Universite de Sherbrooke
Elucidation d'un mecanisme d'acquisition du cuivre par 1'amine oxydase Cu-dependante Caol.
Par
Chardeen PETER Departement de biochimie
Memoire presente a la Faculte de medecine En vue de l'obtention du grade de Maitre es Sciences (M.Sc.) en Biochimie
1*1
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I+S
TABLE DES MATIERES
TABLE DES MATIERES II
LISTE DES FIGURES , V
LISTE DES ABREVIATIONS ...VI
RESUME DU MEMOIRE . VII
INTRODUCTION .. 1
1. Le cuivre, un element essentiel mais toxique pour la cellule 1
1.1 Importance biologique du cuivre 1
1.2 Maladies associees a un desequilibre du cuivre cellulaire ... 2 2. Acquisition et distribution du cuivre chez la levure Saccharomyces cerevisiae 4
2.1 Acquisition du cuivre ;.. 4
2.1.1 Le transport de haute affinite ..-..' 4
2.1.2 Le transport de faible affinite 9
2.1.3 Le transport vacuolaire 11
2.2 Regulation de l'apport en cuivre , 11
2.3 Distribution du cuivre intracellulaire 13
2.3.1 La chaperonne Atxl 14
2.3.2 Ccsl, une chaperonne de cuivre pour SGD1 16
2.3.3 Coxl7, une chaperonne mitochondriale 18
3. Acquisition et distribution du cuivre chez Schizosaccharomycespombe .19
3.1 Acquisition du cuivre 19
3.1.1 Le systeme de haute affinite... ! 19
3.1.2 Le systeme vacuolaire ; 20
4. Les amines oxydases dependantes du cuivre (CAOs) 25
4.1 Caracteristiques et fonctions biologiques des CAOs.. 25
4.2 Structure et motifs conserves des CAOs 29
4.2.1 Structure des CAOs ,.. ....29
4.2.2 Motifs conserves dans la sequence primaire 30
4.3 Le cofacteur organique : 2,4,5-trihydroxyphenylalanine quinone (TPQ) et la reaction
enzymatique 32
4.3.1 La biogenese du 2,4,5-trihydroxyphenylalanine quinone (TPQ) 32
4.3.2 La deamination oxidative '... 33
5. Objectifs de 1'etude .,..-...,...* :.. 36
RFSULTATS 37
MANUSCRIT: Copper distributed by Atxl is available to the copper amine oxidase 1 in
Schizosaccharomyces pombe 37
Resume .37
Abstract ,....: 40
Introduction .41
Materials and methods 44
Results 50 Discussion 59 Acknowledgements ,....' 65 References , 65 Figure legends 70 Figures 76 III
DISCUSSION . 86
1. Etude structure fonction de l'interaction Atxl-Caol.. 86 1.1 Identification des residus essentiels a l'interaction entre Atxl et
Caol.. 86
1.2 Impact des mutations sur I'activite de Caol chez S. pombe. 92
2. Caracterisation de l'interaction Atxl-Caol dans S. pombe 93
3. Identification de(s) l'autre(s) soiirce(s) de cuivre pour activer Caol 95 )
4. Etude de Cao2, identification des causes de son manque d'activite... 99
5. L'expression des genes caol* et cao2+ augmente-elle avec l'ajout du substrat? 103
6. Pottrquoi l'expression des genes caol+ et cao2+ est-elle activee en presence de
H202?.... .... .104
7. La chaperonne Atoxl est-elle impliquee dans l'approvisionnement en cuivre de la CAO
murine AOC3? ,. 108 CONCLUSION :... 110 REFERENCES ...Ill REMERCIEMENTS ...134 i . . ' ' )
LISTE PES FIGURES
Figure 1 . Modele de la structure des transporteurs de Gu de haute affinite, les Ctrs 7
Figure 2. Mecanisme d'action du facteur de transcription Macl pour le controle de l'expression
des genes CTR1/3 etFRE'l 13
Figure 3. Illustration du transport et de la distribution du Cu chez S. cerevisiae : 14
Figure 4. Illustration du mecanisme de transfert du Cu entre la chaperonne Atxl et le transporteur
Ccc2 ...' 16
Figure 5. Mecanisme d'action et de translocation du facteur de transcription Cufl pour la
regulation des genes ctr4+, ctr5+, ctr6+ selon le statut en Gu chez S. pombe 23
Figure 6. Representation schematique des residus importants conserves chez les CAOs... 32
' • • ' • ' :)
Figure 7. Modele actuel propose pour la biogenese du TPQ 33
Figure 8. Schema du cycle catalytique des amines oxydases Cu-dependantes (CAOs)... 34 Figure 9. Alignement de sequence entres chaperonnes Atxl de S. cerevisiae et S. pombe 87
Figure 10. Alignement de sequence entre les CAOs de S. pombe (Caol et Cao2) et la CAO de la
levure H. polymorpha 91
Figure 11. Schema de la methode de purification TAP avec la proteine Cao 1 -TAP 96
LISTR PES ABREVIATIONS AA : acide amine
BCS: bathocuproine disulfonic acid
CAO : amine oxydase cuivre dependante - (Copper amine oxydase) Ceo : cytochrome c oxydase
Ctr : copper transporter Cu : cuivre
CuRE : copper response element CuSE: copper signaling element Cys: cysteine
Fe: fer
GFP: green fluorescent protein GST: glutathione-S-transferase His: histidine
HRP: Horseradish peroxidase
IM: membrane interne de la mitochondrie
IMS : espace intermembranaire de la mitochondrie Met: methionine
MT : metallothioneine
MRE : metal response element uM : micromolaire
NES : signal d'exportation nucleaire NLS : signal de localisation nucleaire nm: nanometre
OM : membrane externe de la mitochondrie
ORF : open reading frame (cadre de lecture ouvert) ROS : especes reactifs derives de l'oxygene
Ser : serine
TM : domaine transmembranaire
Resume du memoire :
Les travaux presentes dans ce memoire visent a elucider le mecanisme d'acquisition du cuivre par les amines oxydase cuivre-dependantes (CAOs) chez la levure a fission
Schizosaccharomyces pombe. Les CAOs ont besoin de cuivre pour effectuer leur reaction
enzymatique. Ces proteines catalysent la deamination oxydative des amines primaires produisant, alors, 1'aldehyde correspondant, du peroxyde d'hydrogene (H2O2) et de l'ammonium. Selon les etudes anterieures, les CAOs seraient impliquees dans le catabolisme et l'utilisation des amines endogenes et exogenes. Le sequencage du genome de la levure 5". pombe a permis de mettre en evidence deux genes, caol+ et cao2+, qui
coderaient pour des CAOs. Afin de verifier la fonction de ces proteines, nous avons d'abord utilise une approche genetique combinee a des essais biochimiques. Differentes souches de levure possedant une inactivation dans l'un ou l'autre des genes, ou les deux, ont ete utilisees et testees pour leur capacite a utiliser une amine primaire (l'ethylamine) comme substrat afin de produire du H2O2. Les resultats montrent que seul le gene caol+
est capable de produire une amine oxydase active, et ce, malgre la detection de l'expression des deux genes caol+ et cao2+ chez une cellule sauvage. Des experiences de
mutagenese dirigee ont permis d'identifier trois residus histidines dans la portion C-terminale de Caol qui sont necessaires' a son activite enzymatique. La microscopie a fluorescence a permis de localiser Caol-GFP dans le cytosol des cellules.
Nous avons determine qu'en presence du chelateur de cuivre, le 2,4,5-trihydroxyphenylalanine quinone (TTM), l'inactivation des transporteurs transmembranaires du cuivre Ctr4 et Ctr5 ou du facteur de transcription Cufl entraine la perte totale de l'activite CAO. Afin de determiner quelle proteine intracellulaire etait
responsable de fournir du cuivre a Caol, nous avons inactive des genes correspondant a differentes proteines de transport du Cu a l'interieur des cellules. Les souches utilisees etaient atxlA, ccc2A, pecs A et cpxllA. Seule la deletion du gene codant pour la chaperonne Atxl entraine une diminution significative de l'activite de Caol, toutefois son activite est recuperee par un ajout excedentaire de cuivre dans le milieu de culture. Des essais de double-hybride ont demontre qu'Atxl peut interagir avec Caol lorsque les deux proteines sont co-exprimees dans la levure. De plus, l'association des deux molecules augmente en presence de faibles concentrations en cuivre. L'interaction Atxl/Caol observee est comparable a celle entre Atxl et le domaine N-terminal de Ccc2 qui avait ete prealablement decouverte. Ces resultats constituent la premiere evidence qu'Atxl peut servir de transporteur de cuivre pour une proteine autre que Ccc2, soit egalement pour Caol.
