Université de Sherbrooke
L’étude protéomique de l’exosome à ARN de Schizosaccharomyces pombe révèle un potentiel régulatoire par la phosphorylation site-spécifique
Par
Caroline Telekawa Programme de Biochimie
Mémoire présenté à la Faculté de Médecine et des Sciences de la Santé en vue de l’obtention du grade de maitre ès sciences (M. Sc.)
en biochimie
Sherbrooke, Québec, Canada Mai, 2018
Membres du jury d’évaluation François Bachand, Biochimie
François-Michel Boisvert, Anatomie et Biologie Cellulaire Xavier Roucou, Biochimie
Raymund Wellinger, Microbiologie et Infectiologie
RÉSUMÉ
L’étude protéomique de l’exosome à ARN de Schizosaccharomyces pombe révèle un potentiel régulatoire par la phosphorylation site-spécifique
Par
Caroline Telekawa Programme de Biochimie
Mémoire présenté à la Faculté de Médecine et des Sciences de la Santé en vue de l’obtention du diplôme de maitre ès sciences (M.Sc.) en Biochimie, Faculté de Médecine et des Sciences de la Santé, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J1H
5N4
L’exosome à ARN est un complexe multiprotéique essentiel pour la maturation et la dégradation d’une multitude de classe d’ARN. Bien que plusieurs des fonctions de l’exosome à ARN ont été élucidées, il est cependant incertain si ses activités sont régulées. L’analyse protéomique de l’exosome à ARN purifié de Schizosaccharomyces pombe effectuée ici a permis l’identification de 39 modifications post-traductionnelle (PTMs), incluant des sites de phosphorylation, de méthylation et d’acétylation. De manière intéressante, la majorité des sites répertoriés ont été identifiés sur Dis3, une sous-unité catalytique du complexe, ainsi que sur Mtr4, une hélicase à ARN associée à l’exosome. L’analyse fonctionnelle de sites de PTMs ciblés utilisant des mutations neutres ou mimiques de PTMs a révélé des substitutions qui affectait la croissance cellulaire et les fonctions de l’exosome. Notamment, nos résultats suggèrent que la phosphorylation site-spécifique présente au centre exonucléolytique de Dis3 et au domaine hélical de Mtr4 controlerait leur activité. Nos données challenge l’idée que l’exosome est un complexe statique exécutant une activité constitutive et supporte un modèle où l’activité de l’exosome est affinée par des PTMs, ajoutant un niveau supplémentaire de régulation dans la dégradation d’ARN.
Mots clés : exosome à ARN, modification post-traductionnelle (PTMs), phosphorylation, régulation, expression génique, levure à fission, LC-MS/MS, Dis3, Mtr4, protéomique, phospho-mimetique
SUMMARY
The proteomic study of the Schizosaccharomyces pombe RNA exosome reveals regulatory potential through site-specific phosphorylation
By
Caroline Telekawa Biochemistry program
Master thesis presented to the Faculté de Médecine et des Sciences de la Santé for the obtention of a degree of Master of Science (M.Sc.) in Biochemistry, Faculté de Médecine et des Sciences de la Santé, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J1H
5N4
The RNA exosome is a conserved multi-subunit complex essential for processing and degradation of several types of RNAs. Although many of the functions of the RNA exosome are well established, whether the activity of this complex is regulated remains unclear. Here we performed a proteomic analysis of the RNA exosome complex purified from Schizosaccharomyces pombe and identified 39 post-translational modifications (PTMs), including phosphorylation, methylation, and acetylation sites. Interestingly, most of the modifications were identified in Dis3, a catalytic subunit of the RNA exosome, as well as in the exosome-associated RNA helicase, Mtr4. Functional analysis of selected PTM sites using modification-deficient and -mimetic versions of exosome subunits revealed substitutions that affected cell growth and exosome functions. Notably, our results suggest that site-specific phosphorylation in the catalytic center of Dis3 and in the helical bundle domain of Mtr4 control their activity. Our findings argue against a view in which the exosome is a static complex with constitutive activity but support a model in which modifications fine-tune exosome activity and add a layer of regulation to RNA degradation.
Key words : RNA exosome, post-translational modification (PTMs), regulation, gene expression, fission yeast, LC-MS/MS, Dis3, Mtr4, proteomics, phospho-mimetics
TABLE DES MATIÈRES
Remerciements... 1
Introduction... 2
1. Travailler avec Schizosaccharomyces pombe... 2
1.1. La levure à fission comme organisme modèle... 2
1.2. Promoteur répressible « no message in thiamine 1 » Pnmt1... 3
1.3. Marqueurs ade6 et Nat... 5
1.4. Étiquette moléculaire « TAP »... 5
2. L’expression génique... 8
3. L’exosome à ARN... 8
3.1. La structure de l’exosome à ARN eucaryote... 8
3.2. Conservation du complexe de l’exosome à travers les phyla... 10
3.3. Dis3...10
3.4. Rrp6... 11
3.5. Voies d’engagement de substrats... 12
4. Cofacteurs nucléaires de l’exosome... 14
4.1. Complexe TRAMP... 14
4.2. Complexe MTREC... 15
4.3. NEXT-CBC et PAXT-CBC... 16
4.4. Rrp47 et Mpp6... 17
4.5. Complexe NSS... 17
5.1. Complexe SKI... 18
5.2. Protéines liants les éléments AU-riches... 19
6. Implication de l’exosome à ARN dans la biogénèse des ribosomes... 21
7. Maladies associées à des mutations des protéines de l’exosome à ARN... 24
8. Protéomique... 26
8.1. La protéomique comme champ d’étude... 26
8.2. Spectrométrie de masse (MS)... 27
8.2.1. Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem... 27
8.2.2. Applications de la spectrométrie de masse... 28
8.3. Modifications post-traductionnelles (PTMs)... 29
8.3.1. Phosphorylation... 29
8.3.2. Méthylation... 31
8.3.3. Acétylation... 32
8.3.4. Ubiquitylation... 34
8.4. Étude des modifications post-traductionnelles par spectrométrie de masse... 36
9. Problématique, hypothèse et objectifs de recherche... Résultats... 39
Article 1 :Profiling of post-translational modifications of the RNA exosome reveals regulation by phosphorylation... 39
Résumé... 41
Abstract... 42
Introduction... 43
Results... 46
Discussion... 68
Materials and Methods... 73
Supplementary tables... 78
Acknowledgements... 107
References... 107
Discussion... 113
Conclusion et perspectives... 124
Liste des références... 126
LISTE DES FIGURES
Introduction
Figure 1. Système de déplétion utilisant le promoteur Pnmt1 et la thiamine... 3
Figure 2. Méthode de purification en tandem utilisant une double étiquette TAP... 6
Figure 3. Architecture de l’exosome à ARN eucaryote... 9
Figure 4. Voies d’engagement des substrats d’ARN au complexe de l’exosome... 12
Figure 5. Interactome de l’exosome à ARN eucaryote et ses fonctions au sein de la cellule... 19
Figure 6. Schéma de la maturation des pré-ARN ribosomaux chez les levures... 22
Figure 7. Modifications post-traductionnelles des chaînes latérales d’acides aminés par l’addition covalente de groupement biologiques... 36
Article 1 Figure 1. Affinity purification of the S. pombe RNA exosome complex... 47
Figure 2. Repertoire of post-translational modifications (PTMs) identified on subunits of the fission yeast RNA exosome and Mtr4... 50
Figure 3. Functional characterization of Dis3, Mtr4 and Rrp6 variants with substitutions at selected modified residues... 56
Figure 4. Phospho-mimetic versions of Dis3 and Mtr4 result in defective 5.8S rRNA synthesis... 59
Figure 5. The presence of a negative charge that mimic the phosphorylated state of Ser-809 and Tyr-814 of Dis3 inhibits its catalytic activity... 64
Figure 6. Ser-809 and Tyr-814 of S. pombe Dis3 are evolutionarily conserved residues located near the exosome exonucleolytic center... 66
Figure 7. Three-dimensional representation of the localization of identified PTMs in this study... 51
Supplementary Figure 1. Impaired 5.8S rRNA production in the Mtr4 double T1061D/S1067D phospho-mimetic mutant... 61
Supplementary Figure 2. Degradation of 3’-phosphate AU-rich RNA using affinity purified exosome complex... 65
