the médial half of P2". However, for ail ofits longitudinal extent, P3+ is straddled by a mossy fiber terminal field whereas no LRN projections terminate beneath this Zebrin 1+ band in the dorsal face of this lobule. The next longitudinal Purkinje cell compartments P4+ is also overlapped by labelled LRN terminais, but the latters split in two bands running in a more or less parallel direction, at the medio-rostrocaudal level. A fourth parasagittal mossy fiber band stretches under the médial half of Pl" but extends somewhat onto Pl+- On the
28 contralatéral side (left side), labelled glomeruli occupy the latéral portion of Pr and the médial portion of P2+ except at the medio-rostrocaudal level where the band shifts slightly laterally, under P2+.
1.4.4.4 54L3AV
In this animal, three major mossy fîber terminal fîelds could be clearly delineated and extend across the vermis. Two of them are located on the ipsilateral side (left), between the Zebrin I+ Purkinje cell compartments Pl+/P2+ and between P2+/P3+. The most latéral mossy fîber band runs under the médial half ofP2‘, but straddles slightly P2+ at its most rostral and caudal levels. The second terminal fîeld, on the ipsilateral side, stretches beneath Pi -at the rostral level, but encroaches Zebrin I+ Purkinje cell compartment Pl+ at the medio-rostrocaudal portion of the vermis. At the caudal level, this mossy fîber band straddles somewhat onto Pl+. On the contralatéral side, a third LRN terminal fîeld runs under Zebrin I" compartment Pl" on ail its longitudinal extent.
1.4.4.5 53L3BD
As in lobule IIIA, the dorsal face oflobule IIIB reveals an arrangement of fîve main mossy fîber terminal fîelds. These extend across the vermis in the sagittal plane, amind the fîve Zebrin 1+ compartments ofPurkinje cell.
On the contralatéral (left) and ipsilateral (right) side, bands occupy the latéral portion of Pi-. However, a single cluster of LRN labelled terminais stands the médian P1+ and overlies the médial part of Pl" on each side. This may represent a structural interindividual différence or may be a part ofthe mossy fîber band nearby. On the right side, a broad band runs under latéral P2+/medial P2’ while two other mossy fîber terminal fîelds stretch beneath P3- and P4-. The latters seem to cross atthe medio-rostrocaudal level, but this can be due to the fact that at this level, the two bands share a same cluster of labelled rosettes. In general, there is no labelled LRN terminais beneath P1+ and P3+.
1.4.4.6 54L3BD
The pattern of mossy fïber bands found in the dorsal aspect of lobule IIIB in animal #54 is only slightly different from that found in the dorsal or ventral face of lobule IIIA of that animal. Indeed, three main LRN terminal fields are still présent and extend, in a similar way, among the same positive immunoreactive Purkinje cell bands: on the contralatéral side, one band stretches beneath the latéral half ofPi" and encroaches somewhat P2+; on the ipsilateral side, two LRN terminating zones are situated under Pi" and P2“ on their longitudinal extent. However, there are some extra mossy fïber labelled rosettes overlying, contralaterally and in the rostral portion of the lobule only, the médial half of Pi" and almost entirely the Zebrin 1+ Purkinje cell Pl+. Likewise, on the left side, there is a long stretch devoid of LRN terminais under P2+, which still appears in the ventral and dorsal aspect of lobule III A and in the ventral aspect of lobule IIIB.
1.4.4.7 53L3BV
The longitudinal organization of LRN terminais and Zebrin I positive domains is somewhat different from the ventral face of lobule III B. In particular, while there is scarcely no labelled rosettes under the dorsal P] + and P2+ compartments, the ventral face does show some terminating zones beneath these Zebrin I Purkinje cell compartments. In addition, the positive immunoreactive Purkinje cell domains remain the same, except for the P4+ band on the ipsilateral side, which split in two at the medio-rostrocaudal level: the médial branch joins the P3+ band.