INTRODUCTION
1. Le cuivre, un element essentiel, mais toxique pour la cellule. 1.1 Importance biologique du cuivre
• (
Le Cu (Cu) est l'un des rares mineraux qui existent encore a l'etat natif dans la croute terrestre. Ce metal de transition possede des proprietes chimiques remarquables. En effet, la capacite du Cu a exister sous deux etats, sa forme oxydee Cu (II) et sa forme reduite Cu (I), a ete mise a profit chez les organismes vivants pour la passation des electrons dans plusieurs processus cellulaires. En consequence, le Cu constitue un cofacteur catalytique essentiel pour plusieurs enzymes cellulaires impliquees dans divers sentiers metaboliques (114, 123). Parrrii ces enzymes, on retrouve la cytochrome c oxydase (Ceo) dans la respiration, la ceruloplasmine et l'hephaestine dans le transport du fer (Fe), la peptitylglycine mono-oxygenase dans production d'hormones peptidiques, la tyrosinase dans la pigmentation, les facteurs V et VIII dans la coagulation sanguine et la Cu/Zn superoxyde dismutase (Cu/Zn SOD) dans la protection contre le stress oxydatif. Cependant, malgre son importance capitale, le Cu s'avere un element potentiellement toxique a la fois pour les procaryotes et les eucaryotes lorsque ses concentrations sont trop elevees. En effet, l'aptitude du Cu a donner ou a recevoir des electrons lui permet de catalyser la reaction de Fenton selon 1'equation suivante :
H202 + Cu1+ -> OH:+ OH' + Cu2+
Parmi les produits de cette reaction, appeles especes reactifs derives de l'oxygene (ROS), il y a le radical hydroxyle (OH*) qui peut engendrer des dommages al'ADN et
l'ARN, ainsi qu'aux lipides membranaires et aux proteines cellulaires (55, 144, 145). De plus, l'exces de Cu peut entrainer le deplacement d'autres cofacteurs ioniques comme le zinc (Zn) et inhiber l'activite de certaines metalloproteines. Par exemple, des essais in vitro ont demontre que le Cu peut deplacer le Zn au niveau du motif en doigts de zinc du recepteur a estrogene inhibant alors la liaison de celui-ci a sa sequence cible sur l'ADN (119). II est done important pour les etres vivants de controler l'acquisition, la distribution, la sequestration, ainsi que l'exportation du Cu au niveau cellulaire. Grace a ces systemes de regulation, on ne retrouve virtuellement pas de Cu libre dans les cellules.
Au cours des dernieres annees, la decouverte de transporters de' Cu et
/ - . . . •
1'identification de diverses chaperonnes de Cu ( molecules qui lient et acheminent le Cu vers les proteines intracellulaires), ont permis une meilleure comprehension de l'homeostasie de cet oligo-element. Dans ee texte, nous verrons les principaux mecanismes de regulation qui ont ete decouverts chez deux organismes modeles, la levure a bourgeon Saccharomyces cerevisiae et la levure a fission
Schizosaccharomyces pombe. II est important de souligner que les travaux effectues
chez les levures ont permis d'identifier des proteines homologues a la plupart des cuproproteines decrites dans les prochaines sections chez les mammiferes, en particulier chez l'homme.
1.2 Maladies associees a un desequilibre du cuivre cellulaire. ' Comme il a ete ecrit precedemment, les organismes vivants ont tous besoin d'une excellente regulation de l'acquisition et de la distribution du Cu afin d'eviter les effets
nefastes qui sont les consequences d'un exces de ce metal. En effet, il existe des maladies humaines qui resultent d'un desequilibre de l'homeostasie du Cu. Parmi ces desordres, on peut citer la maladie de Menkes et la maladie de Wilson (7, 57). La maladie de Wilson est une tare autosomale et recessive entrainant une accumulation de Cu dans le foie et le cerveau des personnes atteintes. Les patients atteints de cette maladie ont une esperance de vie variant de 6 a 40 ans. La maladie de Menkes est aussi une maladie recessive dont les symptomes sont beaucoup plus severes que ceux de la maladie de Wilson. Les patients atteints de la maladie de Menkes meurent generalement avant l'age de 20 ans. Ces individus sont incapablesd'absorber le Cu du systerhe intestinal afin de l'acheminer vers le sang pour sa distribution aux differents tissus et organes de l'organisme. En consequence, plusieurs enzymes cellulaires importantes perdent leur activite. Les genes responsables de ces deux tares ont ete identifies, il s'agit des genes ATP7A (proteine de Menkes) (26, 105) et ATP7B (proteine de Wilson) (22, 153). Les deux proteines issues de ces genes appartiennent a la famille des ATP-ases de type P; elles sont transmembranaires (8 TM) et possedent six motifs (MXCXXC) de liaison au Cu permettant alors la captation et le transport de ce dernier.
Un desequilibre en Cu au niveau des cellules du cerveau pourrait etre implique dans le developpement de tares neurodegeneratives comme 1'Alzheimer, le Parkinson et la sclerose amyotrophique laterale (ALS)(8, 23). II existe aussi des evidences qui suggerent que le Cu pourrait etre implique dans des encephalopathies spongiformes etant donne qu'il se lie a la proteine PRION (19). De plus, un desordre de l'homeostasie du Cu pourrait accelerer la progression du cancer. En effet, des etudes
realisees par Erler et ses collaborateurs (42, 43) ont permis de constater que la lysyl oxydase (une cuproenzyme) serait impliquee dans la formation de metastases dans diverses lignees tumorales.
2. Acquisition et distribution du cuivre chez la levure Saccharomyces cerevisiae. 2.1 Acquisition du cuivre
2.1.1 Le transport de haute affinite
L'utilisation des levures comme o'rganismes modeles a permis 1'identification des composantes cellulaires jouant un role cle dans l'homeostasie du Cu. Parmi les levures, Saccharomyces cerevisiae a ete d'une grande aide pour l'elucidation des mecanismes de transport et de distribution intracellulaire du Cu a l'echelle moleculaire. S. cerevisiae presente plusieurs avantages : son genome est entierement sequence, elle est facile a cultiver, elle fait preuve d'une maniabilite genetique hors du commun, et enfin, les outils et les techniques moleculaires sont tres developpes chez cet organisme modele.
Dans l'environnement, la majorite du Cu disponible est sous la forme oxydee Cu2+. De nombreux travaux proposent que le Cu du milieu extracellulaire doit etre
reduit en Cu1+ avant de pouvoir traverser la membrane plasmique. Ce sont les
proteines situees a la surface des cellules, appelees les Fe(III)/Cu(II) reductases, qui sont chargees d'accomplir cette tache. Bien que sept genes codant pour ces reductases aient ete identifies chez S. cerevisiae, (FRE1 a FRE7), les resultats montrent que ce sont en fait les proteines Frel et Fre2 qui contribuent majoritairement a la reduction du Cu (II) a la surface ceilulaire (50, 59, 114). Une fois reduit, le Cu1+ traverse la
membrane plasmique par les transporteurs membranaires codes par les genes CTR1 et CTR3 (36, 73). Les produits de ces deux genes appartiennent a la famille des transporteurs de haute affinite du Cu, les Ctrs (Cu transporter). Les membres de cette
famille sont tous specifiques pour le Cu. On parle de transport de haute affinite parce que la bonstante de Michaelis (Km) de ces proteines pour l'ion est tres faible variant entre 1 uM et 5 uM (123). L'alignement des sequences primaries de tous les Ctrs
connus montre que ces proteines possedent des domaines tres conserves, structurellement et fonctionnellement, de la levure a l'humain en passant par les plantes (Fig. 1A). Les transporteurs Ctrs contiennent tous trois domaines
transmembranaires. Leur region N-terminale est riche en residus methionines que Ton retrouve au niveau des sequences de type MxxM ou MxM appelees "Mets motifs". Le nombre de ces motifs varie selon les especes. Des experiences biochimiques suggerent que l'extremite N-terminale de yCtrl serait extracellulaire, alors que son extremite C-terminale serait cytoplasmique (Fig. IB) (122). Les transporteurs de Cu a haute affinite ont la particularite de s'organiser en trimeres au niveau de la membrane.
