Altération des protéines spécifiques du surfactant Pulmonaire au cours de l'Hypoxie et l'Avitaminose. Rôle dans le développement de Pneumocystis carinii

Texte intégral

(1)THÈSE en vue de l’obtention du grade de. DOCTEUR DE L’UNIVERSITE TOULOUSE III Discipline : BIOLOGIE-SANTE-BIOTECHNOLOGIE Présentée et soutenue Par. Marie-France VIVES épouse PLOURDE le 6 décembre 2007 Titre : ALTERATION DES PROTEINES SPECIFIQUES DU SURFACTANT PULMONAIRE AU COURS DE L’HYPOXIE ET L’AVITAMINOSE Rôle dans le développement de Pneumocystis carinii Directeur de thèse: Marie-Claude PRÉVOST. JURY M. Bertrand PERRET M. Daniel CAMUS M. André DAGENAIS M. El Moukhtar ALIOUAT Mme Marie-Claude PRÉVOST. Président Rapporteur Rapporteur Examinateur Examinateur.

(2) « Tous les progrès sont précaires, et la solution d’un problème nous confronte à un autre problème » MARTIN LUTHER KING. À Marie-Claude et à François.

(3) REMERCIEMENTS Je désire tout d’abord exprimer ma gratitude à mon directeur de thèse, Marie-Claude Prévost, pour le support constant dont elle a fait preuve tout au long de ces années. Il lui a fallu beaucoup de courage mon maîtriser le « boulet de canon » que je suis. Je tiens à remercier tous les membres du laboratoire (en particulier Christine, Corinne et Michel) qui m’ont apporté, de près ou de loin, une aide efficace et généreuse. J’adresse tous mes remerciements au Dr Roger Escamilla, Sylvie Caspar-Bauguil , à Brigitte Periquet, Pr Creusy C. et à leur équipe pour leur précieuse contribution à la réalisation de ce projet de recherche. Le recrutement de 150 témoins aurait été impossible sans le concours de Mme Latorzeff, médecin du travail à l’Hôtel Dieu, et M. Vassal, responsable d’un service de Centre d’examens de santé CPAM 31. Le docteur Roger Escamilla a eu pour mission, avec ses collaborateurs cliniciens, de sélectionner les patients atteints de BPCO. Je remercie le Dr A. Saoudi pour les réactifs fournis généreusement, M. Courtage et I. Rouquette pour leur soutien technologique. Enfin, je remercie le Dr E.M. Aliouat et Y. Berthiaume, d’avoir accepté d’évaluer le travail présenté dans cette thèse. Aux, Dr A. Dagenais et B. Perret, merci d’avoir accepté de faire partie du jury. Je demande pardon à Michel P. pour avoir monopolisé sa femme si longtemps. Et enfin parce que remercier ne suffit pas, je dédie cette thèse à ma petite famille François, mon époux, Alexandre et Gabriel, mes enfants..

(4) TABLE DES MATIÈRES LISTE DES TABLEAUX………………………………………………….. 10 LISTE DES FIGURES……………………………………………………... 12. ABRÉVIATIONS…………………………………………………………... 15. INTRODUCTION : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE I LE POUMON : Rappel d’anatomie 1. L’appareil respiratoire………………………………………………………… 18 2. L’alvéole…………………………………………………………….…………….. 18 Pneumocyte de type I………………………………………………………… Pneumocyte de type II…………………………………………………………. 18 18. 3. Macrophage alvéolaire…………………………………………………………. 19. II LE SURFACTANT PULMONAIRE 1. Composition du surfactant pulmonaire…………………………………… 20 1.1. Lipides…………………………………………………………………………. 1.2. Protéines……………………………………………………………………….. 1.2.1. Protéines hydrophyles : SP-A et SP-D...……………………………… 1.2.1.1. Organisation génomique………………………………………….. 1.2.1.2. Structure des protéines……………………………………………. 1.2.1.3. Multimérisation……………………………………………………. 1.2.1.4. Distribution tissulaire……………………………………………… 1.2.2. Protéines hydrophobes : SP-B et SP-C………………………………… 1.2.2.1. Organisation génomique et «processing» de la protéine B ……… 1.2.2.2. Structure de la protéine B…………………………………………. 1.2.2.3. Organisation génomique et «processing» de la protéine C……… 1.2.2.4. Structure de la protéine C…………………………………………. 1.2.2.5. Distribution tissulaire des protéines B et C……………………….. 20 21 21 21 22 25 26 26 26 28 29 31 32. 2. Synthèse et dégradation du surfactant pulmonaire…………………….. 32 2.1. Métabolisme intracellulaire du surfactant…………………………………… 2.1.1. Formation des corps lamellaires………………………………………. 2.1.2. Sécrétion………………………………………………………………… 2.2. Métabolisme extracellulaire du surfactant………………………………….. 2.2.1. Formation de la myéline tubulaire……………………………………. 2.2.2. Conversion des «Large agregates » (LA) en «Small agregates » (SA). 2.3. Recyclage et voie de dégradation……………………………………………... 33 33 33 34 34 34 35. III ROLE DU SURFACTANT PULMONAIRE 1. Rôle Mécanique…………………………………………………………………. 36 1.1. Généralité sur les propriétés tensioactives………………………………….. 1.2. Implication des protéines hydrophobes………………………………………. 36 36 4.

