altFUS, la deuxième protéine encodée dans le gène FUS, inhibe le recrutement mitochondrial de PARKIN

Texte intégral

(1)

(2) Université de Sherbrooke. altFUS, la deuxième protéine encodée dans le gène FUS, inhibe le recrutement mitochondrial de PARKIN. Par Amina Merwa LEKEHAL Programme de Biochimie. Mémoire présenté à la Faculté de médecine et des sciences de la santé en vue de l’obtention du grade de maitre ès sciences (M. Sc.) en Biochimie. Sherbrooke, Québec, Canada Mars,2021. Membres du jury d’évaluation Pr. Xavier Roucou (Département de Biochimie et génomique fonctionnelle) Pr. Benoit Laurent (Département de Biochimie et génomique fonctionnelle) Pr. Steve Jean (Département Immunologie et biologie cellulaire). © Amina Merwa LEKEHAL,2021.

(3) Résumé. altFUS, la deuxième protéine encodée dans le gène FUS, inhibe le recrutement mitochondrial de PARKIN. Par Amina Merwa LEKEHAL Programme de Biochimie Mémoire présenté à la Faculté de médecine et des sciences de la santé en vue de l’obtention du diplôme de maitre sciences (M.Sc.) en Biochimie, Faculté de médecine et des sciences de la santé, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J1H 5N4 Les mitochondries sont des organites responsables du métabolisme bioénergétique, de l'homéostasie du calcium et de la transmission de signaux essentiels aux neurones en raison de leur forte consommation d'énergie. De plus en plus de preuves ont démontré que les mitochondries jouent un rôle clé dans les maladies neurodégénératives telles que la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), aussi appelée maladie de Lou Gehrig qui affecte particulièrement les motoneurones et entraîne une faiblesse et une atrophie musculaire. Dans la SLA causée par des mutations dans le gène FUS, une des caractéristiques cellulaires observées dans les neurones est l’inhibition de l’autophagie et l’accumulation d’agrégats protéiques cytoplasmiques. Mais comment FUS, une protéine nucléaire peut-elle inhiber l’autophagie ? Récemment, le laboratoire a découvert que le gène FUS code pour une seconde protéine : la protéine alternative FUS, ou altFUS. La séquence codante d’altFUS est “dissimulée” dans celle de FUS, mais dans un cadre de lecture alternatif. Avant mon arrivée au laboratoire, il a été démontré que c’est altFUS, et non pas FUS, qui inhibe l’autophagie. De plus, certains interacteurs protéiques d’altFUS tels que PGAM5 et PHB sont impliqués dans la mitophagie, un mécanisme de dégradation sélective des mitochondries endommagées par autophagie. Plus précisément, ces interacteurs participent dans la mitophagie par la voie PINK1/PARKIN. Ces données ont mené à l’hypothèse à l’origine de mon projet : altFUS inhiberait plus précisément la mitophagie. Dans ce contexte de recherche, deux objectifs ont été définis : -. Localiser précisément altFUS à la mitochondrie à l’aide de la microscopie de super résolution et la technique Stimulated-Emission-Depletion ou STED afin de nous aiguiller sur sa fonction. Déterminer si altFUS inhibe la voie de mitophagie PINK1/PARKIN.. La microscopie STED nous a permis de déterminer qu’altFUS est une protéine localisée à la membrane mitochondriale interne, très probablement dans les crêtes formées par cette membrane. De plus, nous avons mis en évidence une coopération fonctionnelle entre les 2 protéines FUS et altFUS dans l’inhibition du recrutement de PARKIN à la mitochondrie, qui est une étape initiale importante dans le processus de mitophagie. Cependant, la mitophagie semble procéder normalement. Ce résultat indique que dans nos conditions expérimentales surexprimant altFUS dans lesquelles la mitophagie est induite par l’ajout de molécules qui dépolarisent la mitochondrie, PARKIN n’est pas essentielle. Mes travaux à la maîtrise montrent que altFUS, une deuxième protéine codée par le gène FUS, est un inhibiteur du recrutement mitochondrial de PARKIN. Mots clés : FUS, altFUS, mitophagie, autophagie, PARKIN, coopération, mitochondrie.. i.

(4) Abstract. altFUS, the second protein encoded in the FUS gene, inhibits mitochondrial recruitment of PARKIN. By Amina Merwa LEKEHAL Biochemistry Program Dissertation presented to the Faculty of Medicine and Health Sciences for the Master of Science (M.Sc.) in Biochemistry degree. Faculty of Medicine and Health Sciences, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J1H 5N4 Mitochondria are organelles responsible for bioenergetic metabolism, calcium homeostasis and the transmission of essential signals to neurons due to their high energy consumption. More and more evidence has shown that mitochondria play a key role in neurodegenerative diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), also known as Lou Gehrig’s disease, which particularly affects motor neurons and causes muscle weakness and atrophy. In ALS caused by mutations in the FUS gene, one of the cellular characteristics observed in neurons is the inhibition of autophagy and accumulation of cytoplasmic protein aggregates. But how can FUS, a nuclear protein inhibit autophagy? Recently, the laboratory discovered that the FUS gene encodes a second protein: the alternative protein FUS, or altFUS. The coding sequence of altFUS is "hidden" in the FUS sequence, but in an alternative reading frame. Before my arrival in the lab, it was shown that altFUS, and not FUS, inhibits autophagy. Moreover, some altFUS protein interactors such as PGAM5 and PHB are involved in mitophagy, a mechanism of selective degradation of damaged mitochondria by autophagy. Specifically, these interactors participate in mitophagy through the PINK1/PARKIN pathway. These data led to the hypothesis at the origin of my project: altFUS would specifically inhibit mitophagy. In this research context, two objectives have been defined: - To precisely locate altFUS to the mitochondria using Stimulated-Emission-Depletion (STED) microscopy to shed light on its function. - To determine whether altFUS inhibits the PINK1/PARKIN mitophagy pathway. STED microscopy allowed us to determine that altFUS is a protein localized to the inner mitochondrial membrane, most likely in the ridges formed by this membrane. Furthermore, we have demonstrated a functional cooperation between the 2 proteins FUS and altFUS in the inhibition of PARKIN recruitment to the mitochondria, which is an important initial step in the mitophagy process. However, mitophagy appears to proceed normally. This result indicates that in our experimental conditions overexpressing altFUS in which mitophagy is induced by the addition of molecules that depolarize mitochondria, PARKIN is not essential. My master's work shows that altFUS, a second protein encoded by the FUS gene, is an inhibitor of PARKIN's mitochondrial recruitment. Key words: FUS, altFUS, mitophagy, autophagy, PARKIN, cooperation, mitochondria.. ii.

(5) Table des matières 1.. Introduction .................................................................................................................. 1 1.1. La mitochondrie .................................................................................................... 1 1.1.1. Rôle et biologie de la mitochondrie ................................................................. 1 1.1.2. Comportements mitochondriaux ..................................................................... 4 1.1.2.1 Fusion et fission ........................................................................................... 4 1.1.2.2. Autophagie et mitophagie ............................................................................ 6 1.1.3. La mitochondrie lors de pathologies neurodégénératives.............................. 10 1.2. La sclérose latérale amyotrophique ou la SLA, une maladie neurodégénérative multifactorielle ............................................................................... 12 1.2.1. Physiopathologie ............................................................................................ 12 1.2.2. FUS et la SLA ................................................................................................ 14 1.2.3. FUS et la mitochondrie .................................................................................. 16 1.2.4. Anomalies de l’autophagie dans la SLA........................................................ 18 1.3. L’annotation du potentiel codant du génome ................................................... 19 1.3.1. Annotations conventionnelles (ou historiques) ............................................. 19 1.3.2. Les ORFs oubliés par les annotations conventionnelles ................................ 20 1.4.. Annotation OpenProt ......................................................................................... 22. 1.5. Méthodes de détection des protéines alternatives ............................................ 23 1.5.1. Analyses de conservation .............................................................................. 23 1.5.2. Le profilage des ribosomes (RIBO-seq) ........................................................ 24 1.5.3. Protéomique basée sur la spectrométrie de masse (MS) ............................... 25 1.5.4. Édition du gène .............................................................................................. 25 1.5.5. Les signatures moléculaires et les domaines protéiques ................................ 26 1.5.6. Les défis techniques pour la détection et l’étude de la fonction des protéines alternatives .................................................................................................................... 27 1.6. FUS, un gène multicodant qui code pour une deuxième protéine, altFUS .... 28 1.6.1. Annotation fonctionnelle du gène FUS selon OpenProt ................................ 28 1.6.2. AltFUS (IP_243680), une protéine alternative mitochondriale exprimée dans les lignées cellulaires et tissus ...................................................................................... 32 1.7. L’interactome d’altFUS est enrichi en protéines impliquées dans le processus d’autophagie, et l’expression d’altFUS inhibe l’autophagie ...................................... 34 1.8. 2.. Hypothèse de recherche ...................................................................................... 37. Matériels et méthodes................................................................................................. 38 2.1. Objectif #1 Déterminer la localisation précise d’altFUS dans la mitochondrie par microscopie de déplétion par émission simultanée (STED) ................................ 38 2.1.1. Culture cellulaire ........................................................................................... 38 2.1.2. Transfections .................................................................................................. 38 iii.