Les residus methionines sont tres importants pour le transport du Cu. Des mutations au niveau du Mets motifs diminuent significativement l'efficacite du transport par yCtrl lorsque ces residus sont substitues par des alanines (122). Ceci suggere que la region N-terminale servirait a capturer le Cu du milieu extracellulaire et a le rapprocher du canal ionique forme par les trois monomeres. On observe egalement un motif MxxxM tres conserve dans le 2ieme TM. Celui-ci servirait a coordonner l'ion de Cu pendant son passage a travers la membrane (122, 123). Les Ctrs possedent un troisieme motif tres conserve appele GG4 au niveau du TM3. Ce
dans le transport de haute affinite du Cu (35, 36). Parmi ces phenotypes, on observe : une faible croissance sur un milieu pauvre en Cu, une deficience respiratoire (annihilation de 1'incorporation du Cu dans la Ceo), une sensibilite au stress oxydatif (defaut d'incorporation du Cu a la Cu/Zn SOD) et une perte du transport de haute affinite du Fe due a Fincapacite de fournir du Cu a Fet3, une ferroxydase Cu-dependante necessaire pour Facquisition du fer. Ctrl est une proteine de 406 acides amines qui est O-glycosylee- du cote N-terminal. La glycosylation pourrait etre importante pour la fonction de la proteine (35). Ctrl possede 3 TM, 8 Mets motifs et 2 motifs HCH (Figure 1). L'expression du gene CTR1 est regulee au niveau transcriptionnel et son produit est aussi regule par un mecanisme post-traductionnel selon le statut en Cu intracellulaire (Section 2.2).
La proteine Ctr3 a ete identified comme une composante dont Faction supprime les phenotypes causes par l'inactivation de Ctrl (73). Elle est constitute de 241 acides amines. Elle ne possede pas de Mets motif et son domaine C-terminal est different de celui de Ctrl, sauf pour la presence des trois domaines transmembranaires. La transcription du gene CTR3 est, elle aussi, regulee par le statut en Cu (Section 2.2), mais Ctr3 ne subit aucune modification post-traductionnelle qui soit Cu-dependante. Ctr3 est inactive dans la purpart des souches de levure utilisees en laboratoire a cause de Finsertion d'un transposon dans la region regulatrice du gene, empechant l'expression de ce dernier (73).
Ctrl et Ctr3 forment des homotrimeres a la surface cellulaire. Elles ont des fonctions independantes et redondantes. L'absence de residus methionines en N-terminal de Ctr3 suggere que les Mets motifs ne sont pas essentiels pour le transport
du Cu a l'interieur de la cellule; le transport a travers la membrane dependrait surtout des residus methionines retrouves a l'interieur des TMS, qui eux, seraient essentiels.
Ctrl et Ctr3 sont interchangeables et peuvent compenser l'une pour l'autre dans le transport du Cu. Cependant, les souches doubles mutantes Ctrl A ctr3A presentent des phenotypes associes a une deficience pour le transport du Cu (voir ci-haut). L'utilisation des doubles mutants a permis 1'identification des transporteurs de Cu de haute affinite chez l'homme (160), la plante (70), la souris (91) et le lezard (129). Le transport execute par les Ctrs n'est pas un processus ATP-dependant, car les proteines
ne possedent pas de domaine ATP-ase. II existe des evidences que l'acquisition du Cu par yCtrlet hCtrl est'couplee a une forte augmentation du potassium (K+); cela
suggere un systeme de co-transport Cu+/K+ (116).
2.1.2 Le transport de faible affinite
L'acquisition du Cu par les transporteurs de haute affinite constitue un mecanisme essentiel a tous les organismes vivants. Un mauvais fonctionnement de ce systeme peut avoir des consequences desastreuses pour les organismes. En effet, chez la levure Saccharomyces cerevisiae, les cellules Ctrl A ctr3A sont anormales. Cependant, les etudes ont demontre que les phenotypes pouvaient etre supprimes par un ajout excedentaire de Cu ( > 30uM) dans le milieu de culture (36, 73, 123). Ces observations ont permis de realiser qu'il existait fort probablement des systemes de faible affinite pour l'acquisition du Cu. Des proteines ont ete associees au transport de faible affinite incluant Fet4 et Smfl/2 (section 2.1.3). Leur affinite pour l'ion de Cu demande une concentration de l'ion variant entre 30 et 40 uM.
Fet4 a d'abord ete identifie comme un transporteur de faible affmite pour l'ion de Fe, mais le transport du Fe pouvait etre inhibe par d'autres metaux comme le cobalt, le cadmium et le nickel (38). Ces resultats suggeraient que Fet4 n'etait pas uniquement specifique pour le Fe. Hassett et ses collaborateurs ont demontre que Fet4 etait aussi un transporteur de faible affinite pour le Cu avec un Km de l'ordre de 35uM
(58). Une souche dans laquelle le gene FET4 est inactive presente une diminution de l'acquisition du Cu qui est comparable a celle observee pour la diminution de l'acquisition du Fe. Fet4 est une proteine eontenant six domaines transmembranaires et est localisee a la membrane plasmique (37, 38).
Les genes SMF1 et SMF2 ont ete decouverts et clones lors d'un criblage pour 1'identification de genes suppresseurs de la sensibilite a la temperature causee par une inactivation du gene MIF1 (150). Les chercheurs ont ensuite observe que 1'ajout de manganese (Mn ) dans le milieu de culture avait le meme effet qu'une surexpression du gene SMF1, suggerant alors une fonction pour Smfl dans le transport du Mn du milieu extracellulaire au cytosol (95, 96, 141). Par la suite, Smfl a ete caracterise comme un transporteur de metaux permettant l'acquisition non seulement du Mn , mais aussi des ions de Zn2+, Cu2+, Fe2+, Cd2+, Ni2+ et Co2+ (30, 96, 141, 142). Les
proteines Smfl et Smf2 appartiennent a la famille des transporteurs Nramps. Comme
les transporteurs Ctrl et Ctr3, Smfl et Smf2 sont tres similaires, avec un pourcehtage d'homologie de 49 % (150). De plus, la fonction predite pour Smf2 est virtuellement similaire a celle de Smfl. Contrairement au Cu acquis par Fet4, il n'existe aucune evidence que le Cu transporte par les Smfs soit achemine vers les chaperonnes de Cu.
2.1.3 Le transport vacuolaire
Chez 5. cerevisiae, c'est la proteine Ctr2 qui est responsable du transport vacuolaire du Cu. Ctr2 appartient a la famille des transporteurs de Cu de haute affinite comme Ctrl et Ctr3 (voir section 2.1.1, figure 1) (70). La proteine Ctr2 a ete identifiee par homologie avec le transporteur de Cu COPT1 de la plante Arabidopsis
thaliana. Elle est localisee a la membrane vacuolaire et permet de recuperer le pool de
Cu vacuolaire afin de le transporter vers le cytosol lorsque la cellule est en carence de Cu (118, 123). L'inactivation du gene CTR2 augmente la resistance des cellules au Cu, et son expression ne permet pas d'eliminer les phenotypes causes par le manque d'expression de Ctrl et Ctr3 (81, 123, 160). Un homologue humain de Ctr2 (hCtr2) a ete identifie et presente les memes caracteristiques que la proteine de levure. Contrairement a Ctrl et Ctr3, la proteine Ctr2 n'est pas regulee par le statut en Cu de la cellule, car les niveaux proteiques de Ctr2 demeurent inchanges que se soit en carence ou en exces de Cu. De plus, le gene CTR2 ne possede pas de CuRE (Cu Response Element) au niveau de son promoteur qui pourrait permettre sa regulation Cu-dependante au niveau transcriptionnel (voir section 2.2.1) (118). Recemment, la reductase Fre6 a ete identifiee comme etant la proteine responsable de la reduction du Cu2+ vacuolaire en Cu1+ juste avant son transport au cytosol par Ctr2 (127).