(5) 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4.. Etude des mutations pour la SP-B…………………………………….. Rôle de la SP-B…………………………………………………………. Etude des mutations pour la SP-C……………………………………. Rôle de la SP-C………………………………………………………….. 36 37 38 39. 2. Rôle de Défense………………………………………………………………….. 39 2.1. Généralité……………………………………………………………………… 2.1.1. Définition et implications des différentes cellules de l’immunité…… 2.1.2. Les différents mécanismes de défense………………………………… 2.1.2.1.Défense immunitaire non spécifique……………………………… 2.1.2.2.Défense immunitaire spécifique………………………………….. 2.2. Défense assurée par le surfactant pulmonaire……………………………… 2.2.1. Défense « indirecte »…………………………………………………… 2.2.2. Défense «directe » …..…………………………………………………. 2.2.2.1. Etudes des mutations pour la SP-A……………………………… 2.2.2.2. Rôle de la SP-A……………………………………………………. 2.2.2.3. Etudes des mutations pour la SP-D……………………………… 2.2.2.4. Rôle de la SP-D……………………………………………………. 2.2.2.5. Rôle mineur des protéines hydrophobes…………………………. IV LES COLLECTINES ET LES PATHOGENES 1. Reconnaissance des différents pathogènes par les collectines………. 39 40 42 42 43 44 44 44 44 45 46 48 49. 50. 2. Les récepteurs des collectines……………………………………………….. 52 3. Effets provoqués par la liaison de la SP-A et la SP- D avec les pathogènes ………………………………………………..……………… 53 3.1. Opsonisation…………………………………………………………………… 3.2. Agglutination………………………………………………………………….. 3.3. Altération de la croissance bactérienne……………………………………… 3.4. Régulation de la phagocytose………………………………………………… 3.5. Elimination des cellules apoptotiques……………………………………….. 3.6. Modulateur de l’immunité…………………………………………………… 3.7. Réponse allergique……………………………………………………………. 3.8. NO et Stress oxydatif………………………………………………………….. 3.8.1. NO ……..……………………………………………………………….. 3.8.2. Les réactifs oxydants…………………………………………………... 3.9. Modulation de l’inflammation……………………………………………….. 3.9.1. Effet pro-inflammatoire……………………………………………….. 3.9.2. Effet anti-inflammatoire……………………………………………….. 3.9.3. Rôle spécifique des cytokines …………………………………………. 3.10. Médiateur de la parturition…………………………………………………. 53 53 53 54 55 55 56 57 57 57 58 59 59 60 60. V REGULATION DU SURFACTANT PULMONAIRE 1. Maladie altérant la composition du surfactant pulmonaire………….. 62 1.1. Modification des protéines hydrophiles……………………………………… 62 1.2. Modification des protéines hydrophobes et des lipides……………………… 63. 2. Régulation transcriptionnelle des protéines du surfactant…………… 63 2.1. Eléments régulateurs de la transcription des protéines hydrophiles………. 64 5.

(6) 2.1.1. La protéine A…………………………………………………………… 2.1.2. La protéine D…………………………………………………………… 2.2. Eléments régulateurs de la transcription des protéines hydrophobes…….. 2.2.1. La protéine B…………………………………………………………… 2.2.2. La protéine C……………………………………………………………. 64 64 65 65 67. 3. Facteurs importants pour la régulation du surfactant pulmonaire... 68 3.1. La vitamine A …..…………………………………………………………….. 68 3.1.1. Les effets sur le développement, la maturation et la croissance pulmonaire 3.1.2. Les effets sur la régulation des gènes du surfactant…………………. 70 3.1.3. Les effets sur la défense pulmonaire et l’inflammation……………… 70 3.2. Les glucocorticoïdes…………………………………………………………… 71 3.2.1. Les effets sur le développement, la maturation et la croissance pulmonaire 3.2.2. Les effets sur la régulation des gènes du surfactant…………………. 71 3.2.3. Les effets sur la défense pulmonaire et l’inflammation……………… 72 3.3. Adaptation à l’oxygène………………………………………………………... 72 3.3.1. L’hyperoxie……………………………………………………………... 72 3.3.1.1. L’oxygène régule la synthèse des phospholipides……………….. 73 3.3.1.2. L’oxygène régule les protéines du surfactant……………………. 73 3.3.2. L’hypoxie……………………………………………………………….. 74 3.3.2.1. Les effets sur le poumon…………………………………………... 75 3.3.2.2. L’HAPE(« Hight altitude pulmonary edema»)…………………. 76 3.3.2.3. Les effets sur l’expression des constituants du surfactant pulmonaire 3.3.2.4. Les facteurs impliqués dans la régulation de l’hypoxie…………. 77. VI PNEUMOCYSTIS et PNEUMOCYSTOSE 1. Historique.………………………………………………………………………… 79 2. Pnumocystose……..……………………………………………………………... 79 3. Spécificité d’espèce ……………………………………………………………. 80 4. Morphologie et cycle biologique ……………………………………… 4.1. Morphologie …………………………………………………………………… 4.2. Cycle biologique ………………………………………………………………. 5. Modèles de culture de Pneumocystis …….………………………………… 5.1. Culture in vitro ..………………………………………………………………. 5.2. Modèles animaux ………..…………………………………………………….. 81 81 83 84 84 85. 6. Interaction hôte-parasite……………………………………………………… 6.1. Transmission …………………………………………………….……………. 6.2. Interaction avec les cellules alvéolaires ……………………………………... 6.2.1. Attachement de P. carinii aux cellules pulmonaires ………………… 6.2.2. Intéraction de P. carinii avec la matrice extracellulaire …………….. 85 85 86 87 87. 7. Interaction avec le surfactant pulmonaire……………………………….. 7.1. Les lipides ……………………………………………………………………… 7.2. Les protéines hydrophobes …………………………………………………... 7.3. Les protéines hydrophiles …………………………………………………….. 88 88 89 89. 6.

(7) 8. Implication du système immunitaire ………………………………… 91 8.1. Réponse non spécifique : les macrophages et les granulocytes neutrophiles 91 8.2. Défense assurée par les lymphocytes T CD4+/CD8………………………….. 91 8.3. Défense assurée par les lymphocytes B et les anticorps……………………… 92. VII OBJECTIF DE L’ÉTUDE. MATÉRIEL ET MÉTHODES 1. Mise en place des divers traitements……………………………………….. 98 1.1. 1.2. 1.3. 1.4.. Les animaux témoins………………………………………………………….. Les animaux immunodéprimés ..…………………………………………….. Les animaux soumis à l’’hypoxie hypobare .…………..…………………... Les animaux soumis à un régime sans vitamine A …………………………... 98 98 98 99. 2. Le sacrifice et les prélèvements………………………………………. . 100 3. Statut immunitaire des animaux …..…..…………………………………… 100 3.1. Préparation des échantillons pour la cytométrie de flux (FACS)..…………. 100 3.2. Lecture et Mode d’interprétation des résultats……………………………… 101 4. Inoculation de P. carnii ………………………………………………………. 101 4.1. Inoculation endotrachéale de P. carnii chez le rat………………………….. 101 4.2. Recherche de Pneumocystis……………………………………………………. 102. 5. Étude des modifications de la composition protéique du surfactant pulmonaire ……………………………………………………………………... 102 5.1. Validation des Anticorps……..……………………………………………….. 5.2. Préparation des échantillons………………………………………………….. 5.2.1. Traitement des lavages broncho-alvéolaires (LBA)………………….. 5.2.2. Préparation d'un homogénat de poumon de rat……………………… 5.3. Western Blot et immunoempreinte................................................................... 5.3.1. Préparation des gels de polyacrylamide………………………………. 5.3.2. Electrophorèse………………………………………………………….. 5.3.3. Le transfert …………………………………………………………….. 5.3.4. Incubation avec l’anticorps primaire et secondaire…..………………. 102 104 104 104 104 104 105 105 105. 6. Étude de l’expression génique des protéines du surfactant …………. 106 6.1. Conception et synthèse de la sonde pour la détection des ARNms des protéines du surfactant pulmonaire……………………………………………………… 106 6.1.1. Conception des amorces nucléotidiques……………………………… 106 6.1.2. Synthèse d'ADN complémentaires par transcription inverse……….. 106 6.1.3. Réaction de polymérisation en chaîne (PCR)…………………………. 107 6.1.4. Analyse des produits d'amplification………………………………….. 107 6.2. Extraction des ARN totaux des différents échantillons prélevés…………… 107 6.3. Quantification des ARNm des protéines du Surfactant pulmonaire, « Northern Blot »…………………………………………………………………………… 107 6.3.1. Electrophorèse………………………………………………………….. 107 6.3.2. Transfert et immobilisation des ARNs sur la membrane……………. 108 7.