(6) 2.1.3. Immunofluorescence ...................................................................................... 38 2.1.5. Microscopie STED (Stimulated Emission Depletion) ................................... 40 2.1.5.1. Principe ...................................................................................................... 40 2.1.5.2. Technique ................................................................................................... 41 2.1.6. Analyse de colocalisation, déconvolution et profil de fluorescence .............. 41 2.2. Objectif #2 Déterminer si altFUS régule la voie de mitophagie PINK1/PARKIN ............................................................................................................. 42 2.2.1. Culture cellulaire ........................................................................................... 42 2.2.2. Clonages ........................................................................................................ 42 2.2.3. Transfections .................................................................................................. 43 2.2.4. Traitement d’induction de mitophagie ........................................................... 43 2.2.5. Co-immunoprécipitation ................................................................................ 43 2.2.6. Immunobuvardage (Western Blot) ................................................................ 44 2.2.7. Gel SDS-PAGE phos-tag ............................................................................... 45 3.. Résultats ...................................................................................................................... 47 3.1. Objectif #1 Déterminer la localisation précise d’altFUS dans la mitochondrie par microscopie de déplétion par émission simultanée (STED) ................................ 47 3.1.1. altFUS est localisée à l’intérieur de la mitochondrie ..................................... 47 3.1.2. altFUS est localisée à la membrane mitochondriale interne .......................... 49 3.2. Objectif #2 Déterminer si altFUS régule la voie de mitophagie PINK1/PARKIN ............................................................................................................. 52 3.2.1. altFUS interagit avec PHB et PHB2 .............................................................. 52 3.2.2. altFUS inhibe le recrutement mitochondrial de PARKIN ............................. 56 3.2.2.1. altFUS inhibe le recrutement de PARKIN à la mitochondrie lors d’induction de la mitophagie .................................................................................... 56 3.2.2.2. Des mutations faux-sens pour altFUS n’interfèrent pas avec sa capacité d’inhiber le recrutement mitochondrial de PARKIN ................................................ 63 3.2.3. altFUS est impliqué dans la voie de mitophagie PINK1/PARKIN ............... 65. 4.. Discussion .................................................................................................................... 71 4.1.. Localisation précise d’altFUS avec la microscopie super résolution STED .. 71. 4.2.. L’interactome d’altFUS et la validation d’interaction avec PHBs ................. 72. 4.3.. Inhibition du recrutement mitochondrial de PARKIN par altFUS et FUS .. 73. 4.4. AltFUS ne semble pas inhiber la mitophagie dépendante de la voie PINK1/PARKIN ............................................................................................................. 75 4.5.. Rôles possibles d’AltFUS .................................................................................... 76. 5.. Conclusion ................................................................................................................... 78. 6.. Références ................................................................................................................... 79. 7.. Annexe ......................................................................................................................... 94 iv.

(7) Liste des tableaux Tableau 1: Diversité des protéines encodées dans le gène FUS ...................................................29 Tableau 2:Anticorps primaires et secondaires et combinaison utilisés pour la microscopie STED. ................................................................................................................................................94 Tableau 3: Anticorps primaires utilisés. ........................................................................................95 Tableau 4 : Anticorps secondaires utilisés pour le western blot. ................................................96. v.

(8) Liste des figures Figure 1: Structure et composants d’une coupe transversale de mitochondrie........................... 3. Figure 2 : Dynamique mitochondriale ............................................................................... 6 Figure 3: Les étapes du processus d’autophagie ............................................................... 7 Figure 4 : Modèle de la voie de mitophagie PINK1/PARKIN médiée par PHB2 .......... 9 Figure 5: Les domaine de la protéine FUS et les mutations impliquées dans la SLA familiale .............................................................................................................................. 16 Figure 6: Le modèle de traduction alternatif .................................................................. 21 Figure 7: FUS est un gène bicodant ................................................................................. 30 Figure 8: La conservation d'altFUS ................................................................................. 32 Figure 9 : Spécificité de l’anticorps personnalisé altFUS .............................................. 32 Figure 10: altFUS est une protéine mitochondriale ........................................................ 34 Figure 11: L’interactome mitochondrial d’alfFUS est enrichi en protéines reliées à l’autophagie ........................................................................................................................ 35 Figure 12: Principe de la microscopie STED. ................................................................. 40 Figure 13: Localisation mitochondriale d’altFUS et TOMM20 par microscopie ....... 48 Figure 14: altFUS est localisée à l’intérieur de la mitochondrie ................................... 49 Figure 15: Localisation mitochondriale d’altFUS et COXIV par microscopie ........... 50 Figure 16: altFUS est localisée à la membrane mitochondriale interne ....................... 51 Figure 17: Validation de l’interaction PHB/altFUS par co-IPs..................................... 54 Figure 18: PHB2 est un partenaire d’interaction d’altFUS........................................... 55 Figure 19: Recrutement mitochondrial de PARKIN lors de la mitophagie ................. 57 Figure 20: altFUS inhibe le recrutement mitochondrial de PARKIN après traitement à l’oligomycine et antimycine ........................................................................................... 58 Figure 21: altFUS inhibe dans certaines cellules le recrutement mitochondrial de PARKIN après traitement au CCCP ............................................................................... 59 Figure 22: altFUS et FUS coopèrent dans l’inhibition du recrutement mitochondrial de PARKIN......................................................................................................................... 62 Figure 23: Les mutants altFUS coopèrent avec FUS dans l’inhibition du recrutement mitochondrial de PARKIN ............................................................................................... 64 Figure 24 : altFUS n’a pas d’effet sur l’accumulation et la phosphorylation de PINK1 ............................................................................................................................................. 67 Figure 25: altFUS seul et sa coopération avec FUS n’ont pas d’effet sur VDAC et phospho-UB ........................................................................................................................ 69 Figure 26: Immunofluorescence d’expression d’ATP5I et altFUS. .............................. 96 Figure 27: Immunofluorescence d’expression de PHB et altFUS. ................................ 97 Figure 28: Immunofluorescence d’expression de PHB2 et altFUS. .............................. 97. vi.

(9) Liste des Abréviations Abréviation. Signification (English translation). CDS. Séquence codante (coding sequence). ORF. Cadre de lecture ouvert (open reading frame). RefORF. Cadre de lecture ouvert de référence (Reference open reading frame). AltORF. Cadre de lecture ouvert alternatif (Alternative open reading frame). UTR. Région non-traduite (Untranslated region). ARN. Acide ribonucléique (Ribonucleic acid (RNA)). ARNm. ARN messager (messenger RNA). ADN. Acide désoxyribonucléique (Deoxyribonucleic acid (DNA)). sORF/SmORF Petit cadre de lecture ouvert (Small open reading frame) LC-MS/MS. Spectrométrie masse en tandem (Liquid chromatography coupled tandem mass spectrometry). siRNA. Petit ARN interférent (Small interferent RNA). CCCP. Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (carbonyl cyanide mchlorophenylhydrazone). GFP. Protéine fluorescente verte (Green fluorescent protein). OA. Oligomycine/amtimycine (oligomycin/antimycin). FUS. Protéine de Fusion dans le sarcome (Fused in sarcoma protien). PARKIN. Parkin RBR E3 Ubiquitin Protéine Ligase (Parkin RBR E3 Ubiquitin Protein Ligase). PINK1. Kinase 1 induite par PTEN (PTEN Induced Kinase 1). STED. Épuisement des émissions stimulées (Stimulated emission depletion). TOMM20. Translocase de membrane mitochondriale externe 20 (Translocase Of Outer Mitochondrial Membrane 20) vii.

