Étude du mécanisme de croissance du filament bactérien

Étude du mécanisme de croissance du filament

bactérien

Résumé

Plusieurs types de bactéries peuvent se déplacer dans leur milieu à l’aide de flagelles rotatifs. Ces flagelles sont composés d’un moteur rotatif ainsi que d’un filament long qui peut atteindre plusieurs fois la longueur du corps (10-15 µm) à l’extérieur de la cellule. Ceux-ci sont composés d’un assemblage de plusieurs milliers de protéines identiques appelées flagelline (FliC). Chaque filament croît par auto-assemblage des unités de FliC à son extrémité extérieure. Chaque FliC doit donc être transportée, partiellement dépliées dans un mince canal à l’intérieur du filament. Au bout du filament se trouve une structure, nommée le cap, composée de 5 protéines FliD essentielles à la polymérisation de la flagelline. Le travail réalisé au cours de cette thèse porte sur deux aspects particuliers de l’assemblage d’un filament. Premièrement, un filament peut-il continuer à s’assembler s’peut-il est cassé ? Deuxièmement, quel est le taux de croissance d’un filament et est-ce que ce taux varie avec la longueur du filament ?

En utilisant des impulsions laser ultrabrèves, nous avons coupé des filaments marqués d’un fluorophore pour observer s’ils continuaient à s’assembler. Suivant une période de croissance de 2 heures, les filaments étaient marqués de fluorophores différents et observées sous un microscope en épifluorescence. Une souche de Salmonella enterica génétiquement modifiée pour n’exprimer en moyenne qu’un seul filament par cellule a été utilisée. Cette modification assure que chaque filament revisité a bien été coupé auparavant. La même expérience fut aussi réalisée à l’aide d’une souche surexprimant la protéine FliD. En tout, 82 filaments bactériens furent ainsi coupés, puis observés après une période de croissance et aucune reprise de croissance ne fut observée. Ces résultats peuvent sembler surprenants à la lumière de récentes études qui ont rapporté que les filaments continuent de s’assembler lorsqu’ils sont cassés mécaniquement par des forces de cisaillement (”shearing”).

En utilisant des marquages de couleurs différentes, nous avons aussi mesurer le taux de sance du filament en fonction de sa longueur. Nos résultats démontrent que le taux de crois-sance diminue graduellement avec la longueur, allant de ∼ 4µm/h à 1µm jusqu’à ∼ 1µm/h à 10 µm. Ces résultats contrastent avec le taux constant de 2.3�m/3h rapporté récemment dans la littérature. Les expériences décritent dans cette thèse ont donc permis d’élaborer un modèle novateur décrivant le mécanisme de croissance du filament bactérien combinant la simple diffusion avec un mécanisme actif qui introduit les flagellines à la base du filament.

Abstract

Many types of bacteria swim using a rotary motor. These remarkable biological motors are composed of a stator, a rotor and a bacterial flagellar filament which extends many body lengths (10-15µm) outside of the cell. The filaments are constructed of as many as 20000-30000 protein subunits (called flagellin). Each filament grows at its distal end by self-assembly of flagellin subunits that have to be exported in an unfolded conformation through the narrow channel inside the filament. At the very end of the filament, a “cap” structure made of the FliD protein is essential for flagellin self-assembly and polymerization. The work performed in this doctoral thesis focuses on two specific aspects of the filament assembly. First, we ask whether the filament can continue to grow after being cut? Secondly, the rate of growth is measured as a function of the filament’s length.

Using femtosecond laser ablation, we cut individual bacterial filaments and observed whether they could regrow. Bacterial filaments were first labeled with an orange fluorophore, cut with the laser, and then re-labeled with a green fluorophore after a 2h regrowth period. The ex-periments were performed with a genetically modified Salmonella enterica strain that grows only one filament per cell. This modification allows us to make sure that we revisit (after the regrowth period) the exact individual filaments that were cut by the laser. The same exper-iment was also performed with a strain where the cap protein FliD could be overexpressed. Overall, 82 filaments were cut and we did not observe any regrowth. Interestingly, this con-clusion differs from results reported recently using mechanically broken (sheared) Escherichia

coli filaments.

Using a similar approach (sequential labeling of filaments with different colors) we also inves-tigated the rate at which bacterial filaments grow as a function of their initial length. Our results lead us to the conclusion that the growth rate decreases with length (from ∼ 4µm/h at 1µm down to ∼ 1µm/h at 10µm). These observations again contrast with the constant growth rate (2.3 µm/3h) reported in a recent study. Those two separate results helped in the developement of a new model for the mechanism behind the bacterial flagellar growth combining simple diffusion with an active mecanism feeding the flagellin proteins at the base of the filament.

Table des matières

Résumé iii

Abstract v

Table des matières vii

Liste des tableaux ix

Liste des figures xi

Remerciements xvii Avant-propos xix Introduction 1 Biophotonique . . . 1 La motilité bactérienne . . . 1 Description du projet. . . 3

1 Moteur flagellaire, ablation laser et stabilisation laser 5 1.1 Structure et assemblage du moteur flagellaire . . . 5

1.2 Assemblage du filament . . . 7

1.3 Visualisation du filament. . . 9

1.4 Ablation laser . . . 10

1.5 Interaction protéines/laser . . . 13

1.6 Montage laser . . . 15

2 Single-cell analysis of flagellar filament re-growth after damage by laser ablation 21 2.1 Avant-propos . . . 21 2.2 Résumé . . . 22 2.3 Abstract . . . 22 2.4 Introduction. . . 23 2.5 Results. . . 25 2.6 Discussion . . . 31

2.7 Materials and Methods. . . 34

2.8 Supplementary Material . . . 37 3 Bacterial flagella grow through an injection-diffusion mechanism 41

3.1 Avant-propos . . . 41

3.2 Résumé . . . 42

3.3 Abstract . . . 42

3.4 Introduction. . . 43

3.5 Results. . . 44

3.6 Discussion and Conclusion . . . 47

3.7 Materials and Methods. . . 48

3.8 Supplementary Material . . . 50

4 Marquage de filaments et système in vitro 53 4.1 Adaptation du patch-clamp pour une utilisation sur les bactéries . . . 54

