Rapport final du projet AGEcaninox

(1)

HAL Id: hal-02806154

https://hal.inrae.fr/hal-02806154

Submitted on 6 Jun 2020

HAL is a multi-disciplinary open access

archive for the deposit and dissemination of

sci-entific research documents, whether they are

pub-lished or not. The documents may come from

teaching and research institutions in France or

abroad, or from public or private research centers.

L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est

destinée au dépôt et à la diffusion de documents

scientifiques de niveau recherche, publiés ou non,

émanant des établissements d’enseignement et de

recherche français ou étrangers, des laboratoires

publics ou privés.

Rapport final du projet AGEcaninox

Claude Genot, Anne Meynier, Marie-Caroline Michalski, M. Linder, A.

Giboreau, G. Breton

To cite this version:

Claude Genot, Anne Meynier, Marie-Caroline Michalski, M. Linder, A. Giboreau, et al.. Rapport

final du projet AGEcaninox. [Contrat] ANR-FORM-090601-01-01, 2013. �hal-02806154�

(2)

Compte-rendu de

fin de projet

10/09/20143

Projet ANR-08-ALIA-02

AGEcaninox

Programme ALIA 2008

A

I

DENTIFICATION

... 2

B

R

ESUME CONSOLIDE PUBLIC

... 2

B.1 Instructions pour les résumés consolidés publics ... 2

B.2 Résumé consolidé public en français ... 2

B.3 Résumé consolidé public en anglais ... 4

C

M

EMOIRE SCIENTIFIQUE

... 5

C.1 Résumé du mémoire ... 5

C.2 Enjeux et problématique, état de l’art ... 6

C.3 Approche scientifique et technique ... 6

C.4 Résultats obtenus ... 7

C.5 Exploitation des résultats ... 9

C.6 Discussion ... 9

C.7 Conclusions ... 10

C.8 Références ... 11

D

L

ISTE DES LIVRABLES

... 11

E

I

MPACT DU PROJET

... 15

E.1 Indicateurs d’impact ... 15

E.2 Liste des publications et communications ... 16

E.3 Liste des éléments de valorisation... 21

E.4 Bilan et suivi des personnels recrutés en CDD (hors

stagiaires) ... 23

Ce document a été rempli par le coordinateur en collaboration avec les partenaires du projet.

(3)

A I

DENTIFICATION

Acronyme du projet AGEcaninox

Titre du projet Marqueurs de l’oxydation des acides gras polyinsaturés dans des aliments enrichis en oméga 3, conséquences sur le stress oxydant in vivo et

perception par les seniors Coordinateur du

projet

(société/organisme)

INRA UR1268 Biopolymères Interactions Assemblages, Nantes Période du projet

(date de début – date de fin)

01-01-2009 - 30/06/2013 Site web du projet,

le cas échéant https://collaboratif.inra.fr/silverpeas/admin/jsp/MainFrameSilverpeasV5.jsp (accès sur demande) Rédacteur de ce rapport

Civilité, prénom, nom Mme Claude Genot

Téléphone 02 40 29 39 58

Adresse électronique [email protected] Date de rédaction 15 septembre 2013

Si différent du rédacteur, indiquer un contact pour le projet Civilité, prénom, nom

Téléphone

Adresse électronique

Liste des partenaires présents à la fin du projet (société/organisme et responsable scientifique)

INRA UR1268 Biopolymères Interactions Assemblages, Claude Genot, Anne Meynier

INRA USC1235, INSERM U1060, Université de Lyon, INSA-Lyon IMBL, CarMeN, Marie-Caroline Michalski INPL, LIBio, Michel Linder

Institut Paul Bocuse Recherche, Agnès Giboreau Société Polaris, Gildas Breton

B R

ESUME CONSOLIDE PUBLIC

B.1 I

NSTRUCTIONS POUR LES RESUMES CONSOLIDES PUBLICS

B.2 R

ESUME CONSOLIDE PUBLIC EN FRANÇAIS

L’oxydation des lipides dans des aliments enrichis en oméga-3 peut moduler leur effet santé

De faibles niveaux d’oxydation des lipides sont-ils susceptibles d’affecter les bénéfices liés à la consommation d’aliments enrichis en oméga-3 ?

Les attentes en terme de bénéfices santé d’aliments enrichis en acides gras polyinsaturés (AGPI) oméga-3 d’origine marine (EPA et DHA) sont nombreuses, en particulier pour les populations fragilisées comme les seniors. Cet enrichissement peut s’accompagner de la présence de produits d’oxydation des lipides formés lors de la fabrication des aliments ou pendant leur digestion. Or, si certains de ces produits sont des marqueurs du stress oxydant in vivo, l’impact en terme métabolique de leur ingestion en quantités modérées et les conséquences éventuelles sur la santé n’était pas connu. Une raison majeure en était le manque de méthodes permettant de les quantifier dans les aliments.

Le projet AGEcaninox visait ainsi à fournir des éléments d’évaluation du risque éventuel lié à l’absorption chronique et en quantités modérées de produits d’oxydation lipidique dans les aliments enrichis en acides gras oméga-3.

(4)

Il s’agissait éventuellement à terme d’attirer l’attention des pouvoir publics et des fabricants de produits enrichis en oméga-3 sur des effets indésirables observables pour des niveaux d’oxydation n’induisant pas de perte des qualités sensorielles et ni de l’acceptabilité des produits.

Effets sur le stress oxydant in vivo et l’acceptabilité sensorielle de faibles niveaux d’oxydation dans des formulations enrichies en oméga-3

Des méthodes de quantification de marqueurs de l’oxydation des acides gras oméga-6 et oméga-3 ont été mises au point puis comparées aux méthodes courantes de mesure de l’oxydation des lipides sur diverses matières premières et formulations alimentaires. Puis, sur la base de matières premières lipidiques sélectionnées pour leur composition en acides gras, DHA et EPA étant apporté sous forme de triacylglycérols ou de phospholipides, différentes formulations ont été réalisées pour :

- préciser l’impact sur la formation des marqueurs de l’oxydation, de la structure chimique et de la localisation des lipides vecteurs de DHA ;

- étudier les évolutions des structures des lipides émulsifiés, la bioaccessibilité des acides gras, et leur oxydation dans des conditions de digestion gastro-intestinale réalisées in vitro ;

- évaluer, dans un contexte de régime hyperlipidique et sur modèle animal (souris) l’impact de la consommation d’EPA et DHA sous forme triacylglycérols ou de phospholipides en présence de quantités modérées de produits d’oxydation des lipides sur le stress oxydant et l’inflammation en démontrant, sur modèle cellulaire, que ces marqueurs sont absorbés ;

- évaluer l’acceptabilité sensorielle d’aliments enrichis faiblement oxydés par des consommateurs placés en situation réelle.

Résultats majeurs du projet

La mise au point de méthodes spécifiques de quantification d’aldéhydes issus de l’oxydation a permis de montrer que l’absorption des produits d’oxydation, formés dans les aliments enrichis en oméga-3 à un niveau où ceux-ci restent sensoriellement acceptables, ou éventuellement formés pendant la digestion, est susceptible de provoquer du stress oxydant et de l’inflammation aux niveaux intestinal et sanguin, et d’activer des défenses antioxydantes. La forme d’apport des oméga-3 (triacylglycérols ou phospholipides) module l’oxydabilité des formulations et leurs effets métaboliques. Ces données nouvelles devraient être prises en compte pour formuler et contrôler la qualité des produits enrichis en oméga-3.

Production scientifique et brevets depuis le début du projet

AGEcaninox a donné lieu à la réalisation de 3 thèses, dont 2 financées par l’ANR, 5 publications dans des revues scientifiques à comité de lecture (d’autres sont en préparation), 2 chapitres d’ouvrage, 18 communication orales, dont certaines avec édition de proceedings et 10 posters dans des congrès et séminaires scientifiques internationaux et nationaux.