(10) COXIV. Sous-unité IV du cytochrome C oxydase (Cytochrome C Oxidase Subunit IV). PHBs. Prohibitines (prohibitin). UB. Ubiquitine (ubiquitin). VDAC. Canal d'anion dépendant de la tension 1 (Voltage Dependent Anion Channel 1). WB. Immunobuvardage (Western blot). IP. Immunoprécipitation (Immunoprecipitation). coIP. Co-immunoprécipitation (Coimmunoprecipitation). viii.

(11) Remerciements. Aujourd’hui, ce sont deux longues années de travaux et de recherche qui s’achèvent pour moi. Cela a été un parcours exceptionnel, riche en connaissances et en apprentissage. De ce fait, je tiens à exprimer toute ma reconnaissance au Pr. Xavier Roucou, mon directeur de recherche, pour l’accueil au sein de son laboratoire, pour sa confiance, mais également pour sa disponibilité et son écoute tout au long de ma maîtrise. En effet, l’opportunité qu’il m’a offerte m’a permis de progresser non seulement sur le plan scientifique et technique, mais de surcroît, sur le plan de la communication et de la gestion de projet. Je souhaite également faire part de ma gratitude à l’assistant de recherche du laboratoire Jean-François Jacques, pour ses encouragements, ses valeureux conseils et son accompagnement. Il n’a guère failli à la mission qu’il s’est assignée, celle de transmettre tout son savoir et sa passion pour le monde de la recherche et de la science. Il a toujours su rendre le travail à ses côtés agréable et plaisant, garantissant une atmosphère de travail très stimulante. Je remercie, en outre, tous les membres du laboratoire, Marie Brunet, Sébastien Leblanc et Noé Guilloy, pour les discussions scientifiques, l’ambiance et les moments de partage. Un remerciement très spécial à Marie Brunet pour son amitié, ses conseils et surtout pour m’avoir challengé tout au long de mon parcours, ce qui a fait développer mon esprit critique et alimenter ma réflexion. Ses connaissances, sa rigueur et son esprit scientifique ont été inspirants pour moi. Je tiens à remercier Joannie St-Germain pour ses encouragements, Ines Khatir et Jessica Avila Lopez pour les moments agréables. Je remercie également Marie-Line Dubois et Jennifer Raisch d’avoir contribué à mon épanouissement personnel et professionnel par leur amitié, leur soutien, leur bienveillance ainsi que pour tous les bons moments passés ensemble. Enfin, je ne saurais oublier d’adresser mes vifs remerciements à Benoît Laurent (mon mentor) et Steve Jean pour avoir accepté de faire partie du comité d’évaluation de mon mémoire. A tous un grand merci pour m’avoir apporté l’aide dont j’avais besoin, pour m’avoir aidé à progresser, à prendre la mesure de mes capacités et à devenir meilleure. Vous quitter est tellement éprouvant pour moi mais si nos chemins se séparent aujourd’hui, je suis certaine qu’ils vont se croiser de nouveaux au fil du temps.. ix.

(12) 1. Introduction 1.1. La mitochondrie 1.1.1. Rôle et biologie de la mitochondrie Les mitochondries sont les moteurs de la cellule. Chez tous les eucaryotes qui ne dépendent pas de la photosynthèse, les mitochondries sont la principale source d'adénosine triphosphate (ATP), le composé riche en énergie qui pilote les fonctions cellulaires fondamentales. L'ATP est produite à une échelle massive dans le corps humain. Nous produisons chaque jour environ notre propre poids corporel en ATP, et presque tout cela est généré par les mitochondries, principalement dans les muscles, le cerveau, le foie, le cœur et le tractus gastro-intestinal. (Rolfe et Brown, 1997). L'ATP est générée par l'ATP synthase mitochondriale à partir d'ADP et d'ions phosphate. Outre la respiration cellulaire et la synthèse de l'ATP, les mitochondries ont de nombreuses autres fonctions essentielles, notamment la production de nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) et de guanosine Triphosphate (GTP) dans le cycle de l'acide citrique, la biosynthèse des acides aminés, des groupes hème et des centres fer-soufre ou la synthèse de phospholipides pour la biogenèse membranaire. Elles agissent également dans la signalisation du calcium (Rizzuto et al., 2012), des réponses au stress (Pellegrino et Haynes, 2015) et généralement en tant que centre de signalisation cellulaire (Chandel, 2014). Les mitochondries jouent un rôle fondamental dans la santé humaine et leurs dysfonctionnements seraient à l'origine de plusieurs maladies. De plus, les mitochondries sont impliquées dans l'apoptose et le vieillissement (Bratic et Larsson, 2013). Les mitochondries sont des organelles cellulaires très structurées, séparées du cytoplasme par la membrane mitochondriale externe et interne. La membrane externe est poreuse et librement traversée par des ions et de petites molécules non chargées à travers des protéines membranaires (porines) (Figure 1), telles que le canal anionique dépendant du voltage (VDAC) (Bayrhuber et al., 2008). Les membranes interne et externe des 1.

(13) mitochondries définissent trois compartiments au sein de l'organite, chacun avec son rôle distinct et les composants protéiques correspondants. Le compartiment le plus interne, entouré par la membrane interne, est la matrice mitochondriale (Figure 1). C'est l'équivalent du cytoplasme bactérien, dont il se distingue par un pH de 7,9 à 8 (Llopis et al., 1998). Le pH élevé de la matrice mitochondriale provient du gradient électrochimique transmembranaire qui entraîne la synthèse d'ATP. La matrice mitochondriale est le site de réplication de l'ADN mitochondrial (ADNmt), de transcription, de biosynthèse des protéines et de nombreuses réactions enzymatiques (Kühlbrandt, 2015). L'ADNmt est compacté par le facteur de transcription mitochondrial A (TFAM) en assemblages supramoléculaires appelés nucléoïdes ; il existe environ 1000 par cellule. La membrane interne et externe sont séparées par l'espace intermembranaire (Figure 1). Il s'agit d'un espace d'environ 20 nm entre la membrane externe et la partie de la membrane interne connue sous le nom de membrane limite interne (Figure 1). Toutes les protéines de la matrice importées dans la mitochondrie à partir du cytoplasme doivent passer à travers la membrane externe et interne et donc également à travers l'espace intermembranaire. Les translocases de protéines de la membrane externe (TOM) et interne (TIM) forment un super complexe qui s'étend sur l'espace intermembranaire (Gold et al., 2014). La membrane limite interne contient un grand nombre de protéines qui acheminent les ions, l'ATP, l'adénosine diphosphate (ADP) et de petits métabolites entre le cytoplasme et la matrice (Kühlbrandt, 2015). La membrane interne forme des invaginations, appelées crêtes, qui s'étendent dans la matrice (Figure 1). Les crêtes définissent le troisième compartiment mitochondrial. Les membranes des crêtes forment des ouvertures tubulaires lorsqu’elles se joignent à la membrane de délimitation interne, appelée jonctions des crêtes (Figure 1). Les molécules et les ions sont échangés entre les invaginations des crêtes et l’espace intermembranaire à travers les jonctions (Jans et al., 2013; Mannella, 2006). Les membranes des crêtes contiennent la plupart des complexes entièrement assemblés de la chaîne de transport d'électrons et de l'ATP synthase. Les crêtes contiennent de grandes quantités de petite protéine porteuse d'électrons. soluble. appelée. cytochrome c (Hüttemann. et. al.,. 2011). Les. crêtes. 2.