4.2 Microbilles et nanoparticules . . . 55

4.3 Détection de la vitesse de rotation . . . 58

4.4 Possibilités futures . . . 60

4.5 Améliorations possibles . . . 66

Conclusion 67

A Manuscrit complet de l’article “Variability in bacterial flagella

re-growth patterns after breakage” 69

B Manuscrit complet de l’article “Bacterial flagella grow through an

injection-diffusion mechanism” 81

Liste des tableaux

1.1 Performances du système de stabilisation laser . . . 16

1.2 Caractéristiques de la source d’impulsions laser fs utilisée (RegA) . . . 17

2.1 Number of filaments cut and revisited . . . 28

2.2 S. enterica strains used in the study . . . 38

Liste des figures

1.1 Vue en coupe de la membrane cellulaire de bactéries Gram-négatives . . . 6

1.2 Structure interne du moteur flagellaire . . . 7

1.3 Exemple de marquage fluorescent . . . 9

1.4 Processus d’ionisation multi-photonique . . . 11

1.5 SEE et exposition énergétique requis en fonction de la durée d’impulsion pour atteindre un claquage optique . . . 12

1.6 Coefficient d’absorption de différents composés biologiques. . . 13

1.7 Évolution de la température au centre du point focal du laser . . . 14

1.8 Stabilisation de la position du laser. . . 16

1.9 Lame 𝜆/2 . . . 19

1.10 Stabilisation de la puissance du laser . . . 20

2.1 Schematic of the experimental setup . . . 25

2.2 EM800 strain characteristics . . . 26

2.3 Cutting the filament and double labeling. . . 28

2.4 Results of the shearing experiment . . . 30

2.5 Functional analysis of arabinose inducible fliD . . . 39

3.1 Rate of growth of filaments in EM800 strain. . . 44

3.2 Rate of growth of EM1281/1282 strains with and without arabinose . . . 45

3.3 Rate of growth of filaments in EM2011 strain . . . 46

3.4 Rate of growth of filaments in EM2011 strain using triple labeling . . . 46

3.5 Scatter plots of filaments length for strains EM1281/1282 . . . 51

3.6 Rate of growth of filaments in EM2011 strain in the presence of arabinose . . . 52

3.7 Scatter plot for filaments used in the triple labeling assay not showing a third part . . . 52

4.1 Molécule de biotine-maléimide . . . 58

4.2 Rotation d’une bille obtenue à l’aide d’une caméra EMCCD . . . 59

4.3 Rotation d’une bille obtenue à l’aide d’une photodiode avalanche . . . 60

4.4 Proportion du temps passé par le moteur en rotation horaire (CW bias) en fonction de la concentration de la protéine CheY-P . . . 62

À mes parents, ma conjointe Amélie et mes amis

Science is a way of thinking more than it is a body of knowledge

Remerciements

Plusieurs personnes méritent du crédit pour l’accomplissement qu’est l’écriture d’une thèse. En premier lieu, je tiens à remercier mes parents pour tout le support et les encouragements qu’ils m’ont donnés durant toutes ces années sans jamais douter. Sans eux, rien de ceci n’aurait pu avoir lieu. Ma conjointe Amélie fut aussi à mes côté lors des moments heureux comme ceux plus difficiles et son support fut très important tout au long de cette aventure. Finalement, un merci spécial à mes amis et le reste de ma famille pour les encouragements.

Du côté académique, je me dois de saluer Mathieu Gauthier, Alexandre Bastien et Ismaël Duchesne qui furent des collègues exceptionnels au cours de ma maîtrise et mon doctorat. Les nombreuses conversations et collaborations furent très importantes pour que ce document puisse être produit. Je tiens aussi à remercier nos collaborateurs externes Dr. Marc Erhardt et Dr. Kelly T. Hugues pour le travail qu’ils ont accomplis pour me permettre de réaliser les différentes expériences décrites dans ce document.

En terminant, un merci très spécial à mon directeur de thèse Dr. Simon Rainville qui m’a donné une chance incroyable d’entrer au sein de son groupe de recherche. J’ai beaucoup grandi en tant que scientifique, mais aussi en tant que personne à ses côtés durant plus de 5 années. Les compétences acquises en le côtoyant sont sans prix.

Avant-propos

Cette thèse a été écrite sous format d’article pour les deux chapitres principaux. Le chapitre

2 est un article qui a été soumis et accepté pour publication dans la revue Scientific Report. Comme la revue est anglophone, ce chapitre a été écrit en anglais pour conserver le ton et le langage utilisé par tous les auteurs. Puisque la version finale de l’article inclue des travaux de nos collaborateurs, elle est placée en annexe et le chapitre 2 de la thèse consiste en une première version du manuscrit qui décrit uniquement les expériences que j’ai réalisées au cours de mon doctorat. L’introduction ainsi que la discussion ont été écrites en collaboration avec mon directeur de thèse Dr. Simon Rainville ainsi qu’avec nos collaborateur Dr. Marc Erhardt et Dr. Kelly T. Hugues. Les manipulations génétiques pour obtenir les différentes souches ont été réalisées par Dr. Erhardt.

Le chapitre3a aussi été écrit en anglais sous forme d’articl. La version dans cette thèse résume les expériences que j’ai réalisées. D’autres expériences ont été faites par nos collaborateurs ont par la suite été ajoutées pour former un article qui a été publié dans eLife (voir en annexe). Les manipulations génétiques pour obtenir les différentes souches ont été réalisées par Dr. Erhardt. Ces travaux ont mené à l’élaboration d’un modèle très complet décrivant le mécanisme de croissance du filament bactérien.

Le chapitre 1 décrit les principes théoriques ainsi que les ajouts que j’ai amenés au montage expérimental de notre groupe. Ces notions théoriques abordent le moteur flagellaire bactérien de même que l’ablation laser et sont nécessaires à la compréhension et l’appréciation des résultats et conclusions des chapitres suivants.

Curieusement, la thèse se termine avec le chapitre 4 qui aborde les expériences réalisées du-rant la fin de ma maîtrise et les deux premières années de mon doctorat. Ces travaux n’ont finalement jamais été publiés dans une revue scientifique étant plutôt constitués d’étapes et d’expériences préliminaires dans le développement d’un système in vitro pour étudier le mo-teur flagellaire bactérien. Malgré le fait que peu de résultats quantitatifs analysables furent produits par ces travaux, les protocoles élaborés et résultats initiaux ont attiré passablement d’attention positive dans des conférences internationales sur la motilité bactérienne et sont importants pour les étudiants qui pourraient vouloir poursuivre dans cette direction. Le cha-pitre 4 de cette thèse décrit donc les travaux faits dans cette direction.

Introduction

Biophotonique

La collaboration entre les différents domaines scientifiques est de plus en plus présente dans le monde de la recherche. Dans le cadre de cette thèse, la chimie, la microbiologie, la physique ainsi que la génétique ont été utilisées de façon complémentaire. Ce travail sur des micro-organismes a été facilité par l’utilisation de techniques de photonique, tel que l’imagerie par fluorescence et l’utilisation de lasers pour faire de l’ablation et créer une pince optique. Le mariage de l’optique, de la photonique et la microbiologie, nommé biophotonique, est un domaine en plein expansion qui fait son entrée autant au niveau de la recherche de pointe que du milieu médical.

L’étude du monde bactérien est un sujet chaud qui est de grand intérêt dans le monde en ce moment. Le demande en antibiotiques de plus en plus puissants résultant de l’émergence de la résistance des bactéries à ces antibiotiques pousse les chercheurs à tenter de mettre au point différents moyens de combattre les infections. À l’opposé, nous commençons à comprendre que la relation de symbiose entre notre corps et la flore intestinale est cruciale pour le bon fonctionnement de celui-ci. Plusieurs questions restent cependant sans réponse.

Un avantage intéressant de la biophotonique est la capacité à étudier les cellules bactériennes vivantes. Il est alors possible d’observer des processus biologiques multiples en temps réel. Un de ces processus en particulier est la construction du moteur flagellaire bactérien ainsi que de son filament. Cette nanomachine extraordinaire permet aux cellules bactériennes de se déplacer dans leur milieu pour se nourrir, se sauver ou simplement trouver un meilleur endroit à coloniser.

La motilité bactérienne

Plusieurs micro-organismes ont la possibilité de se déplacer dans leur environnement. En général, cette motilité leur sert à migrer vers des milieux favorables à leur développement et leur croissance [1]. Certains organismes s’en servent aussi pour atteindre leurs proies, échapper à leurs prédateurs ou s’accrocher à une surface fixe. Une bactérie peut par exemple coloniser

le système digestif d’un organisme et se fixer à cette source importante de nourriture pour éviter d’être entraîné par les mécanismes de défense de cet hôte. Le rôle de la motilité sur la virulence de certains pathogènes bactériens est aussi un sujet d’étude riche [2,3].