(8) 6.3.3. Hybridation et exposition………………………………………………. 108. 7. Etude des phospholipides…………………………………………………….. 108 8. État des poumons et microscopie…………………………………………… 109 8.1. L’analyse cytologique…………………………………………………………. 109 8.2. Examen histopathologique……………………..…………………………….. 109. 9. Étude Epidémiologique : Réseau EUROCARINI……………………. 111 9.1. Extraction des ADN des liquides de rinçage oro-pharyngés (LROP)……… 112 9.2. Les différentes amorces……………………………………………………….. 112 9.3. Les PCR………………………………………………………………………… 112 9.3.1. PCR 1……………………………………………………………………. 112 9.3.2. PCR 2……………………………………………………………………. 113 9.4. Vérification de la spécificité des résultats PCR……………………………… 113 9.4.1. Transfert…………………………………………………………………. 113 9.4.2. Pré hybridation………………………………………………………….. 114 9.4.3. Hybridation et lavages………………………………………………….114 9.4.4. Révélation avec l’anticorps anti-digoxygénine…………………………114. RÉSULTATS 1. Modifications du surfactant pulmonaire en fonction de l’âge des rats …………………………………………………………………………………… 116 1.1. Evolution du niveau d’ARNm des protéines du surfactant en fonction de l’âge des rats…………………………………………………………………………. 116 1.2. Evolution des quatre protéines du surfactant en fonction de l’âge de l’animal 1.3. Impact du portage de Pneumocytis chez des animaux sains……………….. 119 1.3.1. Portage de Pneumocystis………………………………………………. 119 1.3.2. Impact de la présence de Pneumocystis sur les protéines du surfactant 1.3.2.1. Au niveau de l’expression des ARNm ……………………………. 120 1.3.2.2.Au niveau de la traduction des protéines ….……………………… 120. 2. Impact du modèle Hypoxie Hypobare sur le surfactant pulmonaire.. 121 2.1. Caractérisation du modèle…………………………………………………….. 121 2.1.1. Détermination du statut hypoxique…………………………………… 121 2.1.2. Impact de l’hypoxie sur le poids………………………………………. 123 2.1.2.1. En hypoxie chronique……………………………………………... 123 2.1.2.2. En hypoxie intermittente………………………………………….. 123 2.1.3. Œdème pulmonaire et inflammation…………………………………. 124 2.1.4. Sensibilité des globules rouges………………………………………… 126 2.1.5. Modifications immunologiques……………………………………….. 127 2.1.5.1. Modification des défenses immunitaires…………………………. 127 2.1.5.2.Mesure du potentiel global de défense anti-radicalaire (KRL) des globules blancs……………………………………………………… 129 2.1.5.3. Impact d’un séjour en caisson hypobare sur les réactions immunologiques des rats…………………………………………… 130 2.2. Comparaison entre l’effet hypoxique 4 heures et 72 heures sur le surfactant pulmonaire…………………………………………………………………….. 131. 8.

(9) 2.2.1. Modification des lipides du surfactant ……………………………….. 131 2.2.2. Modification de l’ARNm et des protéines du surfactant lors d’une exposition hypoxie hypobare de 4 et 72 heures…………………………. 132 2.2.2.1. Evolution des ARNm……………………………………………… 132 2.2.2.2. Evolution des protéines du surfactant……………………………. 133 2.3. Impact d’une hypoxie intermittente sur le surfactant pulmonaire………… 135 2.3.1. Modification des ARNm des quatre protéines du surfactant pulmonaire 2.3.2. Modification des quatre protéines du surfactant…………………….. 136 2.4. Discussion : impact des différents modes d’hypoxie sur la composition du surfactant pulmonaire……………………………..………………………….. 139 2.4.1. Synthèse des résultats concernant l’hypoxie …………………………. 139 2.4.2. Données en faveur de la diminution des protéines SP-B et SP-C……. 140 2.4.3. Données en faveur de la diminution des protéines SP-A et SP-D …... 141 2.5. Hypoxie intermittente et développement de Pneumocystis…………………. 142 2.5.1. Résultats concernant les protéines du surfactant ……………………. 142 2.5.2. Résultats concernant le taux de parasites dans le poumon de l’hôte.. 143 2.5.3. Discussion……………………………………………………………….. 144. 3. Impact du modèle Avitaminose A sur le surfactant pulmonaire….. 146 3.1. Caractérisation du modèle……………………………………………………. 146 3.1.1. Vérification de la chute de vitamine A…………………………….…. 146 3.1.2. Impact d’un régime dépourvu en vitamine A sur la prise de poids... 147 3.1.3. Modifications immunologiques……………………………………….. 148 3.1.4. Etude histologique……………………………………………………. 149 3.2. Impact de la déficience en vitamine A sur les protéines du surfactant pulmonaire 3.3. Discussion : déficience en vitamine A et surfactant pulmonaire………….. 150 3.4. Impact du régime déficient en vitamine A sur le développement de P. Carinii 3.4.1. Etude histologique et Pneumocystis…………………………………. 152 3.4.2. Résultats concernant les protéines du surfactant ………………….. 153 3.4.3. Résultats de l’inoculation de P.Carinii ……………………………… 153 3.4.4. Discussion……………………………………………………………… 155. 4. Etude EUROCARINI...………………………………………………………. 157 4.1. Population étudiée…………………………………………………………….. 4.1.1. Patients BPCO…………………………………………………………. 4.1.2. Témoins « sains »………………………………………………………. 4.2. Détection de Pneumocystis dans le LROP…………………………………… 4.3. Répartition de Pneumocystis en fonction des saisons……………………… 4.4. Détection des Anticorps………………………………………………………. 4.5. Discussion …………………………………………………………………….. 4.6. Conclusions ……………………………………………………………………. 157 157 158 158 159 159 160 162. RÉFÉRENCES……………………………………………………………………… 160 ANNEXES……………………………………………………………………………. 197. 9.