(14) PLWRFKRQGULDOHVVRQWDLQVLOHSULQFLSDOVLWHGHFRQYHUVLRQG pQHUJLHELRORJLTXHFKH]WRXVOHV HXFDU\RWHVQRQSKRWRV\QWKpWLTXHV /HJUDGLHQWGHSURWRQVjWUDYHUVODPHPEUDQHGHVFUrWHVHVWJpQpUpSDUWURLVJUDQGVFRPSOH[HV GHSURWpLQHVPHPEUDQDLUHVGHODFKDvQHUHVSLUDWRLUHGDQVOHVFUrWHVFRQQXVVRXVOHQRPGH FRPSOH[H , 1$'+ XELTXLQRQH R[\GRUpGXFWDVH

(15) ,,, F\WRFKURPHFUpGXFWDVH

(16) HW ,9 F\WRFKURPHFR[\GDVH

(17) 9HGHO HW DO

(18) /H FRPSOH[H , DOLPHQWH OHV pOHFWURQV GH OD PROpFXOHSRUWHXVHVROXEOH1$'+GDQVODFKDvQHUHVSLUDWRLUHHWOHVWUDQVIqUHjXQTXLQROGDQV OD PHPEUDQH/ pQHUJLH OLEpUpH GDQV OD UpDFWLRQ GH WUDQVIHUW G pOHFWURQV HVW XWLOLVpH SRXU SRPSHUTXDWUHSURWRQVGHODPDWULFHDX[FUrWHV 9HGHOHWDO

(19) /HFRPSOH[H,,,SUHQG OHVpOHFWURQVGXTXLQROUpGXLWHWOHVWUDQVIqUHjODSHWLWHSURWpLQHSRUWHXVHG pOHFWURQVVROXEOH F\WRFKURPHFSRPSDQWXQSURWRQGDQVOHSURFHVVXV 9HGHOHWDO

(20) (QILQOHFRPSOH[H ,9WUDQVIqUHOHVpOHFWURQVGXF\WRFKURPHFjO R[\JqQHPROpFXODLUHHWFRQWULEXHDXJUDGLHQW GH SURWRQV HQ XWLOLVDQW MXVTX j TXDWUH SURWRQV SDU PROpFXOH G R[\JqQH FRQVRPPpH SRXU IDEULTXHUGHO HDX 9HGHOHWDO

(21) /HFRPSOH[H,, VXFFLQDWHGpVK\GURJpQDVH

(22) WUDQVIqUH OHVpOHFWURQVGXVXFFLQDWHGLUHFWHPHQWDXTXLQROHWQHFRQWULEXHSDVDXJUDGLHQWGHSURWRQV 9HGHOHWDO

(23) . )LJXUH6WUXFWXUHHWFRPSRVDQWVG¶XQHFRXSHWUDQVYHUVDOHGHPLWRFKRQGULH. 3.

(24) 1.1.2. Comportements mitochondriaux 1.1.2.1 Fusion et fission Les mitochondries remodèlent constamment leur architecture par une alternance de division asymétrique (fission) et de fusion qui permettent des transitions morphologiques et une adaptation à différentes situations fonctionnelles (Youle et Bliek, 2012). La fission est coordonnée avec la réplication de l’ADN et est essentielle pour la duplication mitochondriale et la biogenèse, qui est une condition nécessaire à la division cellulaire et fortement liée au cycle cellulaire. La fission est également une phase essentielle de l'autophagie mitochondriale (mitophagie), qui permet le recyclage de sections de mitochondries devenues dysfonctionnelles ou endommagées (Youle et Bliek, 2012). Chez les mammifères, La fission est médiée par la protéine de fission mitochondriale 1 (Fis1) et un membre de la famille de la dynamine cytosolique, dynamine 1(Drp1) (Youle et Bliek, 2012) (Figure 2). Ce dernier est recruté à partir du cytosol pour former des spirales autour des mitochondries qui se resserrent pour couper les membranes internes et externes. La fusion entre les membranes externes mitochondriales est médiée par les membres de la famille de la dynamine ancrée dans la membrane nommés mitofusines (Mfn1 et Mfn2 ), tandis que la fusion entre les membranes internes mitochondriales est médiée par un seul membre de la famille de la dynamine appelé protéine d’atrophie optique 1 (OPA1) (Figure 2) (Youle et Bliek, 2012). Les mécanismes de fission et de fusion mitochondriales sont régulés par des évènements de protéolyse et de modifications post-traductionnelles. Ce processus permet aux mitochondries de former un réseau tubulaire en constante évolution, essentiel pour la santé de la plupart des cellules eucaryotes (Hoppins et al., 2007). La fission et fusion déterminent l'état structurel et fonctionnel des mitochondries de telle sorte que les mitofusines ou OPA1 maintiennent la teneur en ADNmt, le potentiel membranaire (mΨ), les niveaux de coenzyme Q, la forme des crêtes et l'activité de la chaîne respiratoire (Figure 2) (Mishra et Chan, 2016; Mourier et al., 2015). Ces événements sont en outre soutenus par la biogenèse mitochondriale qui est coordonnée entre les génomes nucléaires et mitochondriaux et implique la réplication du génome mitochondrial suivie de la division des mitochondries (Garnier et al., 2005).. 4.

(25) La fission et la fusion mitochondriales sont nécessaires dans les neurones, qui ne peuvent survivre sans fission mitochondriale. Deux maladies humaines, l'atrophie optique dominante et la maladie de Charcot Marie Tooth type 2A, sont causées par des défauts de fusion, plus spécifiquement des mutations dans le gène OPA1 (Bombelli et al., 2014). L'importance de la fusion mitochondriale pour l'embryogenèse a été montrée avec des souris knock-out Mfn1 et Mfn2, qui meurent in utero à mi-gestation en raison d'une carence placentaire, alors que les souris Mfn1 Mfn2 à double knock-out meurent encore plus tôt dans le développement (H. Chen et Chan, 2010). Les fibroblastes d'embryons dérivés des souris double knock-out survivent en culture, malgré une absence totale de fusion, mais certaines de leurs mitochondries affichent un nombre réduit de copies d'ADNmt et perdent leur potentiel membranaire, causant des défauts de synthèse d’ATP (H. Chen et al., 2005). La fusion mitochondriale n'est donc pas absolument essentielle pour la survie cellulaire in vitro, mais elle est nécessaire au développement embryonnaire et à la survie cellulaire à des stades ultérieurs du développement (H. Chen et Chan, 2010). Ces exigences différentielles pour la fusion peuvent provenir de demandes plus élevées sur le métabolisme oxydatif dans différents types de cellules ou sur d'autres fonctions qui sont indirectement affectées par la fusion, comme la motilité mitochondriale des neurones.. 5.

(26) Figure 2 : Dynamique mitochondriale Dans des conditions physiologiques normales, les mitochondries existent dans un équilibre dynamique par des événements de fusion et de fission continus. La fission est régulée par la protéine 1 (Drp1) liée à la dynamine, la protéine de fission 1 (Fis1). Tandis que la fusion est régulée par l'atrophie optique 1 (Opa1) et les mitofusines (Mfn) 1 et 2. La fission mène à la formation de petites mitochondries arrondies, tandis que la fusion forme des réseaux mitochondriaux allongés et tubulaires interconnectés. Ces dynamiques sont nécessaires pour maintenir la fonctionnalité et l'emplacement des mitochondries pour répondre aux besoins énergétiques de la cellule. Divers stress entraînent un déséquilibre de la dynamique mitochondriale en déplaçant l'équilibre vers la fission et la fragmentation conduisant à un potentiel de membrane mitochondriale (mΨ) compromis, la fonction de l'ADN mitochondrial (ADNmt) et la phosphorylation oxydative. 1.1.2.2. Autophagie et mitophagie L'autophagie est une voie majeure de dégradation des protéines impliquées dans la clairance des agrégats en les encapsulant afin de protéger les cellules. Ce processus est également nécessaire pour maintenir un réseau mitochondrial sain en éliminant les vieilles mitochondries et endommagées. La macroautophagie communément appelée l’autophagie,. 6.

