Régulation de la symbiose endomycorhizienne par le phosphate

Texte intégral

(1)5)µ4& &OWVFEFMPCUFOUJPOEV. %0$503"5%&-6/*7&34*5²%&506-064& %ÏMJWSÏQBS Université Toulouse 3 Paul Sabatier (UT3 Paul Sabatier). 1SÏTFOUÏFFUTPVUFOVFQBS Coline Balzergue -F lundi 3 décembre 2012. 5Jtre : Régulation de la symbiose endomycorhizienne par le phosphate ED SEVAB : Interactions plantes-microorganismes. 6OJUÏEFSFDIFSDIF Laboratoire de Recherche en Sciences Végétales (LRSV, UMR5546 UPS/CNRS). %JSFDUFVS T EFʾÒTF Dr Soizic Rochange Pr Guillaume Bécard 3BQQPSUFVST Pr Didier Reinhardt Dr Sergio Svistoonoff "VUSF T NFNCSF T EVKVSZ. Dr Laurent Nussaume.

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(3) Remerciements,. Je remercie les rapporteurs de mes travaux de thèse pour avoir accepté de prendre le temps de lire cette thèse résumant au moins 3 ans de travaux, merci pour les commentaires et les critiques avisés qui concerneront ce manuscrit. Merci aussi aux membres du Jury qui prendront le temps d’écouter ma présentation lors de ma soutenance et pour la discussion qui en découlera. Merci à Hélène Javot (CEA, Cadarache) et David Barker (LIPM, Toulouse), puis Mireille Chabaud (LIPM, Toulouse), pour votre participation à mes comités de thèse qui m’ont permis de faire le point sur mes résultats et d’orienter la poursuite de mes travaux de thèse (merci Hélène pour la découverte du système « double-cone » et pour celui qui a voyagé depuis Cadarache). Le labo : Je remercie tous les membres du LRSV pour les bonjours, les sourires, leurs services (communs ou pas), les échanges et les conseils, j’ai passé 3 années de thèse très agréables grâce à vous... Cela concerne aussi les personnes du LIPM avec qui j’ai pu travailler, discuter ou que j’ai souvent croisées. Merci pour les cafés des non-perm (et les soirées) qui sont des moments de pause, d’échanges et de bonne humeur essentiels durant notre passage au laboratoire (même s’il faut avouer que le café en lui-même est rarement fameux). Merci aux microscopistes Alain, Aurélie, Cécile et Yves, vous êtes toujours de bons conseils, disponibles et avec le sourire. C’est toujours un plaisir de travailler avec vous. Merci aussi pour ma participation à la formation microscopie végétale. Merci à tous ceux avec qui j’ai pu travailler, discuter manip… car je suis persuadée que la science n’avance qu’à condition d’échanges et de partages. Je pense tout d’abord à David Barker et Mireille Chabaud avec qui j’ai pu collaborer durant environ 2 années de ma thèse. Merci pour votre confiance, notre participation à « l’histoire CO », merci à Mireille pour le partage du matériel biologique, le transfert d’un savoir-faire Calcium Spiking, ta patience et les réponses à mes nombreuses questions. Merci aussi à Fabienne Maillet, c’est toujours aussi agréable de vernir chercher des MycLCO. Merci à Céline Camps, Thomas Rey et Amaury Nars pour quelques amorces pour le Fluidigm. Je remercie l’ensemble des membres de l’équipe pédagogique (enseignants et préparateurs TP) avec qui j’ai pu interagir pour la préparation et la réalisation de ces 3 années de « monitorat » à l’UPS. La première année était censée être une confirmation que l’enseignement n’était pas vraiment fait pour moi. Finalement, j’ai poursuivi le monitorat avec plaisir jusqu’à la fin de ma thèse, révélant un réel intérêt pour l’enseignement. Un grand merci à Catherine Digonnet, pour son intérêt pour la pédagogie..

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(5) Et plus particulièrement l’équipe myco : Soizic, il y a 5 ans je commençais à travailler avec toi pour 2 mois de stage en M1. Bon j’avoue être venue te voir à l’époque dans l’espoir de trouver un stage non pas sur les mycorhizes (bien qu’aujourd’hui je sais que c’est l’avenir de la planète), mais car je pensais que tu faisais de la génétique chez les plantes… (et oui, naïve vision des étudiants qui pensent que les prof font dans les labo les mêmes choses que ce qu’ils enseignent à la fac). Bref, comme on me l’a fait remarquer lors du concours pour la thèse j’étais devenue « mycorhize dépendante » telle une plante carencée et j’ai poursuivi avec toi en M2R et en Thèse. Merci pour cette belle aventure, pour ton suivi, ta patience, ta rigueur et tes qualités scientifiques, ta disponibilité, tes corrections d’anglais et de français, tes conseils… Merci aussi de m’avoir laissé la possibilité et le temps de faire en parallèle de ma thèse toutes autres activités plus ou moins reliées à la thèse comme l’enseignement, être représentantes à l’école doctorale et à différents comités au labo… car tout cela était aussi important pour moi et m’a permis de prendre pleinement conscience de ce qu’est le monde de l’enseignement, de la recherche et du laboratoire. Merci à Soizic et Guillaume pour leur encadrement durant ma thèse, je n’ai jamais été toute seule. Plus largement merci à tous les membres de l’équipe myco : Christophe, Virginie, Jean-Philippe, Dominique, Françis, Damien, Pierre-Marc, Johann, Mathilde, Alexandra, Jérôme, Nianwu, Mohammad… et à ceux qui ont quitté l’équipe : Nathalie, Olivier, Marion, Monique, Julie, Seb, Emma… pour les conseils, les réunions, les repas, les discussions scientifiques ou non, les bons moments partagés ensemble... J’ai beaucoup appris à vos côtés. Merci d’avoir supporté mes maniaqueries et mes crises « rangementionnelles » du labo... Merci à Domi pour ta bonne humeur et ta patience sans borne concernant mes nombreuses questions de Biomol, sans toi pas de qPCR ou de Fluidigm possibles, et pas de nouvelles fraîches de la Dépêche. Merci beaucoup à Virginie pour les conseils et les analyses biochimiques. Sans toi pas de spectrométrie de masse, pas de strigo, pas de CO. Merci pour toutes les heures passées à l’INSA, les allers retours pour récupérer les échantillons, ta patience, ta réactivité et ta gentillesse. Merci à Laurent Brottier, mon stagiaire de L3Pro qui a réussi à suivre le rythme des derniers mois de la 3ème année de thèse et qui m’a bien aidé pour l’obtention de mes derniers résultats. Merci aux membres de l’équipe venant de pays plus ou moins lointains, les échanges représentent un plus et pas seulement pour l’amélioration (ou pas) de l’anglais… Mes amis, ma famille : Un clin d’œil particulier aux membres du « bureau 50» et à ses moments de folle bonne ambiance : Dodo, Dada, PM, Alex, Jéjé, Marion, Jojo, Mathilde… Merci pour cette bonne humeur constante, les blagues plus ou moins légères, les fous rires, les cafés, les discussions boulot et autres, les secrets, les gâteaux, les petits dej lors de vaisselle cassée… PM, ta capacité bibliographique me fera toujours flipper et Damien mes plantes vertes et ma table basse se rappellent encore de toi. Merci les amis pour tous les bons moments passés.