Supplementary Figure 3. Thr1061 and Ser-1067 of S. pombe Mtr4 are evolutionarily conserved residues located near the ratchet helix of the helical bundle domain... 70
LISTE DES TABLEAUX
Introduction
Tableau 1. Mutations répertoriées des composantes de l’exosome d’ARN causant des maladies chez l’humain... 25
Article 1
Table 1. Summary of PTM sites identified in S. pombe RNA exosome subunits and Mtr4 helicase... 53 Supplementary Table 1. List of proteins identified in Dis3-TAP purification with a minimum of 2 unique peptides in at least two independent biological replicates... 78 Supplementary Table 2. List of proteins identified in Rrp4-TAP purification with a
minimum of 2 unique peptides in at least two independent biological replicates... 93 Supplementary Table 3. List of S. pombe strains and DNA constructs used in this
LISTE DES ABRÉVIATIONS
3’-ETS 3’ external transcribed spacer ou espaceur externe transcrit en 3’ 5’-ETS 5’ external transcribed spacer ou espaceur externe transcrit en 5’
A ou Ala Alanine
ADE Marqueur adénine
ADN Acide désoxyribonucléique
ADP Adénosine diphosphate
Amp Ampiciline
ARE(s) AU-rich element(s) ou élément(s) AU-riche(s) ARN(s) Acide ribonucléique(s)
ARNe ARN enhancer ou ARN exhausteur ARNi Interférence à l’ARN
ARNm ARN messager
ARNPI/II/III ARN ploymérase I/II/III
ARNr ARN ribosomal
ARNt ARN de transfert
ATP Adénosine triphosphate
AUBP AU-rich binding proteins ou protéines liants les éléments AU-riches CBC Cap-binding complex ou complexe liant la coiffe
CBP Calmodulin binding peptide ou peptide liant la calmoduline
CoA Coenzyme A
CUT(s) Cryptic unstable transcript(s) ou transcrit instable cryptique D ou Asp Acide aspartique
D. melanogaster Drosophila melanogaster E. coli Escherichia coli
H. sapiens Homo sapiens
HRDC Domaine Helicase et RNase D C-terminal
ITS1 Internal transcribed spacer 1 ou espaceur interne transcrit 1 ITS2 Internal transcribed spacer 2 ou espaceur interne transcrit 2
K ou Lys Lysine
Kan Kanamycine
KH K Homology ou Homologie K
LC-MS/MS Liquid chromatography couple to tandem mass spectrometry ou chromatographie liquide couplée à de la spectrométrie de masse en tandem
M. musculus Mus musculus
MS Mass spectrometry ou spectrométrie de masse MTREC Mtl1-Red1 core ou corps Mtl1-Red1
Nat Nourseothricine N-acétyl transférase
NEXT Nuclear exosome targeting ou ciblage à l’exosome nucléaire NGD No-go decay ou dégradation no-go
NMD Nonsens mediated decay ou dégradation non-sense
NNS Nrd1-Nab3-Sen1
NSD Non-stop decay ou dégradation sans stop
PAXT PolyA tail exosome targeting ou ciblage de l’exosome aux queues poly-A
PH Pleckstrin Homology ou Homologie Pleckstrin Pnmt1 Promoteur no message in thiamine 1
PNPase Polynucleotide phosphorylase PO4-2 Groupement phosphate
Poly-A Polyadénosine ou polyadénylation
ProA Protéine A
PROMPT(s) Promoter upstream transcript(s) ou transcrit(s) en amont du promoteur
PTM(s) Post-translational modification(s) ou modification(s) post-traductionnelle(s)
qPCR Quantitative polymerase chain reaction ou réaction de polymérisation en chaîne quantitative
R ou Arg Arginine
RNase Ribonucléase
Rrp Ribosomal RNA processing protein ou protéine de traitement de l’ARN ribosomal
RT Reverse transcription ou transcription inverse
S ou Ser Sérine
S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae S. pombe Schizosaccharomyces pombe
SKI Super Killer
snARN Petit ARN nucléaire snoARN Petit ARN nucléolaire
T ou Thr Thréonine
TAP Tandem affinity purification ou purification par affinité en tandem TAP-tag Double étiquette moléculaire composé d’une partie ProA et CBP TEV Tobacco etch virus ou virus de la mosaïque du tabac
TRAMP Mtr4 polyadenylation ou polyadénylation médiée par Trf-Air-Mtr4
Tub Tubuline
WT Wild Type ou type sauvage
À mes parents pour leur soutien inconditionnel, À mon frère pour sa complicité, Et à mes amies et amis pour leur folie!
Do not go gentle into that good night, Rage, rage against the dying of the light. -Dylan Thomas
REMERCIEMENTS
Pour reprendre un proverbe africain, ça prend un village pour diplômer un étudiant gradué! J’aimerais d’emblée remercier mon directeur de recherche, le professeur François Bachand pour l’encadrement et l’opportunité de travailler sous sa tutelle. Merci Frank pour la confiance et pour le beau projet. Merci aussi pour ton respect et ta franchise. J’ai adoré mon passage au Labo Bachand! Merci également à mon co-directeur, le professeur François-Michel Boisvert sans qui la spectrométrie de masse m’aurait sans doute donnée beaucoup plus de fil à retorde. Merci FMB pour ton implication dans ce beau projet. Merci aux membres de mon jury de mémoire, les professeurs Xavier Roucou et Raymund Wellinger pour avoir accepté de sacrifier un peu de leur temps pour de la correction. Je remercie le Pr. Roucou d’avoir également siéger sur mon comité d’encadrement à titre de mentor. Je tiens également à souligner le bonheur que j’ai eu à travailler au sein de l’équipe du Pr. Bachand. Danny Bergeron et Marc Larochelle, vous êtes deux assistants de recherche en or! Anne-Marie Landry-Voyer et Kiersten Dionne, merci d’avoir étayé mon quotidien au cours des deux dernières années. J’ai beaucoup de chance d’avoir côtoyé de si brillantes et bonnes personnes! Merci à l’ensemble du département de Biochimie ainsi que les autres membres du PRAC qui m’ont apporté de l’aide à un moment ou à un autre lors de ma maîtrise. L’entraide en science est certainement l’une des meilleures choses qui soit! Je me dois de remercier également mes parents, Martine Desjardins et Richard Telekawa, pour leur appui infaillible durant toutes ces années d’études post-secondaires. Les réserves de sauce à spaghetti m’ont sauvées plus d’une fois lors de périodes de mi- ou de fin de session. Finalement, je voudrais maintenant lancer ma gratitude et mon amour à mes ami(e)s Sherbrookoises et Sherbrookois ainsi que Gatinoises et Gatinois. Vous avez rempli ma vie de spontanéité, de folie, de danse enflammée, de moments comiques, de jeux loufoques, de 5@8 endiablés, de roadtrips improvisés, de photos et vidéos compromettantes mais surtout de rires et d’amour. Un merci particulier aux résidents du 1339 pour votre support et votre compagnie au quotidien. Vous êtes mes meilleur(e)s!
INTRODUCTION
1. Travailler avec Schizosaccharomyces pombe 1.1. La levure à fission comme organisme modèle
Les levures sont depuis longtemps exploitées comme organismes expérimentaux de choix chez les biologistes (Lock et al., 2018; Mohammadi et al., 2015; Lippuner, et al., 2014). Elles ont la particularité de présenter tous les avantages d’un organisme unicellulaire comme Escherichia coli (E. coli) mais à la différence de cet organisme procaryote, les levures sont des eucaryotes qui permettent l’étude de mécanismes conservés entre les levures et les mammifères supérieurs, comme l’humain (Cooper, 2000). Entre autres, les levures ont été utilisées dans diverses études portant sur la formation d’organelles et du cytosquelette, ainsi que sur des mécanismes tels que la transcription, la traduction et la réplication d’ADN, qui divergent largement des mécanismes similaires procaryotes (Sabatinos et Forsburg, 2010).
Les levures présentent d’autres caractéristiques qui les distingue davantage de modèles procaryotes. Notamment, elles peuvent être maintenues en haploïdie ou en diploïdie via le contrôle des conditions de croissances (Hoffman et al., 2015). De plus, les levures possèdent des génomes facilement modifiables par recombinaison homologue et permettent le maintien d’un ou plusieurs plasmides indépendants. Finalement, à la différence d’organismes eucaryotes pluricellulaires, elles ont l’avantage de pouvoir être répliquées rapidement et récoltées en grandes quantités. Elles permettent donc l’échantillonnage d’un large éventail d’individus pour une seule et même expérience (Hoffman et al., 2015; Sabatinos et Forsburg, 2010).