Plusieurs stratégies ont été développés par les bactéries pour se mouvoir. Certains

Myxococ-cus (par exemple : M. xanthus) sécrètent un polysaccharide visqueux qui leur permet une

colonisation de surface par glissement. Dans certains cas, des pili (qui servent généralement à l’attachement des bactéries à une surface, à la respiration et à la conjugaison de gènes) se contractent et s’allongent pour permettre à la bactérie de glisser sur une surface solide. Une revue de la littérature sur le mécanisme de glissement des bactéries est disponible en [4]. Dans un milieu liquide (plutôt que sur une surface), les bactéries font appel à un ou plusieurs flagelles. Les groupes Bacillus, Clostridium, Escherichia et Salmonella, entre autres, utilisent plusieurs filaments distribués de façon péritriche, c’est-à-dire aléatoirement sur toute la surface de la cellule. Les Spirochètes sont des bactéries en forme de spirale qui ont un manteau externe contenant des lipides, protéines et glucides recouvrant entièrement la paroi cellulaire. Des flagelles distibués aux pôles restent emprisonnés dans le périplasme et forment des filaments

axiaux qui provoquent une pulsation du corps de la bactérie et entraînent un mouvement en

tire-bouchon. Ce type de mouvement donne un avantage à la bactérie en milieu très visqueux. Les Bdellovibrio sont des parasites d’autres bactéries qui se déplacent très rapidement à l’aide d’un flagelle toujours situé à une extrémité du corps de la bactérie. Ce filament lui permet d’entrer en collision avec une cellule hôte et, à l’aide d’enzymes, percer un trou dans la paroi de l’hôte permettant au Bdellovibrio de s’introduire dans la cellule. Après avoir perdu son flagelle, il se multiplie en se nourrissant du contenu cytoplasmique à l’abri de prédateurs et de compétition. À la mort de l’hôte de nouvelles cellules sont libérées [1,5].

Le filament est constitué d’environ 20000 copies d’une protéine appelée flagelline arrangées de manière hélicoïdale. Le filament peut s’étendre de 10 à 20 µm de long pour un diamètre d’environ 20 nm. Le centre du filament est un canal qui sert à faire parvenir la flagelline jusqu’à l’extrémité. Les filaments sont attachés au crochet (structure cylindrique souple) qui sert de joint flexible entre le filament et le moteur qui est lui-même ancré dans la paroi cellulaire. Contrairement à plusieurs processus biologiques, la rotation du moteur n’est pas directement assurée par de l’ATP1_{, mais plutôt par un flux d’ions H}+_{(force proton-motrice ou fpm). Le}

moteur flagellaire possède un diamètre de moins de 50 nm et peut atteindre une vitesse de rotation de 300 Hz [6]. Certaines bactéries vivant en milieu marin utilisent plutôt des ions Na+

comme source d’énergie et peuvent atteindre 700 Hz [7,8]. Ce moteur permet aux bactéries de parcourir plusieurs fois la longueur de leur corps par seconde (10-20µm/s [9]).

1. L’adénosine triphosphate est une molécule fournissant l’énergie nécessaire au métabolisme des organismes vivants.

Description du projet

Cette thèse est construite autour de deux articles traitant de l’assemblage du filament. Ces deux expériences partagent plusieurs points communs au niveau technique. Ces points com-muns sont décrits au premier chapitre. De plus, certains points théoriques non abordés dans les articles sont détaillés dans cette première partie.

Le chapitre suivant est centré autour de l’ablation de filaments à l’aide d’impulsions ultra-brèves. À l’aide d’un faisceau laser à impulsions femtosecondes et d’un marquage fluorescent, des filaments sont coupés individuellement sans endommager la cellule. Suivant une seconde période de croissance, les bactéries sont de nouveau marquées et revisitées afin d’observer si la croissance des filaments s’est poursuivie. La nouveauté de cette approche réside dans la nature individuelle des observations. Ayant l’assurance que le filament observé a été coupé, nous pouvons éviter de se baser sur les statistiques d’une population pour tirer nos conclusions. Ensuite, nous avons déterminé le vitesse de croissance du filament en fonction de sa longueur à l’aide de marquages fluorescents doubles et triples. Ceci, nous permet de proposer un modèle différent permettant d’expliquer le mécanisme derrière l’assemblage du filament, un sujet toujours au coeur de débats.

Finalement, le dernier chapitre traite de notre système in vitro et des efforts réalisés pour améliorer le marquage des filaments à l’aide d’autres techniques que la fluorescence. Ce sys-tème permet l’étude de cellules individuelles à l’aide de la technique de patch-clamp. Cet ingénieux système permet de prendre contrôle de la rotation du moteur flagellaire bactérien en perçant la membrane cellulaire à l’aide d’un faisceau laser femtoseconde. Une fois la paroi compromise, il est possible de modifier le voltage passant par une électrode se situant dans la pipette. Ce changement de voltage nous donne donc un accès direct au fonctionnement du moteur. Des expériences possibles dans le futur à l’aide des ces techniques de marquage et du systèmes in vitro sont aussi abordées.

Chapitre 1

Moteur flagellaire, ablation laser et

stabilisation laser

Comme mentionné en introduction, plusieurs types de bactéries peuvent se déplacer dans leur milieu de différentes façons. Cette thèse s’intéresse plus particulièrement à la motilité bactérienne à l’aide d’un ou plusieurs flagelles consistant essentiellement en une partie statique et une partie rotative. Le flagelle consiste essentiellement en un long filament relativement rigide qui est ancré dans la membrane par un moteur rotatif. Les bactéries, qui sont des organismes unicellulaires, produisent les protéines nécessaires à l’assemblage du moteur dans le cytoplasme de la bactéries, c’est-à-dire à l’intérieur de celles-ci. Ce chapitre débutera donc avec une courte révision de la structure et l’assemblage du moteur ainsi qu’une revue plus en profondeur de l’assemblage du filament. Ensuite, les principes derrière l’ablation laser à l’aide d’impulsions ultra-courtes seront discutés.

Comme les expériences décrites dans cette thèse concernent l’étude d’une structure biologique à l’aide d’un faisceau laser, une section est consacrée aux protéines ainsi que leur interaction avec les champs électriques provoqués par des impulsions laser. Finalement, le montage expé-rimental sera détaillé ainsi que les techniques utilisées pour stabiliser la position du faisceau de même que sa puissance.

1.1

Structure et assemblage du moteur flagellaire

La membrane cellulaire de bactéries Gram-négatives (voir figure1.1) se divise en deux parties : la membrane cytoplasmique et la paroi cellulaire. La première est constituée d’une double couche de phospholipides possédant une perméabilité sélective. Elle permet de séparer le milieu cytoplasmique habituellement très riche du milieu ambiant qui, en général, est plus pauvre en nutriments. Par contre, elle permet le passage de l’eau ainsi que certaines molécules spécifiques à l’aide de canaux ioniques prenant place dans la membrane. La membrane cytoplasmique est

Figure 1.1 – Vue en coupe de la membrane cellulaire de bactéries Gram-négatives. Figure tirée de [10]

commune aux bactéries Gram-positives et Gram-négatives.

La paroi cellulaire sert de protection et donne sa forme à la bactérie en plus de protéger le milieu intra-cellulaire. Chez les bactéries Gram-négatives, elle est composée d’une couche de polymère appelée peptidoglycane ainsi que d’une couche constituée de phospholipides et de lipopolysaccharides nommée membrane externe. La pathogénicité de certaines bactéries est expliquée par la présence des lipopolysaccharides sur la membrane externe [1].