Illustration

AGEcaninox : la forme de l’apport en acides gras oméga-3 à longues chaines et la présence en quantités modérées de leurs produits d’oxydation dans des formulations et aliments enrichis ou formés au cours de la digestion peuvent moduler leurs effets bénéfiques.

Informations factuelles

Le Projet AGEcaninox est un projet de recherche fondamentale coordonné par l’INRA, UR1268 Biopolymères Interactions Assemblages (BIA, Nantes). Il associe le laboratoire de Recherche en Cardiovasculaire, Métabolisme, Diabétologie et Nutrition (CarMeN : INRA USC1235, INSERM U1060, Université de Lyon, INSA-Lyon IMBL, Lyon, Villeurbanne), le laboratoire d’Ingénierie des Biomolécules

(5)

(LIBio, INPL Nancy-Lorraine, Vandœuvre–les-Nancy), l’Institut Paul Bocuse Recherche (IPBR, Ecully), la société Polaris (Even) et l’agence Senior Agency (Paris). Le projet qui a démarré en janvier 2009 a duré 4,5 ans (48 + 6 mois). D’un coût global d’environ 2.5 M €, il a bénéficié d’une aide ANR de 549 000 € ayant permis de financer notamment 2 bourses de thèses et d’une bourse de thèse cofinancée par l’INRA et la région Pays de la Loire.

B.3 R

ESUME CONSOLIDE PUBLIC EN ANGLAIS

Lipid oxidation could interfere with the health benefits of omega-3 fatty acids

Quantification, metabolic and sensory impact of lipid oxidation in omega-3-enriched food formulations and produced during their digestion

Expectations in terms of health benefits of foods enriched in polyunsaturated fatty acids (PUFA) omega-3 of marine origin (EPA and DHA) are numerous, especially for vulnerable populations such as seniors. The enrichment can however favor the formation of lipid oxidation compounds during the manufacture or the digestion of the foods. Some of these compounds are markers of oxidative stress in vivo but their metabolic impact, when regularly eaten in moderate amounts, was not known. A major reason was the lack of methods to quantify them in foods. The AGEcaninox project aimed to provide tools and data to evaluate if any potential risks are associated with the chronic intake in moderate amounts of oxidized lipids from foods enriched in omega-3 fatty acid. The long-term objective is to attract, if relevant, the attention of public authorities and manufacturers of omega-3 enriched-products on adverse health effects of lipid oxidation at levels that does not induce loss of sensory qualities and neither of acceptability of products.

Sensory acceptability and impact on in vivo oxidative stress of weakly-oxidized omega-3 enriched formulations

Specific methods to quantify markers of lipid oxidation of omega-6 and omega-3 fatty acids in various raw materials and food formulations have been developed and compared to current methods. Then formulations made of food-grade oils and lecithins selected for their fatty acid composition were conceived. In these formulations DHA and EPA were provided in the form of triacylglycerols or phospholipids. These formulations were the basis to:

- describe the impact on the formation of oxidation markers, of chemical structure and location of lipids DHA vectors;

- study the evolution of the structures of emulsified lipids, the bioaccessibility of fatty acids and their oxidation in conditions of in vitro gastrointestinal digestion;

- evaluate, in a context of high fat diet and animal (mouse) model, the impact of the consumption of EPA and DHA in the form of triacylglycerols or phospholipids in the presence of moderate amounts of lipid oxidation products, on the oxidative stress and inflammation. The absorption of the chosen markers was demonstrated on cell model;

- assess the sensory acceptability of weakly oxidized enriched foods by consumers placed in actual consumption conditions.

Major results

The development of specific methods to quantify aldehydes issued from lipid oxidation allowed to demonstrate that the absorption of lipid oxidation products, formed in foods enriched with omega-3 PUFA at a level where they remain sensory acceptable, or possibly formed during digestion, can cause oxidative stress and intestinal and blood inflammation and activate antioxidant defenses. The enrichment of formulations in omega-3 as triacylglycerol or phospholipids modulated their metabolic effects and their oxidation kinetics. These new data should be taken into account in the formulation and quality control of products enriched with omega-3.

Scientific output

The scientific output of AGEcaninox project comprises 3 PhD thesis, 5 articles published in peer-reviewed journals (plus articles in preparation), 2 book chapters, 18 oral communications and 10 posters in national and international scientific congress and symposia.

(6)

AGEcaninox : the molecular forms of long-chain omega-3 fatty acid in enriched-foods or delivery systems and the formation during food processing and digestion of low amounts of lipid oxidation products can modulate their health benefits.

Informations factuelles

AGEcaninox is a basic research project coordinated by INRA, UR1268 Biopolymères Interactions Assemblages (BIA, Nantes). Its framework associates CarMeN laboratory (laboratoire de Recherche en Cardiovasculaire, Métabolisme, Diabétologie et Nutrition: INRA USC1235, INSERM U1060, Université de Lyon, INSA-Lyon IMBL, Lyon, Villeurbanne), LIBio laboratory (laboratoire d’Ingénierie des Biomolécules, INPL Nancy-Lorraine, Vandœuvre–les-Nancy), IPBR (Institut Paul Bocuse Recherche, Ecully), Polaris (Even) et Senior Agency (Paris). The project started January 2009 and lasted 48 (+ 6) months. Its cost was about 2.5 M €, 549 000 € of which having been founded by ANR. Two Ph-Ds were granted by this way, a third one having beneficiated of a grant from INRA and the Région Pays de la Loire.

C M

EMOIRE SCIENTIFIQUE

Des rapports annexes plus détaillés accompagnent ce résumé qui ne fait pas l’objet de

mesure de confidentialité.

Mémoire scientifique confidentiel

: oui / non

C.1 R

ESUME DU MEMOIRE

Les bénéfices santé des aliments enrichis en acides gras polyinsaturés (AGPI) oméga-3 d’origine marine (EPA et DHA) sont nombreux, en particulier pour les populations fragilisées comme les seniors. Cet enrichissement peut cependant découler la formation de produits d’oxydation des lipides. Or, l’impact métabolique de l’absorption chronique et en quantités modérées de ces produits, qui sont des marqueurs du stress oxydant in vivo, était peu connu.

Dans ce contexte, le projet AGEcaninox, rassemblant un consortium de 3 laboratoires publics (INRA UR1269 BIA, Nantes ; INRA USC1235 CarMeN - INSERM U1060 - Université de Lyon – INSA Lyon IMBL ; INPL LIBio, Vandœuvre-lès-Nancy), et 3 structures privées (IPBR, Polaris et Senior Agency), visait à fournir des données quantitatives sur les quantités de produits d’oxydation lipidique susceptibles de se former dans les aliments enrichis en oméga-3 et au cours de leur digestion, et si ces quantités, ingérées de façon chronique, pouvait constituer un risque éventuel lié à leur absorption et métabolisme.

Des méthodes quantitatives de dosage des aldéhydes (malondialdéhyde et hydroxy-alcénals : 4-HHE et 4-HNE) ont été mises au point et appliquées à diverses matières premières lipidiques, formulations et aliments en parallèle de méthodes classiques, chimiques et physiques. Les résultats ont montré l’intérêt de ces nouvelles méthodes pour quantifier des marqueurs spécifiques présents à faibles concentrations (nM).

Puis, sur la base de matières premières lipidiques sélectionnées pour leur composition en acides gras, le DHA et l’EPA étant apportés sous forme de triacylglycérols ou de phospholipides, différentes formulations ont été réalisées. Elles ont permis de montrer un impact modéré sur la formation des marqueurs de l’oxydation de la structure chimique et de la localisation des lipides vecteurs de DHA.

(7)

Dans des conditions de digestion gastro-intestinale réalisées in vitro, l’oxydation amorcée en phase stomacale en présence de metmyoglobine, initiateur alimentaire de l’oxydation, se poursuit en phase intestinale avec formation d’aldéhydes à des concentrations fonctions de la balance pro/antioxydants et de l’insaturation des acides gras.