La levure à fission Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) est un ascomycète qui a un style de vie unicellulaire plutôt que mycéliale à l’instar d’autre champignons macroscopiques et a la capacité de fermenter des sucres comme la levure à bourgeonnement Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). En revanche, divers facteurs distinguent les deux levures. S. pombe voit son matériel génétique distribué sur trois gros chromosomes et possèdent de larges structures centromériques, analogue à celles des mammifères (Hoffman et al., 2015).
De plus, elle présente un plus faible taux de duplication de gènes et une présence marquée d’introns dans son génome comparativement à la levure à bourgeonnement (Jeffares et al., 2015; Mojardín et al., 2013; Wood et al., 2002). S. pombe possède également des gènes homologues aux humains qui ne sont pas présent chez S. cerevisiae, ce qui fait d’elle un modèle expérimental présentant certains attributs intéressants pour les chercheurs (Aravind et al., 2000). De plus, elle possède toutes les composantes du mécanisme d’interférence à l’ARN (ARNi) qui sont absents chez S. cerevisiae mais présents chez les animaux. En somme, ces caractéristiques font de S. pombe un organisme modèle de prédilection dans de multitudes sphères de recherches.
La communauté travaillant avec S. pombe comme modèle de prédilection est moins importante en taille que celle de la levure à bourgeonnement mais elle est tout aussi diversifiée. Plusieurs outils recensent les recherches effectuées chez S. pombe, notamment la base de données PomBase (Wood et al., 2012), qui contient les données de génomique, de protéomique, de structure et de phénotypes répertoriées et annotées par la communauté, ainsi que le site PombeNet établi par le laboratoire du professeur Forsburg de l’Université de Californie du Sud qui renferme une panoplie de ressources utiles pour travailler avec S. pombe.
1.2. Promoteur répressible « no message in thiamine 1 » Pnmt1
Comme mentionné précédemment, la levure à fission possède un génome aisément manipulable de quelque manière que ce soit par l’expérimentateur. Cependant, il s’avère que certaines modifications soient léthales à la survie cellulaire. C’est le cas notamment lors de délétions de gènes dit essentiels à la levure qui sont nécessaires à sa vitalité. Pour contourner cet obstacle, une des stratégies employées chez la levure à fission est de substituer le promoteur endogène du gène cible par un promoteur répressible. Ce promoteur, à condition d’ajouter une substance exogène qui lui est spécifique, coupe la transcription du gène cible et permettra alors une certaine croissance des levures sans l’expression de ce gène cible. Plutôt que de générer une souche de délétion (retrait d’un
gène), l’expérimentateur génère une souche de déplétion conditionnelle permettant la croissance cellulaire. Cette stratégie a été employée lors de ces travaux en utilisant le promoteur répressible Pnmt1, qui en présence de thiamine (ou vitamine B1), empêche la transcription de son gène cible (Figure 1). Il suffit de faire croître ces différentes souches de levures, possédant un promoteur répressible en présence de thiamine, de douze à quinze heures afin de dépléter le gène d’intérêt (Van Driessche et al., 2005; Bähler et al., 1998; Maundrell, 1990).
Figure 1. Système de déplétion utilisant le promoteur répressible Pnmt1 et la thiamine Le gène dis3 codant pour l’expression de la protéine Dis3 voit son promoteur endogène (Pdis3) remplacé (ADNg) par la promoteur répressible Pnmt1. En condition sans thiamine (gauche), le gène dis3 est transcrit en ARNm pour par la suite pouvoir est traduit en protéine Dis3 fonctionnelle. En condition avec thiamine (droite), la transcription de la copie endogène du gène dis3 est inhibée par la présence de thiamine dans le milieu. Sans expression de l’ARNm de Dis3, la protéine n’est alors pas produite. En supplémentant avec une copie sauvage du gène dis3 flanqué de ses région promotrice (Pdis3) et terminatrice (Tdis3) endogènes dans un autre locus comme le locus adénine (ade), il est alors possible de rétablir la cellule à son état sauvage.
1.3. Marqueurs ade6 et Nat
Les stratégies de sélection retrouvées chez la levure à fission utilisent à la fois des marqueurs auxotrophes et des marqueurs de résistances à certains antibiotiques. L’auxotrophie est l’incapacité de générer de manière endogène une substance biochimie. (Voet et al.,2016) Certains marqueurs de ce genre correspondent à des gènes qui complèteront une voie de synthèse pour cette substance. Un marqueur auxotrophe particulièrement utilisé dans la communauté est ade6, un marqueur restaurant la capacité de synthèse de l’acide aminé adénine. Cette sélection se distingue par l’accumulation d’un produit rouge-rose de la voie de biosynthèse de l’adénine en milieu pauvre ou dénué en adénine chez les cellules n’ayant pas restauré l’allèle ade- (Beaudoin et Labbé, 2006). Suite à une transformation visant à reconstituer l’allèle ade- avec un vecteur s’intégrant dans le génome, les colonies roses seront considérées négatives alors que les colonies blanches seront considérées comme positives lorsque mise sur un milieu sélectif.
La nourseothricine par l’intégration du marqueur Nat est un autre marqueur communément utilisé lors d’études avec S. pombe est la résistance à (Kochupurakkal et Iglehart, 2013). Ce gène code pour la nourseothricine N-acétyl transférase qui inactive l’antibiotique en acétylant le groupe amine bêta de la lysine bêta. De plus, la nourseothricine et la sélection au marqueur Nat peuvent être utilisés autant sur des milieux riches que sur des milieux minimaux (Van Driessche et al., 2005). L’avantage d’avoir dans son arsenal une grande variété de marqueur de sélection est la possibilité d’intégrer plusieurs attributs chez une souche de manière séquentielle. Il est seulement requis d’utiliser des marqueurs de sélection distincts afin de faciliter l’isolement de clones pertinents.
1.4. Étiquette moléculaire « TAP »
La purification de protéine a été révolutionnée par le développement d’étiquettes moléculaires ou tag qui permettent l’isolement spécifique d’une protéine d’intérêt arborant ladite étiquette. De plus, encore aujourd’hui, plusieurs innovations des techniques
de purification par affinité sont mises de l’avant afin d’améliorer la qualité des purifications. L’une de ces stratégies mise de l’avant est celle de la purification par affinité en tandem ou TAP. Brièvement, une protéine d’intérêt se voit apposé un tag moléculaire en N- ou en C-terminal comprenant trois parties; un peptide pouvant lier la calmoduline (CBP), une séquence de reconnaissance de la protéase du virus de la mosaïque du tabac (protéase TEV) et une protéine A (ProA) (Figure 2A) (Li, 2010). Une première étape de purification utilisera la partie ProA du tag afin de récolter la protéine d’intérêt. La première élution sera effectuée par la coupure de la séquence TEV et une seconde étape de purification sera effectuée utilisant la partie CBP de la double étiquette (Figure 2A). La seconde élution utilisera de l’EDTA pour chélater les ions de calcium (Ca+2) essentiel à la liaison
CBP-calmoduline. Certaines variations de cette stratégie utilisent différentes combinaisons de double étiquettes moléculaires selon les besoins des expérimentateurs et certaines autres ne procèdent pas à une première élution par coupure protéolytique. Néanmoins, l’efficacité et la spécificité de cette stratégie de purification sont indéniables et celle-ci a été largement utilisée lors de ces travaux de maîtrise dans la levure S. pombe (Gould et al., 2004).
Figure 2. Méthode de purification en tandem utilisant une double étiquette TAP
(A) La double étiquette TAP est composée de trois sections; une portion protéine A (ProA), un peptide liant la calmoduline (CBP) et une séquence de clivage pouvant être reconnue par la protéase du virus de la mosaïque du tabac (TEV). La première étape de purification consiste à effectuer une capture d’affinité par la partie ProA de l’étiquette TAP à l’aide de billes recouvertes d’anticorps anti-ProA. L’élution des protéines capturées suite à cette première étape est accomplie par la coupure protéolytique de la séquence TEV par la protéase TEV. L’éluat est par la suite soumis à une seconde capture par affinité mais avec une résine calmoduline qui a la capacité de lier la partie CBP du TAP tag. La liaison CBP-calmoduline nécessite une la présence d’ions calcium (Ca+2). (B) Suivant la double
purification, les protéines présente sur la résine calmoduline subiront une digestion enzymatique par la trypsine ou la chymotrypsine. Les peptides résultants seront injecter en LC-MS/MS pour analyse.