(27) commence par la formation d’une membrane d'isolement, également connue sous le nom de phagophore qui est probablement dérivé de la bicouche lipidique du réticulum endoplasmique (RE) et / ou du trans-Golgi et des endosomes (Axe et al., 2008; Simonsen et Tooze, 2009). Le phagophore en croissance peut interagir sélectivement avec les agrégats de protéines et les organites (Figure 3). Il est proposé que la protéine 1A / 1B-chaîne légère 3 associée aux microtubules (LC3B-II) se trouvant à la surface du phagophore, agit comme un « récepteur » et interagit avec les molécules « adaptatrices » sur les protéines ou organites cibles (Figure 3). Ce phagophore se développe pour engloutir la cargaison intracellulaire, comme les agrégats de protéines mal repliées, les organites et les ribosomes dysfonctionnels, séquestrant ainsi la cargaison dans un autophagosome à double membrane (Figure 3) (Mizushima, 2007). L'autophagosome chargé mûrit par fusion avec le lysosome, favorisant la dégradation du contenu autophagosomal par les protéases acides lysosomales (Figure 3).. Figure 3: Les étapes du processus d’autophagie Les premiers précurseurs autophagiques morphologiquement reconnaissables sont appelés phagophores. Ces derniers se forment dans le cytoplasme sous forme de structures à double membrane en forme de sac et peuvent être reconnus par les protéines qui s'associent à leurs membranes tels que LC3B-II. Les bords du phagophore s'allongent et fusionnent pour former une vésicule. La vésicule fermée à double membrane est appelée autophagosome. Les autophagosomes sont acheminés le long des microtubules vers la région périnucléaire où ils fusionnent avec les lysosomes et leur contenu est dégradé. 7.

(28) L'élimination autophagique des mitochondries, la mitophagie, semble être intimement liée aux processus de fission et de fusion mitochondriales. Une étude de la dynamique mitochondriale des fibroblastes a montré qu'une mitochondrie fille sur cinq est dépolarisée et éliminée par mitophagie (Twig et al., 2008). La fission est nécessaire pour la mitophagie (Twig et al., 2008). La mitophagie est caractérisée par des mécanismes moléculaires qui permettent une dégradation sélective des mitochondries. Le mécanisme le mieux décrit est la voie PINK1/PARKIN. La kinase 1 induite par PTEN (PINK1) est une kinase cytoplasmique capable de phosphoryler différents substrats, y compris l'ubiquitine et l’ubiquitine-ligase E3 PARKIN (Fivenson et al., 2017). Dans le cas d'une mitochondrie saine, la partie N-terminale de PINK1 est importée dans la mitochondrie par les translocases des complexes membranaires externe et interne (TOM et TIM, respectivement), alors que le domaine Cterminal qui contient l’activité kinase reste dans le cytosol. Ensuite, PINK1 est dégradée à l'intérieur de l'organite par la protéase mitochondriale presenilins-associated rhomboid-like Protein (PARL) localisée à la membrane interne. Le niveau basal de PINK1 est donc très faible, et l’absence de phosphorylation de PARKIN cytoplasmique empêche son recrutement à la mitochondrie (Bayne et Trempe, 2019). Lorsque la mitochondrie est endommagée, la dépolarisation de la membrane interne conduit au maintien de PARL grâce au complexe formé par les prohibitines (PHB1/PHB2) pour empêcher le clivage de la protéine membre de la famille des phosphoglycérates mutases 5 (PGAM5), ce qui protège PINK1 de la dégradation par PARL et entraîne son accumulation à la membrane externe (Figure 4, étape 1 et 2) (Cheng et al., 2021; Yan et al., 2019). PINK1 phosphoryle alors l'ubiquitine sur la serine 65 qui agit alors comme modulateur allostérique de PARKIN (Kazlauskaite et al., 2015; Koyano et al., 2014). Par la suite, PINK1 phosphoryle PARKIN (Figure 4, étape 3) (Kane et al., 2014), produisant un changement de conformation et son recrutement à la mitochondrie (Figure 4, étape 4) afin d’exercer son activité ubiquitine-ligase sur diverses protéines mitochondriales telles les mitofusines 1 et 2 (Mfn1, Mfn2), le canal anionique voltage-dépendant 1 (VDAC1) et la translocase de la membrane externe mitochondriale 20 (TOMM20) (Yao et al., 2020; C.-W. Zhang et al., 2016). Par 8.

(29) conséquent, l'ubiquitine phosphorylée sur la serine 65 est à la fois un modulateur de PARKIN et un substrat pour l’ubiquitination. Une fois ces protéines mitochondriales polyubiquitinées (Figure 4, étape 5), le protéasome va dégrader ces protéines et engendrer la rupture de la membrane mitochondriale externe (Figure 4, étape 6). Les récepteurs d'autophagie tels que l’optineurine ( OPTN ) et la protéine de point nucléaire 52 (NDP52) facilitent la formation de l'autophagosome autour de la mitochondrie endommagée (Lazarou et al., 2015). Une récente étude montre que PHB2 est un récepteur de l’autophagie possédant un motif LIR, une région d'interaction au LC3 présent à la surface de l’autophagosome (Y. Wei et al., 2017; Yan et al., 2019). Ainsi, après rupture de la membrane externe mitochondriale, PHB est exposée à la surface favorisant ainsi l’interaction entre PHB2 et microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B (MAP1LC3B) (Figure 4, étape 7). L’autophagosome encercle la mitochondrie endommagée et fusionne avec le lysosome pour être dégradée (Y. Wei et al., 2017; Yan et al., 2019). Le rôle essentiel de PHB2 dans la voie PINK1/PARKIN est confirmé par l’observation que le recrutement mitochondrial de PARKIN est inhibé dans des cellules knockdown pour PHB2 (Yan et al., 2019).. Figure 4 : Modèle de la voie de mitophagie PINK1/PARKIN médiée par PHB2 Les numéros indiquent les étapes du processus. 1. Les PHBs localisées à la membrane mitochondriale interne (MMI) interagissent avec la protéase PARL et régulent son activité protéolytique. Lors de la dépolarisation ou des dommages des mitochondries, les PHBs se fixent au PARL pour protéger PGAM5 du clivage. 2. PINK1 protégée par PGAM5 passe à 9.

(30) la membrane externe mitochondriale (MME) et s’autophosphoryle. 3. Puis, PINK1 phosphoryle l’ubiquitine sur la serine 65 et active PARKIN par phosphorylation sur son domaine ubiquitine. 4. Ceci va permettre le recrutement de PARKIN aux mitochondries endommagées. 5. Les protéines de la membrane externe mitochondriale tels que VDAC sont ensuite ubiquitinées et 6 dégradées par le protéasome, entraînant la rupture de la MME. 7. Ensuite, PHB2 exposée est ainsi détectée par MAP1LC3B dans les phagophores pour initier la mitophagie. Inspiré par (Y. Wei et al., 2017; Yan et al., 2019) 1.1.3. La mitochondrie lors de pathologies neurodégénératives La dégénérescence axonale a une association intime avec un dysfonctionnement mitochondrial, y compris des déficits énergétiques, un stress oxydatif, un déséquilibre de la fission et de la fusion mitochondriales, une altération du transport mitochondrial axonal et un dérèglement de la mitophagie (Wang et al., 2021). Le vieillissement est un phénomène physiologique normal. Le glaucome et de nombreuses maladies neurodégénératives (par exemple, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson et la sclérose latérale amyotrophique) sont liés au vieillissement. Des exemples d’implication de la mitochondrie dans certaines maladies neurodégénératives sont décrits dans cette section. Le glaucome est une maladie neurodégénérative chronique et évolutive. Il a été démontré que la dégénérescence des cellules ganglionnaires et de leurs axones est liée au vieillissement (Liu et al., 2018). Avec l’âge, les neurones des cellules ganglionnaires présentent plusieurs régions sans mitochondries et une diminution du transport mitochondrial dans les axones dégénératifs (Mao et al., 2016). Les changements de ces mitochondries avec l'âge sont liés à des changements dans l'expression de Mfn2. Le niveau de Mfn2 dans la rétine est légèrement élevé chez les souris âgées comparé à des souris jeunes (Nivison et al., 2017). Considérant la fonction de Mfn2 dans le maintien de la morphologie mitochondriale et la participation au transport mitochondrial (Misko et al., 2010), cette augmentation indique la demande de fusion et de transport mitochondriaux. De plus, étant donné que Mfn2 phosphorylée est un récepteur de PARKIN sur les mitochondries dépolarisées, la quantité de Mfn2 phosphorylée chez les jeunes souris est également plus élevée que les souris âgées, ce qui indique que le transport des mitochondries est modifié (Nivison et al., 2017). 10.