Sur modèle animal (souris) et dans un contexte de régime hyperlipidique, la présence de quantités modérées de ces produits d’oxydation des lipides est susceptible de provoquer du stress oxydant et de l’inflammation aux niveaux intestinal et sanguin et d’activer des défenses antioxydantes. Ces réactions sont liées à l’absorption de produits tels que le 4-HHE, spécifiquement issu de l’oxydation des oméga-3, comme cela a été démontré sur modèle cellulaire. La consommation d’EPA et DHA sous forme de triacylglycérols ou bien de phospholipides module aussi leurs effets métaboliques. Enfin, les attentes des seniors vis à vis des aliments enrichis en oméga-3 ont été étudiées et la caractérisation sensorielle des formulations et aliments enrichis a été réalisée. Celle-ci a confirmé les risques de défaut d’odeurs liées à l’utilisation des lipides vecteurs d’EPA et DHA, tandis que les tests réalisés avec des consommateurs placés en situation réelle de restauration ont montré que des aliments enrichis faiblement oxydés pouvaient demeurer acceptables.

Ces données nouvelles devraient être prises en compte pour formuler et contrôler la qualité des produits enrichis en oméga-3.

C.2 E

NJEUX ET PROBLEMATIQUE

,

ETAT DE L

’

ART

Les enjeux initiaux du projet étaient de fournir des éléments d’évaluation du risque éventuel lié à l’absorption en quantités modérées de produits d’oxydation lipidique dans les aliments enrichis en acides gras oméga-3. Ils étaient basés sur la constatation que :

- de nombreux travaux scientifiques soulignent les bénéfices santé des acides gras polyinsaturés (AGPI) oméga-3 d’origine marine (EPA et DHA). Un numéro spécial du British Journal of Nutrition a été consacré à ces aspects (Br J Nutr, 2012, vol 147, issue S2, S1-S283). Dans les recommandations de l’ANSES concernant les apports lipidiques alimentaires parues elles-aussi en cours de projet (01/03/2010), et en accord avec les recommandations de l’EFSA, il a été notamment précisé que les apports journaliers en DHA et en EPA devraient être, pour un adulte (70 kg ; 2000 kcal/jour) de 250 mg chacun. Ces apports ne sont pas couverts pour une partie importante de la population (Astorg et al, 2004).

- les populations fragilisées comme les seniors pourraient tirer un bénéfice particulier d’apports accrus en oméga-3, en particulier de DHA pour son intérêt dans la prévention des maladies cardiovasculaires (Delgado-Lista et al, 2012) et neurodégéneratives (Dangour et al, 2012). - l’enrichissement de certains aliments en oméga-3 peut permettre de contribuer aux apports

journaliers. C’est ainsi que différents produits ont été mis sur le marché ces dernières années. Leur succès dépend à la fois des qualités sensorielles des produits proposés et de l’attitude des consommateurs ciblés vis-à-vis des produits proposés.

- cet enrichissement peut aller de pair avec la formation de produits d’oxydation des lipides au cours des procédés de fabrication, de stockage, de préparation ménagère, et même au cours de la digestion. Or, il n’existait pas de méthode permettant de quantifier spécifiquement les produits d’oxydation lipidique dans les aliments, et encore moins de limites légales à leur présence.

- l’impact métabolique de l’absorption chronique et en quantités modérées des composés qui sont des marqueurs du stress oxydant quand ils sont produits in vivo, demeurait peut connu.

Dans ce contexte, le projet AGEcaninox visait à fournir des données sur les quantités de produits d’oxydation lipidique susceptibles de se former dans les aliments enrichis en oméga-3, en particulier les aliments enrichis, et au cours de leur digestion, et si ces quantités, ingérées de façon chronique via des aliments par ailleurs acceptables d’un point de vue sensoriel, pouvait constituer un risque éventuel lié à leur absorption et métabolisme.

Enfin, dans la mesure où différents travaux avaient montré que l’efficacité métabolique du DHA, mais aussi sa propension à subir les réactions d’oxydation, pouvaient différer selon qu’il était apporté sous forme de triacylglycérols ou de phospholipides, ces deux structures moléculaires ayant des propriétés physiques et technologiques (fonctionnalités) très différentes, nous avons introduit ce paramètre dans notre plan expérimental.

C.3 A

PPROCHE SCIENTIFIQUE ET TECHNIQUE

L’approche choisie pour le projet, multidisciplinaire, comportait 4 tâches correspondant à des domaines scientifiques différents:

1- Formulation et préparation des vecteurs d’oméga-3. Il s’agissait, sur la base de la composition lipidique fine des matières premières, de formuler des vecteurs (émulsions et aliments) d’acides gras oméga-3 en tenant compte de la localisation des AG longues chaines (DHA en particulier)

(8)

sur des structures triglycéridiques ou phospholipidiques et de la structuration des systèmes, (émulsions).

2- Développement de méthodes de quantification de différents marqueurs de l’oxydation dans les matrices alimentaires, quantification de ces marqueurs dans les matières premières et les formulations dans diverses conditions, y compris en conditions digestives simulées, et comparaison avec les méthodes classiques. Modélisation des effets de la présence de lipides oxydés sur la dynamique des lipides (perméabilité, fluidité et hydratation d’un modèle de bicouche de phospholipides).

3- Absorption par les cellules intestinales des produits d’oxydation des lipides (modèle cellulaire) et effets métaboliques des lipides oxydés (modèle animal : souris).

4- Caractérisation sensorielle des formulations et aliments enrichis, acceptabilité par les consommateurs et étude des attentes et comportements des seniors vis-à-vis des aliments enrichis en oméga-3.

Ces tâches se sont déroulées en étroite interdépendance au cours du projet.

C.4 R

ESULTATS OBTENUS

Tâche 1 : Des émulsions huile dans eau, vectrices d’acide gras oméga-3 longue chaine (EPA,

DHA), et conformes aux recommandations nutritionnelles ont été élaborées. Les formulations, obtenues sur la base de plans de mélanges, permettent d’apporter ces AGPI-LC par des triacylglycérols (TAG) ou des phospholipides (PL), en fonction du choix des huiles et lécithines. Pour ces dernières, un procédé de synthèse enzymatique de phospholipides et lyso-phospholipides enrichis en acide docosahexaénoïque (DHA) possèdant de bonnes qualités émulsifiantes a été mis au point. Les caractéristiques physico-chimiques des émulsions, obtenues après une phase de re-formulation afin d’assurer leur stabilité physique, ont été étudiées en termes de composition, morphologie et stabilité dans le temps. Deux émulsions submicroniques (gouttelettes de taille moyenne de 203 et 230 nm, respectivement), obtenues par homogénéisation haute pression (1500-2000 bars), de compositions en acides gras proches, et stabilisées principalement par des phospholipides ont ainsi été conçues à partir d’ingrédients en majorité de grade alimentaire (thèse

T.H. Kabri, 2013). La première, stabilisée par une lécithine de soja et du Tween-80 contient le

DHA sous forme de TAG (huile de thon). Dans la seconde, le DHA est incorporé sous forme de PL (PL-DHA) synthétisés spécifiquement dans le cadre du projet. Les deux émulsions, caractérisées par diffusion dynamique et statique de la lumière, mesure du potentiel zêta, microscopie électronique, CARS et 31_{P RMN se sont révélées stables dans nos conditions expérimentales (37°C}

sous agitation) sur une durée de 10 jours pour l’émulsion TAG-DHA et d’au moins 3 semaines pour l’émulsion PL-DHA. Pour l’émulsion stabilisée avec les PL-DHA, l’association à l’interface des phospholipides mono- et bicaténaires assure une courbure suffisante de l’interface pour former de petites gouttelettes et la charge négative globale des gouttelettes, liée à la présence de PL anionique, une stabilité remarquable du système. Pour l’émulsion TAG-DHA, la stabilisation, moins efficace à long-terme, est liée aux interactions répulsives entre Tween-80 et phosphatidylcholine à l’interface, la forte balance hydrophile-hydrophobe du Tween compensant la forme cylindrique de la lécithine, et aux répulsions stériques entre gouttelettes associées à la présence des chaines polyoxyéthylènes du Tween (Kabri et al. 2013 ; Genot et al., 2013).