2. L’expression génique
La transcription d’ARN requiert divers joueurs afin de pouvoir être proprement produits à partir de l’information contenue dans le matériel génétique, pour ensuite être épissés adéquatement, pour finalement être exportés du noyau. Il est nécessaire par la suite de procéder à la traduction sans erreur des transcrits codants et finalement, à la dégradation de ceux-ci au bon moment (Bentley, 2014). Toutes ces étapes comportent des mécanismes distincts de modulation qui bien qu’à l’apparence indépendante, s’avère être intrinsèquement liés dans la production efficace de transcrits fonctionnels codants et non codants (Komoli et Silver, 2008). Ainsi, le délicat équilibre entre la synthèse et la dégradation d’entités biochimiques fonctionnelles est un élément clef d’une expression génique optimale. Plusieurs mécanismes de surveillance nucléaire et de contrôle cytoplasmique sont donc mis en place afin de contrôler le maintien des niveaux adéquats de transcrits codants et non codants.
3. L’exosome à ARN
Un joueur majeur de la surveillance transcriptionnelle et de la régulation génique est le complexe de l’exosome à ARN. Ce complexe multiprotéique est reconnu pour ses capacités à catalyser les évènements de dégradation d’ARN ainsi que de maturation de ceux-ci.
3.1. La structure de l’exosome à ARN eucaryote
Le corps de l’exosome à ARN est composé de neuf sous-unités ordonnées en deux anneaux et confère une forme de baril au complexe (Liu et al., 2016; Kowalinski et al., 2016; Makino et al., 2013a). Le premier est hexamèrique et comprend trois hétérodimères de protéines à domaines RNAse PH-like Rrp41-Rrp45, Rrp42-Mtr3 et Rrp43-Rrp46 (Kilchert et al., 2016). Juxtaposé sur ces six sous-unités se trouve la couronne (ou cap) de l’exosome formés des trois protéines à domaine de liaison à l’ARN S1/KH Csl4, Rrp4 et Rrp40 (Makino et al., 2013a; Falk et al., 2017). Ce complexe est catalytiquement inactif jusqu’à l’addition d’une ou de
deux ribonucléases soit Rrp6 et Dis3. Rrp6 se fixe par son domaine C-terminal, nommé le lasso, à la couronne via des interactions avec la sous-unité Csl4 ainsi qu’avec l’anneau hexamèrique (Wasmuth et al., 2014). Dis3 s’ancre au bas du corps de l’exosome via des interactions avec l’hétérodimère Rrp41-Rrp45 (Wasmuth et al., 2017; Zinder et al., 2016; Makino et al., 2015) (Figure 3).
Figure 3. Architecture de l’exosome à ARN eucaryote
(A) Représentation de l’agencement des sous-unités composant le corps du complexe de l’exosome. En vert, les protéines à domaines RNase PH-like (Rrp41, Rrp42, Rrp43, Rrp45, Rrp46 et Mtr3) forment un anneau hexamérique qui est surplombé des trois protéines à domaines S1 (Csl4, Rrp4 et Rrp40), en jaune. (B) L’agencement des onze composantes de l’exosome en complexe. Au bas au corps de l’exosome est la sous-unité Dis3 en bleue ancrée aux sous-unités Rrp41 et Rrp45. La sous-unité Rrp6 en rouge se retrouve au haut du complexe attaché au complexe par des interactions avec Csl4. Les représentations en A et
en B ne sont pas à l’échelle mais montrent l’agencement spatial répertorié des cristaux résolus du complexe de l’exosome. (C) La structure résolue du complexe de l’exosome eucaryote de S. cerevisiae liant un substrat d’ARN en orange est représenté en ruban. La rotation de 180° montre le domaine C-terminal (lasso) de Rrp6 qui s’enroule sur les sous-unités Rrp46 et Mtr3. Le code de couleur utilisé en C reprend celui utilisé en A et en B. Les images en C ont été obtenues à partir de la structure résolue de l’exosome à ARN de S. cerevisiae #5K36 (Zinder et al., 2016) de la Protein Data Bank (PDB) avec le programme PyMOL 2.0 (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.0 Schrödinger, LLC.)
3.2. Conservation du complexe de l’exosome à travers les phyla
L’exosome à ARN eucaryote possède des homologues distants chez les bactéries et les archéobactéries. La RNAse PH bactérienne, le PNPase bactérienne ainsi que l’exosome archéen sont des versions primitives qui possèdent une forte ressemblance au corps inactif du complexe eucaryote (Januszyk et Lima, 2014; Lykke-Andersen et al., 2009). Ce qui les distingue de leur orthologues eucaryotes est l’absence de sous-unité supplémentaire à leurs extrémités. La RNAse PH et la PNPase bactériennes exercent intrinsèquement des activités phosphorolytique et hydrolytique sans nécessiter de sous-unités catalytiques supplémentaires comme chez les eucaryotes (Büttner et al., 2005; Lorentzen et al., 2007). Des études structurales et de conservations ont démontrées l’introduction de mutations survenues à travers l’évolution qui ont mené à la perte de résidus essentiels à l’activité phosphorylase des sous-unités à domaine PH-like du corps exosomal (Januszyk et Lima, 2014).
3.3. Dis3
Dis3 est une ribonucléase de la famille des RNase 2 qui est associé à l’exosome à ARN. Elle possède six domaines distincts; un motif trois cystéines (CR3), un PilT-N-terminus (PIN), deux domaines Cold-shock (CSD), un domaine de liaison à l’ARN (RNB) ainsi qu’un domaine S1 de liaison à l’ARN (Robinson et al., 2015). Localisé dans le domaine RNB, Dis3 possède une activité 3’->5’ exoribonucléase processive (qui reste liée à son substrat jusqu’à l’hydrolyse complète de celui-ci) permettant la dégradation ou la maturation de substrats
d’ARN. Une seconde activité endoribonucléase localisée au domaine PIN cette fois-ci, peut également être catalysée par cette sous-unité (Schaeffer et al., 2009; Assenholt et al., 2008; Lebreton et al., 2008). L’importance in vivo de la fonction endonucléase de Dis3 reste cependant nébuleuse.
La sous unité Dis3 adopte deux types de conformation au sein de l’exosome; une conformation ouverte permettant le recrutement direct de substrat (voir la section 3.5 et la Figure 3B) et une conformation plus fermée qui est nécessaire lorsque les substrats d’ARN sont engagés dans la voie centrale de l’exosome (Figure 3D) (Han et van Hoof, 2016; Liu et al., 2014; Makino et al., 2013b. Cette dualité de la sous-unité Dis3 au sein de l’exosome aurait comme particularité la reconnaissance de différentes classes d’ARNs. Chez l’humain, la protéine possède deux autres homologues soit les protéines DIS3-like exonuclease 1 et 2 (DIS3L et DIS3L2) . Il semble que la protéine DIS3L2 ne soit pas associée au complexe de l’exosome d’ARN et exerce ses fonctions de manière indépendante (Malecki et al., 2013; Lubas et al., 2013; Pashler et al., 2016; Pirouz et al., 2016). DIS3L est cependant un partenaire exclusivement cytoplasmique de l’exosome à ARN humain et peut à cet égard, servir d’exonucléase dans les différentes fonctions du complexe (Staals et al., 2010). À la différence de DIS3, DIS3L ne détient pas d’activité endonucléolytique (Tomecki et al., 2010). Les mécanismes qui favoriseront l’agencement de DIS3L plutôt que DIS3 à l’exosome cytoplasmique humain demeurent nébuleux.
3.4. Rrp6
Une seconde protéine de la famille des nucléases DEDD (Ibrahim et al., 2008) contribue également à l’activité catalytique du complexe de l’exosome. Rrp6 est associée au corps de l’exosome via des interactions avec les sous-unités Csl4, Mtr3 et Rrp43. Son domaine C-terminal, communément appeler le « lasso », est peu structuré et adopte une conformation qui enlace le corps de l’exosome (Makino et al., 2013b; Wasmuth et al., 2014). Son domaine PMC2NT lui sert de plateforme de recrutement de cofacteurs comme Rrp47 (Makino et al., 2015; Stead et al., 2007) alors que son domaine HRDC rempli un rôle clef dans le
recrutement de substrats à traiter (Midtgaard et al., 2006). En N-terminal, Rrp6 possède un centre exoribonucléase 3’->5’ dit distributif (qui relâche son substrat après clivage) (Thomas et Oliviera, 1977) (Zuo et Deutscher, 2001; Burkard et Butler, 2000) qui permet la dégradation/maturation des substrats qui lui sont dirigé. Rrp6 est une composante de l’exosome eucaryote strictement nucléaire, où elle est impliquée notamment dans la maturation de l’ARNr 5.8S. Rrp6 est la seule sous-unité du complexe de l’exosome qui n’est pas essentielle à la viabilité des cellules, mais sa délétion cause un ralentissement important de la croissance cellulaire chez les levures (Deutschbauer et al., 2010; Lemay et al.,2010).