2.2 Regulation del'apport en cuivre
Les genes impliques dans le transport du Cu a la surface cellulaire (CTR1, CTR3 et FRE1) sont regules au niveau transcriptionnel selon le statut en Cu de la cellule. En effet, 1'expression de ces genes est activee en carence de Cu et elle est reprimee en sa
presence ( Figure 2) (82, 101, 154). Cette regulation est assuree par des elements en cis sur les promoteurs des genes, appeles CuREs (Cu Response Elements), composes de la sequence consensus suivante : 5'-TTTGC(T/G)C(A/G)-3'. II existe deux copies des CuREs sur les promoteurs de CTR1, CTR3 et FRE1 qui sont essentiels a une bonne activation de la transcription. Les CuREs sont arranges en repetition directe ou inversee sur l'ADN (82, 101, 154). C'est le facteur de transcription Macl qui lie les CuREs et regule l'expression des genes impliques dans le transport du Cu. Macl est une proteine nucleaire possedant un domaine de liaison a l'ADN dans sa partie N-terminale. Sa portion C-terminale contient un domaine de transactivation (TAD). La fonction de transactivation de Macl est inhibee en presence Cu (152). En effet, un systeme simple hybride utilisant le domaine de liaison a l'ADN du facteur Gal4, fusionne au domaine C-terminal de Macl (acides amines 252 a 341), a permis de constater que Macl etait incapable d'activer la transcription de CTRl-lacZ en presence de Cu (50, 53). Macl activate la transcription de CTRl-lacZ seulement en carence de Cu. Dans la region C-terminale de Macl, on retrouve plusieurs residus cysteines qui forment deux motifs repetes contenant chacun une histidine et cinq cysteines. Ces deux motifs sont nommes REP-I et REP-II. Le motif REP-I constitue le domaine senseur de Macl. II s'associerait a 4 atomes de Cu, ce qui entrainerait un changement de conformation qui engendrerait des interactions intramoleculaires entre les extremites N- et C-terminales de la proteine, inhibant sa capacite a transactiver la transcription (152). Le motif REP-II fait partie du domaine de transactivation de Macl. II possederait egalement la capacite de Her 4 atomes de Cu. A des
exemple, on peut citer la lysyl oxidase, la tyrosinase et la ferroxydase multi-Cu-dependante. Chez 5*. cerevisiae, c'est la chaperonne Atxl, localisee dans le cytosol, qui est responsable de charger le Golgi en Cu. Le gene ATX1 a ete identifie comme un gene capable de remplacer le gene SOD1 dans la detoxification des ROS (93). Aujourd'hui, on ne connait toujours pas la raison pouvant expliquer cette complementation. Atxl est une proteine soluble de 73 acides amines qui possede un motif de liaison au Cu de type MxCxxC permettant la coordination d'un atome de Cu par molecule. Elle possede une structure avec la signature PapPaP (117, 120, 123, 132). Atxl amene le Cu a la proteine transmembranaire Ccc2, qui est situee au niveau de la membrane de l'appareil de Golgi (Figure 3). Ccc2 appartient a la famille des proteines ATP-ases de type P, c'est l'homologue des proteines ATP7A (Menkes) et ATP7B (Wilson) humaines. Une fois que Ccc2 a obtenu le Cu d'Atxl, elle le transporte vers la lumiere du Golgi. Ccc2 possede deux motifs MxCxxC de liaison au Cu au niveau de son domaine N-terminal. Des essais in
vitro et de double-hybride ont demontre que les proteines Atxl et Ccc2 interagissent
directement ensemble et de facon Cu dependante (120, 146). Tout comme Atxl, Ccc2 possede une portion proteique dont la structure est de type PaPpaP, facilitant l'interaction entre les deux proteines. Un fait interessant est que Atxl expose a sa surface des residus tres basiques charges positivement (riches en lysines : K24, K28,K61, K62 et K65) alors que Ccc2 expose des residus charges negativement. Cette situation creerait une force electrostatique qui renforcerait le lien entre les deux molecules (131). En effet, des mutations au niveau de ces residus diminuent grandement leur interaction. Un modele du transfert de l'atome de Cu entre la
cellules mutantes lys7 sont auxotrophes pour la lysine. II est cependant important de souligner que LYS7 n'est pas directemeht implique dans la voie de biosynthese de la lysine, mais qu'il est plutot essentiel a ['activation de la SOD 1. Une fois activee, la SOD1 peut proteger les proteines (dont celles de la voie de biosynthese de la lysine) centre les ROS. Ces resultats decoulent des observations de Culotta et son groupe qui ont remarque une perte d'activite de la SOD1 dans les mutants lys7 et ce, malgre une importante accumulation du polypeptide dans les cellules (34).
La chaperonne Ccsl comprend trois domaines fonctionnels distincts selon des resultats obtenus a la suite d'essais de proteolyse, de mutagenese et d'analyses structurelles (86, 88, 135). Le domaine I, situe dans la region N-terminale, est tres semblable a Atxl et contient un motif tres conserve de liaison au Cu : MxCxxC. Bien que ee domaine est apparente a celui d'Atxl, Atxl n'est pas capable de remplacer la fonction de Ccsl(88). In vivo, le domaine I de Ccsl est seulement necessaire en conditions de carence de Cu, car a des concentrations intermediaires du metal, Ccsl peut dormer du Cu a SOD1 en absence de ce domaine (135). Le deuxieme domaine de Ccsl est tres important. D'un point de vue structure!, celui-ci est homologue a la SOD1; toutefois, il est deppurvu des residus essentiels a l'activite dismutase. Le domaine II de Ccsl possede tous' les residus necessaires a la dimerisation de la chaperonne avec la SOD1, permettant ainsi l'interaction entre les deux proteines. Le domaine II n'est pas implique dans la liaison du Cu; il permet seulement Fassociation entre les deux proteines pour que le transfert du metal s'effectue d'un polypeptide a l'autre (87). Enfin, le domaine III, situe en C-terminal, est le plus petit, mais hautement conserve. Dans ce domaine, on retrouve un motif CxC qui lie le Cu (135).
Une mutation de l'un ou l'autre de ces residus abolit le transfer! du Cu a la SOD1, maisn'empeche pas 1'interaction entre les deux proteines (134).
' • • • f .
2.3.3 Cox 17, une chaperonne mitochondriale.
L'acheminement du Cu a la mitochondrie est un processus tres complexe. II a ete demontre que la chaperonne Cox 17 est essentielle pour 1'acquisition du Cu par la cytochrome c oxydase (CcO) situee a la mitochondrie (51). La CcO est une enzyme transmembranaire situee au niveau du complexe IV dans la chaine de phosphorylation oxydative impliquee dans la respiration. Elle est presente a la fois chez les bacteries et les eucaryotes. Chez ces derniers, elle est precisement localisee au niveau de la membrane interne (IM) de la mitochondrie. La CcO est composee de plus d'une douzaine de sous-unites proteiques. Les trois premieres, nominees Coxl, Cox2 et Cox3, forment le cceur catalytique de 1'enzyme. Les sous-unites Coxl et Cox2 utilisent le Cu comme cofacteur (84). Ce sont des etudes genetiques qui ont permis 1'identification du gene COX17. Les cellules mutantes coxl 7 sont incapables de respirer a cause d'une perte d'activite de la CcO. Toutefois, ce phenotype disparait avec un ajout exogene de Cu dans le milieu de culture (51). Des essais de fractionnement cellulaires ont permis de.localiser Coxl7 dans le cytosol et dans 1'IMS avec un ratio de 40 % (cytosol) pour 60 % (IMS) (114). Cependant, la fonction de la forme cytosoliquen'est toujours pas elucidee.
Cox 17 est Un polypeptide de 69 acides amines contenant sept residus cysteines pouvant etre impliques dans la liaison du Cu (cysteines 16, 23, 24, 26, 36v47 et 57).