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(7) ensemble : les tapas et la sangria du Délicatessen, les bières pas bonnes du Killarney, les savoureux petits plats de la Maison Drôle, les sorties ski, le Lot, Vaour, les dumplings, les congrès (haa je n’aurai pas les mêmes souvenirs de Bruxelles et Ste Maxime sans vous…), les parties de Mölkky… le « Burau 50 crou » ne mourra jamais ! Merci à Claire et Sophie, mes deux « vieilles » amies du collège. Sophie, merci pour les nouvelles et les encouragements depuis le Congo. Claire, merci pour les discussions, les retours en voiture, les soirées jeux car on est plus fort à trois au Gost-Stories. Quoi qu’il se passe on se retrouvera dans le Lot. Merci à Clairounette qui m’accompagne depuis mes premiers pas toulousains, merci pour ta bonne humeur et ton accent du soleil ; toi aussi tu verras, tu arriveras à la finir ta thèse. Merci aux belettes Marion et Claire pour les repas du midi qui me permettaient de m’échapper du labo… Merci à Mathilde la mexicaine pour ces mails d’encouragement… Plus fortement encore je remercie ma famille, Sandy, Néné, Manon et plus particulièrement mes parents, vous avez toujours cru en moi et m’avez toujours poussée à faire ce que j’avais envie. Merci de m’avoir écoutée et soutenue dans les bons et les moins bons moments (les doutes et les galères qui font parties de la thèse). Merci pour votre amour, votre affection et votre soutien. Et enfin MERCI à toi Julien. Merci d’avoir tenu le coup toi aussi durant mes années d’étude, en particulier pendant la fin de la thèse. Merci de ne pas avoir fui en courant au moment de la rédaction ! Merci pour ta confiance, ton soutien, tes conseils et ton écoute, ta patience immense et surtout l’amour et la joie que tu m’apportes. Sans toi cela n’aurait pas été possible, cette thèse c’est aussi un peu la tienne..

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(9) Coline Balzergue, Résumé de Thèse TITRE : Régulation de la symbiose endomycorhizienne par le phosphate. RÉSUMÉ : La majorité des plantes terrestres forment une symbiose racinaire avec des champignons mycorhiziens à arbuscules (MA). Les champignons fournissent à la plante de l’eau et des minéraux en particulier du phosphate (Pi), en échange les plantes leur apportent des éléments carbonés. La fertilisation phosphatée est connue pour inhiber l’interaction symbiotique, mais les mécanismes intervenant dans cette régulation sont inconnus. Nous avons montré que le Pi est capable d’inhiber presque totalement la mycorhization à un stade très précoce, avant même l’attachement du champignon à la surface de l’épiderme racinaire. Cette inhibition est liée aux teneurs en Pi dans les parties aériennes et fait intervenir une signalisation systémique. Par la suite, nous avons cherché à identifier les mécanismes impliqués dans la régulation de la mycorhization par le Pi. Les évènements précoces d’interaction ont été examinés avec un intérêt marqué pour les exsudats racinaires. Tout d’abord, nous avons analysé l’importance des strigolactones dans la régulation. Ces molécules sont sécrétées par les racines des plantes et stimulent le développement des champignons (MA). La production de strigolactones est elle aussi régulée de façon systémique par le Pi et les exsudats végétaux de plantes non carencés en Pi sont dépourvus de strigolactones. Cependant, un ajout exogène de ces molécules ne suffit pas pour lever l’inhibition associée à la présence de Pi. De plus, la part des exsudats végétaux en général dans cette régulation a été étudiée. Bien que les exsudats jouent un rôle pour favoriser (ou non) la mise en place de l’interaction, des mécanismes de contrôle supplémentaires existent au niveau de la racine elle-même. Parmi plusieurs mécanismes régulateurs hypothétiques nous avons testé si le Pi pouvait affecter la capacité des plantes à reconnaitre correctement leurs partenaires fongiques. Pour cela nous avons utilisé deux approches. (i) Il est connu que les racines répondent à la présence de champignon par des oscillations de concentrations en calcium dans les noyaux. Nous n’avons pas trouvé d’effet du Pi sur cette réponse. (ii) Nous avons aussi analysé si l’expression de gènes végétaux en réponse au champignon pouvait être régulée par le Pi. Quelle que soit la condition phosphatée testée, les plantes sont capables de répondre à la présence de champignon par l’induction de gènes de défense et de gènes « symbiotiques ». Cependant, le Pi affecte négativement l’expression de certains des gènes symbiotiques, laissant penser que les plantes seraient moins à même de répondre au champignon lorsqu’il y a du Pi. Pour finir, d’autres mécanismes de régulation possibles (tels que la composition des parois ou un effet hormonal des strigolactones) sont proposés et discutés. Mots Clés : Mycorhize ; Phosphate ; Symbiose ; Régulation ; Exsudats ; Strigolactones ; Splitroot ; Calcium spiking ; Expression génique ; Medicago truncatula ; Pois (Pisum sativum) ; Glomus intraradices/Rhizophagus irregularis ; Gigaspora rosea..

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(11) Coline Balzergue – Thesis abstract TITLE: Regulation of endomycorrhizal symbiosis by phosphate. ABSTRACT: Most plants form root symbioses with arbuscular mycorrhizal (AM) fungi. AM fungi supply their host plants with water and minerals, especially phosphate. In return, they obtain carbohydrates from their hosts. Phosphate fertilization is known to have a negative impact on the symbiotic interaction, but the underlying mechanisms are not yet understood. We first showed that phosphate supply is able to almost totally inhibit the interaction at a very early stage, prior to the attachment of fungal hyphae to the root epidermis. This inhibition is linked to shoot phosphate contents and involves a systemic regulation. Then, we tried to identify mechanisms involved in the regulation of AM symbiosis by phosphate. Early signaling events were examined with a particular focus on root exudates. First, the importance of strigolactones in the regulation was tested. Strigolactones are rootsecreted compounds which stimulate fungal growth and metabolism. Strigolactone production is also systemically regulated by phosphate, and root exudates of phosphatereplete plants lack strigolactones. However, supplementation with exogenous strigolactones failed to restore root colonization under high phosphate supply. Moreover, the role of root exudates in general (not only strigolactones) in the regulation was addressed. Although root exudates contribute to the control of the interaction, additional regulatory mechanisms likely exist at the level of the root itself. Among several hypothetical regulatory mechanisms we tested whether phosphate could affect the ability of plants to recognize properly their fungal partners. To test this hypothesis we used two approaches. (i) Root cells are known to respond to AM fungi by oscillations of calcium concentrations in the nucleus. We did not find any effect of phosphate on this response. (ii) We also analyzed whether phosphate could modify plant gene expression in response to the fungus. Regardless of phosphate supply, plants are able to respond to the presence of fungus by the induction of defense-related and "symbiotic" genes. However, phosphate negatively affects the expression of some symbiotic genes, suggesting that plants are less able to respond to the fungus when they are not under phosphate starvation. Finally, other potential regulatory mechanisms (such as cell wall composition or an involvement of strigolactones role at the hormonal level) are proposed and discussed. Keywords: Mycorrhiza ; Phosphate ; Symbiosis ; Regulation ; Root exudates ; Strigolactones ; Splitroot ; Calcium spiking ; Gene Expression ; Medicago truncatula ; Pea (Pisum sativum) ; Glomus intraradices/Rhizophagus irregularis ; Gigaspora rosea..