(31) Différents phénomènes sont observés pour la mitophagie dans les axones in vivo et in vitro. In vitro, Sung et al., (2016) ont démontré que les autophagosomes colocalisent avec les mitochondries dans les axones lorsque les neurones sont traités avec des molécules induisant des lésions mitochondriales. Cependant, les preuves issues de l’imagerie in vivo suggèrent que la mitophagie dépendante de PARKIN est indispensable pour le renouvellement des mitochondries et l'intégrité des axones (Cao et al., 2017). La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative liée à l'âge caractérisée par une déficience cognitive progressive, un trouble de la mobilité et une perte de mémoire. Les caractéristiques de la MA comprennent le métabolisme aberrant de l'amyloïde-β (Aβ) et les enchevêtrements neurofibrillaires de la protéine Tau hyperphosphorylée, qui sont particulièrement importants dans la dégénérescence axonale (Wang et al., 2017). L'agrégation pathologique de Tau et Aβ altère le transport des mitochondries dans les axones (Cai et Tammineni, 2017; L. Zhang et al., 2018). Par rapport aux neurones sains, les neurones primaires de modèle de souris lié à la MA ont un transport mitochondrial inhibé, ainsi qu'une fission mitochondriale et une fusion mitochondriale inhibées (Calkins et al., 2011). Le transport axonal mitochondrial défectueux dans la MA entraîne la réduction du nombre des mitochondries au niveau des axones distaux (Ali et al., 2016) et inhibe l'activité du complexe de phosphorylation oxydative (OXPHOS), entraînant un déficit énergétique important (Spires-Jones et Hyman, 2014). Les oligomères Aβ et les enchevêtrements neurofibrillaires provoquent également un dysfonctionnement des mitochondries et un stress oxydatif (Butterfield et Boyd-Kimball, 2018), qui peuvent à leur tour altérer le transport axonal. Il est démontré que le stress oxydatif est l'un des événements typiques corrélés à la dégénérescence axonale au stade précoce de la MA (Alavi Naini et Soussi-Yanicostas, 2015). Le dysfonctionnement de la biogenèse mitochondriale joue un rôle clé dans la pathogenèse de la maladie de parkinson (MP). Par exemple, l'inactivation de PARKIN dans les formes familiale de la MP réduit l’activité du promoteur de PCG-1α, un régulateur clé de la biogenèse mitochondriale, provoquant finalement la perte des neurones (Lee et al., 2017). L'analyse des cerveaux post-mortem de patients atteints de MP a montré que la distance entre le terminal synaptique et les mitochondries dans les neurones dégénératifs est augmentée 11.

(32) avec une diminution du volume et du nombre de mitochondries, suggérant que la disponibilité synaptique mitochondriale et la biomasse contribuent à la dégénérescence des neurones (Mallach et al., 2019). PINK1 et PARKIN sont deux protéines qui peuvent éliminer sélectivement les mitochondries endommagées. Les mutations de ces protéines peuvent conduire à la MP et lier la mitophagie à cette maladie. Le knockout des gènes liées à l’autophagie 5 ou 7 (Atg5 ou Atg7), deux gènes essentiels dans la formation de l’autophagosome, entraîne une perte d'autophagie, un gonflement des terminaisons axonales et éventuellement la mort cellulaire (Maday, 2016). Ainsi, l'autophagie joue un rôle indispensable dans l'homéostasie axonale. Enfin, le dysfonctionnement mitochondrial joue également un rôle dans la sclérose latérale amyotrophique (SLA), une maladie neurodégénérative qui va être décrite dans la section suivante. Des études suggèrent que la dégénérescence axonale dans la SLA est significativement corrélée avec les dommages mitochondriaux, une altération du transport des mitochondries et un dysfonctionnement autophagie-lysosome. Les mitochondries structurellement modifiées et agrégées, d'aspect gonflé et vacuolisé, ont été l'un des premiers changements observés chez les motoneurones des patients atteints de SLA (B. Wang et al., 2021). La fonction autophagie-lysosomale est également défectueuse chez les souris SLA à un stade précoce de la maladie à la fois ex vivo et in vivo, empêchant l'élimination des mitochondries endommagées des axones distaux (Xie et al., 2015).. 1.2. La sclérose latérale amyotrophique ou la SLA, une maladie neurodégénérative multifactorielle 1.2.1. Physiopathologie La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative qui affecte à la fois les motoneurones inférieurs du tronc cérébral et de la moelle épinière et les motoneurones supérieurs du cortex moteur. La perte de ces neurones entraîne une atrophie et une faiblesse musculaires. 90% de cas de la SLA sont sporadiques. Cela signifie que la maladie survient sans facteurs de risque clairement associés et sans antécédents familiaux de 12.

(33) la maladie (Schymick et al., 2007). Il n’existe toujours pas un test de dépistage exclusif et le diagnostic de la SLA se fait donc par élimination. Toutefois, il y a des signes cliniques qui peuvent indiquer l’atrophie des motoneurones comme une faiblesse musculaire, une perte de masse musculaire et une incapacité à contrôler les mouvements (Tard et al., 2017). La maladie survient généralement entre 50 et 65 ans et se caractérise par une paralysie progressive et une mort éventuelle par insuffisance respiratoire dans les 2 à 5 ans suivant l'apparition des premiers symptômes. La cause de la SLA sporadique est largement inconnue mais implique probablement une combinaison de facteurs génétiques et environnementaux tels que les métaux lourds, champs électromagnétiques et chocs électriques et les pesticides (Bozzoni et al., 2016) (Schymick et al., 2007). Des mutations dans plusieurs gènes peuvent provoquer une SLA familiale. Les mutations du gène Chromosome 9 Open Reading Frame 72 (C9orf72) représentent 30 à 40 % des cas de SLA familiale aux États-Unis et en Europe (Chiò et al., 2012). Des mutations dans le gène Superoxide Dismutase 1 (SOD1) sont à l'origine de 15 à 20% des cas de SLA familiale, et les mutations des gènes TAR DNA Binding Protein (TARDBP) et fused in sarcoma (FUS) représentent chacune environ 5% des cas. Les autres gènes associés à la SLA familiale représentent chacun une petite proportion de cas (Renton et al., 2014; Vance et al., 2009a). On estime que 60% des personnes atteintes de SLA familiale ont une mutation génétique identifiée. La cause de la maladie chez les individus restants est inconnue (Chiò et al., 2012). Il n'existe actuellement aucun remède ou traitement connu qui arrête ou inverse la progression de la SLA. Cependant, il a été démontré que les médicaments approuvés par la FDA, le riluzole (noms de marque Rilutek, Teglutik) et l'édaravone (Radicava), ralentissent légèrement la progression de la SLA (Sawada, 2017). En outre, plusieurs essais cliniques prometteurs menés dans le monde entier fournissent des informations importantes sur la manière de combattre cette maladie (Sawada, 2017).. 13.