Cu(I) via quatre residus cysteines tres conserves (Cys26, Cys36, Cys47 et Cys57). Ces residus sont impliques dans la formation de deux motifs CX9C (3). Grace a des strategies de criblages genetiques, deux autres genes codant pour les proteines Scol et Sco2 ont ete identifies comme faisant partie du sentier de distribution du Cu a la CcO. La surexpression de SCOl permet de retablir la respiration chez des cellules mutantes
coxl 7A (52). Par contre, la surexpression de COX17 ne permet pas une
complementation des defauts respiratoires d'un mutant scol. Ce resultat suggere que Scol agit en aval de Coxl7 dans la voie de distribution du Cu a la CcO (52). Sco2 est un homologue structurel de Scol, son role chez S. cerevisiae n'est toujours pas elucide. Scol et Sco2 sont ancrees a 1'IM de la mitochondrie et possedent tous deux un motif CxxxC de liaison au Cu.(llO). Le modele actuel suggere que Coxl7 transfere le Cu a Scol, qui die, se charge d'alimenter l'un des sites actifs de la CcO. Selon les etudes de co-immunoprecipitation et de chromatographie par affinite, ce serait la sous-unite Cox2 de la CcO qui interagit avec Scol (98).
3. Acquisition et distribution du cuivre chez Schizosaccharomyces pombe. 3.1 Acquisition du cuivre
3.1.1 Le systeme de haute affinite
Les mecanismes d'acquisition du Cu par Schizosaccharomyces pombe sont semblables, mais non identiques a ceux de & cerevisiae. Les etudes chez cette levure sont tres importantes dans la mesure ou celle-ci presente un degre d'homologie avec les cellules humaines qui est superieur a celui de la levure a bourgeon.
v
Tout comme chez S. cerevisiae, 1'acquisition du Cu par S. pombe necessiterait la reduction du Cu2+ en Cu+. La proteine Frpl a ete identifiee.et caracterisee comme une
9+
metalloreductase membranaire potentielle qui pourrait permettre la reduction du Cu enCu1+ afin de faciliterle transport de 1'ion a travers la membrane. Frpl est similaire
a la proteine Frel de S.cerevisiae (6, 130).
Une fois reduit, le Cu1+ est transporte par un complexe membranaire constitue de
deux proteines appelees Ctr4 et Ctr5 (161). Ctr4 possede trois TMs, cinq Mets motifs (N-terminal) et un motif HCH (C-terminal). Dans le second TM de Ctr4, on retrouve le motif MxxxM qui permettrait la coordination du Cu lors de son passage a travers la membrane, ainsi qu'un motif GxxxG, qui lui, serait necessaire a son assemblage avec Ctr5. Pour ce qui est de Ctr5, elle possede egalement trois TMs, on y retrouve le motif MxxxM (TM2) et le motif GxxxG (TM3). Ctr5 contient 2 Mets motifs et un motif HCH (Figure 1) (123). Contrairement a Ctrl et Ctr3, les fonctions de Ctr4 et Ctr5 ne sont pas redondantes. En effet, Ctr4 et Ctr5 forment des heterocomplexes au niveau de la membrane plasmique. De plus, chacune des proteines a besoin de son partenaire pour sa maturation et sa localisation a la membrane. La formation du complexe Ctr4/Ctr5 se fait dans le sentier de secretion, et cette multimerisation est primordiale pour la migration du complexe de transport vers la membrane plasmique et son bon fonctionnement a la surface cellulaire.
3.1.2 Le systeme vacublaire
^Chez S. pombe, c'est la proteine Ctr6 qui est responsable du transport vacuolaire du Cu. En fait, on observe une augmentation de la toxicite des cellules au Cu lorsque
ctr6 est surexprime. Toutefois, le phenotype observe n'est pas du a une augmentation
de 1'acquisition du Cu extracellulaire, car on observe une diminution de l'activite du complexe de transport Ctr4/Ctr5. II semblerait done que Ctr6 utilise le pool vacuolaire de Cu pour alimenter le cytosol. De plus, la deletion de ctr6+ entraine une diminution
de l'activite de la SOD1 cytosolique, ce qui suggere que le Cu transports par Ctr6 contribue a rapprovisionnement de cette enzyme. La proteine Ctr6 fait partie des transporteurs de Cu de haute affinite de type Ctr. En effet, elle possede trois domaines transmembranaires et forme des homotrimeres au niveau de la membrane vacuolaire en condition de carence en Cu. Ctr6 contient un Mets motif (N-terminal), un motif MxxxM (TM2) et un motif GxxxG (TM3) (Figure 1). Contrairement au transporteur vacuolaire Ctr2, Ctr6 est regulee selon le statut en Cu par le facteur de transcription Cufl (Section 3.2) (1.4).
3.2 Regulation des transporteurs de cuivre
Tout comrae la levure a bourgeon, la levure a fission est, elle aussi, sensible a une forte accumulation de Cu dans le cytosol. Afin d'eviter cette situation, cet organisme controle l'acquisition de ce metal en regulant la transcription des transporteurs de haute affinite du Cu. En effet, les genes ctr4+, ctr5+ et ctr6+ sont transcrits en carence
de Cu et leur transcription est inhibee en presence de Cu. C'est le facteur de transcription Cufl qui est responsable de cette regulation (80). Les cellules mutantes
cufl A presentent plusieurs phenotypes lies a une carence en Cu : une incapacite a
croitre sur un milieu non-fermentable (inactivation de la CcO), un defaut de l'activite
de la S0D1 et une incapacity a acquerir le Fe (due a un manque d'acquisition de Cu par la multi-cuivre oxydase Fiol) (80). ,
Cufl est une proteine nucleaire de 411 acides amines qui possede un mecanisme d'action similaire a celui de la proteine Macl de S. cerevisiae (Section 2.2). Elle a ete identifiee grace a des essais de complementation et des comparaisons informatiques a partir de son homologie avec le facteur de transcription Macl. En effet, la region C-terminale de Cufl contient un motif riche en, cysteines (CxCxxxCxCxxCxxH) qui est analogue au domaine REP-I de Macl. De plus, tout comme pour le motif REP-I de Macl, ce motif retrouve chez Cufl constitue le domaine senseur de la proteine. En effet, des mutations au niveau des cysteines et de l'histidine de ce motif abolissent la regulation du transcrit ctr4+. Des etudes ont demontre qu'en presence de
concentrations elevees en Cu, Cufl subirait un changement de conformation de la proteine qui masquerait le NLS, ce qui entraine une accumulation des proteines nouvellement synthetisees dans le cytosol (10, 12, 13).
La liaison de Cufl sur l'ADN depend d'une sequence consensus repetee et conservee au niveau des promoteurs des genes cibles. Cette sequence est la suivante : 5'- D(T/A)DDHGCTGD-3'; on la nomme CuSE (Copper Signaling Element). On retrouve plusieurs CuSEs au niveau des promoteurs de ctr4+, ctr5+ et ctr6+. En
somme, en carence de Cu, Cufl se lie aux CuSEs et induit la transcription des genes (9). ."_
Des etudes recentes ont demontre que la localisation de la proteine Cufl depend aussi du statut en Cu de la cellule (figure 5). Cufl possede une sequence d'exportation nucleaire (NES) riche en leucines dans sa region C-terminale. Lorsque la
3.3 Distribution du cuivre
Comme nous venons de le decrire dans les deux sections precedentes, chez S.
pombe, l'acquisition du Cu commence par sa reduction en ion Cu + au niveau de la
membrane cellulaire. Une fois reduit, l'ion metallique traverse la membrane grace au complexe proteique membranaire Ctr4-Ctr5. Arrive au cytosol, le Cu serait capture par differentes chaperonnes qui le distribueraient aux cuproenzymes cellulaires. Chez la levure a fission, seule la chaperonne Pecs (SPAC22E12.04), homologue de Ccsl, a ete caracterisee (85). Pecs est similaire a 30 % a son homologue de S. cerevisiae. Cependant, les proteines presentent des differences notables. En effet, contrairement a Ccsl, Pecs possede quatre domaines importants, annotes I, II, III et IV. Les domaines II et III sont semblables a ceux de Ccsl, mais le domaine I ne contient pas le motif MxCxxC de liaison au Cu. Toutefois, malgre cette difference, 1'expression des trois premiers domaines de Pecs (pccs+I-IIT) dans une souche ccsl A permet une activation
complete de la proteine SOD1. Ces resultats suggerent que pccs+I-III est l'equivalent
fonctionnel de Ccsl. La sequence primaire du domaine IV de Pecs est similaire a celle des metallothioneines. Ce domaine est riche en residus cysteines et comprend plusieurs motifs Cys-Cys. L'expression du domaine IV de Pecs fournit aux cellules une tolerance aux metaux comme le Cu et le cadmium (Cd), tandis que l'inactivation du gene pecs" entraine une sensibilite a ces metaux. Chez S. pombe, la chaperonne Pecs a done deux fonctions : l'activation de la SOD1 en carence de Cu (pecs I-III) et la detoxification de la cellule en cas d'exces de Cu (pccs+IV) (85).