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(13) Introduction Générale ................................................................................................................ 1 1/ La rhizosphère et sa communauté microbienne ............................................................... 1 1 – 1 / Quelques exemples de partenaires symbiotiques du sol ....................................... 2 1 – 2/ La symbiose mycorhizienne à arbuscules (MA) ....................................................... 3 1 – 2a/ Les champignons MA, des organismes particuliers ........................................... 3 1 – 2b/ La classification des Gloméromycètes ............................................................... 4 1 – 2c/ L’importance de la symbiose MA ....................................................................... 5 1 – 2d/ Les différents stades de développement de l’interaction ................................. 6 1 – 2e/ Existence d’une voie de signalisation commune avec la symbiose rhizobium (voie SYM) nécessaire à la mise en place de l’interaction ............................................. 8 1 – 2f/ Les différents points de contrôle de l’interaction ............................................ 10 1 – 3/ Les signaux végétaux dans la phase pré-symbiotique : une attention particulière pour les strigolactones ..................................................................................................... 12 1 – 3a/ Du « branching factor » aux strigolactones ..................................................... 12 1 – 3b/ Les strigolactones, molécules d’intérêt dans la rhizosphère........................... 13 1 – 3c/ Les strigolactones, une famille nombreuse ..................................................... 14 1 – 3d/ L’étude des mutants de la voie de biosynthèse des strigolactones mène à l’identification d’une nouvelle hormone végétale ....................................................... 15 1 – 3e/ D’autres rôles hormonaux pour les strigolactones.......................................... 18 1 – 3f/ Régulation de la production de strigolactones................................................. 19 1 – 4/ Les signaux fongiques pré-symbiotiques : des facteurs Myc aux Myc-LCO .......... 20 1 – 5/ La régulation de la symbiose.................................................................................. 22 1 – 5a/ L’importance des signaux végétaux ................................................................. 22 1 – 5b/ Autorégulation et régulation systémique........................................................ 23 1 – 5c/ Le phosphate, élément régulateur de la symbiose .......................................... 24 1 – 5d/ Régulation systémique de la symbiose par le phosphate ............................... 25 2/ Le maintien de l’homéostasie du phosphate .................................................................. 26 2 – 1/ La voie de signalisation impliquant miR399, PHO2 et IPS1/At4 ............................ 27 2 – 2/ Les réponses effectrices face à la carence phosphatée......................................... 29 2 – 2a/ Une meilleure utilisation du Pi interne ............................................................ 29 2 – 2b/ Une meilleure acquisition du Pi externe ......................................................... 30 2 – 2c/ Réponses systémiques et réponses locales ..................................................... 32 2 – 3/ La symbiose MA, élément de réponse à la carence .............................................. 34 2 – 3a/ Effets de la symbiose MA sur le développement des plantes ......................... 34 2 – 3b/ L’acquisition du phosphate par la voie symbiotique ....................................... 35 3/ Questions et objectifs adressés à travers ce projet de thèse.......................................... 37 CHAPITRE I/ Contrôle de la mycorhization par le phosphate, une régulation systémique et précoce ..................................................................................................................................... 39 1/ Présentation..................................................................................................................... 39 1 – 1/ Choix des organismes ............................................................................................ 39 1 – 1a/ Le matériel végétal ........................................................................................... 39 1 – 1b/ Le matériel fongique ........................................................................................ 41 1 – 2/ Conditions de fertilisation phosphatée ................................................................. 42 2/ Phosphate, mycorhization et régulation systémique ...................................................... 42 2 – 1/ Phénotype mycorhizien des plantes cultivées en HighP ....................................... 42 2 – 1a/ Effet de la fertilisation sur la biomasse ............................................................ 42 2 – 1b/ Effet de la fertilisation sur les teneurs internes en P ...................................... 43.

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(15) 2 – 1c/ Effet de la fertilisation sur la mycorhization .................................................... 43 2 – 1d/ Effet de la fertilisation sur la formation des hyphopodes ............................... 45 2 – 2/ Effet direct du phosphate sur le champignon et contrôle systémique de la mycorhization ................................................................................................................... 47 2 – 2a/ Effet du phosphate sur la germination de spores et la ramification du champignon .................................................................................................................. 47 2 – 2b/ Effet du phosphate sur la mycorhization de M. truncatula............................. 48 2 – 2c/ Approche split-root .......................................................................................... 49 3/ Un mécanisme régulateur possible : rôle des signaux diffusibles végétaux et en particulier des strigolactones ............................................................................................... 50 3 – 1/ Les strigolactones, molécules effectrices de la régulation par le phosphate ? ..... 50 3 – 1a/ Effet du phosphate sur la production de strigolactones en système split-root ...................................................................................................................................... 51 3 – 1b/ Effet d’un traitement par des strigolactones exogènes? ................................ 52 3 – 2/ La métabolomique, une approche sans a priori .................................................... 53 3 – 3/ Etude des signaux diffusibles végétaux ................................................................. 54 3 – 3a/ Effets d’exsudats racinaires sur le développement du champignon ............... 54 3 – 3b/ Effet des exsudats racinaires sur l’interaction................................................. 56 3 – 3c/ Utilisation d’un système «double-cône» pour découpler l’effet des exsudats de l’effet du phosphate environnemental ................................................................... 58 3 – 4/ Bilan sur les signaux diffusibles végétaux .............................................................. 60 4/ Autres mécanismes régulateurs possibles ...................................................................... 61 4 – 1/ Hypothèse n°3 : signalisation fongique perturbée en HighP................................. 61 4 – 2/ Hypothèse n°4 : perception du champignon perturbée en HighP ........................ 62 CHAPITRE II/ Effet du phosphate sur la perception du champignon par la plante.................. 63 1/ Etude des oscillations calciques nucléaires ..................................................................... 63 1 – 1/ Introduction : les réponses calciques lors de la nodulation et de la mycorhization .......................................................................................................................................... 63 1 – 1a/ Réponses calciques lors de la nodulation ........................................................ 63 1 – 1b/ Réponses calciques lors de la mycorhization .................................................. 64 1 – 2/ Présentation du système Cameleon 35S-NupYC2.1 .............................................. 64 1 – 3/ Effet du phosphate sur les oscillations calciques nucléaires ................................. 66 1 – 3a/ Conditions d’étude des réponses calciques nucléaires végétales ................... 66 1 – 3b/ Signalisation calcique nucléaire végétale en réponse à des signaux fongiques (GSE et CO4) .................................................................................................................. 68 1 – 3c/ Signalisation calcique nucléaire dans les cellules racinaires au contact des hyphopodes .................................................................................................................. 70 1 – 4/ Conclusion .............................................................................................................. 71 2/ Approche expression de gènes (Fluidgim®)..................................................................... 72 2 – 1/ Synthèse bibliographique : étude de la symbiose mycorhizienne à travers des approches transcriptomiques .......................................................................................... 72 2 – 2/ Choix de la technique, des conditions et des gènes .............................................. 76 2 – 2a/ Choix de la technique et conditions utilisées .................................................. 76 2 – 2b/ Choix des gènes ............................................................................................... 77 2 – 3/ Obtention des échantillons et traitement des données ........................................ 78 2 – 4/ Résultats................................................................................................................. 79 2 – 4a/ Effet de l’inoculation des plantes sur l’expression des gènes ......................... 80.