3.5. Voies d’engagement de substrats
Comme mentionné précédemment, l’exosome possède deux sous unités catalytiques responsables des fonctions catalytiques du complexe. L’étude structurale de l’architecture particulière de l’exosome a permis l’observation de diverses voies d’engagement que peuvent emprunter les ARNs dédiés à la dégradation ou au traitement par l’exosome (Figure 4). Deux de ces voies d’engagement sont les voies dites « directes » (Figure 4A et 4B). Dans ce contexte, les ARNs sont recrutés directement à l’une ou l’autre des nucléases aux extrémités du complexe (Delano-Forino et al., 2017a; Delano-Forino et al., 2017b; Han et van Hoof, 2016; Makino et al., 2013b; Makino et al., 2015; Liu et al., 2014). La troisième voie d’engagement recrute une molécule d’ARN via la couronne du corps de l’exosome et envoie celle-ci à Rrp6 (Figure 4C) (Makino et al., 2013b; Makino et al., 2015; Wasmuth et al., 2014; Kilchert et al., 2016). Les sous-unités composant le second anneau du corps de l’exosome permettent le passage d’ARN simple brin à travers des pores présents entre elles et l’anneau hexamérique de l’exosome. Le mécanisme sous-jacent qui par la suite dirige le substrat vers Rrp6 reste encore méconnu.
La quatrième voie d’engagement permet le passage d’une molécule d’ARN à partir de l’extrémité supérieure de l’exosome jusqu’à la sous-unité Dis3 (Figure 4D). L’ARN parcours la longueur entière du corps de l’exosome afin de se rendre au centre exonucléolytique de Dis3 où il sera dégradé ou maturé (Han et van Hoof, 2016; Liu et al., 2014; Makino et al.,
2013b; Makino et al., 2015; Drazkowska et al., 2013; Malet et al., 2010; Bonneau et al., 2009). Cette dernière voie de passage requiert des substrats de longueur minimale de 31nt-33nt.
Figure 4. Voies d’engagement des substrats d’ARN au complexe de l’exosome
(A) et (B) Voie d’engagement directe aux sous-unités Rrp6 et Dis3. Dans ces situations, le substrat est recruté par un cofacteur ou par le corps de l’exosome mais n’entrera pas par l’un des pores de la couronne ou par le pore central du complexe. Il sera dirigé vers la sous-unité Rrp6 (A) ou la sous-sous-unité Dis3 (B). (C) Voie d’engagement de substrat passant par la couronne du corps de l’exosome pour le diriger vers Rrp6. La couronne possède des pores entre ses composantes permettant le passage d’ARN simple brin. Le mécanisme qui permet la direction du substrat vers Rrp6 est méconnu. (D) Entrée du substrat par le haut du complexe de l’exosome. L’ARN traversera l’entièreté du corps de l’exosome afin de se rendre au site exonucléase de la sous-unité Dis3.
4. Cofacteurs nucléaires de l’exosome
La myriade de substrats pris en charge par l’exosome d’ARN soulève la question de spécificité de celui-ci. En effet, comment s’effectue la distinction entre les substrats dédiés à la dégradation versus les substrats nécessitant une maturation? Les deux dernières décennies ont permis l’identification de divers cofacteurs de l’exosome conservés à travers l’évolution qui serviraient d’adaptateurs spécifiques au recrutement de diverses classes de substrats ainsi qu’à dicter le destin de ceux-ci. La Figure 5 répertorie l’interactôme principal de l’exosome à ARN eucaryote.
4.1. Complexe TRAMP
Décrit en premier chez la levure à bourgeonnement S. cerevisiae, le complexe de polyadénylation Trf4/5-Air1/2-Mtr4 ou TRAMP représente un important cofacteur de l’exosome nucléaire. Il procède, entre autres, à l’ajout de queues poly-A sur une variété de substrats afin qu’ils soient dégradés par la machinerie enzymatique de l’exosome (Jia et al., 2012). La sous-unité Air1 et son homologue Air2 sont des protéines à doigt de zinc responsables de la liaison du complexe aux acides nucléiques de substrats d’ARN. La sous-unité Trf4 et son homologue Trf5 sont des poly-A polymérases chargées de l’ajout de queues poly-A en 3’ de substrats recrutés par la sous-unité Air1/2. Mtr4, la dernière constituante du complexe TRAMP, est une ARN hélicase de la famille des DExH qui permet la résolution 3’-5’ de structures secondaires des ARNs capturés (Jia et al., 2011) afin de permettre leur passage à l’exosome en plus de moduler également la longueur des queues poly-A ajoutées par Trf4/5 (Falk et al., 2014). Des études structurales ont octroyé à Mtr4 deux autres domaines fonctionnels supplémentaires. Le domaine « arche » de Mtr4 aurait une importance capitale lors de la maturation des ARNr (Jackson et al., 2010; Schuller et al., 2018) alors que le domaine « ratchet » serait essentiel dans les fonctions de déroulement de l’ARN au site actif de l’hélicase (Taylor et al., 2014). Reconnu d’abord pour son implication dans la surveillance des ARNt (Kadaba et al., 2004), le complexe TRAMP
s’est révélé polyvalent. Ces multiples fonctions permettent au complexe TRAMP de s’associer à l’exosome d’ARN, notamment pour effectuer la maturation d’ARN ribosomaux, pour la maturation des snARN et snoARN, ainsi que pour la dégradation des ARNs non codants de régions télomériques, des CUTs et des pré-ARN messagers.
Le complexe TRAMP possède des homologues de la levure à l’homme. Chez S. pombe, le complexe TRAMP présente quelques distinctions. Par exemple, c’est la sous-unité Cid14, un homologue de Trf4, qui remplace celle-ci dans le complexe et il n’existe qu’un seul homologue de la protéine à doigt de zinc Air1 chez la levure à fission (Keller et al., 2010). Chez S. cerevisiae, l’une des première fonctions découverte du complexe TRAMP s’associant à l’exosome est la surveillance de la synthèse adéquate d’ARNt de méthionine. En condition de stress cellulaire, la perte d’un groupement méthyl en position A58 de l’ARNtMet changerait drastiquement sa structure tertiaire le rendant anormal et donc
inefficace pour le recrutement lors d’évènements de traduction. Le complexe TRAMP procèdera donc à la polyadénylation de l’ARNt qui sera ensuite dégradé par l’exosome d’ARN (Kadaba et al., 2004).
4.2. Complexe MTREC
La levure à fission compte un important complexe de surveillance comportant plusieurs sous-modules distincts qui coopèrent avec l’exosome et le spliceosome. « Mtl1-Red1 core » ou MTREC a fait l’objet de plusieurs études en protéomique afin de déterminer sa composition. Mtr4-like 1 (Mtl1) est une hélicase à ARN homologue à Mtr4 du complexe TRAMP. Elle permet le déroulement des structures secondaires des ARNs recrutés par MTREC afin de pouvoir être engagé dans l’exosome. RNA elimination defective 1(Red1) quant à elle permet l’association de MTREC à l’exosome via sa liaison avec Rrp6. En plus des deux sous-unités centrales du complexe Mtl1 et Red1, quatre autres modules peuvent s’associer à MTREC sans nécessiter d’ARN. Red5-Pab2-Rmn1, Ars2-Cbc1-Cbc2, Iss10-Mmi1 ainsi que Pla1 permettent à MTREC de former un super complexe d’au plus onze sous-unités (Zhou et al., 2015).
MTREC avec son sous-module Iss10-Mmi1 est responsable de la modulation de l’expression génique de la levure à fission en phase végétative. Ensemble, ils permettent le recrutement de d’ARN méiotique ou meiARN afin qu’ils soient pris en charge par l’exosome nucléaire afin d’être dégradés (Egan et al., 2014). En plus de l’adressage des meiARN, MTREC permet également le recrutement de « cryptic unstable transcripts » ou CUTs qui sont des transcrits non codants de régions intergéniques (Lee et al., 2013). Les CUTs de S. pombe, possédants de longues queues polyA, sont rapidement pris en charge par des « polyA-binding proteins » ou PABPs comme Pab2 qui interagiront avec MTREC pour permettre la dégradation de ces-derniers par l’exosome. Mtl1 s’associe également à Nrl1 et Ctr1 afin d’interagir avec le spliceosome pour effectuer la surveillance de transcrits incorrectement épissés ou non épissés (Zhou et al., 2015). Ces transcrits étant considérés comme non fonctionnels seront adressés par l’exosome nucléaire afin d’être dégradés. L’exosome agit ainsi comme une entité responsable du contrôle de qualité de transcrits codants. MTREC associé à l’exosome possèdent un rôle similaire à celui du complexe NEXT associé à l’exosome chez l’humain.