La membrane cellulaire étant le rempart entre le milieu ambiant et l’intérieur de la bactérie, certains organelles de motion se retrouvent ancrés dans celle-ci. Le moteur flagellaire bacté-rien est constitué d’un stator, d’un rotor ainsi que d’un mécanisme de roulement et se situe directement dans la membrane cellulaire. La figure 1.2 montre un schéma des principales composantes du moteur flagellaire. La partie statique est composée de deux protéines, MotA (4 copies) et MotB (2 copies) ainsi que des anneaux L et P. Le complexe MotA/MotB est nommé unité génératrice de couple et son interaction avec le rotor génère le couple nécessaire au moteur. Ce complexe agit aussi comme un canal laissant passer les protons (ions H+_{) et}

utilise leur énergie potentiel comme source d’énergie pour initier la rotation du moteur. Le moteur est constitué de plusieurs unités génératrices de couple de (10-16, valeur qui peut changer avec l’espèce et même pour chaque moteur [11]) qui peuvent se déplacer dans la membrane. Le couple est ensuite transféré au rotor qui est composé des anneaux C et MS et de la tige. Les anneaux L et P servent aussi de mécanisme de roulement [12].

La structure des filaments est bien connue. Elle consiste en une suite de 11 protofilaments hélicoïdaux formés de flagelline (FliC). Ces protofilaments ont une forme courte et une forme longue distribués en alternance pour donner sa forme de spirale au filament [12]. Une fois complétés, ils mesurent de 10 à 20 µm de long (plusieurs fois la longueur de la bactérie qui est de 2 µm) et ont un diamètre de 20 nm. Le filament est relié au moteur par un joint universel

Figure 1.2 – Structure interne du moteur flagellaire [12]

souple nommé crochet. Ce dernier mesure 55 nm de long et est composé de la protéine FlgE. Le fait que le crochet soit souple permet à l’axe de rotation du filament d’être différent de celui du moteur [12]. Une description plus complète de l’assemblage du moteur et des gènes impliqués se retrouve à la section 2.4.

1.2

Assemblage du filament

1.2.1 Crochet

Le corps du moteur flagellaire comprend une machine exportatrice de protéines spécifiques au filament [13]. Ce système de sécrétion, que les biologistes désignent comme “système de sécrétion de type III”,exporte la plupart des composantes extra-cellulaires requises pour la construction du crochet et le filament à l’aide de la force proton motive (proton motive force, PMF) [14,15].

Une fois que le corps du moteur ainsi que la partie rotative du moteur (appelée rod) sont construits, le système de sécrétion ajoute les sous-unités formant le crochet, soit des protéines FlgE. Le crochet se développe ensuite jusqu’à une longueur de 55 nm. Deux protéines sont impliquées dans la mesure très précise de la longueur du crochet : FliK et FlhB [16]1_. L’ab-sence de FliK provoque la formation de longs polyhooks sans filaments (crochets pouvant aller jusqu’à 1 µm [17]) tandis que l’absence de FlhB forme un complexe polyhook-filament. Ceci indique que le changement du type de substrat exprimé marquant le début de l’assemblage du filament peut se faire sans FlhB mais avec une synchronisation déficiente [16]. FliK agit comme une règle moléculaire mesurant directement dans le temps la longueur du crochet.

1. Plusieurs chercheurs se sont penchés sur le sujet pour tenter de comprendre comment cette mesure si précise est contrôlée par la bactéries. 2 modèles ont longtemps été en compétition au sein de la communauté scientifique : le measuring cup ainsi que le molecular ruler. Ce dernier modèle est aujourd’hui accepté

L’interaction entre FliK et FlhB une fois la longueur voulue atteinte catalyse la réaction né-cessaire au changement de sécrétion de substrats de type filament [17]. Ce changement de substrat provoque le début de l’assemblage du filament.

1.2.2 Protéines associées au crochet (hook-associated proteins, HAP) La sécrétion de ces protéines régulatrices ainsi que l’achèvement de la construction du crochet provoque un changement dans la spécificité du système de sécrétion de type III. En effet, lorsque le complexe crochet-corps est complété, la sécrétion de substrats de type filament est engagée. Une fois ce changement activé, la protéine FlgM est sécrétée libérant ainsi 𝜎28_pour

activer la transcription du promoteur de Classe 3. Les gènes entraînant la production du reste du filament ainsi que du système de chimiotaxie sont alors activés [18].

Cependant, avant de pouvoir faire grandir le filament, trois types de protéines doivent être sécrétées. Ces protéines associées au crochet (HAP) sont nécessaires pour que la construction du filament se produise. En premier lieu, La protéine FlgK vient se lier au crochet pour former la première partie d’un adaptateur entre le crochet et le filament. La protéine FlgL est ensuite exportée permettant finalement à la protéine FliD, aussi appelée cap, de prendre place [19]. Cette structure est composée de 5 copies de FliD et est essentielle à la croissance du filament étant nécessaire pour la polymérisation des unités de FliC du filament [20, 21]. Lors de l’assemblage du filament, le cap se trouve donc au bout de celui-ci.

1.2.3 Construction du filament

Le filament flagellaire est formé de plusieurs milliers de sous-unités de flagelline (FliC) et il peut atteindre entre 10 et 15 µm. Pour ce faire, les sous-unités sont produites dans la cellules et sont exportées dépliées hors de la cellule par un mince canal à l’intérieur du filament. Une fois arrivée au bout, le cap polymérise et met en place les sous-unitées [22,23].

1.2.4 Bris d’un filament

La présence des trois HAPs étant nécessaire à l’assemblage du filament, un filament cassé doit donc former un nouveau cap pour que la croissance puisse se poursuivre. L’absence du

cap inhibe l’assemblage du filament [20, 21]. Cependant, pour qu’il puisse se former, il doit pouvoir se lier aux protéines FlgL lors de l’assemblage du filament. Comme FlgL n’est pas présente dans le filament [19], un cap doit pouvoir se former sans la présence de FlgL lors d’un bris. Ces trois protéines sont cependant constamment sécrétées durant l’assemblage du filament et rejetées à l’extérieur par le cap sans être intégrées au filament [24], ce qui pourrait potentiellement permettre la reprise de la croissance. Les expériences du chapitre 2 utilisent l’ablation laser pour briser des filaments et observer si le ceux-ci continuent de s’assembler ou non.

Figure 1.3 – Exemple de marquage fluorescent. On peut voir 2 marquages différents, un orange et un vert. Le premier (orange, 546 nm) est un marquage réalisé sur la culture au complet. Une fois que les bactéries sont fixées sur la lamelle de microscope, une deuxième période de croissance d’une durée d’une heure a été réalisée ainsi qu’un deuxième marquage (vert, 488 nm). Certains corps de bactéries peuvent être partiellement marqués. Les corps les plus lumineux sont des bactéries mortes la majorité du temps.

1.3

Visualisation du filament

Le filament bactérien n’est pas visible à l’aide de la microscopie optique traditionnelle, nous devons utiliser d’autres façons pour le visualiser. La façon la plus simple pour visualiser le filament en entier de bactéries in vivo est par fluorescence. Pour éviter de marquer la membrane de la cellule, ce qui noierait le faible signal produit par les filaments, un marquage spécifique de ceux-ci est nécessaire.