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(17) 2 – 4b/ Gènes dont l’expression est affectée par la fertilisation phosphatée............. 81 2 – 4c/ Effet des traitements sur l’expression des gènes marqueurs de défense ....... 83 2 – 4d/ Effet des traitements sur l’expression des gènes reliés à la symbiose............ 85 2 –5/ Conclusion et discussion autour des résultats de Fluidigm® .................................. 87 2 – 5a/ Importance de la défense en réponse aux signaux fongiques MA .................. 88 2 – 5b/ Perturbation par le phosphate des gènes de réponse « myc »....................... 91 CONCLUSION GÉNÉRALE ET PERSPECTIVES ............................................................................. 93 1/ Mécanismes de régulation de la symbiose par le phosphate : bilan, hypothèses et perspectives ......................................................................................................................... 93 1 – 1/ Hypothèse n°5 : les strigolactones n’ont pas dit leur dernier mot… ..................... 96 1 – 1a/ Importance des HPC et des transporteurs de strigolactones ? ....................... 96 1 – 1b/ Les strigolactones, signaux systémiques ?....................................................... 97 1 – 1c/ Les strigolactones, rôles hormonaux ?............................................................. 97 1 – 2/ Hypothèse n°6 : existence de signaux de surface ? ............................................... 99 2/ Des enjeux fondamentaux et appliqués ........................................................................ 101 2 – 1/ Mieux comprendre l’interaction mycorhizienne et la nutrition phosphatée des plantes en général .......................................................................................................... 101 2 – 2/ Mieux faire face à la crise du phosphate… .......................................................... 103 2 – 2a/ De la malnutrition phosphatée des plantes à la crise invisible du phosphate .................................................................................................................................... 103 2 – 2c/ Des solutions pour faire face à la crise........................................................... 104 MATÉRIELS & MÉTHODES ...................................................................................................... 107 Matériels biologiques ................................................................................................. 107 Conditions de culture ................................................................................................. 107 Inoculation des plantes et détermination du taux de mycorhization ....................... 107 Expériences de split-root............................................................................................ 108 Mesure des teneurs en phosphate ............................................................................ 108 Préparation des exsudats racinaires .......................................................................... 109 Bioessai de germination du champignon R. irregularis ............................................. 109 Bioessai de ramification du champignon G. rosea (« branching test ») .................... 110 Analyses en spectrométrie de masse......................................................................... 110 Expérimentations « double-cone » ............................................................................ 111 Production de GSE (Germinating Spore Exsudates)................................................... 111 Etude des oscillations calciques nucléaires................................................................ 112 Dynamic ArrayTM IFCs (Fluidigm) ................................................................................ 113 Analyses statistiques des données ............................................................................. 115 BIBLIOGRAPHIE.…………………………………………………………………………………………………………………116 ANNEXE 1 : Balzergue et al., 2011……………………………………………………………………………………..144 ANNEXE 2 : Laparre et al., 2010…………………………………………………………………………………………158 ANNEXE 3 : Gènes utilisés pour le Fluidigm®……………………………………………………………………..161 ANNEXE 4 : Effet des différents traitements sur l’expression de gènes de défense……………163.

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(19) 1. Introduction Générale 1/ La rhizosphère et sa communauté microbienne Les racines, organes souterrains des plantes, sont de fait bien souvent oubliées lors de l’étude des végétaux. Elles jouent pourtant des rôles centraux dans le développement et la vie de ces organismes. Tout d’abord elles encrent les plantes dans leur substrat, les fixant de façon définitive à un endroit donné. Cette immobilité oblige les plantes à faire preuve d’une étonnante capacité de plasticité et d’adaptation face aux perturbations environnementales. Les racines jouent aussi un rôle majeur dans l’absorption de l’eau et des minéraux essentiels à la croissance, et constituent parfois un organe de réserve pour l’organisme. Les racines (ainsi que les microorganismes associés) jouent le rôle d’architecte du sol, elles produisent des composés sécrétés dans l’environnement agissant sur la dégradation ou la formation de matière, participant ainsi au (re)modelage du sol. Les racines ne peuvent être étudiées et comprises dans toute leur complexité sans considérer également leur environnement immédiat. C’est Lorenz Hiltner en 1904 qui utilisa le premier le terme de rhizosphère, provenant du grec « rhiza » signifiant racine et « sphere/sphaera » signifiant cercle d’influence. La rhizosphère représente donc le champ d'influence du système racinaire, elle comprend l’ensemble des racines ainsi que la zone de sol proche influencée par ces racines [soit via des exsudats racinaires, soit via des microorganismes interagissant avec les dernières (Badri et al., 2009)]. Dans la rhizosphère, les racines vivent entourées de nombreux micro-organismes formant un grand réservoir de diversité biologique. L’ensemble des micro-organismes dans un environnement donné est appelée microbiome. Le matériel génétique du microbiome présent dans le tube digestif de l’homme est souvent considéré comme un second génome; nous pourrions en dire de même pour le microbiome de la rhizosphère. L’importance de ces communautés microbiennes est de plus en plus étudiée chez les animaux mais aussi à l'échelle des écosystèmes (Berendsen et al., 2012). La rhizosphère comprend à la fois des organismes bénéfiques et néfastes pour les plantes. Ces organismes peuvent être des bactéries, des virus, des champignons, des oomycètes, des insectes, des nématodes, mais aussi des plantes parasites ou encore les racines d’autres plantes avoisinantes..

(20) Figure 1 : Structures de colonisation des champignons ectomycorhiziens (en bleu) et endomycorhiziens à arbuscules (en rose) (Bonfante et al. 2010). Les champignons ectomycorhiziens se développent tout autour de la racine jusqu’à la pointe racinaire formant un manteau fongique d’hyphes extérieurs, mais ils colonisent aussi l’intérieur de la racine entre les cellules végétales formant le réseau de Hartig. Les champignons endomycorhiziens à arbuscules ne colonisent pas la pointe racinaire, ils se développent de façon extracellulaire mais aussi de façon intracellulaire par exemple lors de la formation des arbuscules dans les cellules corticales..

(21) 2. 1 – 1 / Quelques exemples de partenaires symbiotiques du sol Parmi les différents organismes bénéfiques pour les plantes on compte les champignons mycorhiziens. Le mot mycorhize provient du grec « mycos » pour champignon et « rhiza » pour racine, il définit donc une interaction entre des racines et des champignons. Les mycorhizes peuvent être morphologiquement et phylogénétiquement classées en deux groupes principaux : - tout d’abord on distingue les ectomycorhizes où le champignon ne pénètre pas à l’intérieur des cellules racinaires. Il forme à l’extérieur des racines une sorte de manchon d'hyphes, et à l’intérieur des racines il se développe entre les cellules formant une interface symbiotique appelée réseau de Hartig (Figure 1). Cette symbiose concerne la plupart des arbres des forêts tempérées et implique des champignons appartenant aux Basidiomycètes ou aux Ascomycètes (arbre phylogénétique en Figure 2-A). - dans le cas des symbioses endomycorhiziennes, les champignons rentrent à l’intérieur des cellules racinaires pour réaliser les échanges avec la plante. Il existe 3 types d’endomycorhizes, les endomycorhizes à pelotons du type ericoïde ou associées aux orchidées et les endomycorhizes à arbuscules au centre de notre étude. Dans ce dernier cas les champignons concernés appartiennent au groupe monophylétique des Gloméromycètes. D’autres symbioses endoracinaires existent, on trouve notamment les symbioses fixatrices d’azote faisant des bactéries capables d’assimiler de l'azote atmosphérique améliorant ainsi la nutrition azotée des plantes hôtes. Parmi ces interactions, on peut trouver les exemples suivants (bactéries/plantes) : rhizobium/Parasponia ; Frankia/plantes actinorhiziennes ; Nostoc/Gunnera , ainsi que rhizobium/plantes légumineuses (ou Fabaceae) particulièrement bien décrite aujourd’hui. La plus détaillée et la mieux décryptée aujourd’hui est celle qui associe les bactéries rhizobia et les plantes de la famille des légumineuses. Je vais pour le moment présenter plus en détail la symbiose mycorhizienne à arbuscules, en décrivant plus particulièrement les champignons impliqués dans cette symbiose, l’importance de l’interaction ainsi que les différentes étapes de développement, les évènements de signalisation et les éléments de régulation de la symbiose..