(10) TABLE DES ILLUSTRATIONS LISTE DES TABLEAUX INTRODUCTION : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE Tableau I :. Composition moyenne représentative des surfactants pulmonaires (Hamm H., 1996) 20. Tableau II : Impact de la multimérisation sur les différentes fonctions de la protéine D (Van de Wetering J.K., 2004) 25 Tableau III : Exemples de pathogènes et d’allergènes liés par la SP-A et la SP-D (inspiré de Wright J.R., 2004). 51. Tableau IV : Les récepteurs des collectines SP-A et SP-D (inspiré de Kishore U., 2005) 52 Tableau V : Tableau récapitulatif de l’effet des collectines SP-A et SP-D sur les cellules de l’immunité (inspiré de Wright J.R., 2004). 56. Tableau VI : Impact des maladies sur les protéines A et D du surfactant pulmonaire (inspiré deCrouch E.C., 2000 et Hermans C. et Bernard A., 1999) 62 Tableau VII :Effets de la durée de l’hyperoxie sur l’expression des protéines SP-A, SP-B, SP-C et SP-D (d’après Allred T.F. et al., 1999 ; Boggarram V., 2004) 73 RÉSULTATS Tableau I :. Analyse du portage de Pneumocystis carinii chez les rats provenant du fournisseur.. 119. Tableau II : Caractéristiques d’oxygénation des rats soumis à différentes durées d’hypoxie hypobare. 121. Tableau III : Analyse cytologique des LBA. 125. Tableau IV : Effet de l’hypoxie hypobare sur la composition biochimique du surfactant pulmonaire 131. 10.

(11) Tableau V : Evolution des protéines du surfactant en fonction d’une hypoxie aiguë, chronique et intermittente par rapport aux témoins. 138. Tableau VI : Impact d’un traitement Avitaminose sur l’expression et la traduction des quatre protéines du surfactant pulmonaire. 150. Tableau VII: Age de la population étudiée en fonction du sexe, et de la présence de Pneumocystis dans les lavages oropharyngés. 158. Tableau VIII: Répartition du portage de Pneumocystis en fonction des saisons. 159. Tableau IX: Détection des anticorps anti-Pneumocystis dans le sérum. 159. 11.

(12) LISTE DES FIGURES INTRODUCTION : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE Figure 1 :. Figure 2 :. Figure 3 :. Figure 4 :. Figure 5 :. Figure 6 :. Structure du gène des protéines SP-A et SP-D humaines (Kishore et al., 2006). 21. Structure monomérique, trimérique et multimérique des protéines SP-A et SP-D (inspiré de Haagsman H.P. et al., 2001). 22. Organisation génomique et étape du « processing » de la protéine SP-B (Guttentag S.H. et al., 1998). 27. Représentation schématique de l’insertion de la protéine B dans les lipides du surfactant pulmonaire (Notter R.H., 2000). 28. Organisation génomique et étape du « processing » de la protéine SP-C (inspiré de Beers M.F. et al., 2005). 30. Représentation schématique de la protéine C dans les lipides du surfactant pulmonaire (Notter R.H., 2000). 31. Figure 7 :. Représentation schématique du métabolisme et de la sécrétion du surfactant pulmonaire (inspiré de Christopher B.D. et Orgeig S., 2003) 32. Figure 8 :. Structure des tubules de myéline (inspiré de Palaniyar N et al., 2001). 34. Schéma récapitulatif des différents rôles des collectines du surfactant pulmonaire (d’après Wright J.R., 2005). 61. Figure 9 :. Figure 10 :. Différents stades de Pneumocystis sp. en microscopie électronique à transmission (d’après Dei-Cas E. et al., 2004) 82. Figure 11 :. Morphologie de P. carinii en microscopie photonique. Figure 12 :. Cycle hypothétique de Pneumocystis carinii dans l’alvéole pulmonaire (d'après Yoshida Y., 1989) 83. 83. 12.

(13) MATÉRIEL ET MÉTHODE Figure 1 :. Représentation graphique du caisson hypoxie hypobare. 99. Figure 2 :. Détection par les anticorps. 103. RÉSULTATS Figure 1 :. Niveau d’expression de l’ARNm codant pour les quatre protéines du surfactant pulmonaire (SP-A, SP-D, SP-B et SP-C) en fonction de l’âge des rats 116. Figure 2 :. Evolution des 4 protéines du surfactant en fonction de l’âge de l’animal. 118. Figure 3:. Impact de l’hypoxie sur la prise de poids du rat. 123. Figure 4:. 4A et B Evaluation de l’œdème pulmonaire. 124. 4C Evaluation de l’œdème pulmonaire. 125. Sensibilité des globules rouges au test KRL chez les rats témoins et les rats hypoxiques. 126. Figure 5 :. Figure 6 :. Impact du caisson hypoxie hypobare sur les lymphocytes circulants comparativement aux rats immunodéprimés et témoins 128. Figure 7 :. Comparaison de la capacité d’activation des globules blancs de rats témoins et de rats « caisson » par la concanavaline A. 129. Comparaison du potentiel de défense anti-radicalaire des globules blancs des rats témoins et des rats « caisson ». 130. Evolution de l’ARNm des quatre protéines du surfactant en fonction du temps d’exposition à une hypoxie hypobare. 132. Figure 8 :. Figure 9 :. Figure 10 :. Evolution des quatre protéines du surfactant après une hypoxie hypobare de 4 heures et de 72 heures 133. Figure 11 :. Evolution des protéines hydrophiles du surfactant après une hypoxie hypobare de 4 heures et de 72 heures. 134. Effet de l’hypoxie hypobare intermittent sur l’expression des ARNm des quatre protéines du surfactant. 135. Effet de l’hypoxie hypobare intermittente sur les protéines SP-A, SP-B, SP-C et SP-D du surfactant. 137. Figure 12 :. Figure 13 :. 13.