Des mélanges lipidiques ont été formulés et préparés pour être introduits dans des aliments pour souris, dont les teneurs en acides gras et la forme d’apport (TAG ou PL) ont été optimisées. Deux aliments, contenant de faibles quantités de produits d’oxydation des lipides ont été également préparés pour les études in vivo (Tâche 3).

Tâche 2 : Des méthodes spécifiques de dosage du malondialdéhyde (MDA), du 4-hydroxyhexénal

(4-HHE) et du 4-hydroxynonénal (4-HNE) basées sur la dérivation des composés d’intérêts suivie de la séparation des dérivés par HPLC ou GC et détection spécifique (fluorescence ou SM en présence d’étalons trideutériés pour les hydroxy-alcénals) ont été mises au point ou adaptées aux milieux alimentaires. Elles ont été appliquées sur différentes huiles, mélanges d’huiles, émulsions et aliments, y compris au cours de la digestion réalisée in vitro, en parallèle du dosage des hydroperoxydes, des acides gras et des tocophérols. Pour trois huiles alimentaires de consommation courante et une huile marine, les méthodes développées dans le cadre du projet ont été comparées avec des méthodes normalisées (Indice de peroxyde : IP, Indice d’anisidine : IA) et ce à différents niveaux d’oxydation, afin de préciser les domaines de validité et d’utilisation des différentes méthodes. Les résultats montrent les IP sont fortement corrélés avec les méthodes développées, au contraire de l’IA. La quantification des hydroxy-alcénals permet en outre de préciser les acides gras cibles de l’oxydation.

Une approche physico-chimique de caractérisation des phénomènes d’oxydation des AGPI-LC a été également mise en place pour essayer de mettre en évidence l’impact du mode de vectorisation

(9)

des AGPI-LC (TAG ou PL) en comparaison avec les méthodes classique (IP, indices de polyènes, IA, Totox). Des cinétiques d’oxydation in situ sous conditions drastiques (température élevée et oxygène) ont été suivies par FTIR (infrarouge à transformée de Fourier) et DSC (analyse thermique différentielle) par mesure de l’OIT (oxidative induction time). Les résultats obtenus permettent de mettre en évidence la disparition des doubles liaisons éthyléniques avec l’apparition de composés nouveaux d’oxydation.

En ce qui concerne les émulsions formulées au cours de la tâche 1 les résultats de cinétiques réalisées à 37 °C en présence et en absence de metmyoglobine, en modifiant également la teneur initiale en tocophérols dans les émulsions, tendent à montrer une formation de produits d’oxydation des lipides légèrement moindre lorsque les AGPI-LC sont apportés par les phospholipides que par les triacylglycérols, même si les deux émulsions formulées au cours de cette étude sont globalement peu oxydables. En revanche, les tocophérols sont progressivement et quasi-totalement consommés, avec des vitesses dépendant des conditions du milieu, sans pertes notables d’acides gras insaturés dans la plupart des conditions. Des analyses multidimensionnelles ont permis de préciser les corrélations entre variables mesurées (consommation d’oxygène, tocophérols, acides gras, diènes conjugués, hydroperoxydes, MDA, 4-HHE, 4-HNE). (thèse T.H.

Kabri, 2013)

Lors de la digestion in vitro d’émulsions alimentaires modèles, la présence d’antioxydants (tocophérols) ou d’agents promoteurs de l’oxydation (metmyoglobine) s’est révélée critique pour le développement de réactions d’oxydation lipidique. Par ailleurs, l’évolution de la structure de ces émulsion et la vitesse de lipolyse, et donc de libération des acides gras dans le compartiment duodénal dépend des conditions gastriques. Enfin, il a été particulièrement intéressant d’observer que l’oxydation, en particulier la formation de MDA et d’hydroxyalcénals, amorcée lors de la phase stomacale, se poursuit lors de la phase intestinale (thèse H.B. Kenmogne-Domguia, 2012 ;

Kenmogne-Domguia et al 2012 a,b ; Kenmogne-Domguia et al. en révision).

Tâche 3 : In vivo chez la souris, la consommation de régimes hyperlipidiques enrichis en oméga 3

modérément oxydés induit un stress oxydant, montré par l’augmentation de concentration plasmatique en 4-HHE, et une inflammation montrée par l’augmentation d’IL-6 et de MCP-1 par rapport aux régimes non oxydés. Le stress oxydant et l’inflammation sont également augmentés dans le jéjunum. Le gavage de souris avec du 4-HHE résulte en une augmentation postprandiale de sa concentration plasmatique suggérant une absorption intestinale, et induit des marqueurs de stress au niveau de l’intestin grêle, suggérant une contribution de l’absorption intestinale du 4-HHE dans les effets métaboliques des régimes oxydés.

In vitro, l’hypothèse d’une absorption intestinale de 4-HHE est également appuyée par le passage

partiel des 4-hydroxyalcénals au travers de monocouches de cellules Caco-2, le 4-HHE étant plus absorbé que le 4-HNE. Ces marqueurs de stress oxydant induisent une plus une activation des voies de l’inflammation et des défenses anti-oxydantes dans les cellules intestinales, et la formation d’adduits et de protéines carbonylées.

Ces résultats (thèse M. Awada, 2012 ; Awada et al. 2012) peuvent contribuer à expliquer certains résultats récemment publiés chez l’Homme, notamment concernant l’augmentation de la concentration plasmatique de 4-HHE lors de la consommation de fortes doses de DHA (Calzada et al. Atherosclerosis, 2010). Les auteurs discutent ce résultat par la génération d’un stress oxydant cellulaire ; les résultats du projet AGEcaninox permettent de suspecter également la contribution d’une absorption intestinale de 4-HHE potentiellement présent dans les gélules d’huile riche en DHA.

En conditions non oxydées, les oméga-3 empêchent l’induction du stress oxydant et de l’inflammation induits par un régime hyperlipidique chez la souris et ce, qu’ils soient apportés par des TG ou par des PL. Cependant, par rapport aux TG, les PL vecteurs d’oméga 3 permettent de réduire la taille des adipocytes et de stimuler le système antioxydant (thèse M. Awada, 2012 ;

Awada et al., 2013)

Tâche 4 : Une enquête préliminaire a permis de montrer 1) que les seniors ont peu de

connaissances sur les lipides et les oméga-3, que les informations sont principalement issues de la publicité et la presse, que le médecin est le prescripteur en qui ils ont confiance en matière de choix alimentaires. Ils sont plutôt réfractaires aux produits enrichis et allégués. Ainsi, nos recommandations vont dans le sens d’intégrer les nouveaux acides gras dans des aliments, sans en faire particulièrement mention, par exemple pour la restauration collective – maisons de retraite, hôpitaux.

Les tests sensoriels réalisés ensuite ont montré que les formulations oxydées sont aisément identifiables par test olfactif (tests triangulaires) et que la forte odeur de poisson doit être masquée pour être acceptée.

(10)

Des cuisiniers ont alors exploré différentes recettes et une préparation « guacamole / thon » a été retenue pour les tests consommateurs. Enfin, lorsqu’intégrés à un plat, aucune différence d’appréciation hédonique n’a été relevée entre les mélanges lipidiques non oxydés et oxydés.