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(23) 3. 1 – 2/ La symbiose mycorhizienne à arbuscules (MA) 1 – 2a/ Les champignons MA, des organismes particuliers Les champignons MA sont des organismes particuliers pour plusieurs raisons : i) Ce sont des biotrophes obligatoires : sans l’interaction avec la plante hôte leur fournissant des éléments carbonés, ils ne peuvent accomplir leur cycle de développement (Smith & Read, 2008). Les raisons du caractère obligatoire de la biotrophie restent encore mal connues. Cependant les données de séquençage récentes suggèrent qu'elle ne serait pas liée à la perte de gènes essentiels, mais plutôt à un contrôle par la plante de l'activité métabolique du champignon (Tisserant et al., 2012). ii) Les études en laboratoire ne montrent pas de spécificité d’hôte forte : un même champignon peut coloniser de nombreuses espèces végétales. Réciproquement, une plante peut être colonisée par plusieurs espèces de champignons MA (parfois en même temps). Il existe néanmoins des associations préférentielles, ce phénomène étant sans doute plus important dans la nature qu'au laboratoire. Ces préférences pourraient être liées au contenu des exsudats racinaires de différentes espèces végétales (Steinkellner et al., 2007), ou bien aux modes de colonisation différents des champignons (type Arum ou Paris) (Smith & Read, 2008), ou bien encore au caractère plus ou moins mutuel et donc durable de l’interaction entre les partenaires (Kiers et al., 2011). iii) La génétique de ces champignons reste encore mal comprise. Le degré de ploïdie, le nombre de chromosomes, la ségrégation des noyaux, l'existence ou non de méiose, sont autant de sujets non résolus et faisant parfois l’objet de controverse (Sanders & Croll, 2010). La reproduction sexuée n'a jamais été observée chez ces champignons, même si les gènes nécessaires semblent présents (Tisserant et al., 2012 ; Corradi & Bonfante, 2012). Les champignons MA semblent ainsi se développer de manière clonale, les hyphes sont coenocytiques (sans septa séparant les différents noyaux) et donc multinucléés, les spores contiennent des centaines (voire milliers) de noyaux associés à un grand polymorphisme génétique. La communauté scientifique spécialiste est encore divisée sur la question de la ploïdie et de la caryotie. Les champignons MA pourraient être homocaryotes (noyaux génétiquement identiques) et plutôt polyploïdes, ou être homocaryotes et haploïdes, ou encore hétérocaryotes (noyaux génétiquement différents) et haploïdes (revue : Sanders & Croll, 2010). De plus, les champignons MA ont un pourcentage en bases A-T.

(24) A. B. Rhizophagus irregularis. Gigaspora rosea. Figure 2 : Phylogénie des Gloméromycètes (adapté d’après Parniske, 2008) A : arbre phylogénétique des différentes lignées de champignons, on retrouve les Gloméromycètes (entourés en rouge), les Ascomycètes (violet) , les Basidiomycètes, les Chytridiomycètes (vert) et les Zygomycètes (bleu). B : arbre phylogénétique des 4 ordres de Gloméromycètes. Les deux champignons utilisés dans cette thèse sont rajoutés en rouge : Rhizophagus irregularis (ex Glomus intraradices) et Gigaspora rosea appartiennent à deux ordres différents..

(25) 4. inhabituellement élevé (environ 70 % chez R. irregularis), qui complique le séquençage et l’assemblage du génome, en cours depuis plusieurs années (Martin et al., 2008). iv) Un aspect important du développement du champignon est que certaines espèces peuvent réaliser des fusions d’hyphes entre individus génétiquement proches, phénomène appelé anastomose. Ce processus permet l'échange de nutriments (Mikkelsen et al., 2008) mais aussi de noyaux (Giovannetti et al., 1999 ; Croll et al., 2009) compliquant encore plus la structure/plasticité génétique de cet organisme. L’ensemble de ces caractères rendent la production des champignons MA à grande échelle difficile. La mise en place d’un système de culture in vitro de champignon sur des racines « hairy-roots » en boîte de Petri (Bécard & Fortin, 1988) permet cependant de produire du champignon en conditions axéniques et d’étudier d’un peu plus près l’interaction. De plus, la transformation génétique stable des champignons MA est pour le moment impossible et les exemples de transformations transitoires restent rares et difficile à mettre en œuvre (Harrier & Millam, 2001 ; Helber & Requena, 2008 ; Helber et al., 2011) (EXEMPLES). Ceci limite ainsi souvent les possibilités d’étude du champignon ou de l’interaction. Une meilleure compréhension de la génétique de ces champignons nous permettra peut-être un jour de réaliser de telles approches.. 1 – 2b/ La classification des Gloméromycètes Les Gloméromycètes sont composés de quatre ordres : les Glomérales (Glomus groupes A et B), les Paraglomérales (Paraglomus), les Archéosporales (Archeospora, Ambispora et Geosiphon) et les Diversisporales (Acaulospora, Gigaspora, Scutellospora, Pacispora et Diversispora) (Figure 2-B) (classification selon Schüßler et al., 2001). On dénombre aujourd'hui environ 150 espèces, une estimation qui pourrait s'avérer largement en dessous de la réalité en raison de la difficulté de délimiter clairement les espèces chez ces organismes (Smith & Read, 2008). On observe parmi les Gloméromycètes une grande diversité morphologique, notamment au niveau des spores qui sont de taille, couleur et forme très variables selon les espèces. Au niveau phylogénétique, les analyses moléculaires permettent aujourd’hui d’affiner la classification des champignons MA. Dernièrement, la communauté scientifique a même été amenée à changer les noms de différents champignons mycorhiziens dont le champignon modèle Glomus intraradices (DAOM197198), qui a été reclassé en 2009 sous le.

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(27) 5. nom de Glomus irregularis (Stockinger et al., 2009). Plus récemment, Walker et Schüßler ont proposé pour cette espèce le nom de Rhizophagus irregularis (Schüßler & Walker, 2010 ; Krüger et al., 2012). Cette dernière appellation reprise dernièrement par plusieurs auteurs (Labidi et al., 2012 ; Pérez-Tienda et al., 2012 ; Lauressergues et al., 2012 ; Liao et al., 2012…), sera utilisée dans ce manuscrit à travers l’écriture R. irregularis.. 1 – 2c/ L’importance de la symbiose MA L’interaction entre es champignons MA et les plantes est extrêmement ancienne puisqu’elle date d’environ 450 millions d’année, moment de l’apparition des premières plantes terrestres. En effet, plusieurs études de fossiles montrent des structures fongiques très semblables à celles typiquement observées chez les champignons MA actuels. Parmi ces fossiles, certains datent du Dévonien inférieur (environ 415 Ma) et montrent notamment des structures ressemblantes à des arbuscules (Remy et al., 1994) et d’autres présentent des spores datent de l’Ordovicien (environ 460 Ma) (Redecker et al., 2000). Il est généralement admis que l’interaction entre les premières plantes primitives et les champignons MA de l’époque a participé à la colonisation du milieu terrestre par les plantes (pour revues voir : Raven & Edwards, 2001 ; Bonfante & Genre, 2008 ; Humphreys et al., 2010). Encore aujourd’hui, la grande majorité des espèces de plantes terrestres (environ 80 %, y compris chez les mousses et les hépatiques) sont capables d’effectuer une symbiose MA, indiquant un incroyable succès évolutif concernant cette interaction symbiotique. Il existe malgré tout plusieurs familles de plantes incapables de réaliser cette symbiose, dont certaines s'engagent dans d'autres relations symbiotiques et d’autres sont totalement non mycotrophes. En dehors de ces exceptions, les plantes sont donc normalement en interaction avec un champignon MA, la condition non mycorhizée restant inhabituelle (Smith & Smith, 2011).. Les intérêts de la symbiose MA pour les plantes sont nombreux. Tout d’abord, le champignon se développe dans les racines mais aussi au niveau extra-racinaire dans le sol. Le nom de mycorhizosphère est attribué à la zone explorée par les deux partenaires (Linderman, 1988). Grace à son réseau mycélien, le volume de sol exploré par le champignon est bien plus grand que celui parcouru par les racines seules. Il peut donc avoir accès à des ressources supplémentaires en eau et en éléments minéraux qui sont transmis ensuite à la.