(14) Figure 14 :. Nombre de parasites de Pneumocystis chez les rats témoins, les rats traités avec de la dexaméthasone et les rats « caisson », 1 semaine et 3 semaines après l’inoculation 144. Figure 15 :. Niveau de vitamine A en fonction de la durée du régime avitaminique dans le sérum et dans le foie. 146. Effet de 3 semaines de Dexaméthasone sur le niveau de vitamine A par rapport aux rats témoins. 147. Evolution du poids des rats en fonction de leur régime alimentaire. 147. Figure 18 :. Statut immunologique des animaux déficients en vitamine A. 148. Figure 19 :. Modifications histopathologiques des poumons de rats sous avitaminose A ou sous dexaméthasone inoculés avec P. carinii 152. Figure 20 :. Nombre de Pneumocystis chez les rats témoins, les rats immunodéprimés et les rats en avitaminose A, 3 semaines après l’inoculation 154. Figure 16 :. Figure 17 :. 14.

(15) ABRÉVIATIONS ADN ALI AMPc ARDS ARNm ATP. Acide désoxyribonucléique « Acute Lung Injury » Adénosine mono-phosphate cyclique « Acute Respiratory Distress Syndrome » Acide ribonucléique messager Adénosine triphosphate. Bp BPCO. Paire de base Broncho-Pneumopathie Chronique Obstructive. °C C1qR CD CL Cmv CPAM CRABP CRD Ct. Degrés celcius Récepteur de la sous unité C1q du complément Cellules dendritiques Corps lamellaires Corps multi-vesiculaires Caisse primaire d’assurance maladie « Cellular retinoic acid binding protein» Domaine de reconnaissance des carbohydrates Coté carboxy-terminal de la protéine. DMEM Dtt. « Dulbecco's modified eagle's medium » Dithiothreitol. ECL EDTA EGFR. « Electro Chemical Light » Acide éthylènediamine tetra-acétique « epidermal growth factor receptor ». FACS FGF basic. « Fluorescence Activated Cells Sorting » « fibroblast growth factor ». g GM-CSF gp-A. Accélération de la pesanteur « Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor » ou gp-95, gp-116, gp-120 ou MSG = « major surface glycoprotéine ». HCO3HAPE Hb HRP. Ion carbonate « High-altitude pulmonary edema » Hémoglobine « Horse Radish Peroxydase ». IAV IL. « Influenza A virus » Interleukine. Kb KDa KRL. Kilo base Kilo Dalton « Kit radicaux Libres ». LA LBA LPS LROP MBL MMP MSG. « Large aggregate » forme active du surfactant Lavage broncho-alvéolaire Lipo poly saccharide Liquides de rinçage oro-pharyngés « mannan-binding lectin » Métallo-protéases « major surface glycoprotéine ». 15.

(16) NE NF1 NF-κB Nt. Elastase des neutrophiles Facteur nucléaire 1 Facteur nucléaire κB Coté amino-terminal de la protéine. PaO2 PaCO2 PBS Pcc PCP PCR PDGF PL/PR. Pression partielle en oxygène Pression partielle en dioxyde de carbone Solution saline de phosphate Pneumocystis Pneumonie à Pneumocystis Réaction de polymérisation en chaîne « platelet-derived growth factor» Rapport phospholipides/protéines « Phorbol Meristate Acetate ». PMA. Rats. T TP AV AVP TC C Dexa DP. RAR RARE RIPA Rnase OUT RNHCl RPMI RSV RXR. Témoins Témoins inoculés par Pneumocystis Régime alimentaire sans vitaminique A Régime alimentaire sans vitaminique A inoculés par Pneumocystis Témoins placés en caisson hypoxie hypobare Rats placés en caisson hypoxie hypobare et inoculés par Pneumocystis Rats traités à la déxaméthasone Rats traités à la déxaméthasone et inoculés par Pneumocystis « Retinoic acid receptor » « Acid retinoic response element » « Radio-immunoprecipitation assay » Inhibiteur de l’enzyme RNAse Formule des chloramines Milieu de culture de composition classique vendu par Gibco/BRL (France) « Respiratory syncytial virus » « Retinoic receptor ». SA SaO2 SCID SDRA SEM SP SP-A SP-B SP-C SP-D SVF SIRP-α. « Small Aggregate » forme moins active du surfactant pulmonaire Saturation en oxygène « Severe combined immunodeficiency » Syndrome de détresse respiratoire aiguë « Standard error of the mean » Protéine du surfactant Surfactant Protéine A Surfactant Protéine B Surfactant Protéine C Surfactant Protéine D Sérum de veau foetal « Signal-inhibitory regulatory protéine alpha». T CD4 T CD8 TGFβ TLR Tm TM TNF-α TPA TTF-1. Lymphocytes T porteur de CD4 ou « helper » amplificateurs de la réponse immune Lymphocytes T porteur de CD8 suppresseurs et/ou cytotoxiques « Transforming growth factor Beta » «Toll-like-receptors» Température de transition Myéline tubulaire « Tumor necrosis facteur de type alpha » « Tissular plasminogen activator » « Thyroid transcription factor 1». VEGF. « Vascular endothelial growth factor ». 16.

(17) INTRODUCTION : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE.

(18) I LE POUMON : Rappel d’anatomie 1. L’appareil respiratoire L’appareil respiratoire est fait de deux compartiments distincts: -. les voies de conduction aériennes, en particulier la trachée et les bronches avec leurs épithéliums ciliés,. -. une surface d’échange gazeux qui est représentée par le système alvéolaire.. L’alvéole est l’unité fonctionnelle du poumon, elle est constituée de trois éléments: l’épithélium du capillaire, l’interstitium et l’épithélium alvéolaire, en contact avec l’air. Elle est tapissée de cellules épithéliales ou pneumocytes. Il en existe de 2 types: les pneumocytes de type I et de type II (Mason R.J. et Williams M.C., 1997 ; Dobbs LG., 1990).. 2. L’alvéole 2.1. Pneumocyte de type I Les pneumocytes de types I ne représentent qu’un tiers des cellules de l’épithélium alvéolaire, mais recouvrent 95% de sa surface. Sur le plan structural, ces cellules sont pauvres en organelles intracellulaires et possèdent de longs prolongements cytoplasmiques. Leur face apicale est en contact avec l'air, alors que la face basale est étroitement liée aux cellules endothéliales des capillaires sanguins, pour former une seule paroi épaisse : la barrière alvéocapillaire. Cet arrangement particulier de cellules épithéliales et endothéliales favorise les échanges gazeux et constitue une barrière de protection contre tous les micro-organismes (Morgenroth K., 1986). 2.2. Pneumocyte de type II Liés aux cellules de type I par des jonctions intercellulaires serrées, les pneumocytes de type II sont impliqués dans la sécrétion des différents constituants du surfactant pulmonaire (Shannon J.M. et al., 1990). Morphologiquement, ces cellules sont différentes des autres cellules de l’épithélium alvéolaire. Elles sont métaboliquement très actives et jouent un rôle central dans le métabolisme des différents composants du surfactant pulmonaire (Beers M. F. et Mulugeta S., 2005). Elles possèdent : Des corps lamellaires. De pH acide, ces organelles (1-2 µm) contiennent les composants du surfactant pulmonaire : les phospholipides, les protéines B et C, et des traces de protéine A.. 18.