C.5 E

XPLOITATION DES RESULTATS

Les résultats obtenus au cours du projet AGEcaninox ont donné lieu à des publications scientifiques dans des revues scientifiques à comité de lecture (5 acceptées, une en cours de révision et plusieurs en cours de rédaction au 12/09/2013), et des interventions orales ou des communications affichées dans divers colloques et séminaires nationaux et internationaux. Le travail de synthèse bibliographique réalisé a donné lieu à la rédaction de deux chapitres d’ouvrage, une troisième revue étant en cours de rédaction. L’essentiel des résultats obtenus a également été présenté lors de deux séminaires nationaux à destination des industriels et organisés par l’équipe du projet, plus une présentation lors du salon IPA. D’autres actions de diffusion sont en préparation (plaquette d’information à destination des industriels ; communiqué de presse sur le potentiel d’enrichissement en oméga-3 dans des recettes adaptées à destination des professionnels de la restauration collective).

Les acquis méthodologiques (méthodes de mesure de l’oxydation, protocoles de digestion in vitro) du projet ont d’ores et déjà été mis à profit dans d’autres projets collaboratifs financés régionalement ou nationalement. Enfin, le projet a permis à l’UR BIA d’établir de nouvelles collaborations à l’échelle européenne (COST1005, projet ITN Marie Curie).

C.6 D

ISCUSSION

Les principaux objectifs initiaux ont été atteints pour chacune des tâches du projet:

- formulations (mélanges lipidiques, émulsions submicroniques et aliments) contenant des quantités similaires d’AGPI-LC vectorisés sur des molécules différentes permettant d’aborder l’étude de l’impact des structures moléculaires et supramoléculaires sur leur oxydabilité dans des matrices alimentaires, et comme aliments à destinations des études sensorielles et nutritionnelles ;

- développement de méthodes de quantification de marqueurs secondaires de l’oxydation: MDA, 4-HHE, 4-HNE et comparaison avec les méthodes classiques ; utilisation de la FTIR et de la DSC comme méthode d’étude de l’oxydation des huiles et lécithines en conditions accélérées ; - mise en place d’un dispositif de digestion in vitro permettant d’évaluer conjointement la

bioaccessibilité des nutriments lipidiques et leur oxydation et études in vitro de l’impact des structures initiales (dans l’aliment) et de l’oxydation au cours de la digestion ;

- études in vitro sur cultures cellulaires, et in vivo (modèle souris) tissus (intestins, plasmas) de l’absorption et des effets métaboliques de certains marqueurs de l’oxydation des acides gras oméga-3 ;

- étude de l’acceptabilité sensorielle de vecteurs et d’aliments enrichis en oméga-3.

Ces travaux ont avant tout permis de démontrer que l’absorption chronique conjointe de produits d’oxydation des acides gras oméga-3, même en quantités modérées, modifie le métabolisme des oméga-3 et provoque de l’inflammation et du stress oxydant intestinal et plasmatique.

Les retombées majeures concernent :

- la nécessité d’intégrer désormais la quantification de certains marqueurs spécifiques de l’oxydation pour évaluer la qualité des produits enrichis en oméga-3.

- l’intérêt d’évaluer les réelles consommations de ces composés d’oxydation que ce soit à partir des aliments enrichis ou non, ou apportés par des compléments alimentaires, et ceci dans des situations de consommation réelle. Ces données nouvelles permettraient d’évaluer les quantités effectivement produites et ingérées via les différentes sources alimentaires et d’établir des valeurs seuils.

Cependant, les perturbations métaboliques liées à la consommation chronique de lipides oxydés ont été observées sur modèle murin. Ces effets devraient être validés sur d’autres modèles, et si possible chez l’Homme par des études cliniques d’intervention nutritionnelle. Il serait maintenant en effet important de poursuivre la mise en évidence les effets de l’oxydation des oméga-3 (1) en fonction du niveau d’oxydation et du type de produits d’oxydation générés, (2) en fonction de la nature du régime alimentaire pris dans sa globalité et (3) en fonction des structures vectrices d’oméga-3. Il faut noter néanmoins à ce stade que l’utilisation de modèles animaux permet de bien contrôler les conditions d’expérimentation et les régimes et peut se révéler, comme dans le présent projet, pertinente.

Les outils mis en place que ce soit en terme de méthodes d’analyse, de procédure de fabrication d’émulsions sub-microniques stabilisées par des phospholipides ou de protocole de digestion in

(11)

supramoléculaires sur les fonctionnalités technologiques et nutritionnelles des lipides. Les émulsions sub-microniques stabilisées principalement ou uniquement par des phospholipides et conçues sur la base de l’alimentarité des ingrédients pourraient se révéler être des vecteurs d’oméga-3 utiles pour l’enrichissement d’aliments. Elles pourraient également permettre de tester,

in fine chez l’Homme, des structures lipidiques d’apport des oméga-3 optimisées en termes d’effets

bénéfiques sur l’adiposité et le métabolisme des lipides.

Ces données complémentaires permettraient d’assoir l’argumentation visant à la prise en compte par les industriels et ce tout le long des filières de la présence de certains produits spécifiques de l’oxydation des lipides. En effet, nos résultats montrent bien l’intérêt de procéder à des mesures des quantités de produits d’oxydation formés, et ce avant et après l’incorporation des lipides vecteurs d’AGPI dans les formulations. La réalisation de ces travaux nécessitera la volonté affichée et le soutien financier des agences de recherche et de sécurité sanitaire.

Du point de vue du partenaire industriel, il apparait que celui-ci a pu développer son savoir-faire en terme de synthèse enzymatique, et particulièrement en terme de synthèse enzymatique de phospholipides et lyso-phospholipides enrichis en acide docosahexaénoïque (DHA). Un produit riche en phospholipides et en DHA possédant d’intéressantes propriétés émulsifiantes et avec un potentiel commercial a ainsi été mis au point. Enfin les résultats obtenus fournissent des éléments de conseils clients sur la posologie des compléments alimentaires riches en DHA : ingestion des capsules en dehors des repas riches en viandes rouges et autres aliments pro-oxydants.

Parmi les difficultés rencontrées au cours du projet, nous avons caractérisé aussi finement que possible les structures moléculaires des huiles et lécithines utilisées pour le projet. Par exemple, les espèces moléculaires présentes dans ces matières premières ont été caractérisées par MALDI-TOF, sans leur séparation préalable, montrant l’intérêt de cette technique émergente. Cependant la stéréochimie des acides gras sur les TAG et les PL et l’identification des structures moléculaires des TAG et des PL oxydés n’ont pas pu être réalisés et en raison de difficultés d’accès à la LC-MS (disponibilité des équipements et coût). Le développement de méthodes chromatographiques (TLC-HPLC) couplées à la spectrométrie de masse permettrait d’accéder à ces informations.

La méthode qui a été développée pour doser les hydroxy-alcénals est lourde et couteuse. Il est donc difficilement envisageable de l’utiliser dans le cadre d’analyses de routine. D’autres techniques n’ont pas pu être testées dans le cadre du projet pour des raisons de temps et de priorisation des objectifs. De plus, seuls les hydroxy-alcénals libres sont quantifiés par la méthode développée, ce qui peut représenter un biais majeur dans les matrices complexes. Une meilleure estimation de l’intensité des phénomènes oxydatifs dans les aliments passerait par une évaluation (élucidation des structures et quantification) des formes adduites de ces marqueurs.

En ce qui concerne les études de simulation en dynamique moléculaire, les travaux entrepris ont été restreints à la modélisation du 4-HNE (issu de l’oxydation des AGPI n-6) et à ses interactions avec l’eau. Les objectifs initiaux concernant une évaluation des conséquences de la présence de produits d’oxydation des AGPI n-3 sur la biophysique de bicouches lipidiques n’ont ainsi pas été atteints malgré l’intérêt non démenti de ce type d’information.