(28) Phase a-symbiotique. Phase pré-symbiotique. Etapes symbiotiques. Myc Factors. Strigolactones. Arbscules. Figure 3 : Schéma des différents étapes de colonisation des champignons MA (adapté d’après Bonfante & Genre 2010). La phase a-symbiotique : le champignon germe et forme quelques ramifications sans l’aide ou la présence du partenaire végétal. La phase pré-symbiotique : échanges de signaux diffusibles sans contact direct entre les deux partenaires. La plante sécrète des exsudats perçus par le champignon, induisant sa ramification et son activité métabolique. Le champignon produit lui aussi des signaux perçus par les cellules racinaires, induisant des variations de teneurs en calcium dans le cytoplasme et les noyaux, ainsi que l’activation de gènes végétaux. La phase symbiotique : le champignon forme un hyphopode à la surface de l’épiderme, la plante met en place un appareil de pré-pénétration (PPA) pour guider le développement du champignon à travers les différentes couches de cellules jusqu’au cellules du cortex interne où sont mis en places les arbuscules et où ont lieu les échanges. Ensuite le champignon peut finir son cycle de développement et former un nouvelle génération de spores..

(29) 6. plante hôte au niveau des racines. Le principal avantage pour la plante est donc une meilleure nutrition hydrique et minérale en particulier en phosphate (pour revue : Smith & Read, 2008). Les plantes mycorhizées reçoivent du phosphate de la part du champignon et cela se traduit le plus souvent par une augmentation de la biomasse par rapport à des plantes non colonisées (l'effet est d’autant plus net que les plantes sont en conditions de carence phosphatée), ceci s’accompagnant parfois de teneurs internes en phosphate supérieures chez les plantes mycorhizées. De plus, l’état mycorhizé fournit aussi à la plante une meilleure résistance aux stress abiotiques comme le stress hydrique, salin ou la présence de métaux lourds (exemples : Al-Karaki, 2000 ; Aroca et al., 2007 ; Hildebrandt et al., 2007) mais aussi aux stress biotiques. En effet, des plantes mycorhizées sont plus résistantes à certains pathogènes racinaires (Whipps, 2004) mais aussi foliaires (exemples : Liu et al., 2007 ; Campos-Soriano et al., 2011). L’association symbiotique entre les champignons MA et les plantes est dite mutualiste, c’est-à-dire que les deux partenaires tirent profit de l’interaction. Les champignons MA (biotrophes obligatoires) reçoivent de la plante des éléments carbonés issus de la photosynthèse. L’interaction représente donc un coût pour le partenaire végétal. La part de photosynthétats transférée au champignon est non négligeable puisqu’elle peut atteindre jusqu’à 20 % du carbone fixé lors de la photosynthèse, soit environ 5 milliards de tonnes de carbone par an (Bago et al., 2000).. 1 – 2d/ Les différents stades de développement de l’interaction Il existe tout d’abord une phase dite a-symbiotique sans contact ni échange entre les deux partenaires (schéma Figure 3). Dans des conditions favorables, les spores peuvent germer spontanément et produire un tube germinatif et quelques ramifications primaires sans même avoir besoin de puiser dans leurs réserves lipidiques (Bécard et al., 2004). Lorsqu’aucun partenaire végétal n’est à proximité, selon les espèces fongique, les hyphes germinatifs peuvent alors se septer et le cytoplasme peut se rétracter dans la spore initiale. Ils peuvent aussi sporuler en formant des spores plus petites (Hildebrandt et al., 2002). Dans tous les cas, l’essentiel des réserves énergétiques des spores initiales est conservé. De nouvelles germinations peuvent alors être observées, augmentant ainsi les chances du champignon de rencontrer une racine (Bécard et al., 2004)..

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(31) 7. Avant même le premier contact entre les deux partenaires, se déroule un échange de signaux diffusibles produits par chacun des partenaires. Cette phase est dite présymbiotique. Les plantes produisent des exsudats racinaires capables d’activer l’activité métabolique et une ramification intense des hyphes du champignon. Les champignons sécrètent eux aussi des signaux diffusibles induisant notamment dans les cellules végétales des variations de concentration en calcium dans le cytosol et le noyau, la régulation transcriptionnelle de gènes et la ramification des racines. La nature et l’importance de ces signaux symbiotiques seront abordées ultérieurement dans une partie spécifique. La germination des spores se fait de façon asynchrone, l’ensemble des étapes qui suivent sont donc elles aussi non synchronisées à l’échelle de la plante. Viennent ensuite les étapes symbiotiques à proprement parler : - Le champignon forme un hyphopode au contact de l’épiderme. Ce dernier représente le point d’accroche du champignon à la racine et son futur point de pénétration. - Dans la cellule épidermique située sous l’hyphopode, un appareil de prépénétration (PPA) est mis en place qui correspond à un réarrangement polarisé du cytoplasme et du cytosquelette. Il permet la formation d’un pont apoplasmique endocellulaire à travers lequel le champignon va se développer pour traverser les différentes couches cellulaires jusqu’aux cellules corticales (Genre et al., 2005 ; 2008). - Le champignon pénètre dans les cellules corticales sans en traverser la membrane plasmique et forme des structures hyper-ramifiées appelées arbuscules. Les arbuscules sont entourés d’une membrane plasmique péri-arbusculaire séparant le champignon du cytoplasme végétal. C’est au niveau des arbuscules qu’ont lieu les échanges carbonephosphate/azote entre le champignon et la plante grâce à des transporteurs spécifiques. Les arbuscules ont une durée de vie limitée (en moyenne 8,5 jours). Ils atteignent une taille maximale dans la cellule puis rentrent en sénescence et le champignon peut être complètement éliminé de la cellule végétale qui revient à son état initial (Javot et al., 2007a). Une cellule peut ainsi accueillir plusieurs arbuscules successifs. De plus, un grand nombre d’espèces de champignons MA comme R. irregularis produisent des structures de réserves lipidiques à l’intérieur des racines au niveau dans les cellules ou au niveau de l’apoplaste, ce sont des vésicules (Smith & Read, 2008). Parallèlement à son développement intra-racinaire, un mycélium se développe à l’extérieur de la racine capable de prélever des minéraux et de l’eau dans des zones de sol.