4.3. NEXT-CBC et PAXT-CBC
Le complexe nuclear exosome targeting (NEXT) est un cofacteur de l’exosome, exclusivement nucléaire, présent chez l’humain. Composé des protéines hMTR4 (Mtr4), RBM7 (analogue à Trf4/5) et ZCCHC8 (analogue à Air1/2) (Lubas et al., 2011), le complexe NEXT participe à la surveillance de transcrits de la polymérase II, notamment en ce qui a trait à la dégradation médiée par l’exosome de CUTs ou de « Promoter upstream transcripts » (PROMPTs) (Tiedje et al., 2015). Il est également responsable de la terminaison et de la maturation des petits ARN nucléaires (snARN). Le complexe NEXT s’associe au cap-binding complexe (CBC) afin de remplir ses fonctions de surveillance de biogénèse d’ARN (Winczura et al., 2018). La terminaison prématurée de transcrits est ainsi possible par le complexe NEXT-CBC qui adressera ses substrats à l’exosome d’ARN
L’association de hMTR4 à ZFC3H1, une protéine à doigt de zinc, forme le cœur d’un autre cofacteur soit la connexion polyA tail exosome targeting (PAXT) (Meola et al., 2016). Le
recrutement de l’exosome est encore une fois effectué par la sous-unité hMTR4 mais à la différence du complexe NEXT, la connexion PAXT favorise le recrutement de substrats d’ARN qui sont longs et polyadénylés par le biais d’interactions avec le complexe CBC et la protéine PABPN1 (Meola et Jensen, 2017).
Bien que hMTR4 soit une partie intégrante des complexes NEXT et PAXT chez l’humain, les deux complexes sont mutuellement exclusifs (Meola et al., 2016) et ne sont pas recrutés simultanément à l’exosome d’ARN.
4.4. Rrp47 et Mpp6
Rrp47, considéré comme un partenaire ubiquitaire à l’exosome, ne possède pas d’activité enzymatique, mais sa liaison avec Rrp6 stabilise cette dernière au corps de l’exosome d’ARN (Makino et al., 2015; Stead et al., 2007). La capacité de Rrp47 à former avec Rrp6 une plateforme de recrutement du cofacteur Mtr4 est crucial (Schuch et al., 2014). Mpp6 vient se positionner sur la sous-unité Rrp40 de la couronne de l’exosome par le biais de fortes interactions avec deux résidus (R112 et F115 chez la levure à bourgeon). Mpp6 a pour fonction de faciliter l’échange de substrat d’ARN de Mtr4 vers l’exosome à ARN (Falk et al., 2017). Cette protéine facilite ainsi l’entrée de la molécule dans le haut du corps de l’exosome (Figure 4D) suite à la résolution de ses structures secondaires par l’hélicase Mtr4. Ensemble, Rrp47 et Mpp6 facilitent la coopération entre l’exosome (Exo11) et l’hélicase Mtr4 (Wasmuth et al., 2017).
4.5. Complexe NNS
Chez la levure à bourgeon, la terminaison de la plupart des transcrits non codant est effectuée de manière Nab3-Nrd1-Sen1-dépendante ou NNS-dépendante. Suite à la reconnaissance de motifs spécifiques sur l’ARN naissant par Nab3 et Nrd1, la relâche du transcrit de la polymérase est effectuée par l’action de l’hélicase Sen1. Nrd1 est également responsable de l’interaction entre le complexe NNS et le CTD de la polymérase via son
domaine CID (Tudek et al., 2014). Ce même domaine CID peut également interagir avec la sous-unité Trf4/5 du complexe TRAMP (section 4.1). Le complexe TRAMP permet ensuite le recrutement de l’exosome à ARN afin d’effectuer la maturation ou la dégradation de ces transcrits non-codants (Heo et al., 2013; Kuehner et al. 2011). Les mécanismes qui dicteront le choix entre la maturation et la dégradation de ces transcrits non-codants demeurent méconnus.
5. Cofacteurs cytoplasmiques de l’exosome
L’exosome à ARN est plus communément reconnu pour sa contribution nucléaire à l’homéostasie des différentes classes d’ARNs. Cependant, sa présence ubiquitaire dans la cellule lui attribut également d’importants rôles distincts dans le cytoplasme. À l’instar de l’exosome nucléaire, l’exosome cytoplasmique s’associe également avec une panoplie de cofacteurs afin de mener à bien ses activités. Bien que ces dernières soient moins variées que celles du noyau, les fonctions de l’exosome cytoplasmique demeurent cruciales.
5.1. Complexe SKI
Le complexe Super killer (SKI) fait office d’interacteur majeur à l’exosome au cytoplasme (Kowalinski et al., 2016; Zinder and Lima, 2017). Le complexe SKI est un hétérotétramère composé de quatre sous-unités; Ski2 qui est une hélicase de type DExH, Ski3 une large protéine d’échafaudage ainsi que de deux copies de la protéine Ski8 à domaines WD40 (Halbach et al., 2013). Une cinquième protéine, Ski7 (HBS1Lv3 chez l’humain), qui possède un domaine GTPase globulaire en C-terminal serait responsable de médier l’interaction entre l’exosome et SKI (Kowalinski et al., 2015; Araki et al., 2001). La délétion d’une sous-unité du complexe SKI chez la levure s’avère léthale lorsqu’accompagné d’une délétion de la machinerie de dégradation 5’-3’ d’ARNs. SKI médie l’adressage à l’exosome d’ARNm anormaux, notamment ceux contenant un codon stop prématuré (Nonsens Mediated Decay), ceux ne contenant pas de codon stop (Non-Stop Decay) ainsi que ceux causant
l’arrêt de ribosomes (No-Go Decay) (Łabno et al., 2016; Schmidt et al., 2016). L’association SKI/exosome s’ingère donc dans la surveillance des évènements de traduction efficace de la cellule. Qui plus est, suite au clivage endonucléolytique par le complexe RISC, l’ARN impliquée dans l’ARNi est pris en charge par l’exosome allié au complexe SKI (Orban et Izaurralde, 2005).
5.2. Protéines liants les éléments AU-riches
La surveillance cytoplasmique de l’exosome n’est cependant pas restreinte aux ARNm arborant des anomalies. En effet, la perte ou le raccourcissement de la queue polyA des ARNm, souvent causé par la vieillesse, amènera leur dégradation par l’exosome. Par ailleurs, l’exposition d’éléments riches en adénine et en uracil (éléments AU-riches ou AREs) présents en 3’ d’ARNm peuvent être liés par certaines protéines « AU-rich Binding Proteins » ou AUBPs (Chen et al., 2001). La liaison de ces protéines AUBPs tendent à diminuer la stabilité de ces ARNm et favoriseront le recrutement de l’exosome pour leur dégradation (Mukherjee et al., 2002). La régulation des niveaux d’ARNs cytoplasmiques dépend donc aussi de voies de dégradation 3’-5’.