Les cadres de lecture (ORF) SPBD1709.10c et SPB26H8.14c correspondent respectivement aux chaperonnes Atxl et Coxl7. Le produit iss.u de l'ORF
SPBD1709.10c est similaire a 57% a Atxl de 5". cerevisiae. Le motif MxCxxC est conserve dans la region N-terminale. Quelques substitutions existent au niveau de la surface basique de la proteine. Les residus lysines K24 et K28 sont remplaces par les arginines R20 et R24. Le produit de l'ORF SPB26H8.14c est 47% homologue a la proteine Cox 17 de S. cerevisiae. On y retrouve les motifs CX9C qui pourraient etre impliques dans la coordination de l'ion de Cu. Pour ce qui est du transporteur golgien Ccc2, le cadre de lecture identifie est SPBC29A3.01 (79). Les domaines fonctionnels sont tres conserves entre les deux proteines, suggerant un role identique pour la proteine de S. pombe versus celle de S. cerevisiae.
4. Les amines oxydases dependantes du cuivre (CAOs).
Les sections precedentes ont permis de faire une introduction sur l'ion de Cu en faisant ressortir son importance chez les organismes vivants. Nous avons enumere dans la section 1.1 plusieurs enzymes qui utilisent le Cu comme cofacteur. Parmi les cuproenzymes de la cellule, on trouve les amines oxydases (AOs). Dans cette section, nous porterons notre attention, plus particulierement, sur une sous-classe des AOs : les amines oxydases Cu-dependantes (CAOs), aussi connues sous le nom de SSAOs.
4.1 Caracteristiques et fonctions biologiques des CAOs.
Les amines oxydases sont divisees en deux groupes d'enzymes selon la nature du cofacteur contenu dans le site actif: les monoamines oxydases (MAO-A et MAO-B) qui utilisent le FAD {flavin adenine dinucleotide) et les amines oxydases Cu-dependantes qui utilisent le TPQ (2,4,5 trihydroxyphenylalanine quinone). C'est sur
ces dernieres que vont porter les sections suivantes. Les amines oxydases qui preferent le TPQ comme cofacteur sont souvent appelees SSAOs (semicarbazide
sensitive amine oxidases) a cause de leur sensibilite a un inhibiteur de type carbonyle,
le semicarbazide. Dans ce groupe on trouve les diamines oxydases, la lysyl oxydase et les CAOs solubles et membranaires. On peut done dire que les.CA.Os possedent deux cofacteurs : un cofacteur inorganique (Cu) et un cofacteur organique (TPQ) (67, 102). Les CAOs et les MAOs presentent d'autres differences en ce qui coneerne leurs substrats, leurs inhibiteurs et leurs fonctions biologiques. Malgre 1'existence de CAOs chez plusieurs especes incluant les bacteries, les levures, les plantes et les eucaryotes superieurs, tres peu de choses sont connues sur la biologie de ces enzymes. Chez les bacteries, les CAOs ont une fonction nutritionnelle en fournissant aux organismes une source de carbone et d'azote. En effet, des etudes ont demontre que plusieurs bacteries, en particulier les Enterobacteriaceae, font appel aux CAOs lorsque la seule source d'energie dans le milieu est une amine primaire. C'est le cas pour Klebsiella
oxytoca (54) et Escherichia coli (31) qui peuvent tous les deux utiliser le
2-phenylethylamine. Le catabolisme des amines primaires par des CAOs a egalement ete demontre chez des bacteries a gram-positif comme Arthrobacter globiformis (methylamine) (104, 158) et le Mycobacterium Sp (benzylamine) (90). D'ailleurs, l'ajput du substrat (amine primaire) dans le milieu de culture des bacteries est necessaire pour la purification dela CAO.
Chez les levures, les CAOs ont le meme role nutritionnel que chez les bacteries. En effet, des etudes ont demontre que les champignons Aspergillus niger (46-48),
(20, 24, 33) possedent des CAOs dont l'activite est induite par une amine primaire permettent aux organismes d'utiliser 1'amine comme source de carbone et d'azote. Recemment, des essais phenotypiques sur plaques ont permis de demontrer que l'expression heterologue de la CAO de S. pombe chez S. cerevisiae permet la croissance des cellules lorsque la seule source d'azote presente est l'ethylamine (83).
Chez les plantes, les CAOs participent au processus de lignification de la paroi cellulaire (126). Des chercheurs ont remarque que l'ajout d'une amine primaire au site de blessure accelerait la reparation de la paroi cellulaire, tandis que l'ajout d'un inhibiteur de CAO ralentissait le processus.
Chez les mammiferes, les amines oxydases Cu-dependantes sont exprimees a la membrane plasmique de differents tissus, mais on trouve aussi une forme soluble en circulation dans le plasma. Chez l'homme, des etudes ont demontre que les deux formes de l'enzyme seraieht codees par le meme gene, AOC3 (139). En fait, la forme soluble deriverait d'un clivage proteolytique de la proteine membranaire. Deux genes codant pour des CAOs existent chez l'humain; AOC2 au niveau de la retine et AOC3 partout ailleurs (157). Les CAOs catalysent la deamination oxydative des amines primaires. Ce qui resulte en la formation d'un aldehyde, de peroxyde d'hydrogene (H2O2) et d'ammonium (NH3+). La presence de Cu et d'oxygene est essentielle a la
reaction enzymatique qui se produit selon 1'equation suivante : RCH3NH2 + 02 + H20 C A O» RCHO + H202 + NH3+
Une activite CAO peut etre detectee dans les muscles lisses, les adipocytes (125), les chondrocytes (21), la retine (157), le cerveau (164) et les odontoblastes (102). Les
CAOs ont un eventail de substrats qu'elles peuvent metaboliser qu'il s'agisse d'amines xenobiotiques ou d'amines biogenes. Parmi ces substrats, on peut citer : la putrescine, la cadaverine, l'histamine, la lysine, le benzylamine, la methylamine et l'aminoacetone. Les deux dernieres substances ont ete identifiees comme des substrats physiologiques des CAOs. Elles proviennent respectivement du metabolisme de 1'epinephrine, de la creatinine ou de la sarcosine (methylamine) et du metabolisme de la glycine ou de la threonine (aminoacetone). Leur oxydation produit le formaldehyde et le methylglyoxal, respectivement (67, 102).
Malgre un manque de precision sur le role physiologique exact des CAOs, des experiences ont permis d'associer l'activite de ces cuproenzymes a plusieurs processus biologiques comme le developpement de la matrice externe (89),le catabolisme des amines exogenes, la detoxification des amines circulantes (97, 99). De plus, le H2O2 produit par les CAOs. pourrait servir a reguler plusieurs processus physiologiques tels la lipolyse (125) et le transport du glucose dans les adipocytes (41). II semblerait egalement que VAP-1, une glycoproteine identique a la proteine SSAO humaine, soit impliquee dans 1'adhesion et la migration des leucocytes sur les cellules endotheliales (138). L'expression de VAP-1 a la membrane des leucocytes est induite pendant 1'inflammation des tissus et l'activite CAO serait importante lors de ce processus (133). Un autre fait interessant est 1'augmentation de, l'activite CAO chez les patients atteints de maladies comme le diabete mellitus (17, 156), la maladie d'Alzheimer (155), l'insuffisance cardiaque, la cirrhose hepatique (78), l'uremie et les infarctus cerebraux (65, 102).
Aucune. etude ne s'est encore vraiment concentree sur les modulateurs de l'activite des CAOs. Comme il a ete dit precedemment, l'activite de ces enzymes est induite en presence d'amines primaifes (20, 23, 32, 33, 45-48, 83) et lors de certaines maladies inflammatoires (paragraphe precedent). De plus, les resultats de notre laboratoire demontrent que le Cu (83, 115) et le H2O2 (Peter et al, donnees non publiees) entrainent une augmentation de l'activite CAO chez la levure a fission. En effet, lorsque les cellules sont cultivees en presence d'un exces de Cu ou de H2O2, on observe une activite CAO superieure a celle observee en condition basale.