La méthode utilisée pour obtenir un marquage ciblé requiert la modification de la protéine FliC. Celle-ci est modifiée pour remplacer un acide aminé de la chaîne par une cystéine dans la protéine (Voir sections2.7.1et le tableau2.2pour plus de détails sur les différentes souches utilisées durant les expériences de fluorescence). L’acide aminé spécifique qui est remplacé par une cystéine est choisi pour que celui-ci soit accessible du milieu ambiant lorsque la protéine est polymérisée. Il existe plusieurs endroit sur la chaîne d’acides aminés donnant de bons résultats, mais pour ces expériences, nous avons utilisé des souches où la tyrosine 237 a été remplacée par une cystéine(FliC𝑇 237𝐶_).

Les fluorophores utilisées (Alexa-Fluor C₅-maléimide, Invitrogen) ont un groupe maléimide qui réagit avec le groupe thiol de la cystéine. Ceci nous permet d’obtenir un marquage très ciblé des filaments avec des bactéries toujours vivantes. Ils sont de plus disponibles dans un grand éventail de longueurs d’onde.

Les expériences décrites au chapitre 3 ont pour but de mesurer le taux de croissance du filament bactérien. Pour ce faire, les bactéries sont soumises à différentes périodes de croissance de durées précises. En alternant les longueurs d’onde des fluorophores utilisés pour marquer les filaments durant ces multiples périodes de croissance, nous obtenons des filaments marqués de 1, 2 ou 3 couleurs permettant d’obtenir un taux de croissance du filament en fonction de sa longueur initiale. Une exemple de double marquage est montré à la figure1.3.

1.4 Ablation laser

Les lasers sont des sources cohérentes de rayonnement optique pouvant générer beaucoup de lumière et pouvant être manipulées et fortement focalisées dans l’espace. En concentrant un faisceau dans un petit volume, il est possible d’obtenir une grande quantité d’énergie en un point précis. Les lasers sont donc utilisés dans de nombreuses applications pour modifier des matériaux et tissus (chirurgie oculaire, soudure, écriture de guide d’onde, etc.). L’utilisation de ces outils permet une flexibilité et un contrôle incroyable considérant la facilité avec laquelle on peut manipuler les faisceaux. Le dommage créé par un faisceau laser résulte généralement d’une élévation locale de la température du matériau.

Lorsque des tissus biologiques sont utilisés, l’utilisation de laser est très utile car le faisceau peut facilement être concentré en un point sous le micromètre lorsqu’un objectif à haute ouverture numérique est utilisé. Cependant, comme les structures biologiques sont petites et souvent très denses, les chercheurs ont dû développer des outils résultant en un dommage localisé amenant le minimum de dommages collatéraux. Par exemple, une façon d’étudier la fonction d’une cellule dans l’organisme C. elegans est de tuer cette cellule et d’observer le développement de l’organisme. L’élimination d’une neurone nous informe donc sur sa fonction dans l’organisme, soit la mobilité, se nourrir ou la sensibilité à son environnement [25]. Une technologie récente est utilisée pour obtenir ces résultats, le laser à impulsions ultra-brèves. La nature du dommage est intimement relié à la durée des impulsions ainsi qu’au taux de répétition. La durée des impulsions du laser utilisé pour les expériences de cette thèse est quelques dizaines de femtosecondes. Ce type de laser donne un dommage très local et produit très peu de chaleur, deux raisons importantes justifiant son utilisation. Les principes physiques à l’origine de la création de ce dommage est abordée dans cette section.

1.4.1 Mécanismes physiques provoquant des dommages

Le domaine de l’ablation laser à impulsions ultra-brèves est un sujet riche et très vaste [26,

Formation d’un plasma

Pour obtenir du dommage reproductible et localisé, un seuil d’éclairement énergétique (SEE) doit être atteint pour qu’un claquage optique2 _{soit obtenu. Le SEE des tissus biologiques} est très similaire à l’eau [27] et cette approximation sera utilisée ici. La figure 1.4 montre le processus de photo-ionisation multi-photonique qui débute la formation du plasma. Ce processus produit des électrons quasi-libres (qu’on appellera électrons libres par la suite). L’ionisation d’un électron dépend du milieux où se fait l’ablation (ici l’eau) et la longueur d’onde utilisée [27]. Le modèle accepté dicte que la photo-ionisation est proportionnelle à

Figure 1.4 – Processus d’ionisation multi-photonique entraînant une avalanche d’électons. Lorsqu’un électron est excité jusqu’au potentiel d’ionisation, il absorbe l’énergie d’autres pho-tons jusqu’au seuil représenté par la ligne pointillée (absorption par bremsstrahlung inverse) ; celui-ci obtient alors l’énergie nécessaire pour en exciter un autre. Ce processus se répète pour créer l’avalanche d’électrons libres. Figure tirée de [27]

𝐼𝑘_{, où 𝐼 est l’irradiance [W/cm}2_{] et k le nombre de photons nécessaire pour franchir la}

bande interdite de l’eau [27,28]. Comme la largeur de bande interdite de l’eau est de 6.5 eV, équivalent à 5 fois l’énergie d’un photon de 800 nm, k vaut 5 pour notre montage [30]. Une fois ionisés, les électrons absorbent par processus de Bremsstrahlung inverse l’énergie d’autres photons jusqu’à un seuil leur permettant d’exciter d’autres électrons. L’accumulation de ces étapes provoque une avalanche d’électrons libres tout au long de l’impulsion laser créant ainsi un plasma.

Claquage optique

Lorsqu’une densité critique d’électrons libres est atteinte, un plasma est créé. On parle ici du phénomène de claquage optique. Selon Vogel et al [27], le SEE provoquant un claquage optique mène à la création d’une densité d’électrons libres 𝜌_critique = 1021 _cm−3_{. La figure1.5}

illustre les valeurs de SEE (irradiance threshold, [W/cm2_{]) et d’exposition énergétique (radiant} exposure threshold, [J/cm2_{]) en fonction de la longueur des impulsions laser pour quelques}

longueurs d’onde. On remarque sur les 2 graphiques que la dépendance avec la longueur d’onde s’efface avec les durées d’impulsion plus courtes devenant même négligeable pour des impulsions femtosecondes [31]. De plus, malgré le fait que le SEE augmente avec des impulsions plus courtes, l’exposition énergétique déposée dans le milieu diminue [32]. Finalement, le SEE dépend très peu du coefficient d’absorption linéaire de l’eau (ou du matériau dans lequel s’effectue l’ablation) [33,32].

Figure 1.5 – SEE et exposition énergétique requis en fonction de la durée d’impulsion pour atteindre un claquage optique. Figure tirée de [27]

Ablation, cavitation et effets thermiques

Les longueurs d’onde choisies sont d’environ 700-1100 nm (proche infra-rouge), car la plupart des tissus biologiques sont transparents à ces longueurs d’onde [34] (Voir figure 1.6). De cette façon, il n’y a pas d’accumulation d’énergie due à l’absorption. Le plasma vaporise très localement le matériau visé et, lorsque la bulle3 _{se referme sur elle-même, une onde de choc}

3. La bulle formée par le phénomène de cavitation est de moins de 50 nm si on considère que l’énergie de l’impulsion est complètement absorbée [32]

est créée. En utilisant des impulsions de l’ordre de 100 fs, les dommages collatéraux créés par le phénomène de cavitation provoqué à la suite de la formation du plasma sont négligeables [32,25].