(34) 1.2.2. FUS et la SLA FUS, EWS (Ewing Sarcoma) et TAF15 (TATA binding associated factor 15) appartiennent à la famille FET (F pour FUS, E pour EWS et T pour TAF15) des protéines de liaison à l'acide désoxyribonucléique (ADN) / acide ribonucléique (ARN). Chez l’humain, le gène FUS sur le chromosome 16 code pour une protéine de 526 acides aminés, contenant plusieurs domaines fonctionnels distincts, y compris un signal de localisation nucléaire C-terminal (NLS) hautement conservé (H. Deng et al., 2014), où se produisent de nombreuses mutations identifiées (Nolan et al., 2016) (Figure 5). Les protéines de la famille FET ont été initialement caractérisées comme faisant partie des oncogènes de fusion dans les cancers humains (Andersson et al., 2008). Dans des conditions physiologiques, la protéine FUS bien qu'elle puisse faire la navette entre le noyau et le cytoplasme, est principalement localisée dans le compartiment nucléaire (Zinszner et al., 1997). FUS est une protéine impliquée dans la réparation de l'ADN et la régulation de la transcription, de l'épissage, du transport de l'ARN et de la traduction locale (Efimova et al., 2017) La pathologie des troubles neurodégénératifs liés à FUS est caractérisée par des inclusions contenant la protéine FUS dans les cellules neuronales et gliales. Ces inclusions sont généralement observées au cytoplasme (Tyzack et al., 2019). L’agrégation de FUS est une des caractéristiques pathologiques les plus importantes à la fois dans la dégénérescence lobaire frontotemporale liée à FUS (FTLD-FUS) et la SLA liée à FUS (SLA-FUS) (Neumann, Rademakers, et al., 2009; Vance et al., 2009b); Une agrégation de FUS a été observée dans les maladies polyglutaminiques (maladie de Huntington, ataxie spinocérébelleuse) (Neumann, Roeber, et al., 2009; Woulfe et al., 2010). La majorité des mutations dans le gène FUS causant la maladie se localisent dans la région C-terminale ; ces mutations perturbent le signal de localisation nucléaire (NLS) (Figure 5) et entraînent une localisation cytoplasmique anormale de FUS. La mauvaise localisation du FUS perturberait sa fonction nucléaire (Vidal et Atkin, 2019). Une des mutations les plus étudiées est la mutation R495X, dans laquelle l'arginine en position 495 se transforme en un codon stop prématuré, entraînant une perte complète du NLS. Cette mutation est associée à. 14.

(35) un phénotype clinique sévère tels qu’une forte accumulation de FUS et de granules de stress au cytoplasme (Bosco et al., 2010). Alors que la SLA survient généralement entre 50 et 65 ans, une forme de SLA juvénile peut affecter des personnes avant l'âge de 25 ans (Zou et al., 2016). FUS semble être le gène le plus fréquemment impliqué dans la SLA juvénile (Agarwal et al., 2016). Dans la population juvénile et pédiatrique, les patients SLA-FUS présentent une évolution plus rapide et plus agressive que la SLA classique de l’adulte (Zou et al., 2015). Le rôle pathologique de la protéine FUS est associé à une combinaison de perte ou de gain de fonction. Le gain de fonction toxique est dû à la formation d'inclusions cytoplasmiques. Plusieurs modèles murins montrent d’ailleurs que la présence de FUS dans le cytoplasme induit une neurodégénérescence. Par exemple, une souris transgénique homozygote exprimant FUS délétée de son domaine NLS développe une dégénérescence des motoneurones dès la naissance (Scekic-Zahirovic et al., 2016). Plusieurs études ont démontré par une technique biophysique (LLPS ou séparation de phase liquide- liquide) que FUS peut former des gouttelettes de liquide qui sont séparées de la solution d’hydrogel. La formation de ces gouttelettes est un processus réversible qui dépend du domaine intrinsèquement désordonné de FUS (Han et al., 2012; Kato et al., 2012), de la concentration et de la température d'incubation. Il a été démontré que les mutations accélèrent la transition de phase liquide. à. solide. en. convertissant. les. hydrogels. réversibles. en. hydrogels. irréversibles (Murakami et al., 2015; Patel et al., 2015) et en altérant la formation des granules de stress. Les granules de stress sont des complexes traductionnels bloqués composés d’acides ribonucléiques messagers (ARNm), de ribosomes et de protéines de liaison à l'ARN. Ces granules se forment en réponse au stress oxydatif, à un choc thermique, à une irradiation ultraviolette et à une infection virale (Andersson et al., 2008). Cependant, on ne sait toujours pas comment cela se rapporte au phénotype de la maladie et comment le gain de fonction FUS conduit à la neurodégénérescence. FUS est un composant majeur des granules de stress cytoplasmiques (Bosco et al., 2010). En temps normal, lors d’un stress cellulaire, ces granules s’assemblent et se dissout une fois le stress éliminé. Par contre, les granules de stress contenant des mutants de FUS persistent même après l'élimination du stress (Daigle et al., 2016). 15.

(36) Figure 5: Les domaine de la protéine FUS et les mutations impliquées dans la SLA familiale La protéine FUS humaine pleine longueur contient 526 acides aminés qui peuvent être divisés en plusieurs domaines fonctionnels, y compris le domaine «de type prion» ou domaine intrinsèquement désordonné qui contient une région riche en Q / G / S / Y (acides aminés 1–165) et la région riche en G (acides aminés 165–267), un domaine liaison à l’ARN riche en arginine (RRM , acides aminés 285–371), deux régions de répétition Arg-Gly-Gly (RGG) (acides aminés 371– 422 et 453–501), interrompu par un motif en doigt de zinc Cys 2 –Cys 2 (ZNF) (acides aminés 422–453), et un signal de localisation nucléaire non conventionnel (NLS) (acides aminés 510-526). La majorité des mutations liées à la SLA familiale se trouvent plus fréquemment dans (1) la région riche en G, (2) la 2ème région RGG et (3) le NLS. Des domaines structurels et fonctionnels supplémentaires dans FUS comprennent les domaines de type prion et les domaines interagissant avec HDAC1. Tiré de (Shang et Huang, 2016). 1.2.3. FUS et la mitochondrie Une étude a démontré que FUS et les mitochondries interagissent dans le tissu cérébral bovin (Deng et al., 2015). Parmi les partenaires d'interaction de FUS, plusieurs protéines mitochondriales ont été identifiées. Conformément à cette découverte, la protéine. 16.

(37) FUS endogène a été détectée par spectrométrie de masse dans des mitochondries biochimiquement purifiées soutenant l'idée que FUS interagit avec les mitochondries (Deng et al., 2015). Le dysfonctionnement mitochondrial est fortement associé à diverses maladies neurodégénératives, y compris la SLA et FTLD (Smith et al., 2019). Les cellules neuronales des patients présentent un nombre élevé de mitochondries avec des crêtes rompues, une longueur raccourcie et des niveaux d'ATP réduits (Sasaki et Iwata, 2007; W. Wang et al., 2016). Il a également été rapporté que FUS endommage les mitochondries lorsqu'il lorsqu’elle est accumulée au cytoplasme. FUS de type sauvage et mutant sont recrutés dans les mitochondries par HSP60 et peuvent induire une fragmentation mitochondriale (Deng et al., 2015). En outre, il a été démontré que le FUS de type sauvage surexprimé ou l'expression du FUS mutant perturbent les contacts réticulum endoplasmique-mitochondries (Stoica et al., 2016). En effet, la pathologie FUS a été identifiée dans ∼10% des cerveaux de patients atteints de FTLD, y compris une expression accrue de FUS, des agrégats cytoplasmiques et des dommages mitochondriaux, même en l'absence de mutations FUS (Deng et al., 2015; Dormann et Haass, 2011). Ces études indiquent que les mitochondries sont un organite vulnérable lors de l'accumulation accrue de protéines FUS dans le cytoplasme. Deng et al., (2015) ont montré que la surexpression du FUS de type sauvage ou mutant associé à la SLA dans les cellules HEK293 réduisait le potentiel de la membrane mitochondriale et augmentait la production d’espèce réactive d’oxygène (ROS) mitochondriales. Des niveaux accrus de ROS entraînent la translocation mitochondriale de la protéine de pro-fission DRP1 conduisant à une fragmentation mitochondriale (Wu et al., 2011). De même, Deng et al., (2015) ont observé une fragmentation mitochondriale dans des neurones en culture et des motoneurones transgéniques de la mouche, surexprimant FUS de type sauvage ou mutants. Des mécanismes supplémentaires par lesquels FUS induit des dommages mitochondriaux ont été mis en avant. Il a été découvert que FUS de type sauvage ou mutant interagissait avec la sous-unité β mitochondriale ATP synthase (ATP5B) (Deng et al., 2018), qui est la sous17.