(19) Leurs contenus sont libérés dans l’espace alvéolaire par un mécanisme d’exocytose (Beers M. F. et Mulugeta S., 2005). Des corps multivésiculaires. Ce sont de grandes vacuoles de 250 à 1000 nm de diamètre contenant de petites vésicules de 50 à 100 nm de diamètre. Cette structure associée à la présence des pro-protéines B et C, permet de penser que les corps multivésiculaires sont des corps lamellaires immatures (Beers M. F. et Mulugeta S., 2005).. 3. Le macrophage alvéolaire D’autres cellules (les macrophages) résident de manière permanente dans l’alvéole, ces cellules dites « libres » peuvent être collectées par lavage broncho-alvéolaire (LBA). Les macrophages alvéolaires, issus de la transformation des monocytes circulants, sont considérés comme la première ligne de défense du système immunitaire inné (Sano H. et Kuroki Y., 2005 ; Wright J.R., 2004). Ils sont impliqués dans la reconnaissance des pathogènes et dans la phagocytose ainsi que dans la sécrétion des médiateurs de l’inflammation. Le macrophage alvéolaire est aussi impliqué dans l’internalisation et la dégradation du surfactant pulmonaire (Sano H. et Kuroki Y., 2005 ; Wright J.R., 2004).. 19.

(20) II LE SURFACTANT PULMONAIRE Le terme surfactant est né de la contraction du groupe nominal anglais « surface active agent », il est constitué de molécules amphiphiles qui, du fait de leur structure, se localisent au niveau de l’interface air-liquide des alvéoles pulmonaires. Ces molécules possèdent un domaine polaire (hydrophile) et un domaine non-polaire (hydrophobe) ; le groupe polaire est situé dans la phase aqueuse (appelé hypophase) alors que le groupe non-polaire s’étale au contact de la phase gazeuse. Grâce à ces propriétés physiques, le surfactant pulmonaire s’oppose au collapsus des alvéoles en fin d’expiration et améliore l’ensemble de la mécanique respiratoire (Vedhuizen R. et Possmayer F., 2004). Un surfactant non fonctionnel ou immature conduit à des détresses pulmonaires graves pouvant entraîner la mort (Nogee L.M., 2004 ; Coles F.S., 2003 ; Whitsett J.A. et Weaver T.E., 2002). Le surfactant pulmonaire est une mixture complexe de lipides, essentiellement de phospholipides amphiphiles et de protéines (Vedhuizen R. et Possmayer F., 2004).. 1. Composition du surfactant pulmonaire 1.1. Lipides L’analyse des lavages broncho-alvéolaires permet de montrer que les lipides representent 90 % du surfactant pulmonaire et que 95 % de ces lipides sont des phospholipides (tableau I). La répartition des lipides varie d’une espèce à l’autre et également en fonction de l’état de maturation et de l’état physiologique du poumon. Il existe également une variabilité interindividus qui rend impossible la notion de surfactant normal (Vedhuizen R. et Possmayer F., 2004).. Tableau I :. Phosphatidylcholines (PC) saturées. 50 %. Phosphatidylcholines insaturées. 17 %. Phosphatidylglycérol (PG). 7%. Phosphatidyléthanolamine (PE). 4%. Phosphatidylinositol (PI). 2%. Sphingomyéline (SPH). 2%. Autres phospholipides. 3%. Lipides neutres et cholestérol. 5%. Composition moyenne représentative des surfactants pulmonaires (Hamm H., 1996). 20.

(21) 1.2. Protéines Elles représentent 10 % du surfactant pulmonaire. La protéine la plus abondante du surfactant pulmonaire est l’albumine, mais il existe aussi 4 protéines spécifiques (SP : Surfactant Protein) : SP-A (28 à 36 kDa), SP-B (8 kDa), SP-C (4 kDa), SP-D (43 kDa). Les protéines hydrophiles A et D, facilement dissociables du surfactant, jouent un rôle prédominant dans la défense pulmonaire. Les protéines B et C, petites molécules hydrophobes, sont principalement impliquées dans la dynamique de synthèse et dans le rôle mécanique du surfactant. Elles sont responsables, en particulier, de la capacité du surfactant à réduire la tension de surface (Frerking I. et al., 2001). 1.2.1. Protéines hydrophiles : SP-A et SP-D 1.2.1.1. Organisation génomique Les protéines hydrophiles A et D font partie de la famille des collectines. Elles sont codées par une succession de plusieurs exons (figure 1) qui semblent provenir de la duplication d’un gène primaire (Hawgood S. et Poulain F.R., 2001).. Figure 1 :. Structure du gène des protéines SP-A et SP-D humaines (Kishore et al., 2006). Le gène de la protéine A a été cloné et séquencé pour plusieurs espèces. Chez la souris, il est situé sur le chromosome 14, il a une taille de 4,6 kb et il est composé de 6 exons et de 5 introns (figure 1), (Kishore et al., 2006 ; Korfhagen T.R. et al., 1992). Le gène de la SP-A humaine, situé sur le chromosome 10, est constitué de deux gènes fonctionnels (SP-A1 et SP-A2) et d’un pseudo-gène (Hawgood S. et Poulain F.R., 2001). Pour chaque gène exprimé, plusieurs variants ont été découverts (Haagsman H.P., 2002).. 21.