Un autre verrou, uniquement partiellement levé au cours de ce projet relève de la difficulté de produire des formulations alimentaires en contrôlant parfaitement à la fois la composition (y compris les structures moléculaires et les antioxydants) et la structuration dans l’aliment. L’une des raisons en est l’indisponibilité, pour des raisons diverses, de certaines matières premières. De même, les conclusions des études portant sur le potentiel des méthodes physico-chimiques (FTIR, DSC) pour évaluer l’impact du positionnement des AGPI-LC sur les phospholipides sur l’oxydation ont été limitées en raison d’interférences liées à la présence de composés antioxydants. Nos résultats mettent cependant en exergue l’importance de maîtriser et connaitre précisément la composition (teneur en antioxydants, présence de trace de métaux pro-oxydants ou autres agents initiateurs de l’oxydation, …) des matières premières utilisées pour la fabrication d’aliments ou de compléments alimentaires. Nos travaux ont également souligné l’intérêt d’une caractérisation multi-échelle des structures à l’aide de techniques complémentaires.

Enfin, l’étude d’acceptabilité sensorielle a montré la nécessité d’intégrer les vecteurs lipidiques dans des recettes afin de masquer leur forte odeur de poisson. Dans ces conditions, aucune différence entre lipides oxydés ou non oxydés n’a été perçue par les consommateurs qui ont trouvé les plats proposés acceptables. De manière importante, ce résultat démontre que le consommateur est susceptible de consommer des produits (aliments ou autre forme d’apport) contenant de faibles quantités de produits d’oxydation lipidique.

C.7 C

ONCLUSIONS

Le projet AGEcaninox visait à fournir des éléments d’évaluation du risque éventuel lié à l’absorption en quantités modérées de produits d’oxydation lipidique dans les aliments enrichis en acides gras

(12)

oméga-3. La démarche pluridisciplinaire mise en œuvre par les partenaires du projet a permis d’obtenir de nombreux résultats parmi lesquels :

 La formulation, à l’aide de phospholipides, d’émulsions vectrices d’AGPI n-3 longues chaine stables physiquement et peu oxydables.

 Dans des formulations complexes, la structure chimique (triacylglycérols ou phospholipides) et la localisation (interface ou cœur lipidique) des AGPI n-3 longue chaine (EPA et DHA) ont peu d’impact sur la stabilité oxydative d’émulsions vectrices stabilisés par des phospholipides.  La quantification des tocophérols dans diverses matrices, que ce soit au cours de leur

conservation ou leur de leur digestion, permet de révéler les phases précoces de l’oxydation des lipides et fournit des éléments d’interprétation des cinétiques.

 La formation de composés issus de l’oxydation des lipides peut se produire à la fois dans l’aliment avant son ingestion et au cours de la digestion, et ce à des taux qui dépendent prioritairement du niveau d’insaturation global des lipides et de la balance pro/antioxydants. La consommation d’aliments riches en AGPI-LC n-3, conjointement à celle d’agents pro-oxydants comme la myoglobine entraîne une production de composés tels que le 4-hydroxy-hexénal ou le MDA en quantités susceptibles d’avoir des effets physiologiques ou métaboliques.

 La consommation chronique de lipides faiblement oxydés se traduit chez l’animal par une augmentation de marqueurs du stress oxydant, de l’inflammation et du système antioxydant et induit un stress dans l’intestin grêle. En revanche, l’accrétion des AGPI-n-3 dans les tissus ne semble pas modifiée.

 Une offre alimentaire enrichie est envisageable en restauration collective où l’odeur de poisson des lipides est acceptable par le choix d’une recette adaptée.

L’oxydation des lipides, et en particulier des oméga-3, devrait dans l’avenir être mieux quantifiée, avec le dosage en routine de marqueurs spécifiques, et prise en compte comme critère de qualité des produits, qu’elle se produise dans les chaines de production des aliments ou des compléments alimentaires ou au cours de la digestion. Et ceci pour une meilleure compréhension et maitrise des effets sur le long terme de l’alimentation sur la santé. Tous ces points mériteraient de faire l’objet d’informations spécifiques auprès des fabricants de compléments alimentaires et d’aliments enrichis en oméga-3.

C.8 R

EFERENCES

AFSSA (2010) Avis de l'agence française de sécurité sanitaire des aliments relatif à l'actualisation

des apports nutritionnels conseillés pour les acides gras,

http://www.anses.fr/Documents/NUT2006sa0359.pdf.

Astorg P., Arnault N., Czernichow S., Noisette N., Galan P., Hercberg S. (2004) Dietary intakes and food sources of n-6 and n-3 PUFA in french adult men and women. Lipids, 39, 527-535.

Br J Nutr, 2012, vol 147, issue S2; S1-S283

Calzada C., Colas R., Guillot N., Guichardant M., Laville M., Vericel E., Lagarde M. (2010) Subgram daily supplementation with docosahexaenoic acid protects low-density lipoproteins from oxidation in healthy men. Atherosclerosis 208:467-472.

Dangour, A. D., Andreeva, V. A., Sydenham, E., and Uauy, R. (2012). Omega 3 fatty acids and cognitive health in older people. British Journal of Nutrition. 107: S152-S158.

Delgado-Lista, J., Perez-Martinez, P., Lopez-Miranda, J., and Perez-Jimenez, F. (2012). Long chain omega-3 fatty acids and cardiovascular disease: a systematic review. British Journal of Nutrition. 107: S201-S213.

EFSA (2010) Scientific opinion on dietary reference values for fats, including saturated fatty acids, polyunsaturated fatty acids, monounsaturated fatty acids, trans fatty acids, and cholesterol 1.Efsa panel on dietetic products, nutrition, and allergies (NDA) 2, EFSA Journal, 8, 1461.doi:10.2903/j.efsa.2010.1461.

D L

ISTE DES LIVRABLES

Quand le projet en comporte, reproduire ici le tableau des livrables fourni au début du projet. Mentionner l’ensemble des livrables, y compris les éventuels livrables abandonnés, et ceux non prévus dans la liste initiale.

Date de

livraison N° Titre Nature

(rapport, logiciel, prototype,

données, …)

Partenaires

(13)

Delivery

date * N° A1 to E3 : initial numbering Title of deliverables Mx : milestones Nature (milestones, report, software, prototype, data, …) Partners

P1 = UR1268 BIA, Nantes P2 = CaRMen, Lyon P3 = LIBio, Nancy P4 = IPBR, Lyon P5 = Polaris, Pleuven Comments Task 0 Delivered

01/2009 1 meeting with list of decisions A1 : Report of the kick-off Report P1 Delivered

10/2009 2

A2 : Recruitment of Ph-D student P1/P3 (Tin-Hinan Kabri

– Ph-D 1)

Employement

agreement P1/P3 Difficulties to recruit Ph-D student Delivered

06/09 3 A3 : 1

st

half-annual report Report P1+ P2-5

Delivered 10/2010 4

A4 : Recruitment of Ph-D student P1/P2 (Manar Awada –

Ph-D 2) Employement agreement P2/P1 New Delivered 10/2009 5 Recruitment of Ph-D student P1 (Hernan Kenmogne - Ph-D 3) Employement

agreement P1 Grant from INRA and Région Pays de la Loire New

Delivered 03/2010 6

Annual Scientific reports

Year 1 Scientific reports P1, P2, P4 See joined files Delivered

12/2009 7 A5 : 1st annual report Report P1 + P2-5 Delivered

12/2009 8 A6 : Consortium agreement signed

Consorsium

agreement P1+ P2-5 Delivered

06/2010 9 A7 : 2

nd

half-annual report Mid-term report for

ANR P1 + P2-5

Delivered

01/2011 10 A8 : 2nd annual report Report P1+ P2-5 New

Delivered 01/2011 11

Annual Scientific reports Year 2

Scientific reports for concerned tasks or

partners P1, P2, P3, P4, P5 See joined files Delivered

08/2011 12 A9 : 3

rd

half-annual report Report P1+ P2-5

Cancelled 13 A10 : 3rd annual report Report P1+ P2-5

New delivered

05/2012 14

Annual Scientific reports

Year 3 Scientific reports P1, P2, P3, P4, P5 See joined files Cancelled 15 A11 :4th half-annual report Report P1+ P2-5