(38) unité catalytique essentielle de l'ATP synthase mitochondriale (Wang et Oster, 1998). La liaison du FUS à l'ATP5B a perturbé l'assemblage du super-complexe ATP synthase, supprimant la synthèse de l'ATP (Deng et al., 2018). Auparavant, l'assemblage du complexe ATP synthase était étroitement associé à la formation de crêtes mitochondriales (Paumard et al., 2002). Ce qui pourrait expliquer la perturbation ou la perte de crêtes observées suite à la surexpression de FUS (Deng et al., 2015, 2018).. 1.2.4. Anomalies de l’autophagie dans la SLA Des anomalies de l'autophagie ont été observées dans de nombreux troubles neurodégénératifs, dont la SLA (Park et al., 2020). L'autophagie neuronale a normalement une fonction protectrice, et sa perte chez les souris déficientes en gènes essentiels pour l'autophagie, autophagy Related 5 (Atg5) et autophagy Related 7 (Atg7), dans le système nerveux central (SNC) provoque une neurodégénérescence caractérisée par l'accumulation généralisée d'inclusions cytoplasmiques ubiquitinées (Hara et al., 2006; Komatsu et al., 2006). L'un des signes les plus évidents de l'implication de l'autophagie dans la physiopathologie de la SLA est l'accumulation d'autophagosomes dans le cytoplasme des neurones de la moelle épinière de patients (Sasaki, 2011). Soutenant le rôle important de l'autophagie dans la SLA, l’inhibition de l'autophagie dans les neurones exprimant FUS mutée, entraîne une augmentation du nombre de granules de stress positifs pour FUS (Ryu et al., 2014). Plusieurs défauts structuraux et métaboliques mitochondriaux ont été décrits dans la littérature et de nombreux gènes liés à la SLA seraient impliqués dans ce dysfonctionnement mitochondrial (Sasaki et Iwata, 2007; Smith et al., 2019). Dans ce contexte, il est intéressant de noter qu’un certain nombre de protéines issues de gènes associées à la SLA familiale et sporadique, y compris les protéines SOD1, TDP-43, FUS, C9orf72, se sont avérées interagir avec les mitochondries (Choi et al., 2019; J. Deng et al., 2015; Higgins et al., 2002; W. Wang et al., 2016) Les mitochondries endommagées ou âgées sont séquestrées et éliminées de manière sélective par le processus de mitophagie (Pickles et al., 2018; H. Wei et al., 2015), une variante 18.

(39) sélective du processus d’autophagie. Cette voie est importante pour l'homéostasie neuronale et est le plus souvent liée à la maladie de Parkinson, en raison de mutation dans les gènes PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1) et E3 la ubiquitin-protein ligase parkin (PARKIN) liées à la forme familiale de la maladie (Kitada et al., 1998; Valente et al., 2004; Youle et Narendra,. 2011). Cependant,. l'accumulation. de. mitochondries. endommagées. ou. dysfonctionnelles est également considérée comme un facteur contributif à la SLA (Granatiero et Manfredi, 2019). Ainsi, le taux d’expression de PARKIN est diminué dans la moelle épinière des patients SLA avec accumulation de TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) (Lagier-Tourenne, 2012). De plus, la surexpression de PARKIN sauve les défauts locomoteurs dans un modèle de drosophile SLA lié à FUS. (Cha et al., 2020).. 1.3. L’annotation du potentiel codant du génome 1.3.1. Annotations conventionnelles (ou historiques) Une séquence génomique est sans valeur si elle ne peut être déchiffrée ; par conséquent, les efforts pour annoter les gènes ont commencé dès que les séquences d'ADN sont devenues disponibles à large échelle. Les annotations actuelles du génome et plus spécifiquement des gènes reposent en partie sur des algorithmes de prédiction de cadre de lecture ouverts (Open Reading Frames ou ORFs). Les ORFs peuvent être fonctionnels ou bien aléatoires, c'est-àdire apparaître par chance dans une séquence d'ADN.Trois critères principaux ont été utilisés pour distinguer les ORFs aléatoires et les ORFs fonctionnels (aussi appelée séquence codante ou CDS, ou bien ORF de référence ou RefORF) codant pour des protéines : une séquence délimitée par un codon d’initiation ATG et un codon STOP, une longueur minimale de 100 codons et une limite d'un seul ORF par transcrit, par défaut le plus long (Carninci et al., 2005; Gustincich et al., 2006). Selon les annotations conventionnelles, il existe donc un seul CDS annoté par gène codant et par ARNm. Les ARNm transcrits à partir d’un gène portent soit le CDS canonique ou une variante du CDS canonique qui a été modifié par épissage alternatif. Comme nous allons le voir par la suite, des milliers d’ORFs ont été oubliés par les 19.

(40) annotations conventionnelles pour 2 raisons principales : ils ne satisfaisaient pas au critère de longueur minimale de 100 codons, et/ou ils constituaient un deuxième ORF, ce qui est impossible selon ces annotations.. 1.3.2. Les ORFs oubliés par les annotations conventionnelles L’information génétique contenue dans les ARNm se décode par triplet de nucléotides pour la conversion en acides aminés par le ribosome via les ARN de transferts. Cette caractéristique du code génétique entraîne trois manières possibles pour les ribosomes de traduire l’ARNm, c’est-à-dire qu’il y a trois différents cadres de lecture possibles. En analysant les trois cadres de lecture sur une molécule d’ARNm, il est possible de trouver des codons initiateurs et terminateurs délimitant des ORFs différents des ORFs annotés. Ces nouveaux ORFs sont appelés ORFs alternatifs (altORFs) et ceux-ci peuvent être traduits en protéines dites alternatives (Figure 6) (Brunet et al., 2018). Par convention, le CDS canonique (également appelé ORF de référence ou RefORF) est situé dans le cadre de lecture +1 de l’ARNm. Les altORFs peuvent être situés dans n’importe quel cadre de lecture lorsqu’ils sont localisés dans les régions non traduites 5’UTR ou 3’UTR, ou encore situés dans les cadres de lecture +2 et +3 lorsque ces derniers chevauchent le RefORF (Figure 6). Des transcrits sont également annotés comme non codants (ou ARNnc) lorsqu’ils proviennent de pseudogènes ou lorsqu’ils sont transcrits à partir de gènes codants mais que l’épissage alternatif produit un CDS très différent du CDS canonique. Par contre, ces ARNnc peuvent aussi posséder des altORFs. Les altORFs d’une taille supérieure à 30 codons ont été annotés dans la base de données OpenProt qui sera décrite dans le prochain paragraphe (Brunet et al., 2021). Le seuil minimal arbitraire de 30 codons a été choisi pour garder une taille raisonnable à cette base de données. Les altORFs ont donc une taille minimale arbitraire de 30 codons mais aucune taille maximale n’est imposée. La base de données OpenProt collecte également les évidences d’expression fonctionnelle des altORFs par protéomique et profilage de ribosomes (RIBO-seq) (Brunet et al., 2021). En résumé, en plus de la capacité à produire une protéine canonique et ses isoformes par épissage alternatif, un gène a la capacité de produire plus d’une protéine avec des séquences 20.

(41) HQDFLGHVDPLQpVFRPSOqWHPHQWGLIIpUHQWHVGHFHOOHGHODSURWpLQHGHUpIpUHQFH %UXQHWHWDO

(42) . )LJXUH/HPRGqOHGHWUDGXFWLRQDOWHUQDWLI &HPRGqOHFRQVLGqUHSOXVLHXUVSURWpLQHVFRGpHVGDQVGLIIpUHQWVFDGUHVGHOHFWXUHGDQVOH PrPHWUDQVFULWFRPSUHQDQWOHVUHI3URWVHWSURWpLQHVDOWHUQDWLYHV DOW3URW

(43) 3DUDOOqOHPHQWDX[DOW25)VUHWURXYpVVXUOHV$51PHWOHV$51QFHWDQQRWpVSDU2SHQ3URW G¶DXWUHVODERUDWRLUHVRQWDQQRWpGHV25)VGRQWODWDLOOHYDULHHQWUHFRGRQVHWFRGRQV HWTXLVRQWSUpVHQWVGDQVGHVUpJLRQVDFWXHOOHPHQWDQQRWpHVFRPPHQRQFRGDQWHV $51QFHW 875GHV$51P

(44) &HV25)VRQWpWpDSSHOpVVPDOO25)V V25)VRXVP25)V

(45) 2OH[LRXNHW DO

(46) (QXWLOLVDQWXQHWHOOHGpILQLWLRQOHVSUpGLFWLRQVjO pFKHOOHGXJpQRPHGHVV25) 21.