Figure 1.6 – Coefficient d’absorption de différents composés biologiques en fonction de la longueur d’onde utilisée. Figure tirée de [27]

Le taux de répétition typique des lasers femtosecondes (80 MHz) atténue grandement l’ac-cumulation de chaleur. En effet, comme le temps entre 2 impulsions est plus grand que le temps de diffusion de la chaleur, il n’y a pas de dommages thermiques reliés aux impulsions laser, et ce même lorsque celui-ci est couplé à un objectif à forte ouverture numérique (NA ≥ 0.9) [34,27]. On peut voir sur la figure 1.7l’accumulation de chaleur en fonction du taux de répétition du laser ainsi que du NA utilisé. La ligne pointillée représente la diffusion de la chaleur pour une seule impulsion. On peut voir qu’à un taux de répétition de 250 kHz (4 µm entre chaque impulsion) et un NA de 1.3, l’élévation locale de la température produite entre chaque impulsion est entre 0.01 et 0.001 K, ce qui est négligeable dans notre cas. Il est même possible avec notre montage expérimental de travailler à un taux de répétition de 1 kHz, ce qui diminue davantage l’élévation de température ainsi que les dommages collatéraux [25].

1.5

Interaction protéines/laser

Les protéines produites par les organismes vivants sont constituées d’une longue chaîne d’acides aminés. Cette chaîne doit se replier sur elle même d’une façon précise déterminée par le code génétique pour pouvoir être utilisée par la cellule. Ce repliement se fait habituelle-ment en trois étape, mais seulehabituelle-ment la première est spécifiée par le code génétique [35,36,37]. Un champ de recherche entier se penche depuis 50 ans sur la façon dont elles se replient ame-nant ainsi la mise en place de banques de données immenses comportant plus de 80000 façons possibles de repliements. Ce champs de recherche se penche aussi sur la prédiction de ces configurations. Les acides aminés sont liés ensemble par des liens peptides qui sont des liens

Figure 1.7 – Évolution de la température au centre du point focal du laser produit par un train d’impulsions de 100 fs à 800 nm dans l’eau pour différents NA et taux de répétition. Les lignes pointillées représentent l’élévation de la température pour une seule impulsion. La ligne rouge représente l’évolution de température pour une irradiation d’un laser continu avec la même puissance moyenne que le laser pulsé. Figure tirée de [27]

covalents [38]. Lorsque les chaînes se plient, les structures sont maintenues en place en majorité par des liens hydrogènes [1]. Ces faibles liens permettent aux protéines une grande flexibilité, mais ont comme désavantage qu’elles peuvent perdre leur forme ainsi que leur fonctionnalité lorsqu’elles sont exposées à des conditions trop rigoureuses [1].

Plusieurs travaux ont été réalisés sur l’appliquation de champs électriques intenses à l’aide de laser sur des protéines [25, 29,32, 39]. Ces champs sont créés en utilisant des impulsion laser ultra-courtes (femtosecondes). Comme mentionné à la section 1.4.1, le dommage créé par l’utilisation de ce type de faisceau se fait par l’ionisation des protéines par le plasma créé. Les effets mécaniques collatéraux reliés au phénomène de cavitation sont concentrés dans un volume de moins de 50 nm de diamètre. Comme ce volume est plus petit que le volume focal ou se trouve le plasma, on considère donc que les effets sont négligeables. On peut donc se demander de quelle façon seront affectées les protéines du filament une fois que l’ablation

laser ait eu lieu.

Une étude récente [39] a utilisé des impulsions laser ultra courtes (70 fs) pour vaporiser et étudier les conformations de protéines. L’utilisation de ce type d’impulsion laser permet le transfert de macromolécules à la phase gazeuse à pression atmosphérique. Cette découverte est surprenante considérant qu’une impulsion laser intense a plutôt tendance à ioniser et briser les molécules [39,25]. La clé de ce principe réside dans le fait que si la protéine est vaporisée avant qu’il y ait équilibre thermique, la conformation initiale pourra être conservée dans la phase gazeuse. Considérant le peu de dommages mécaniques et thermiques occasionnés par l’ablation laser femtoseconde on peut raisonnablement supposer que, lorsque le filament est brisé par une impulsion laser, les protéines à l’extrémité gardent leur conformation

1.6 Montage laser

Dans le but d’obtenir un montage expérimental robuste et automatisé, deux systèmes ont été mis en place pour stabiliser le faisceau. Premièrement, des miroirs stabilisent la position du laser en temps réel. Deuxièmement, la puissance d’entrée du faisceau dans le montage est finement contrôlée pour que celle-ci reste stable ou puisse être modifiée précisément et rapidement.

1.6.1 Stabilisation de la position

Le but recherché est de positionner un faisceau colimé pour qu’il remplisse complètement l’arrière de l’objectif d’un microscope inversé nous donnant ainsi un point focal très serré et donc un dommage très localisé. Comme de très faibles mouvements peuvent avoir de grandes conséquences sur l’endroit exact du faisceau focalisé lors de l’ablation et donc du dommage créé, la position du faisceau doit rester le plus stable possible. Ces faibles variations peuvent être de plusieurs natures (variations de température, vibrations d’une table ou causée par un ventilateur, etc.). Le parcours optique du laser femtoseconde utilisé s’étant sur environ 3 mètres puisque la source laser est située dans le local adjacent au laboratoire où se trouve notre montage. Pour garder la position du faisceau constante, un système de miroirs stabilisateurs (Optics in motion, Long beach, CA) a été installé.

Ce système repose sur deux miroirs à action rapide (fast stearing mirrors, FSM) secondés par deux détecteurs de position (position sensitive device, PSD). Ce système nous donne les degrés de liberté nécessaires pour obtenir un faisceau stable au µm près. La figure1.8montre un schéma du montage. L’utilisation de 2 miroirs au lieu d’un seul permet une correction à la fois de la position, et de l’angle d’entrée du laser dans le microscope. Une fois en fonction, les miroirs fonctionnent en boucle ouverte. Si le faisceau est coupé ou bloqué, les miroirs reviennent à leur position initiale. Si l’alignement des PSDs n’est pas modifié, la position du faisceau sur l’image de la caméra reste le même. Nous avons donc un système autonome de

Miroir 1 Miroir 2 Δ𝑋_𝑚𝑎𝑥 (µm) Δ𝑌_𝑚𝑎𝑥 (µm) 𝜎 ΔX (µm) 𝜎 ΔY (µm)

Fermé N/A 7,04 3,69 0,74 0,44

En fonction N/A 0,30 2,13 0,04 0,09

Fermé Fermé 7,78 20,11 1,44 2,01

En fonction En fonction 1,77 1,26 0,13 0,29

Table 1.1 – Performances du système de stabilisation laser. Δ𝑋_𝑚𝑎𝑥 et Δ𝑌_𝑚𝑎𝑥représentent l’écart entre les valeurs de positions minimum et maximum récoltées par l’oscilloscope. La déviation standard de la distribution des positions en X et en Y fut calculée par l’oscilloscope. Les résultats des deux premières lignes du tableau ont été obtenus en n’utilisant que le premier miroir et en lisant les positions à l’aide de PSD 1. Les résultats des deux dernières lignes ont été obtenus en lisant les positions à l’aide de la PSD 2.

stabilisation laser qui en plus accélère énormément l’alignement initial du laser en début de journée. PSD 2 PSD 1 FSM 1 BS 1 FSM 2 Obturateur Vers le mi crosc ope BS 2 Sortie du l aser femtoseconde Table 2 Mur Table 1

Figure 1.8 – Montage du système de FSM pour la stabilisation de la position du laser. Le faisceau est réfléchi par le FSM 1 qui le propage jusqu’à un miroir séparateur de faisceau (beam

splitter, BS) sur la deuxième table optique. La distance entre les deux tables est d’environ

3m. Une faible portion de la puissance est déviée vers la PSD 1 (environ 4%). Celle-ci est situé à la même distance du BS 1 que le FSM 2. Le miroir 1 s’assure donc que le faisceau reste toujours au centre du deuxième miroir. Le même principe recommence pour le FSM 2 avec 4% de la puissance restante réfléchie par le BS 2 vers la PSD 2 et le reste se rendant à un obturateur situé à la même distance du BS 2 que la PSD 2 contrôlant l’entrée du laser vers le microscope. Le deuxième miroir s’assure que le faisceau soit toujours aligné dans le milieu de l’obturateur. Le reste de l’alignement jusqu’au microscope se fait avec des miroirs standards.