Cancelled 16 A12 : 4th annual report Report P1+ P2-5

Delivered

09/2013 17 A13 : Final report Report P1+ P2-5 New

delivered 09/2013 18

Final scientific reports Scientific reports P1, P2, P3, P4, P5 Complementary to previous

reports ; See joined files Delivered

09/2013 19 A14: Financial reports Reports P1, P2, P3, P4, P5 Directly sent to ANR Delivered

Continued  2014 20

A15:Scientific publication(s)

sent to peer reviewed journal Draft of publication P1, P2, P3, P4 See list of publications Partly Delivered 07/2012-08/2013 Continued 2013-2014

21 A16 : Scientific publication(s) accepted

Publications accepted (mail from the

editor) P1, P2, P3, P4

Task 1 : Kabri et al_2013 accepted 08/2013 Task 2 : Kenmogne-Domguia et

al_2012a

Kenmogne-Domguia et al 2012b Task 3: Awada et al 2012 Awada

et al 2013 Delivered

10/2010 22

A17 : Communication(s) in national and/or international

congress (poster or oral)

Oral communications or posters

P1, P2,P3,P4 See list of communications and joined files Delivered

10/2011 23

congress

10/2012 Continued 24

congress

04/2013 25 A20 : Ph-D 1 defends her thesis Thesis report P1/P3

Delayed (maternity’s leave) pH-D defended 12/04/2013

These TH Kabri.pdf Delivered

12/2012 26 A21 : Ph-D 2 defends her thesis Thesis report P2

Defence date: 11/12/2012 Thèse Manar Awada-VF.pdf New

Delivered

12/2012 27 Ph-D 3 defends his thesis Thesis report P1

Defence date: 18/12/2012 These Hernan Kenmogne.pdf ;

mis en ligne : http://prodinra.inra.fr/?locale=fr#! ConsultNotice:196469 Modified In progress 28

A22 : First draft of the

Layman/technical booklet Draft P1,P2,P3,P4,P5

Results probably not adapted to direct layman communication Delivered 29 A23 : Program and date of Schedule for P1,P2,P3,P4,P5 P1 : journée ANR-ALIA BIA mai

(14)

Date de

(rapport, logiciel, prototype, données, …) Partenaires (responsable) Commentaires Delivery

P1 = UR1268 BIA, Nantes P2 = CaRMen, Lyon

P3 = LIBio, Nancy P4 = IPBR, Lyon P5 = Polaris, Pleuven

Comments

05/2013 regional symposium/a planned dissemination 2013 Delivered

09/2013 30

A24 : List of accepted, submitted and to in preparation

scientific publications

List P1 & other partners Thereof in this report Task1. Formulation of omega-3 PUFA carriers emulsions and enriched foods

M. Linder, LiBio, P3, responsible

Delayed Delivered

08/2010 31

B1/M1: Blends of oils rich in PUFA Milestone Lipid material available and characterized Data : composition + formulation P3 + P5  P1 + P5

Main materials (oils and lecithins) and their producers

identified by P1 Natural PL-DHA sources not

available or not usable for the project (conflict of interest)  synthetized by

P5. New

Delivered

12/2009 32 PL-DHA synthesis Synthesis optimized

P5 (synthesis)

+ P1 (analysis)

Introduced to overcome the problem of availability of sources New Delivered 09 & 12/2010 33 PL-DHA delivered PL-DHA : needed amounts synthesized and delivered to other partners

P5 2,3 produced and sent to P1 and kg crude PL-DHA P3

New Achieved

08/2010 35

Composition of lipid

sources Data P1, P3 Tables – see scientific reports P1 and THK’s thesis report Partly delivered 12/2010 Final deliv. 05/2011 36 B2/M2 : Emulsions with different location of PUFA  sub-task 1.3, 2.2, 2.3,

4.2

Milestone Procedure for

emulsion preparation P3  P1

Emulsions (P3) unstable with food-grade water Reformulated by P1 (Bontemps’s Master report) Modified

Delivered 2012 37

B3/M3: Formulation of foods enriched with the omega-3 carriers for sensorial analysis and

analysis of oxidation  sub-tasks 2.4, 4.2 Milestone Method Products prepared P3 P3 + P1

Modified to take into account the difficulties encountered in

the formulation step : sensory trial were finally made on lipid blends (P3) ;

lipid blends for oxidation measurements made by P1 Delivered

01/2011 bis 38 B4/M4 & B5: mice’s fed

Milestone Products (enriched mice’s fed) prepared

and delivered for task 3

P3 –> P1+P2

Lipid blends for mice’s fed (6 different diets, among which 2 oxidized lipids) prepared by

P1 ; mice fed made by society SAFE Modified

B6 & B7 : human food Preparation and supply of the omega-3 enriched foods at different oxidation

levels for sensory experiments and analysis

of oxidation

Milestone Products (enriched

human foods) prepared and delivered for Task 4

P3  P3 + P4

Modified to take into account the difficulties encountered

and results of sociologic study (Task 4.1) Human food prepared by P4 with lipid blends prepared by P3

Task 2: Oxidation : methods and kinetics A. Meynier, BIA, P1 responsible

Delivered 07/2009

to

06/2011 39

C1 : Protocols describing the methods adapted from

in vivo studies to detect and quantify markers of lipid oxidation in lipid

sources

Data + report + first

draft of methods P1 + P2

Methods to measure MDA (P1) / 4-HHE & 4-HNE (P1 +

P2) set up. Oxidized TAG successfully separated from native ones,

but LC-MS not available for identification (P1). Brestaz’s report 2011 Delivered 06/2010 to 12/2012 40 C2/M5 : Protocols to quantify the markers of

lipid oxidation in lipid sources

Milestone Data on initial level of oxidation in lipid sources, blends

+ report

P1 See scientific reports P1 Delivered

12/2011 04/2013 41

C3 : Initial level of oxidation in the omega-3 carriers (new and classical

methods)

Data on initial level of oxidation in lipid sources, blends and

carriers

P1  P1 + P5

Comparison of new and classical methods to evaluate

oxidation in oxidizing oils (P1’s report) THK’s thesis Cancelled 42 C4 : Oxidation of omega-3 _{carriers during processing} Data + report P1 + P3

The carriers were not used to add in foods and thus not submitted to real conditions

food processing Delivered 43 C5 : Time course of Data P1 See THK’s thesis

(15)

Date de

P1 = UR1268 BIA, Nantes P2 = CaRMen, Lyon P3 = LIBio, Nancy P4 = IPBR, Lyon P5 = Polaris, Pleuven Comments 04/2013 oxidation of omega-3 carriers in controlled conditions (new analytical

methods) New Delivered 09/2013 44 C4b : Oxidation of lipid material with physicochemical analysis (FTIR, DSC)

Data & report P3

FTIR, DSC and conventional method study of oxidation of lipid materials in accelerated

conditions P3’s report & Metzer’s report Delivered

04/2013 46

C6 : Oxidabilities of omega-3 FA as related to

their environment (data analysed)

Report P1 See THK’s thesis Delivered 07/2011 06 2012 47 C7/M6 : Omega-3 PUFA carriers exhibiting controlled extent of oxidation  tasks 3 & 4

Milestone Emulsions of different oxidation

levels + Data

P1/P3 _{blends with different levels of}Lipid material and lipid

oxidation delivered for Tasks 3 and 4

Delivered 12/2011 48

C8: Conditions to simulate the gastrointestinal

environment Report + data

P1 Kenmogne-Domguia’s thesis _{+ Kenmgne et al 2012a}

Delivered 07/2012 49 C9 : Physical stability of omega-3 carriers in simulated gastrointestinal conditions

Data + report P1 _{Kenmgne et al 2012a}Kenmogne’s thesis + Delivered

06 to 12/ 2012 50

C10 : fate/formation of lipid oxidation products

under simulated gastrointestinal conditions

Data + report P1

Report of Boulanger, Moisan and Kenmogne’s thesis

Poster Meynier et al, Kenmogne et al, 2012b Cancelled ₅₁

C11/M7 : Micelles containing the suitable molecular form of PUFA-oxidized for cellular studies

 sub-task 3.1 Milestone Conditions for micelles preparation: report + data P1

Absorption of HHE and 4-HNE by caco-2 cells studied

by direct incubation of the cells in presence of 4-HHE and 4-HNE solutions (Awada et al, 2012 ; Awada’s thesis) Delivered

09/2011 52

C12 : Nature and quantities of lipid oxidation

products finally present in the diet of mice.