Figure 5. Interactome de l’exosome à ARN eucaryote et ses fonctions au sein de la cellule Représentation des partenaires principaux d’interactions de l’exosome à ARN ainsi que leurs fonctions spécifiques. Le complexe TRAMP est composé de trois sous-unités; Mtr4, Air1 ou Air2 et Trf4 ou Trf5 (Cid14 chez S. pombe). La liaison de Mtr4 à l’exosome dans le noyau est médiée et stabilisée par les cofacteurs Rrp47 et Mpp6. Ensemble, l’exosome et TRAMP seront impliqués dans la maturation des ARNr (recrutement de l’exosome par la liaison de Mtr4 à UTP18 ou Nop53), la dégradation de pré-ARNm aberrants ainsi que dans la maturation d’ARNt, de snARN et de snoARN. Le complexe PAXT est formé des protéines Mtr4 et ZFC3H1. Celles-ci interagissent avec la protéine PABPN1 et le complexe CBC composé des protéines ARS2, ZC3H18, CBP20 et CBP80 pour le recrutement de leurs substrats La liaison PAXT-exosome chez l’humain sera impliquée majoritairement dans l’étape de terminaison de la transcription de longs ARN polyadénylés. Le cofacteur humain NEXT comprend les protéines Mtr4, ZCCHC8 et RMB7. Son interaction avec l’exosome permettra la dégradation d’ARNe en plus d’être impliqué dans la terminaison des snARN. NEXT-exosome sert également de complexe de contrôle de qualité des transcrits de la polymérase II. Au cytoplasme, la liaison entre le complexe SKI (Ski2, Ski3 et deux copies de Ski8) et l’exosome est médié par le cofacteur Ski7. Avec l’exosome, le complexe SKI est impliqué dans la surveillance de la traduction et permet la dégradation d’ARNm aberrants. Il sert également au recrutement de l’ARN relâcher à la suite du clivage par le complexe RISC dans la machinerie de l’interférence à l’ARN. Le complexe Nab3-Nrd1-Sen1 ou NNS a
été caractérisé chez la levure à bourgeonnement comme partenaire d’interaction de l’exosome d’ARN nucléaire impliqué dans la dégradation et la terminaison des petits ARN nucléolaires (snoARN). Chez S. pombe, l’adressage d’ARNs comportant des défauts d’épissage est effectué par le complexe Mtl1-Nrl1-Ctr1 qui permettra leur envoi à l’exosome pour dégradation. À eux deux, ils seraient responsables de la surveillance de l’épissage au noyau. Le complexe multi-module MTREC de la levure à fission est composé de Red1-Mtl1/Pab2-Rmn1-Red5/Cbc1-Cbc2-Ars2/Iss10-Mmi1/Pla1. La liaison de MTREC à l’exosome permet l’adressage des ARNs méiotiques en phase haploïde et des cryptic unstable transcripts (CUTs) pour la dégradation par l’exosome. L’interaction de l’exosome à des protéines liants des éléments AU-riches (AUBP) permet la surveillance d’ARNm « vieillissants » au cytoplasme ainsi que leur dégradation rapide par l’exosome. Entre parenthèse est indiqué l’espèce où le cofacteur est le mieux caractérisé. Hs = H. sapien (humain); Sc = S. cerevisiae; Sp = S. pombe; Eu = Conservé à travers les eucaryotes.
6. Implication de l’exosome à ARN dans la biogénèse des ribosomes
Les ribosomes sont les entités fonctionnelles responsable de la lecture des ARNm et de la formation de liens peptidiques entre deux acides aminés. Les ribosomes sont composés de deux sous-unités; la petite sous-unité ayant un coefficient de sédimentation de 40S et la grande sous-unité qui possède un coefficient de sédimentation de 60S. La petite sous-unité compte 32 protéines en plus de comporter un seul long ARN non codant, nommé ARN ribosomal (ARNr), le 18S. La grande sous-unité est composée de 47 protéines et compte trois ARNr, le 25S, le 5.8S et le 5S (Kressler et al., 2017; Thomson et al., 2013). L’assemblage des sous-unités ainsi que la maturation des ARNr constituent des processus essentiels et énergivores de la cellule. Les ARNr sont transcrits par la polymérase II (sauf l’ARNr 5S qui est transcrit par l’ARN polymérase I) en longs pré-ARNr polycistroniques qui subissent une maturation co-transcriptionnelle et post-transcriptionnelle nécessitant plusieurs coupures endonucléolytiques ainsi que certaines maturations exonucléolytiques. Dans ce contexte, l’exosome à ARN est recruté aux particules pré-ribosomales (Woolford et Barsega, 2013). Suite aux premières étapes de maturation des ARNr (Figure 6, étapes bleues), le pré-ARNr 27S-S/L est pris en charge par le complexe Las1-Grc3-Rai1-Rat1 qui procède à la coupure endonucléolytique au site C2 (Gasse et al., 2015). La portion 26S résultante est digérée par l’exonucléase 5’->3’ Rat1 pour donner l’ARNr 25S mature. La portion 7S-S/L quant à elle est
prise en charge par l’exosome d’ARN couplé à l’hélicase Mtr4 via leur recrutement par la protéine adaptatrice Nop53 (Figure 6, Pacman vert). Nop53 possède un domaine de liaison spécifique à l’arche de Mtr4 et permet son recrutement à la sous-unité ribosomale pré-60S (Fromm, L. et al., 2017; Thoms et al., 2015). Mtr4 permettra l’entrée du pré-ARNr 7S-S/L dans le canal central de l’exosome jusqu’à Dis3 qui induit sa maturation jusqu’à l’intermédiaire 5,8S+30. Le substrat est alors relâché par Dis3 et à sa sortie du canal central de l’exosome, il est intercepté par Rrp6 qui poursuit la maturation qui résultera en l’intermédiaire 6S-S/L. Le pré-ARNr 6S-S/L est exporté au cytoplasme pour une dernière étape de maturation jusqu’à l’obtention de l’ARNr 5.8S mature (Henras et al., 2015). La délétion ou déplétion de Dis3, Rrp6 et Mtr4 entraîne d’importants défaut de maturation de l’ARN ribosomal 5.8S chez la levure à fission et à bourgeonnement (Lemay et al., 2014; de la Cruz et al., 1998).
Toujours dans la biogénèse des ribosomes, l’exosome est impliqué dans la maturation de l’extrémité 5’-ETS du pré-ARNr. Utp18, comme Nop53, possède également un site spécifique de liaison au domaine arche de Mtr4 et permet donc le recrutement de Mtr4 et de l’exosome à la petite sous-unité ribosomale le pré-40S. Cette interaction permet la dégradation médiée par l’exosome de la partie 5’-ETS suite au clivage au site A0 (Thoms et al., 2015).
En majorité, les pré-ARNr subissent des étapes de maturation A0, A1, A2 et B0 de manière co-transcriptionnelle, représentées en bleues. Une petite partie de transcrits se retrouvent exprimés en long pre-ARNr polycistronique, le 35S. Suite à la coupure B0 survenant à la fin de la transcription, les coupures endonucléolytiques A0, A1 et A2 s’enchaîneront rapidement. Pour ce qui est du reste de la maturation du pré-18S, le précurseur 20S sera exporté au cytoplasme où une ultime coupure endonucléolytique catalysée par Nob1 terminera sa maturation. Le précurseur 27S-A2 subi une étape de maturation par l’exonucléase Rex1 (pacman bleu) qui permet le retrait du 3’-ETS. Majoritairement, 27S-A2 est par la suite clivée par la RNase MRP au site A3. La forme résultante, le 27S-A3 est par la suite processé par l’exonucléase 5’-3’ Rat1 (pacman orangé) pour donner la forme courte du 27S (27SS). De manière moins courante, le 27S-A2 subi une coupure endonucléolytique
au site B1-L qui produira une forme longue de l’ARNr 5.8S (5.8SL). Le 27SS/L subi ensuite la
coupure endonuclélytique en C2 par le complexe Las1. La partie pré-5.8S représenté par le précurseur 7SS/L subit ensuite une étape de maturation visant à retirer la majeure partie de
la portion ITS2 restante en 3’. Cette étape est médiée par les deux activités exocatalytiques (Dis3 et Rrp6) de l’exosome d’ARN couplé à l’hélicase Mtr4 (Pacman vert). La molécule résultante, le pré-ARNr 6SS/L sera exportée au cytoplasme pour subir une dernière étape de
maturation par l’exonucléase 3’-5’ Ngl2 (pacman magenta). En ce qui attrait la maturation du pré-25S, suite à la coupure C2 par le complexe Las1-Grc3-Rai1-Rat1, le précurseur 26S sera pris en charge par Rat1 (pacman orangé), une exonucléase 5’-3’, qui finira sa maturation en 25S. Il sera par la suite exporté au cytoplasme pour la fin de l’assemblage des ribosomes fonctionnels. Inspirée du diagramme de Henras et al., 2015 sur la maturation des pré-ARNr de la levure S. cerevisiae.