(22) La protéine A humaine comprend 248 acides aminés et la masse moléculaire de la forme monomérique se situe entre 28 et 36 kDa (dépendant des N-glycosylations). Les monomères s’associent pour former un complexe trimérique (association en hélice alpha « coiled-coiled ») et six trimères s’agencent pour former une structure plus complexe stabilisée par des ponts disulfures pour une masse moléculaire finale d’environ 650 kDa (figure 2), (Haagsman H.P., 2002). La protéine D est codée par un gène situé sur le chromosome 10 de l’humain (figure1), (LeVine A.M. et Whitsett J.A., 2001). L’ARNm d’une taille d’environ 1,3 kb, génère une glycoprotéine de 43 kDa. Cette protéine est sécrétée sous sa forme mature et ne requiert pas de « processing » extracellulaire (Crouch E.C. et al., 1994b). Comme pour la protéine A, les monomères de SP-D s’associent entre eux pour former des trimères, des dodécamères (figure2) et d’autres structures plus complexes.. Figure 2 :. Structure monomérique, trimérique et multimérique des protéines SP-A et SP-D (inspiré de Haagsman H.P. et al., 2001) 1.2.1.2. Structure des protéines. Les collectines font partie de la famille des protéines à domaine collagène et lectine calcium dépendantes. Huit différentes protéines ont été identifiées : la MBL (mannan-binding 22.

(23) lectin), CL-L1 (collectine liver 1), CL-P1 (collectine du placenta 1), la Conglutinine, la CL43 (collectine de 43 kDa), CL-46 (Collectine de 46 kDa), la SP-A (protéine A du surfactant), la SP-D (protéine D du surfactant). L’unité de base de ces collectines (figures 1 et 2) est constituée de quatre domaines (Van de Wetering J.K.et al., 2004 ; Crouch E.C., 2000 ), soit : •. Le segment N-terminal. Le segment N-terminal de la protéine A est constitué de 7 à 10 acides aminés alors que celui de la D est de 25 acides aminés. Il contient trois motifs structuraux différents: des cystéines responsables de la stabilisation de la structure quaternaire grâce aux ponts disulfures, une région hydrophobe très conservée et un site de glycosilation (Palaniyar N. et al, 2001 et 2002). Cette région a un rôle dans la stabilisation de l’organisation multimérique des collectines, la forme dodécamérique ou structure cruciforme pour la SP-D et la forme octodécamère ou structure dite en « bouquet de fleur » pour la SP-A (Van de Wetering J.K. et al., 2004 ; Crouch E.C., 2000). •. Le domaine collagène. Le domaine collagène contient une série de séquences hydrophiles Gly-X-Y hautement conservées. La SP-A possède, en position Y, une prolines ou une hydroxyprolines alors que la SP-D contient une hydroxylysines ou hydroxyllysyl glycosides (Palaniyar N. et al, 2001). Les fonctions du domaine collagène semblent multiples et distinctes. Cette région semble être responsable de la formation de la triple hélice des trimères. En effet, l’introduction d’un acide aminé supplémentaire dans la succession de Gly-X-Y de la protéine SP-A désorganise la formation de la triple hélice (Palaniyar N. et al, 2001) et la délétion du domaine collagène de la SP-D du rat provoque une sécrétion sous sa forme trimérique au lieu de dodécamérique (Van de Wetering J.K. et al., 2004 ; Crouch E.C., 1994). Le domaine collagène est aussi impliqué dans les interactions avec des récepteurs cellulaires. Le motif GEKGEP présent dans le domaine collagène de la SP-A est responsable de l’interaction avec le récepteur nommé C1q. La SP-D qui ne contient pas ce motif n’est pas capable de réagir avec ce récepteur (Malhotra R. et al., 1992). Le domaine collagène de la SP-D impose une séparation spatiale maximale du domaine CRD des trimères et influence l’association spécifique avec certains carbohydrates (Hartshorn K.L. et al., 2002). Cette caractéristique est responsable des différences dans la spécificité de reconnaissance des micro-organismes entre les protéines A et D.. 23.

(24) •. Le cou (ou connecting domain ou coiled-coil neck). Constitué d’environ 35 acides aminés, il est organisé en structure d’hélice alpha. Il interviendrait dans la formation des liens entre trimères et dans l’orientation des CRD de la SP-D (figure 2) grâce à des interactions hydrophobes (Palaniyar N. et al, 2001). •. Le domaine lectine ou CRD (« Carbohydrate Recognition Domain »). La comparaison des différents CRD des collectines a révélé la présence de 22 acides aminés très conservés dont quatre cystéines. Ces cystéines, grâce à la formation de ponts disulfures, interviennent, probablement, dans la stabilisation des protéines (Van de Wetering J.K. et al., 2004 ; Crouch E.C., 2000). Les CRD des collectines contiennent aussi plusieurs sites de liaison au calcium qui semblent impliqués dans les propriétés de liaison (Weiss W.I. et al., 2001). En effet, le domaine lectine des protéines A et D interagit avec de nombreux ligands incluant les lipides, les lipopolysaccharides et les carbohydrates. Les collectines lient différents types de lipides (McCormack F.X. et al., 1997 ; McCormack F.X. et al., 1994 et 1994b ). Ainsi, la SP-D est capable d’interagir avec les constituants du surfactant pulmonaire comme les phosphatidylinositols (Person A.V. et al., 1992) et les glucosylcéramides (Ogasawara Y. et Voelker D.R., 1995 ; Kuroki Y. et al., 1992b). Le CRD de la SP-A reconnaît et s’associe avec les dipalmitoylphospholipides (Kuroki Y. et Akino T., 1991) et les galactosylcéramides (Kuroki Y. et al., 1992). In vitro, l’association de la SP-A avec les lipides semble aussi faciliter l’«uptake » des phospholipides par les cellules de types II et les macrophages (Pinson U. et al., 1992 ; Wright J.R. et al., 1989). Des études plus récentes sur les souris déficientes en SP-D, soulignent aussi l’importance de la SP-D dans l’homéostasie des lipides (Murata Y. et al., 1993). Le rôle des collectines dans l’homéostase des lipides est lié à la présence, dans le CRD, de trois acides aminés : Glu-Pro-Asn pour la SP-D et Glu-Pro-Arg pour la SP-A (McCormack F.X. et al., 1994b). La plupart des micro-organismes possèdent, à leur surface, un ou plusieurs carbohydrates reconnus par les collectines. In vivo, la SP-A peut lier les di-mannoses de la capsule de certaines bactéries Gram-négatives, la structure « lipid A » de certains LPS , mais aussi des glycolipides (LeVine A.M. et Whitsett J.A., 2001). La SP-D peut lier les glucoses du corps oligosaccharidique des LPS, des sucres comme le N-mannose de l’hémagglutinine et. 24.