Pour mesurer la performance du système, la position du faisceau en X et en Y sur les PSD sont lues par un oscilloscope durant une période de 5 minutes. Ces positions4 _{qui varient} dans le temps avec les fluctuations du laser sont obtenues à un taux d’acquisition de 85 Hz.

4. Les signaux données par les PSD sont en V. Sachant que le détecteur mesure 9 mm x 9 mm, on obtient un facteur de conversion de 0,45 µm/mV.

Taux de répétition 𝜆_centrale FWHM Puissance Δt

10 kHz ∼ 790 nm ± 30 nm 55-70 mW 75-100 fs

100 kHz ∼ 790 nm ± 30 nm 550-700 mW 75-100 fs

250 kHz ∼ 790 nm ± 30 nm 1.2-1.5 W 75-100 fs

Table 1.2 – Caractéristiques de la source d’impulsions laser fs utilisée (RegA). 𝜆_centrale re-présente la longueur d’onde centrale du laser. La largeur à mi-hauteur (Full width at half

maximum, FWHM) du spectre de fréquences du laser est aussi indiquée. Δt est la durée des

impulsions. Les 3 taux de répétitions sont ceux utilisés par les différents groupes partageant le laser.

La déviation standard de la distribution des positions est alors calculée par l’oscilloscope. Le tableau 1.1illustre les performances obtenues avec les FSMs pour différentes configurations. On remarque que la déviation standard de la position lorsque les miroirs sont en fonction est environ 11 fois plus petite en X et 7 fois plus petite en Y par rapport au système fermé. Malgré le fait que les mouvements soient relativement petites (de l’ordre de quelques µm), le système est crucial à l’alignement du faisceau laser. En effet, pour que les dommages laser soient très concentrés, le faisceau doit remplir l’arrière de l’objectif et ainsi être focalisé dans le plus petit volume possible. Comme les cibles d’ablation (filaments, corps de bactéries) sont de l’ordre de grandeur du µm ou moins, chaque µm de fluctuation doit être pris en compte et corrigé le plus possible. Ce système de stabilisation réussit sans problème à garder la position du faisceau stable durant les expériences ainsi que d’une journée à l’autre.

1.6.2 Stabilisation de la puissance

Le laser utilisé est un RegA 9000 (Coherent Inc.) Le taux de répétition est ajustable entre 10 -250 kHz avec une puissance jusqu’à 1.5 W (Voir tableau1.2). Comme le laser est partagé par différents groupes de recherche ne travaillant pas nécessairement avec les mêmes conditions expérimentales, nous avons mis en place un système de stabilisation de la puissance laser arrivant au microscope qui permet l’utilisation de la source laser en tout temps. Le but de ce système est de pouvoir profiter du laser indépendamment du taux de répétition dont se servent d’autres utilisateurs tout en contrôlant le taux que nous utilisons apour nos expériences. Il nous permet aussi de nous assurer d’une puissance stable dans le temps de même que la possibilité de la modifier rapidement et précisément.

Cellule de Pockels

L’effet Pockels provoque une biréfringence dans un milieu optique lors de l’application d’un fort champ électrique. L’indice de réfraction change de façon linéaire avec l’intensité du champ électrique. Lorsque l’axe optique du cristal est aligné avec la direction de propagation du faisceau laser, le cristal agit comme une lame de retard. En trouvant le voltage donnant un retard de 90°, on obtient une lame demi-onde modulable à l’aide d’un voltage contrôlable. Le

retard d’une cellule de pockels est donné par Δ𝜑 = 2𝜋𝑛3

0𝑟63𝑉 /𝜆0 (1.1)

avec 𝑟₆₃la constante électro-optique en 𝑚/𝑉 , 𝑛₀est l’indice de réfraction ordinaire du cristal, 𝑉 la différence de potentiel appliquée en 𝑉 et 𝜆₀ la longueur d’onde du laser dans le vide. Pour une lame 𝜆/2, Δ𝜑 = 𝜋, ce qui donne en utilisant (1.1)[40]

Δ𝜑 = 𝜋 𝑉

𝑉_𝜆/2 𝑉_𝜆/2 = 𝜆0

2𝑛3 0𝑟63

Pour nos conditions (𝜆₀ ∼ 800 nm), un voltage de 𝑉_𝜆/2 = 2.9 kV doit être appliqué pour obtenir une lame 𝜆/2.

Dans le but de pouvoir ajuster le taux de répétition nous avons installé une cellule de Pockels dans le trajet optique ainsi que 2 polariseurs linéaires, un avant et un après la cellule de Pockels. Lorsque les polariseurs sont croisés, cette combinaison agit comme un obturateur électronique. En effet, lorsqu’il n’y a aucun voltage d’appliqué, une très faible puissance laser passe au travers (en raison de l’imperfection des polariseurs). Cette puissance (quelques µW) est bien en deçà de la limite inférieure nécessaire à l’ablation laser. Lorsque le voltage est appliqué, une grande majorité de la puissance incidente est propagée. Comme le temps requis pour créer la biréfringence est d’environ 10 ns et que le temps entre 2 impulsions laser est au minimum de 4 µs, il devient alors possible de sélectionner des impulsions individuelles à un taux de répétition de notre choix allant jusqu’à un maximum de 1 kHz (ce maximum est limité par l’électronique d’alimentation de la cellule de Pockels). En synchronisant l’envoi du voltage avec les impulsions du déclancheur (trigger) laser, nous avons donc une sortie laser flexible indépendante de l’utilisation des autres groupes.

En plus de cet obturateur électronique, nous avons installé une lame 𝜆/2 sur un moteur rotatif à l’avant du premier polariseur. Comme le laser utilisé est polarisé, la lame fait tourner sa polarisation (voir figure 1.9) nous permettant avec l’aide du premier polariseur (P1) de modifier de façon rapide et robuste la puissance du laser. Pour obtenir la puissance maximum, la lame 𝜆/2 est tournée de façon à avoir la polarisation du laser alignée avec le premier polariseur. En variant l’orientation de la lame 𝜆/2, nous pouvons ainsi contrôler la puissance se rendant au microscope. Finalement, un programme LabView a été fait en collaboration avec Sébastien Fournier-Laberge dans le cadre d’un cours Projet contrôlant la puissance entrant au microscope. Dans le but de ne pas avoir à manipuler plusieurs éléments chapeautant l’accès du laser (cellule de pockels, obturateurs, lame 𝜆/2), ce programme a été mis sur pied pour regrouper le tout sur une seule et même interface. La figure1.10montre une version schématisé des éléments du parcours optique.