Data, report P1 See report: Résultats lipides croquettes et oxydation_Oct 2011.doc Partly to non- delivered 09/2013 53 C13 : Physico-chemical properties of oxidation products of LC-PUFA in model membranes (dynamic

molecular simulation)

Report + dynamic

simulation data P3

Molecular modelisation of 4-hydroxynonenal (oxidation product of omega-6 fatty

acids) in water. See Final report of LIBio. Delivered

12/2012 54 C14 : Comparison of the different methods Data + report P1 + P5

See specific report: bilan comp methodes 2011

12 05.doc Publication in preparation

To be continued Task 3. Cellular and animal models

M.C. Michalski, RMND, P2, responsible

Delivered 55

D1 : Oxidative stress and secretion of oxidation products (POX) by Caco-2

cells when fed saturated and omega-3 fatty acids

Data P2 See Awada thesis + Awada et al. J Lipid Res 2012

Delivered 56

D2 : Kinetics of absorption of various POX by Caco-2

cells depending on lipid composition in the apical compartment & impact of POX on cell metabolism

Data : absorption dose-response of POX by Caco-2 cells + impact on cell metabolism (activat. of NFkB signalling pathway)

P2 See Awada thesis + Awada et al. J Lipid Res 2012

Delivered ₅₇

D3 : Impact of omega-3 carrier and oxidation on weight gain, glucose & insulin tolerance, & tissue

weight in mice after the 12-week diet

Data obtained after a 8-week diet (diet duration revised due to feasibility reasons and to fit with recent

literature)

P2

See Awada thesis + Awada et al. J Lipid Res 2012, Awada et al. Nutr Metab

2013 Delivered 58

D4 : Impact of omega-3 carrier and oxidation on lipid metabolism, oxidative

stress & inflammation in mice after the 12-wk diet

Data : impact of omega-3 carrier and oxidation on: markers of oxidative stress in plasma and

P2 See Awada thesis + Awada et al. J Lipid Res 2012, Awada et al. Nutr Metab 2013

(16)

Date de

P1 = UR1268 BIA, Nantes P2 = CaRMen, Lyon

P3 = LIBio, Nancy P4 = IPBR, Lyon P5 = Polaris, Pleuven

Comments

plasma TAG & NEFA Task 4 . Sensory analysis and senior perception

A. Giboreau, IPBR, P4, responsible Delivered

12/2009 59

E1 : Perception and attitude of seniors towards

omega-3 enriched foods Data + Report P4

Vercollier and Deviller et al reports + Task 4 final report Modified

E2 : Sensory acceptability and description of the odour of the omega-3 carriers and of the flavour

of the enriched food

Data + report P3 Task 4 final report Modified

E3 : Acceptability test by

senior consumers Data + report P4 Task 4 final report

Expérimentations additionnelles non prévues initialement dans le projet conduites par les partenaires P1 et P2.

1. L’accrétion des AGPI-LC dans le foie, et deux tissus adipeux a été évaluée sur les 6 groupes de souris de l’expérimentation animale conduite par P2, les mesures et les traitements ayant été réalisés par P2. Les résultats montrent que la consommation pendant 8 semaines d’aliments contenant de faibles quantités de produits d’oxydation des lipides ne modifie pas significativement les compositions en acides gras des tissus. De même, les quantités de 4-HHE et de 4-HNE dans les tissus après 8 semaines restent faibles (max 2 nmoles g-1_{tissu) y compris}

dans le cas des animaux ayant consommé des lipides faiblement oxydés. Ces valeurs, pour le 4-HNE en tous cas, sont considérées comme « physiologiquement » normales (Esterbauer et al, 1991).

2. Des souris ont été gavées avec des émulsions formulées dans le cadre de la tâche 2 et dont le devenir au cours de la digestion in vitro étudié au cours de la thèse de Kenmogne-Domguia. Le gavage a été réalisé avec et sans initiateur de l’oxydation des lipides et l’oxydation évaluée dans les contenus gastriques, duodénaux et dans le plasma. La variabilité des résultats obtenus sur les prélèvements gastriques et intestinaux ne nous a pas permis de dégager d’effet probant de la présence de metmyoglobine, par contre sur les prélèvements plasmatiques, des augmentations des concentrations circulantes en 4-HHE et en 4-HNE ont été observées dans le cas des animaux gavés avec l’émulsion et la metmyoglobine.

E I

MPACT DU PROJET

Ce rapport rassemble des éléments nécessaires au bilan du projet et plus globalement permettant d’apprécier l’impact du programme à différents niveaux.

E.1 I

NDICATEURS D

’

IMPACT

Nombre de publications et de communications (à détailler en E.2)

Comptabiliser séparément les actions monopartenaires, impliquant un seul partenaire, et les actions multipartenaires résultant d’un travail en commun.

Attention : éviter une inflation artificielle des publications, mentionner uniquement celles qui résultent directement du projet (postérieures à son démarrage, et qui citent le soutien de l’ANR et la référence du projet).

Publications

multipartenaires monopartenairesPublications

International Revues à comité de _lecture 3 3

(17)

d’ouvrage Communications (conférence) 5 + 1 poster 2 – 3 p France Revues à comité de lecture Ouvrages ou chapitres d’ouvrage 1 Communications (conférence) 3 1 Actions de diffusion Articles vulgarisation 4 Conférences vulgarisation 1 12

Autres Communiqué de presse

et plaquette pour

industriels en préparation

1 (participation science en fête)

Autres valorisations scientifiques (à détailler en E.3)

Ce tableau dénombre et liste les brevets nationaux et internationaux, licences, et autres éléments de propriété intellectuelle consécutifs au projet, du savoir faire, des retombées diverses en précisant les partenariats éventuels. Voir en particulier celles annoncées dans l’annexe technique).

Nombre, années et commentaires (valorisations avérées ou probables) Brevets internationaux

obtenus

Brevet internationaux en cours d’obtention

Brevets nationaux obtenus Brevet nationaux en cours d’obtention Licences d’exploitation (obtention / cession) Créations d’entreprises ou essaimage Nouveaux projets collaboratifs 6 (2010  2014) Colloques scientifiques 2 (2012, 2013) Autres (préciser)

E.2 L

ISTE DES PUBLICATIONS ET COMMUNICATIONS

Répertorier les publications résultant des travaux effectués dans le cadre du projet. On suivra les catégories du premier tableau de la section Erreur ! Source du renvoi introuvable. en suivant les normes éditoriales habituelles. En ce qui oncerne les conférences, on spécifiera les conférences invitées. N’oubliez pas de joindre les copies des publications et communications au compte-rendu

Publications dans des revues internationales à comité de lecture Parues

Awada M., Meynier A., Soulage C. O., Viau M., Ribourg L., Hadji L., Debard C., Benoit B., Géloën A., Guichardant M., Lagarde M., Genot C., Michalski M. C. (2013). High-fat diet enriched with n-3 LC-PUFA affects differently adiposity and inflammation when carried by phospholipides or triacylglycerols in mice. Nutrition & Metabolism, 10. DOI : 10.1186/1743-7075-10-23

Awada M., Soulage C. O., Meynier A., Debard C., Plaisancie P., Benoit B., Picard G., Loizon E., Chauvin M. A., Estienne M., Peretti N., Guichardant M., Lagarde M., Genot C., Michalski M. C. (2012). Dietary oxidized n-3 PUFA induce oxidative stress and inflammation: Role of intestinal absorption of 4-HHE and reactivity in intestinal cells. Journal of Lipid Research, 53, 2069-2080.