(25) la neuramidase du virus influenza de type A ou les mannoses terminaux des lipoarabinomannans de Mycobactérium tuberculosis (LeVine A.M. and Whitsett J.A., 2001). 1.2.1.3. Multimérisation En fonction de l’espèce étudiée, les protéines A et D sont présentes dans le surfactant sous une ou plusieurs formes multimériques (figure 2) : •. la protéine A se présente sous une forme trimérique et/ou d’octodécamérique lors de l’association de 6 trimères (Van de Wetering J.K. et al., 2004),. •. la protéine D existe sous la forme de trimères (3 fois 43 kDa), de dodécamères (quatre formes trimériques) ou de structures multimériques complexes comme l’association de 32 formes trimériques lors d’une protéinose alvéolaire humaine (Crouch E.C. et al., 1994a ; Crouch E.C., 2000 ). Activité de SP-D. (SP-D)3. (SP-D)12. (SP-D)x multimérique. Liaison aux polysaccharides Inhibition de l’hémaglutination de IAV Agrégation de IAV Liaison de IAV aux neutrophiles Protection contre l’inactivation des neutrophiles par IAV Agrégation de E. Coli Stimulation de la phagocytose de E. Coli Inhibition de la phagocytose de M. tuberculosis Tableau II:. ++. +++. +++. ++. +++. ++++. +/-. +. ++. -. +. ++. +/-. +. ++. -. +. ++. ?. +. ++. ?. +. ?. Impact de la multimérisation sur les différentes fonctions de la protéine D (Van de Wetering J.K., 2004) Le nombre de + correspond à l’efficacité de la réaction, et le ? indique un manque de données sur le sujet. IAV = « Influenza A virus ». L’état multimérique influence les fonctions des collectines. L’interaction entre le CRD de la SP-A et les lipides est très faible sous la forme monomérique ou trimérique (McCormack F.X. et al., 1997b ; Lawson P.R.et Reid K.B.M., 2000). Les fonctions de la SPD sont aussi affectées par le degré de multimérisation (tableau II). Les formes trimériques peuvent se lier au virus de l’Influenza mais elles semblent peu efficaces à lier et améliorer l’aggrégation par les neutrophiles, par contre les formes multimères se lient au virus et provoquent une réponse efficace des neutrophiles (Crouch E.C., 2000).. 25.

(26) 1.2.1.4. Distribution tissulaire La protéine A Le site majeur de synthèse de la SP-A est le poumon, en particulier les peumocytes de type II, les cellules Clara et certaines cellules des glandes trachéo-bronchiales d’un poumon adulte humain (LeVine A.M. et Whitsett J.A., 2001). Cependant, elle a aussi été découverte hors du poumon. La technique de RT/PCR a permis de mettre en évidence la présence de l’ARNm dans la trachée, la prostate, le pancréas, le thymus et les cellules des glandes mucosales (Saitoh H et al., 1998), ainsi que des traces dans le colon et les glandes salivaires (Madsen J. et al., 2003). Des localisations différentes ont été observées en fonction de l’espèce étudiée. Ainsi, on a découvert l’ARNm de la protéine dans l’estomac, le cœur, le foie de la souris (Akiyama J. et al., 2002) et dans la trompe d’Eustache de l’oreille du porc (Haagsman H.P., 2002 ; Paananen R. et al., 1999). Toutefois, la sensibilité des techniques de Northern Blot et de Western Blot limite la détection de cette protéine au poumon et au tractus pulmonaire (Akiyama J. et al. 2002). La protéine D La SP-D est principalement exprimée dans les cellules épithéliales alvéolaires de type II et dans certaines cellules des glandes trachéo-bronchiales du poumon (LeVine A.M. et Whitsett J.A., 2001). Elle a aussi été découverte hors du poumon et sa distribution est variable en fonction de l’espèce animale étudiée (Madsen J. et al., 2000). Un faible niveau de protéine a été détecté dans les cellules produisant du mucus (Fisher J.H. et al., 1995), dans le colon et la lumière intestinale du rat (Rubio S. et al., 1995). Seul l’ARNm a été détecté dans le cœur de la souris (Motwani M. et al., 1995). 1.2.2. Protéines hydrophobes : SP-B et SP-C 1.2.2.1. Organisation génomique et « processing » de la protéine B La protéine B est codée par un seul gène d’environ 10 kb situé sur le bras court du chromosome 2 humain ou du chromosome 6 de la souris. Le gène contient 11 exons, mais seuls les dix premiers sont transcrits pour former un ARNm d’environ 2000 bp. Un «splicing» alternatif a été montré, il génère une délétion de 12 pb dans l’exon 8 et entraîne donc la perte de 4 acides aminés dans la partie carboxy terminale de la pro-protéine. Cette forme est néanmoins très minoritaire.. 26.

(27) Figure 3 :. Organisation génomique et étape du « processing » de la protéine SP-B (Guttentag S.H. et al., 1998). L’ARNm (figure 3) est traduit sous la forme d’une pré-pro-protéine de 381 acides aminés (soit 42 kDa). La protéine mature est constituée de 79 acides aminés, elle correspond à la synthèse de l’exon 6 et 7 du gène et sa masse moléculaire finale est d’environ 8 kDa (Nogee L.M., 2004 ; Nogee L.M., 1998 ; Weaver T.E, 1998). Les 23 premiers acides aminés correspondent à un peptide signal, éliminé lors de la traduction qui aide la protéine à se diriger dans sa voie de sécrétion. Plusieurs autres protéolyses en N-terminal (200 acides aminés) et C-terminal (102 acides aminés) (figure 3) sont nécessaires à la formation de la protéine mature (Guttentag S.H. et al.,1998). Le processus de maturation commence dans la partie terminale du Golgi, mais, il semble que les clivages soient effectués, dans un ordre précis, au niveau de la lumière des corps multivésiculaires ou lors de l’entrée dans les corps lamellaires (Takiyuki U et al., 2004 ; Weaver T.E. et Conkright J.J., 2001). Le rôle des pro-peptides N-terminal et C-terminal dans le processus de maturation et de sécrétion de la protéine B n’est pas encore défini. Plusieurs expériences de délétion impliquent le pro peptide N-terminal et une partie de la protéine mature dans le choix de la voie de sécrétion (Lin S. et al., 1996). Le rôle du pro-peptide C-terminal est plus problématique. Ainsi, chez des souris dont l’allèle SP-B a été inactivé, l’expression d’une. 27.