(32) A LYK3 NFP. DMI2. DM1. DMI1. DMI3 IPD3 NSP1, NPS2, NIN …. ENOD11. B. Figure 4 : Voie de transduction des signaux symbiotiques. A : éléments de signalisation symbiotique. La perception des FNod au niveau membranaire passe par des récepteurs LysM-RLK (LjNFR1 et LjNFR5 chez le lotier correspondants à MtLYK3 et MtNFP chez Medicago truncatula). Elle induit rapidement une réponse calcique nucléaire. LjSYMRK/MtDMI2, LjCASTOR/LjPOLLUX/MtDMI1, LjNUP85, LjNUP133, LjNENA sont positionnés en amont de ce signal calcique et sont nécessaires à sa formation. Ensuite intervient LjCCaMK/MtDMI3 une calmoduline kinase dépendante du calcium qui participe au décodage du signal calcique et qui interagit avec LjCYCLOPS/MtIPD3 et des facteurs de transcription comme MtNSP1, MtNSP2 et MtNIN activant l’expression de gènes tels que MtENOD11. (adapté d’après Singh & Parniske, 2012) B : schéma récapitulatif des éléments communs de la voie de transduction activée par les signaux symbiotiques (FNod et FMyc) menant à la mycorhization, la nodulation et la ramification des racines. (Maillet et al., 2011).

(33) 8. normalement inaccessibles aux racines seules. Ce mycélium extra-racinaire peut coloniser de nouvelles régions du système racinaire de la plante hôte (infections secondaires) ou coloniser les racines d’une plante voisine. Il produit également les nouvelles spores à l’origine d’un nouveau cycle.. 1 – 2e/ Existence d’une voie de signalisation commune avec la symbiose rhizobium (voie SYM) nécessaire à la mise en place de l’interaction Pour commencer, nous allons présenter plus en détail la symbiose entre les bactéries rhizobiennes et les racines des légumineuses. Cette symbiose est relativement bien connue car plus facile à étudier que la symbiose MA, et nous allons voir que son étude a permis de grandes avancées dans la compréhension de la symbiose MA. Lors de cette interaction, un dialogue moléculaire a lieu entre les racines des plantes et les bactéries (Cooper, 2007). Les plantes sécrètent entre autres des flavonoïdes qui, une fois perçus par les bactéries, induisent chez ces dernières l’expression des gènes Nod (pour nodulation). Ces gènes bactériens. codent. pour. des. protéines. impliquées. dans. la. production. de. lipochitooligosaccharides (LCO) appelés facteurs Nod (FNod) (Peters et al., 1986 ; Dénarié & Debellé, 1996). La perception des FNod par les plantes est la première étape qui permettra d’accueillir les bactéries dans la racine et d’aboutir à la formation d’un nouvel organe appelé nodule. La voie de signalisation déclenchée par les FNod est de mieux en mieux décryptée (notamment grâce aux études réalisées chez le lotier Lotus japonicus et chez Medicago truncatula). De façon très intéressante, plusieurs protéines (une dizaine au moins) impliquées dans cette voie de signalisation sont également importantes pour l’établissement de la symbiose mycorhizienne à arbuscules (Parniske, 2008 ; Singh & Parniske, 2012). On l’appelle donc la voie SYM ou CSP (pour common symbiosis pathway) (Figures 4-A et 4-B). Si plusieurs gènes spécifiques de la nodulation comme LjNFR1, LjNFR5, NIN, LHK1, etc. ont été bien caractérisés, aucun gène spécifique de la symbiose MA, impliqué dans les étapes précoces, n’a encore été trouvé. Nous pouvons aussi remarquer que certains éléments de cette voie SYM sont aussi importants pour. La perception des FNod fait intervenir des récepteurs membranaires de type LysMRLK appelés nod factor receptor (LjNFR5/MtNFP et LjNFR1/MtLYK3) (Amor et al., 2003 ;.

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(35) 9. Madsen et al., 2003 ; Radutoiu et al., 2003 ; Limpens et al., 2003 ; Smit et al., 2007 ; Bensmihen et al., 2011). Chez le lotier, une interaction directe vient d’être démontrée in vitro entre les FNod et les récepteurs LjNFR5 et LjNFR1 (Broghammer et al., 2012). De plus, lors de la symbiose particulière entre les bactéries rhizobium et des plantes non légumineuses appelées Parasponia l’homologue de LjNFR5/MtNFP (PaNFP) s’avère nécessaire pour la nodulation mais aussi pour la formation d’arbuscules chez ces plantes (Op den Camp et al., 2011). Le(s) récepteur(s) des signaux fongiques ne sont pour le moment pas identifiés clairement. Les derniers résultats concernant l’interaction symbiotique rhizobium et Parasponia laissent penser que des récepteurs de type LycM-LRK sont aussi impliqués dans la perception de signaux mycorhiziens. D’autres protéines ont été identifiés : un autre récepteur membranaire possédant un domaine kinase fonctionnel appelé LjSYMRK/MtDMI2 (Endre et al., 2002 ; Stracke et al., 2002), un canal cationique nucléaire LjCASTOR/LjPOLLUX/MtDMI1 (Ané et al., 2004 ; Imaizumi-Anraku et al., 2005), des nucléoporines découvertes uniquement chez le lotier LjNUP85, LjNUP133 et LjNENA (Kanamori et al., 2006 ; Saito et al., 2007 ; Groth et al., 2010). Toutes ces protéines sont nécessaires à la formation d’un signal calcique nucléaire essentiel pour les deux symbioses (Oldroyd & Downie, 2006). Une protéine calmoduline-kinase dépendante du calcium LjCCaMK/MtDMI3 localisée dans le noyau intervient ensuite pour décoder et transduire ces oscillations calciques (en particulier pour distinguer les voies Nod et Myc) (Tirichine et al., 2006 ; Lévy et al., 2004 ; Mitra et al., 2004). Lors de cette transduction, la CCaMK interagit avec les protéines LjCYCLOPS/MtIPD3 qu’elle phosphoryle (Messinese et al., 2007 ; Yano et al., 2008) et les facteurs de transcription MtNSP1 et MtNSP2 (Smit et al., 2005 ; Kaló et al., 2005). Un autre facteur de transcription MtNIN est important pour la nodulation (Marsh et al., 2007). De façon intéressante, des chercheurs viennent de découvrir que NSP1 et NSP2 sont indispensables à la production de strigolactones chez le riz et M. truncatula (Liu et al., 2011a). De plus, NSP1 et NSP2 peuvent se lier en complexe au niveau du promoteur du gène ENOD11 et réguler son expression (Hirsch et al., 2009). Le gène MtENDO11 (pour early nodulin 11) bien qu’ayant une fonction inconnue représente un marqueur de la perception des signaux symbiotiques bactériens (FNod) et mycorhiziens (FMyc). Dans le cas de la symbiose mycorhizienne, ENOD11 est exprimé au cours de la progression de la colonisation par le champignon (Journet et al., 2001 ; Chabaud et al., 2002)..