4.2 Structure et motifs conserves des CAOs. 4.2.1 Structure des CAOs.
Jusqu'a aujourd'hui, toutes les CAOs caracterisees sont des glycoproteins dimeriques. La masse moleculaire des monomeres varie de 70 a 95 kDa (71, 99). Qu'elles soient membranaires ou solubles, les CAOs possedent, toutes, un atome de Cu et un TPQ par monomere. II est important de mentionner que le cofacteur TPQ est forme par la modification post-traductionnelle d'une tyrosine au sein du site actif de l'enzyme (69, 71, 106). D'ailleurs, la biogenese du TPQ est un processus autocatalytique qui necessite la presence du Cu et de l'oxygene (voir section 4.3) (106).
Actuellement, plusieurs ORFs codant pour des CAOs ont ete identifies chez les mammiferes/La premiere amine o'xydase Cu-dependante clonee a ete celle du bovin BSAO (bovine serum amine oxidase) (106). Le gene humain a ensuite ete clone par deux groupes differents* en 1996 et 1998, respectivement. Le produit du gene humain
porte deux noms : human placenta amine oxidase (159) et vascular adhesion
protein-1 (VAP-protein-1) (protein-138). La proteine VAP-protein-1 est 83 % identique a BSAO. Par ailleurs, des
proteines homologues ont aussi ete identifiees chez le rat et la souris (16). Quelques rares organismes ne possedent pas de CAO. Parmi ces derniers, on retrouve la levure
Saccharomyces cerevisiae.
La structure tertiaire de quelques CAOs a deja ete resolue (1, 25, 76, 92,'111, 113, 151). Recemment, une structure tertiaire a egalement ete publiee pour la proteine humaine VAP-1 (66).
Les CAOs sont composees de quatre domaines structuraux. Les structures tertiaires determinees sont tres similaires entre elles, malgre les differences au niveau de leurs sequences primaires. Le dimere est generalement en forme de champignon. Une difference majeure peut consister en l'existence ou non d'un domaine transmembranaire dans la region N-terminale (18). Un domaine tres important est le domaine IV situe dans la portion C-terminale de la proteine; c'est aussi le domaine ou on retrouve les motifs les plus conserves. Le site actif de chaque monomere, de meme que leur surface de dimerisation se retrouvent dans ce domaine qui adopte la forme d'un sandwich de type P (18, 66).
4.2.2 Motifs conserves dans la sequence primaire.
L'analyse des sequences primaires des differentes CAOs isolees met en evidence la presence d'un motif tres conserve au niveau du site actif de ces proteines. Ce motif est constitue des residus suivants : Asn- Tyr - Asp/Glu -Tyr. Dans ce motif, la premiere tyrosine sert a la formation du TPQ (69, 72, 106). II existe aussi trois residus
4.3 Le cofacteur organique 2,4,5-trihydroxyphenylalanine quinone (TPQ) et la reaction enzymatique.
4.3.1 La biogenese du 2,4,5-trihydroxvphenylalanine quinone (TPQ).
Le mecanisme de la biogenese du TPQ est un processus auto-catalytique et Cu-dependant. En effet, l'expression heterologue du gene codant pour la CAO de H.
polymorpha (HPAO) chez S. cerevisiae, une levure ne possedant pas de CAO, permet
la production d'une enzyme active. Le modele de la biogenese repose essentiellement sur les resultats in vitro obtenus avec la proteine HPAO (39, 136) et des resultats de cristallographie obtenus a partir de la proteine de la bacterie A. globiformis (151). La biogenese du TPQ commence avec l'enzyme dans sa forme apo (sans Cu et sans TPQ). Les etudes demontrent que pendant la biogenese du cofacteur, l'atome de Cu est coordonne par quatre ligands : trois residus histidines (His) et le residu tyrosine (Tyr) precurseur du TPQ. Chez la bacterie A. globiformis, une mutation dans l'une des histidines du motif His-X-His inhibe la formation du TPQ (24). Une schematisation du modele propose pour la biogenese du TPQ se trouve a la figure 7.
--E Cu (II) .OH - • • r - pH " / \' ' His His 02 ,E
Y<3
OH / His-fti(H! / x« His His r~E - E H*W
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'°i
His-Cufllj / V. His His HiS'-Quil) His His - * * A' I K 0 </> / ' His-'-Cuiii) / -V His Hss H 0 =«CW
0" OHz His—Cufil) His His 02JHJO I 0 H tt?o H,0, H 0/ T 0-OH HteT"/ \ His His 0 H ~ HjO His-:Cu(II) / v His His r-E1
! 01
0 OH HiS'Cu{llj His HisFigure 7. Modele actuel propose pour la biogenese du TPQ. 4.3.2 La deamination oxydative.
La reaction de deamination oxydative catalysee par les CAOs se produit en deux etapes : une demi-reaction reductive qui se termine par la formation de 1'aldehyde et une demi-reaction oxydative permettant la liberation du peroxyde d'hydrogene et de 1'ammonium. Un schema de la reaction complete de deamination oxydative est represente a la figure 8 (18).
formation du produit base de Schiff, le TPQ est sous une forme reduite appelee aminoquinol (Fig. 8E) etant donne qu'il a gagne deux electrons provenant del'amine. Puis, il y a bris du lien entre le substrat amine et le TPQ reduit, suivit de la formation de l'aldehyde correspondant. L'atome d'azote de l'amine primaire remplace maintenant l'oxygene du cofacteur qui etait lie au carbone C5 (Fig. 8E, cercle vert). Cette partie de la reaction est dite reductive a cause de l'etat d'oxydation du TPQ a la fin de ces etapes. Cette partie de la deamination oxydative est tres bien elucidee et semble s'appliquer a toutes les CAOs connues (Fig. 8A -> E)..
Les details de la demi-reaction oxydative sont moins bien elucides que ceux de la demi-reaction reductive; mais on sait que c'est la partie de la catalyse dans laquelle l'oxygene joue un role capitale. En fait, les chercheurs se posent plusieurs questions sur la nature de la molecule exacte qui reagit avec l'oxygene. Est-ce que c'est l'aminoquinol-Cu (II) ou le semiquinone-Cu (I) qui est en equilibre avec cette premiere molecule (Fig. 8E -> F)? L'espece aminoquinol constitue le premier intermediaire de cette partie de la reaction (Fig. 8E -> G). Une molecule d'oxygene se lie a 1'enzyme et accepte deux protons et deux electrons de Taminoquinol resultant en la formation du peroxyde d'hydrogene et d'un intermediaire iminoquinone. L'hydrolyse de 1'iminoquinone permet la liberation de l'ammonium alors que le TPQ oxyde est regenere. Le cycle peut ainsi reprendre et poursuivre avec la deamination oxydative d'une autre molecule de substrat (18).
5. Objectifs du projet de recherche.
Problematique. Grace aux diverses etudes biophysiques et structurelles effectuees, on possede beaucoup d'information sur la biochimie des CAOs, la formation du cofacteur organique et la reaction enzymatique. Toutefois, tres peu d'etudes se sont concentrees sur la biologie et la genetique de ces enzymes ubiquitaires. Comme il a ete mentionne dans les sections precedentes, le Cu est un element essentiel a plusieurs etapes de l'activite des CAOs. En effet, le Cu est necessaire pour la maturation de l'enzyme (formation du TPQ), ainsi que pour le deroulement de la reaction de deaminatipn. oxydative. Cependant, jusqu'a aujourd'hui aucune voie d'appro visionnement en Cu pour les CAOs n'a encore ete identifiee. Objectif global. Afin de repondre a cette problematique, le but global de ce travail etait de determiner la provenance du Cu qui doit d'etre utilise par une CAO fonctionnelle pour sa maturation et son activite. Pour ce faire, notre approche strategique etait d'utiliser l'organisme modele 5". pombe, dont la maniabilite genetique permet la « dissection » des voies d'appro visionnement de cofacteurs tels les ions metalliques a l'echelle moleculaire. Nos travaux etaient divises en trois principaux objectifs :
i) Determiner 1'importance de Taction du systeme de transport de haute affinite du Cu forme par le complexe proteique Ctr4/Ctr5.
ii) Identifier la ou les proteines cytosoliques impliquees dans la distribution du Cu a la Caol de S. pombe.
iii) Etudier la nature du mecanisme par lequel l'ion de Cu est transmis a Caol pour son activation.