It also demonstrates on the ipsilateral side, mossy fïber terminais under the médial halfof P2" and labelled rosettes beneath the caudal portion ofP3+ and P4+. In the rostral part of those Purkinje cell bands, the terminais are situated under the latéral edge of P3", but shift laterally at the medio-rostrocaudal level to straddle P3+ and the two branches of P4+. On the contralatéral side, there is still a mossy fïber band encroaching the médial half ofP2+ and the latéral half of Pi".
30 1.4.4.8 54L3BV
The most characteristic feature ofthis reconstruction is the width of the main mossy fîber terminal fîeld located beneath Pl" on the ipsilateral side (left side). This broad band occupies almost entirely the rostral and médial portion of the Zebrin I non-immunoreactive band Pl". However, in the caudal part of the lobule, these LRN terminating zones shift to the right side, encroaching the Purkinje cell band Pl+. Still on the contralatéral side, a second mossy fîber band extends between Pl+/P2+* situated under the latéral half of Pl" and straddling somewhat P2+> it does shift medially beneath the médial half ofPl" at the caudal level. Finally, on the ipsilateral side, the most latéral LRN terminais are concentrated under médial P2" and then, at the medio- rostrocaudal level, shift under latéral P2"/P3+- In the caudal portion of the lobule, those mossy fîber aggregates displace again beneath the médial half of P2‘. In addition, there is an extra mossy fîber terminal cluster centered under Pl+, which may be a part of either one of the mossy fîberband beside.
The reproductive staining of Purkinje cell bands with Zebrin I offers a reference frame to study the distribution of projections from the LRN mossy fîbers in lobules IIIA and IIIB of the anterior lobe. Band-like patterns are both obtained with mab Q113 Purkinje cell staining, and following LRN mossy fïber anterograde labeling. This suggests that there may be some correspondence between these two entities. However, we did not observe extensive overlapping of LRN mossy fïber bands with Zebrin 1+ Purkinje cell compartments.
In spite a little of variability in the distribution of terminal fields between the animais, which can be due to some degree of variability between the localization ofinjection sites, the présent study reveals some general features. Indeed, a dense and clear eut LRN mossy fïber band can be observed ipsilaterally under the médial half of Zebrin I" compartment P2", straddling the latéral half of P2+ (mostly animal #53). Interestingly, Gravel and Hawkes (1990) hâve found a similar distribution of the lower thoracic-higher lumbar (LTHL) projections in lobule VIII, but this pattern was never found in the anterior lobe. Two hypothèses were put forward by these authors to explain these results: the origins of the mossy fîbers forthe anterior and posterior lobes may be different, or it could be that Purkinje cells are not identical and thus, P2+ Purkinje cells in the anterior lobe would not be "homologous" with those in the posterior lobe. Another major différence with the pattern observed by these two authors is the absence, in our study, of LRN terminais beneath the Zebrin I P3+ band on the dorsal face of lobules. A similar distribution is obtained for the ventral face of lobules IIIA and IIIB, except for one animal. This can be explained by a possible contamination of collaterals from the spinal mossy fîbers. A non-receiving area is also observed under Zebrin I Pl+, both in the dorsal and ventral aspect, contrary with the distribution of the LTHL terminal projections (Gravel and Hawkes, 1990). However, on the dorsal aspect of lobule IIIB, the région beneath Pi+ shows some mossy fïber projections which are localized to spécifie rostrocaudal régions, according to each animal. The variability ofthese projection sites suggests that they may arise from a contaminating source, probably a spinal source.
The most striking feature concerning the general arrangement of LRN terminais is that they almost invariably subdivide the granular layer under
32 the Zebrin I" compartments for both lobule IIIA and IIIB. In addition, the LRN mossy fiber projections fîlls, in general, only a portion of the non- immunoreactive Zebrin I Purkinje cell bands, sometimes straddling the Zebrin I positive compartments. This could be due to incomplète fîlling of the projection by the tracer injection, but it does not seem to be the case since the LRN is a very small nucléus (1500 pm approx.), and the volumes of anterograde tracer used were large enough (30 ni). Moreover, the reproduction of these results from animais to animais leads to exclude the hypothèse of variability between the localization of injection sites. Thus, because of its refinement, the relative incomplète fîlling beneath the longitudinal Zebrin I' compartments may reflect a certain purity of the LRN projections and thus, demonstrate the mediolateral organization of the mossy fîbers from other sources.