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(37) 10. La voie SYM est particulièrement bien caractérisée dans le cas d’interactions symbiotiques rhizobium/légumineuses, de façon intéressante on peut noter que certains éléments sont aussi importants lors d’autres interactions fixatrices d’azote. En effet, plusieurs sont par exemple impliqués lors de l’interaction frankia/plantes actinorhiziennes (Gherbi et al., 2008 ; Hocher et al., 2011) et NFP intervient lors de l’interaction entre rhizobium et la plante non-légumineuse Parasponia (Op den Camp et al., 2011). Ces résultats montrent l’importance de cette voie de signalisation dans la mise en place d’interactions symbiotiques de manière plus générale.. 1 – 2f/ Les différents points de contrôle de l’interaction Chacun des différents stades de mycorhization présentés précédemment peut représenter un point de contrôle de l’interaction, et il existe de nombreux mutants de plantes bloqués à différents stades du développement de la symbiose. Ces mutants peuvent être globalement classés en plusieurs groupes : les cas où le champignon ne forme pas d’hyphopode (hyp-), les cas où les hyphopodes sont formés mais le champignon n’arrive pas à pénétrer l’épiderme (pen-) (NB dans ces mutants les hyphopodes sont parfois anormaux et/ou plus nombreux), les cas où le champignon rentre dans la racine mais a du mal à progresser (coi-, pour cortex invasion) et les cas où les arbuscules sont anormaux ou ne se forment pas (arb-). Les mutants de la voie SYM peuvent eux aussi être classés selon ces groupes : dmi2, dmi1 , nup5, nup133 sont des mutants coi-, castor et ipd3 sont coi- et arb- et dmi3 est le seul à être coi- et arb- mais aussi pen- (Marsh & Schultze, 2001 ; Parniske, 2008). On remarque qu’aucun des mutants de la voie SYM n’est affecté dans la formation d’hyphopodes. De fait, les éléments permettant la formation des hyphopodes restent mal connus. On peut considérer que la formation de l’hyphopode a lieu lorsque les deux partenaires se sont correctement reconnus lors de la phase pré-symbiotique et lorsque la plante est dans un état favorable à l’interaction (Giovannetti et al., 1993a). Des études sur des parois isolées de différentes couches cellulaires ont permis de démontrer que les hyphopodes étaient capables de se former sur la paroi d’épiderme uniquement, et non sur des parois de cortex ou de tissus vasculaire (Nagahashi & Douds, 1997). La mise en place des hyphopodes n’est pas non plus observée sur des racines de plantes non hôtes et n’a pu être reproduite sur des surfaces artificielles telles que de la cellulose ou du nylon (Garriock et al., 1989 ; Giovannetti et al., 1993a ; Nagahashi & Douds, 1997). Les mutants affectés dans la.

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(39) 11. formation d’hyphopodes sont rares. Les mutant pmi1 (premycorrhizal infection) et pmi2 identifiés chez la tomate montrent des hyphopodes normaux mais en nombre considérablement réduit (hyp-) (David-schwartz et al., 2001, 2003). Malheureusement les gènes responsables de cette mutation n’ont pas été caractérisés, mais un rôle de composés diffusibles végétaux a été proposé pour expliquer ces phénotypes (Sun et al., 2012). De même, le mutant nope1 de maïs est bloqué dans la formation d’hyphopodes mais là aussi les raisons de ce phénotype sont inexpliquées (Paszkowski et al., 2006). Enfin, le mutant Ljsym4 est affecté dans la formation des hyphopodes chez le lotier, mais les auteurs n’ont pas identifié les mécanismes ou les gènes responsables de ce phénotype (Bonfante et al., 2000). D’autres mutants (non affectés dans des éléments composants la voie SYM) présentent des phénotypes pen-, coi- ou arb-. Pour accueillir le champignon dans leurs cellules corticales, les plantes doivent reprogrammer ces cellules. Des gènes sont donc impliqués dans les modifications cellulaires permettant l’accueil du champignon. Un gène appelé VAPYRIN a été identifié chez M. truncatula comme nécessaire au développement du champignon, que ce soit pour la pénétration (pen-) de l’épiderme (coi-) mais surtout pour la formation des arbuscules (arb-) puisque chez le mutant vapyrin, le champignon ne pénètre même pas dans la cellule (Pumplin et al., 2010). Ces résultats ont été retrouvés chez le pétunia où un mutant pam1 préalablement caractérisé comme incapable d’accueillir le champignon dans ses cellules s’est avéré être lui aussi affecté dans un gène codant pour la vapyrine (Feddermann et al., 2010), confirmant le rôle de ce gène dans la progression du champignon et l’accommodation des cellules végétales pour accueillir le champignon. De façon intéressante, ce gène se révèle aussi important pour l’infection des poils absorbants par les rhizobia et la formation de nodules dans le cadre de la symbiose nodulaire, son expression est induite suite à un traitement avec des FNod et ce, de façon SYM-dépendante (Murray et al., 2011). Un autre exemple concerne les mutants str1 et str2 de M. truncatula présentant des anomalies au niveau de la formation d’arbuscules. STR1 et STR2 codent pour des « half-size ABC transporters » exprimés chez le sauvage constitutivement dans les tissus vasculaires et induits dans les cellules contenant des arbuscules (Zhang et al., 2010). L’importance de ces gènes pour la formation d‘arbuscules normaux a été retrouvée chez le riz (phénotype arb-) (Gutjahr et al., 2012)..

(40) Témoin. + exsudats. Figure 5 : Ramification du champignon Gigaspora rosea en réponse à des exsudats racinaires Des extraits d’exsudats racinaires sont appliqués des deux côtés de l’hyphe principal (flèches jaunes) d’une spore de G. rosea ayant germé sur milieu M depuis 6 jours. Les nouveaux apex fongiques formés 48h après traitement sont dénombrés (flèches blanches). On remarque une forte ramification lorsque le champignon est traité par des exsudats de plantes par rapport au champignon témoin traité au solvant seul..

(41) 12. 1 – 3/ Les signaux végétaux dans la phase pré-symbiotique : une attention particulière pour les strigolactones 1 – 3a/ Du « branching factor » aux strigolactones De nombreuses études ont montré que les exsudats racinaires de plantes mycotrophes ainsi que le mucilage de l’apex contiennent des molécules capables de stimuler la croissance du champignon et sa ramification (exemples : Graham, 1982 ; Elias & Safir, 1987 ; Bécard & Piché, 1989 ; Giovannetti et al., 1993b ; Tawaraya et al., 1996 ; Nagahashi & Douds, 2004). Les exsudats de plantes non-hôtes ne provoquent pas de tels effets sur le champignon (exemples : Bécard & Piché, 1990 ; Giovannetti et al., 1993b ; Schreiner & Koide, 1993 ; Buee et al., 2000 ; Nagahashi & Douds, 2004), suggérant l’importance de ces signaux dans la mise en place de l’interaction. Différentes études ont été menées pour caractériser les molécules végétales responsables de la réponse de ramification du champignon. Giovannetti et al. en 1996 ont montré grâce à une membrane séparant le champignon des racines que ces dernières sécrétaient des molécules diffusibles d’une taille inférieure à 500 Da activant le champignon. La mise au point d’un bioessai basé sur la ramification du champignon (« branching test » décrit dans Matériels & Méthodes) a permis de démontrer la présence de molécules hydrophobes actives à de faibles concentrations dans une fraction semi-purifiée d’exsudats de racines de carottes «hairy-roots» (Nagahashi & Douds, 2000 ; Buee et al., 2000). A l’époque, ces molécules encore non caractérisées ont été appelées « branching factor » (Buee et al., 2000), car à l’origine d’un hyper-ramification observée chez le champignon comparable à celle obtenue en réponse à une racine hôte vivante (Figure 5) (Bécard & Fortin, 1988 ; Giovannetti et al., 1993b, 1994, 1996). Le champignon passe d’une étape a-symbiotique à une étape pré-symbiotique, au moment où en réponse aux signaux végétaux il active le catabolisme de ses réserves lipidiques et ramifie fortement (Bécard et al., 2004). La nature du ou des signaux contenus dans le « banching factor » est longtemps restée inconnue. Les recherches se sont d’abord portées sur les flavonoïdes, molécules végétales sécrétées par les racines et connues comme intervenant notamment dans le dialogue moléculaire mis en place entre les rhizobia et les légumineuses (Subramanian et al., 2007). Plusieurs études ont montré que certains flavonoïdes stimulaient la croissance de certains champignons MA ainsi que la mycorhization (Scervino et al., 2007) alors que d’autres étaient sans effet ou avaient un effet négatif (Scervino et al., 2007 ; Steinkellner et.