RESULTATS
MANUSCRIT : Copper distributed by the Atxl is available to copper amine oxidase 1 in Schizosaccharomyces pombe.
RESUME:
Plusieurs etudes proposent que les amines oxydases dependantes du Cu (CAOs) sont impliquees dans le metabolisme des amines xenobiotiques et des amines biogeniques. Le cuivre (Cu) est un element essentiel a l'activite de ces enzymes. Chez
Schizosaccharomyces pombe, il existe deux genes, caol + et cao2+, qui coderaient
potentiellement pour des proteines membres de la famille des CAOs. Malgre 1'expression des deux genes dans les cellules de type sauvage, nous observons que seule l'expression de caol+, et non l'expression de cao2+, permet la production d'une
enzyme active. Des mutations ponctuelles au niveau de la proteine ont permis d'identifier trois residus histidines situes dans la region C-terminale de Caol qui sont necessaire a l'activite amine oxydase. L'utilisation d'un allele de fusion fonctionnel
caol+-GFP a permis de demontrer que la proteine Caol-GFP se localise dans le
cytosol des cellules. En condition de carence de Cu, on observe une perte de l'activite amine oxydase dans les cellules ou les genes ctr4+, ctr5+ et cufl+ sont supprimes. Ces
resultats suggerent que la production d'une CAO active depend du transport de haute affinite du Cu effectue par le complexe Ctr4/Ctr5 ainsi que du facteur de transcription Cuf 1. De la meme facon, les cellules atxl nulles montrent une baisse significative de l'activite amine oxydase. Par contre, la deletion des genes ccc2+,pccs+ et coxlT n'a
pas d'effet significatif sur l'activite de Caol. La reinsertion d'un allele atxl+ dans les
cellules mutantes pour le gene atxl+ permet de restorer la perte d'activite observee
chez Caol. Ce resultat permet done de demontrer 1'importance de la presence de Atxl dans les cellules. En utilisant la technique de double-hybride, nous avons demontre que Caol interagit physiquement avec Atxl, et que cette interaction est comparable a celle entre Atxl et la region N-terminale de Ccc2. Dans 1'ensemble, ces resultats decrivent pour la premiere fois le fait que la chaperonne Atxl puisse etre un transporteur de Cu pour une proteine autre que Ccc2, ainsi que son role crucial dans la distribution du Cu a Caol.
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CONTRIBUTION:
Ma contribution globale aux travaux qui ont genere le manuscrit est de 75 %. J'ai realise 70% des constructions moleculaires necessaires a l'obtention des resultats.
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J'ai egalement cree plusieurs souches essentielles a la realisation des experiences. De plus, e'est moi qui ai mis au point l'essai liquide pour la mesure de l'activite amine oxydase. Enfin, j'ai participe a la realisation des figures et a la redaction du manuscrit (. paru dans la revue Eukaryotic Cell du mois d'octobre 2008.
Abstract
Copper amine oxidases (CAOs) have been proposed to be involved in the metabolism of xenobiotic and biogenic amines. The requirement for copper is absolute for their activity. In the fission yeast Schizosaccharomycespombe, caol+ and cao2+ genes are predicted to encode
members of the CAO family. While both genes are expressed in wild-type cells, we determined that only the expression of caol+, but not cao2+, results in the production of an
active enzyme. Site-directed mutagenesis identified three histidine residues within the C-terminal region of Caol that are necessary for amine oxidase activity. Using a caoF-GFP allele that retained wild-type function, Caol-GFP protein was localized in the cytosol. Under copper-limiting conditions, disruption of ctr4+, ctr5+, and cufl+ produced a defect in amine
oxidase activity, indicating that a functionally active Caol requires Ctr4-5-mediated copper transport and the transcription factor Cufl. Likewise, atxl null cells exhibited substantial decreased levels of amine oxidase activity. In contrast, deletion of ccc2A, coxl7A, and pecs A had no significant effect on Caol activity. Residual amine oxidase activity in cells' lacking atxl+ can be restored to normal levels by returning an atxt allele, underscoring the critical
importance of the presence of Atxl in cells. Using two-hybrid analysis, we demonstrated that Caol physically interacts with Atxl, and this association is comparable to that of Atxl with the N-terminal region of Ccc2. Collectively, these results describe the first example of the ability of Atxl to act as a copper carrier for a molecule other than Ccc2, and its critical role in delivering copper to Caol.
Introduction
Copper is an essential metal ion cofactor that is required for many biological processes, including respiration, iron transport, superoxide anion detoxification, and assimilation of carbon and nitrogen sources (29). In excess, however, copper can participate in redox reactions that generate highly reactive oxygen species that cause damage to the cellular membrane, proteins, DNA, and RNA molecules (21). Consequently, organisms have evolved with multiple mechanisms to obtain sufficient levels of copper for incorporation into cuproproteins, while tightly controlling intracellular copper to avoid toxicity.
Copper-containing amine oxidases (CAOs) have been identified in bacteria, yeasts, plants, and animals (39). Although little is known about their precise biological roles, CAOs from
'v.
prokaryotes and lower eukaryotes can catalyze the oxidative deamination of several amine substrates to their corresponding aldehydes, providing carbon and nitrogen sources for cellular growth (7, 49). In higher eukaryotes, the situation is less well defined. Roles have been suggested for CAOs in wound healing, regulation of glucose uptake, metabolite signaling, and cell-cell adhesion and recognition, as well as detoxification of endogenous and xenobiotic amines (42, 54). CAOs are dimeric proteins with molecular masses of-140 - 190 kDa. CAOs have been shown to contain a single copper ion per monomer. Each copper ion is coordinated by the imidazole groups of three highly conserved histidine residues located in the C-terminal half of each monomer (43). In addition to the copper ion, each monomer contains a covalently bound cofactor, 2,4,5-trihydroxyphenylalanine quinone (TPQ), which is generated by post-translational modification of the first conserved tyrosine residue (indicated in bold) in the consensus sequence Asn-Tyr-(Glu/Asp)-Tyr (9, 12, 28, 36). The copper ion and oxygen are required for tyrosine modification into TPQ (10). An active CAO protein therefore has the capacity to convert a primary amine and molecular oxygen into the corresponding aldehyde, ammonia and hydrogen peroxide. Currently, pathways by which copper is delivered to CAOs are"not well understood.
In the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, the high-affinity copper uptake process occurs via a two-component copper transporting complex at the cell surface. This heteroprotein complex is composed of the Ctr4 and Ctr5 proteins that are structurally related to each other and to the Ctr family of copper transporters (4, 46, 55). Gtr4 and Ctr5 are physically associated in vivo (55). Co-expression of both proteins is necessary for the proper function and localization of the heteroprotein complex at the plasma membrane (4, 55). Like most Ctr family members, the N-terminal hydrophilic domains of Ctr4 and Ctr5 are rich in methionine residues (32, 55). At the cell surface, these domains function independently to transport copper, however, both domains are required for optimal cell growth under copper-deficient conditions (4). The copper-sensing transcription factor Cuff plays an essential role in coordinating the copper-regulated transcription of copper transporter genes in S. pombe (2). Cufl activates transcription of the ctr4+ and ctr5+ genes under copper-deficient conditions
and represses their expression under copper-replete conditions (5).
Once inside the cell, free-copper ions are virtually undetectable (47). One strategy by which cells transport copper to copper-dependent proteins within the cytoplasm involves the use of small soluble cytoplasmic copper carriers known as copper chaperones (19). In Saccharomyces cerevisiae, three small copper-binding proteins, Atxl (37), Ccsl (16), and Coxl7 (20), have been identified as chaperones to deliver copper to specific intracellular localizations. Atxl shuttles copper from the cytosol to post-Golgi vesicles by specifically docking with the Ccc2 copper-transporting P-type ATPase (45). Once transferred into the Golgi apparatus, it is thought that copper is loaded onto proteins as part of their maturation. In the mitochondrion, copper is mainly stored within the matrix and from there copper is delivered by an as-yet unidentified intracellular ligand in the mitochondrial intermembrane space. Once transported within the mitochondrial intermembrane space, copper is bound by Cox 17, which in turn transfers copper into cytochrome c oxidase with the aid of Scol and