Eccles et al. (1967) hâve suggested that LRN terminais occupy predominantly the more superfîcial strata of the granular layer. Similar results were observed in the présent study (Fig. 2A). Consequently, mossy fîbers distributed to lower portion of the granular layer may resuit from contamination by spinocerebellar mossy fîbers since there is some indirect spinocerebellar patways involving mossy fîbers from the LRN. Moreover, these results were not constantly observed and thus, lead to the conclusion that there possibly could has been some contamination. Nevertheless this différentiation between mossy fîbers from upper or lower strata has never been demonstrated electrophysiologically (Sasaki and Strata, 1967).
But rétrogradé HRP labeling of the mossy fîbers, ascending through the latéral funiculus, hâve revealed spinal inputs to the LRN (Corvaja et al., 1977). These spinoreticular neurons are widely distributed from the cervical to the sacral segments of the spinal cord. Three distinct components of the spinal afferents to the LRN hâve been disclosed electrophysiologically (Clendenin et al., 1974b; Clendenin et al., 1974; 1975). The most dominant is provided by the bilateral ventral flexor reflex tract and terminate bilaterally for the anterior lobe. The second spinal input arises from the ipsilateral forelimb tract which projects, for one, to the ipsilateral intermediate zone of the anterior lobe; a third spinal mossy fiber path projecting to the LRN ascends the dorsal funiculus. Illert and Lundberg (1978) hâve identifîed a fourth spinal afferent to
the LRN which arises from ascending collaterals of the propriospinal neurons while Ekerot and Oscarsson (1976) had excluded the possibility that collaterals of the dorsal spinocerebellar tract activate any major group of LRN neurons. The LRN also receives many other descending projections from the cérébral cortex, the red nucléus, the fastigial nucléus, the superior colliculus, and the latéral vestibular nucléus (Edwards, 1972; Mizuno et al., 1973; Kawamura, et al., 1974; Künzle and Wiesendanger, 1974; Batton et al., 1977; Corvaja et al., 1977; Carleton and Carpenter, 1983).
Ail of these mossy fiber afferents terminating on the LRN can lead to some contamination while injecting this nucléus with anterograde tracer. Nevertheless, the distribution of LRN mossy fiber bands obtained in the présent study compared with the spiny mossy fiber terminal fields revealed by Gravel and Hawkes (1990) is strongly in accordance with the relative purity of the présent latéral reticulocerebellar projection. Indeed, the mossy fiber bands of both sources hâve a significantly opposite distribution in regards to the Zebrin I Purkinje cell bands Pl+, P2+ and P3+ of lobule III (see above). Further studies in which the spinal afferents would be simply transected could verify our statement.
Consequently, the reproducible distributions of terminal field revealed in the présent study describe a mediolateral pattern of longitudinal bands which is consistent with previous descriptions of the LRN and other sources of mossy fiber projections (Chan-Palay et al., 1977; Robertson et al., 1983; Arsenio-Nunes and Sotelo, 1985; Hawkes et al., 1985; Yaginuma and Matsushita, 1986; Gravel et al., 1987; Hawkesand Leclerc, 1987; Gravel and Hawkes, 1990).
Longitudinal zonal organization in the anterior lobe has also been revealed by electrophysiological studies (Ekerot and Larsson, 1979a; b; 1982; Oscarsson, 1979). However, the subdivisions then obtained reveal complex cerebellar somatotopic maps distributed in a patchy mosaic pattern. Those patchy représentations in the cerebellum were both obtained for the climbing fiber evoked responses (Rushmer et al. 1980; Robertson and Laxer 1981; Robertson et al., 1982), and for the trigeminal mossy fiber signais (Shambes, et al., 1978b; Woolston et al., 1981). It is obvious that the mean by which longitudinal compartments are subdivided rostrocaudally is the natural