7. Maladies associées à des mutations des protéines de l’exosome à ARN
Différentes études de génotypage ont identifié des mutations ponctuelles présente dans les gènes codants pour des protéines de l’exosome à ARN chez des individus présentant diverses maladies. Plus d’une dizaine de mutations présentes sur différentes sous-unités de l’exosome ont été répertoriées chez des patients atteints d’hypoplasie pontocerebellaire de type 1B ou de type 1C ainsi que chez des patients souffrants de détérioration de la rétine, de perte d’audition, de vieillissement prématuré ainsi que qu’un handicap intellectuel variable. L’hypoplasie pontocerebellaire est une maladie neurodégénérative autosomale récessive qui est caractérisée par un mauvais développement de la protubérance annulaire et du cervelet (type 1B) ou du corps calleux et du cervelet (type 1C) (Wan et al., 2012; Rudnik-Schöneborn et al., 2013; Zanni et al., 2013; Eggens et al., 2014; Halevy et al., 2014; Boczonadi et al., 2014). Ce qui soulève plusieurs interrogations dans la communauté
scientifique est le caractère « tissu-spécifique » des maladies liées à l’exosome, étant donné la nature ubiquitaire de l’exosome d’ARN dans les tissus des eucaryotes multicellulaires. Les mutations identifiées jusqu’à présent sur des gènes de l’exosome à ARN causant ces syndromes sont répertoriées à la Table 1. Ces mutations sont réparties entre EXOSC2/Rrp4 (Di Donato et al., 2016), EXOSC3/Rrp40 (Wan et al., 2012; Rudnik-Schöneborn et al., 2013; Zanni et al., 2013; Eggens et al., 2014; Halevy et al., 2014) et EXOSC8/Rrp43(Boczonadi et al., 2014). D’emblée, il est surprenant de constater que ces dernières sont toutes des composantes du corps de l’exosome, dénuées d’activité catalytique. Cette constatation soulève la question à savoir si d’autres facteurs interagissant avec l’exosome sont impliqués et si les mutations observées empêcheraient le recrutement de ceux-ci, expliquant les phénotypes observés chez l’humain. Plusieurs études structurales et fonctionnelles dans différents organismes modèles comme la levure ont permis de présenter des pistes de solutions afin d’expliquer comment ces différentes mutations affecteraient les fonctions de l’exosome. Notamment, le changement d’acide aminé entraînerait la perte d’interactions importantes entre les différentes sous-unités du corps de l’exosome. Certaines autres mutations affectent la structure tertiaire des protéines du complexe. D’autres causeraient l’obstruction de différentes voies d’engagement de substrat à l’exosome. Les fonctions de l’exosome d’ARN sont donc affectées par des défauts d’assemblage du complexe, de diminution du niveau de complexes fonctionnels ou de recrutement de substrats ou de cofacteurs (Morton et al., 2018).
Tableau 1. Mutations répertoriées des composantes de l’exosome d’ARN causant des maladies chez l’humain
Composante de l'exosome
Substitution d'acide aminé et Génotype des individus affectés
Phénotype(s) des individus affectés
Sévérité du syndrome
EXOSC2/Rrp4 G30V Homozygote SMSa Léger
EXOSC2/Rrp4 G198D/G30V Hétérozygote SMSa Léger
EXOSC3/Rrp40 G31A Homozygote HPC1bb Sévère
EXOSC3/Rrp40 V80F/D132A Hétérozygote HPC1bb, PSc Léger
EXOSC3/Rrp40 Y109N/D132A Hétérozygote HPC1bb Sévère
EXOSC3/Rrp40 D132A Homozygote HPC1bb Léger
EXOSC3/Rrp40 D132A/Nulle Hétérozygote HPC1bb Sévère
EXOSC3/Rrp40 G135E Homozygote HPC1bb Sévère
EXOSC3/Rrp40 A139P/D132A Hétérozygote HPC1bb Sévère
EXOSC3/Rrp40 G191C Homozygote HPC1bb, PSc Léger
EXOSC3/Rrp40 W238R/G31A Hétérozygote HPC1bb Sévère
EXOSC8/Rrp43 A2V Homozygote HPC1cd Léger
EXOSC8/Rrp43 S272T Homozygote HPC1cd Sévère
Sommaire des mutations recensées chez certaines sous-unités de l’exosome d’ARN chez des individus arborant des syndromes particuliers. Par niveau léger, on entend que les individus ont survécus pendant plusieurs années alors qu’un niveau sévère répertorie des individus n’ayant pas survécus plus de deux ans. La mutation « nulle » signifie un changement de cadre de lecture menant à une mutation non-sens empêchant l’expression du gène affecté. Tableau adapté de Morton et al., 2018.
aSyndrome multi-symptomatique de rétinite pigmentaire, perte d’audition, vieillissement prématuré, petite stature et faible invalidité intellectuelle.
bHypoplasie pontocerebellaire de type 1b cParaplégie spastique
dHypoplasie pontocerebellaire de type 1c
8. Protéomique
8.1. La protéomique comme champ d’étude
La protéomique est une discipline de biologie moléculaire dédiée à la caractérisation de toutes les protéines, également nommé protéome, d’une cellule, d’un tissu ou d’un organisme. La discipline tend à vouloir renseigner de manière globale sur les particularités des protéomes et leurs propriétés dans des conditions variées. Les applications de la protéomique sont pratiquement infinies ce qui rend les recherches variées et riches.
Plusieurs sphères de la biologie cellulaire peuvent être placées sous la bannière de la protéomique; les interactions protéine-protéine, les modifications post-traductionnelles, la localisation compartimentale des protéines et les biomarqueurs pour n’en nommer que quelques-unes. Plusieurs avancées technologiques ont permis l’expansion du domaine d’étude. En particulier, la spectrométrie de masse qui permet l’étude d’un vaste échantillon de protéines de manière spécifique. De concert, l’expansion des outils bio-informatiques, permettant la reconstitution des données obtenues par spectrométrie de masse en protéines, a également permis d’ouvrir d’avantage le champ de la protéomique (Hixson et al., 2017; Clark and Pazdernik, 2016; Clark and Pazdernik, 2013; Shah et Misra 2011; Saraswathy et Ramalingam, 2011a; Yu et al., 2010).
8.2. Spectrométrie de masse (MS)
La spectrométrie de masse (MS) est une technique analytique quantitative extrêmement puissante qui a de multiples applications. La technique consiste à calculer la masse et la charge d’une molécule injectée au spectromètre de masse afin de déterminer sa composition (Cao et Limbach, 2017; Mellon, 2003). La méthode permet l’identification précise et exacte de molécules chimiques, de molécules d’acides nucléiques et même de macromolécules comme des peptides ou des protéines (Walther et al., 2010). Il n’est donc pas surprenant que la MS se soit imposée comme technique préférentielle dans les études de protéomique dû à l’étendue des données qu’elle puisse fournir pour une seule et même analyse (Vandell et Limbach, 2017; Chaurand et al., 2008).
8.2.1. Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem
L’utilisation de la MS pour l’analyse d’un échantillon protéique nécessite diverses étapes de préparation. Couramment, suivant une lyse cellulaire, une protéine d’intérêt, portant une étiquette moléculaire, sera immunoprécipitée. Les protéines co-purifiées sont alors digérées avec l’aide d’enzymes protéolytiques comme la trypsine ou la chymotrypsine afin
de générer des peptides qui pourront être adéquatement analysés par MS (Tubaon et al., 2017; Wiśniewski et al., 2009). Ce mélange de peptides est ensuite analysé en chromatographie liquide (LC), ce qui permettra une séparation selon la taille des peptides du mélange (Fanali et al., 2017). Cette étape permet une meilleure résolution du mélange peptidique au MS. La sortie de la chromatographie liquide est dirrectement branché à un spectromètre de masse en tandem (MS/MS) qui permet l’analyse des formes longues de peptides, procède à leur fragmentation et analyse les formes fragmentées des peptides (Niessen et al., 2017). Cette technique, communément appelée LC-MS/MS, permet alors d’identifier l’interactome de la protéine d’intérêt et ainsi identifier divers processus biologiques dans lesquels elle est impliquée. La LC-MS/MS représente donc une méthode extrêmement puissante dans les études de protéomique sur des complexes où une protéine est connue pour avoir plusieurs partenaires d’interaction (Karpievitch et al., 2010).
8.2.2. Applications de la spectrométrie de masse
La MS possède une polyvalence peu commune. Elle est utilisée à différentes fins dans de multiples disciplines. Notamment, en médecine, la spectrométrie de masse a permis l’élaboration de tests diagnostiques pour le dépistage non invasif de la maladie de Fabry chez les nouveau-nés du Québec (Auray-Blais et al., 2017). En chimie, la MS sert dans les tests de contrôle du dopage sportif afin d’identifier des métabolites exogènes d’échantillons urinaires (Ouellet et al., 2013). En milieu académique, la spectrométrie de masse permet des études à petite et grande-échelle de protéomes, d’interactomes (Varnaité et MacNeill, 2016) et des changements dans ces deux derniers lorsqu’assujettis à différents stresses métaboliques (Dubois et al., 2016; Boisvert et al., 2010). Il est également facile d’imaginer qu’elle peut servir à l’étude des changements d’expression génique en cas de maladies et de cancers (Mathieu et al., 2016; Chauvin et al., 2018). La polyvalence de la spectrométrie de masse ainsi que sa versatilité font d’elle une technique puissante pour les études de protéomiques et dont le développement est en expansion constante.