θ

θ

θ

Figure 1.9 – Lame 𝜆/2 montrant comment le changement de phase est accumulé par la lame retardatrice. Dans cet exemple, la polarisation à 45° (oscillant dans les cadrans 2 et 4 est tournée de 90° (oscillant dans les cadrans 1 et 3). Pour une polarisation générale linéaire, celle-ci est tournée de 2𝜃 par rapport à l’axe optique de la lame 𝜆/2. Figure reproduite avec l’autorisation de [40]

Pour calibrer le montage, les deux puissance-mètres sont reliés à l’ordinateur ainsi que le moteur contrôlant la lame 𝜆/2. Un programme LabView fait faire un tour complet de la lame 𝜆/2 et enregistre les mesures de puissance avant et après la cellule de Pockels. Une fois cette courbe acquise, le deuxième puissance-mètre est retiré du trajet optique et la puissance sur le premier puissance-mètre est utilisé en temps réel pour contrôler le moteur de la lame 𝜆/2. La puissance voulue est entrée et le moteur stabilise cette puissance. Le programme contrôle également l’ouverture et la fermeture du deuxième obturateur ainsi que le voltage envoyé à la cellule de Pockels pour contrôler le nombre d’impulsions laser.

Ce programme permettrait donc en théorie de stabiliser en temps réel la puissance à l’entrée du microcope à une précision de quelques µW. Les expériences réalisées dans cette thèse ont cependant été effectuées avec des ajustements manuels de la puissance avec le moteur rotatif de la lame 𝜆/2 dû à la durée relativement courte des expériences. La puissance laser restait assez stable au cours des expériences pour nos besoins. Cependant, lorsque des expériences plus longues seront réalisées dans le futur, ce montage sera très avantageux pour assurer la stabilité de la puissance laser dans le temps.

CP FSM 2 BS 1 Obturateur 1 Vers microscope PM 1 WP P 1 Obturateur 2 P 2 Miroir Miroir BS 2 PM 2

Figure 1.10 – Montage stabilisant la puissance laser. Le faisceau ayant été précédemment stabilisé en position par les FSM, il peut ensuite continuer le trajet vers le microscope lorsque le premier obturateur (S1) est ouvert. Il passe ensuite par la lame 𝜆/2 qui fait tourner la polarisation du laser pour passer par le premier polariseur linéaire (P1) laissant passer la polarisation aligné avec l’axe de la cellule de Pockels (CP). Comme les séparateurs de faisceau (BS) sont dépendant de la polarisation, le faisceau est polarisé avant celui-ci. Une faible partie du faisceau (∼ 4%) est dirigée vers le premier puissance-mètre (PM1). Le faisceau passe ensuite par la CP et par le P2 et est dirigé vers le microscope. Un deuxième PM peut être ajouté directement dans le trajet optique ou après un BS pour s’assurer de la puissance ou lors de la calibration.

Chapitre 2

Single-cell analysis of flagellar

filament re-growth after damage by

laser ablation

2.1

Avant-propos

L’idée originale de ce projet fut élaborée quelques années avant mon arrivée dans le groupe de recherche par Dr. Kelly T. Hughes ainsi que Dr. Simon Rainville en collaboration avec Dr. Mathieu Gauthier qui était alors en cours de doctorat. Lors d’un séjour à l’université Laval du Dr. Hughes, un premier essai fut tenté avec le laser femtoseconde pour tenter de couper des filaments et de les revisiter par la suite. La courte durée du séjour de même que la grande difficulté technique de ce projet firent en sorte qu’aucun résultat ne fut obtenu. Durant la conférence BLAST de 2011 à Nouvelle-Orléans, nous avons rencontré le Dr. Marc Erhardt, ancien étudiant du Dr. Hughes. Le laboratoire du Dr. Erhardt avait développé auparavant une souche de Salmonella enterica ne produisant qu’un ou deux filaments. En utilisant cette souche, nous avons mis au point à l’Université Laval une nouvelle procédure expérimentale qui a mené aux résultats présentés dans ce chapitre sur le mécanisme de croissance du filament bactérien.

Ces travaux ont pour but de répondre à la question suivante : Un filament peut-il continuer de s’assembler après avoir été coupé ou cassé ? Cette question étant encore au coeur de débat au sein de la communauté, nous avons voulu amener une autre perspective en utilisant un faisceau laser à impulsions ultra courtes comme outil pour briser des filaments bactériens. Cette nouvelle méthode a permis d’obtenir des résultats intéressants allant à l’encontre de la littérature existante.

Ce manuscrit est donc la version initiale qui fut présenté à la revue Scientific Reports. Après certains commentaires des évaluateurs, des expériences supplémentaires ont été réalisées par

le laboratoire du Dr. Erhardt concernant principalement le shearing. D’autres expériences de marquage du Cap du filament à l’aide de nanoparticules d’or ont aussi été complétées. Des modifications ont donc été apportées au manuscrit pour ajouter ces éléments et l’article a été resoumis depuis. Dans le but de faire le point sur les expériences réalisées dans notre laboratoire, ce chapitre reproduit le manuscrit original comportant exclusivement le travail que j’ai réalisé au cours de ce doctorat. Ce chapitre est donc rédigé en anglais et sous format article avec le titre original qui a aussi été modifié. Le texte final révisé et comprenant les expériences de nos collaborateurs a été accepté pour publication dans Scientific Reports et se retrouve à l’annexeA. Cet article fut publié le 28 avril 2017[41].

2.2 Résumé

Plusieurs types de bactéries peuvent se déplacer dans leur milieu à l’aide de flagelles rotatifs. Les filaments flagellaires peuvent atteindre plusieurs fois la longueur du corps à l’extérieur de la cellule. Ceux-ci sont composés d’un assemblage de plusieurs milliers de protéines iden-tiques appelées flagelline. Ces flagellines sont exportées dépliées dans un canal de sécrétion et sont assemblées à l’aide d’une protéine agissant comme bouchon au bout du filament. Nous répondons ici à la question suivante : Un filament peut-il former un nouveau bouchon (cap) et continuer de s’assembler après avoir été endommagé ? D’importants défis techniques ont dû être résolus dans le but de pouvoir conduire les expériences au niveau d’une cellule unique. Les filaments furent visualisés à l’aide de marquages fluorescent et furent individuellement cou-pés par ablation laser. Après une période de croissance, ces mêmes filaments furent marqués d’un second fluorophore de différente couleur et revisités pour tenter d’observer une reprise d’assemblage. Aucune croissance supplémentaire ne fut observée après l’ablation nous suggé-rant que l’assemblage fut arrêté de façon permanente. Nous concluons donc que les filaments flagellaires ne peuvent reprendre leur croissance suivant un dommage mécanique produit par ablation laser. Cette conclusion est en opposition avec l’observation qu’un filament peut re-prendre sa croissance suite à un endommagement par cisaillement (shearing). La possibilité d’une reprise de croissance d’un filament dépend donc de la méthode utilisée pour le briser.

2.3 Abstract

Many bacteria swim by rotating long appendages called flagella. Flagellar filaments are as-sembled from thousands of subunits that are exported unfolded through a secretion channel and added at the tip of the filament with the help of a capping protein. The assembly of a flagellum uses a significant proportion of the biosynthetic capacities of the cell. Here, we address the simple yet significant question whether a flagellar filament can form a new cap and continue to grow after being damaged. Important technical challenges had to be overcome to test this on a single-cell level. Filaments were visualized by fluorescence microscopy and

cut individually using laser ablation. After a growth period, the exact same filaments were labeled again with a fluorophore of a different color and revisited to examine re-growth. No re-growth was observed on filaments that had been cut (independent on overexpression of the capping protein FliD), suggesting that the growth of filaments was permanently stopped. We thus conclude that flagellar filaments do not re-grow after mechanical damage using laser ablation. This result contrasts with the observation that filaments broken by mechanical shear do re-grow. Hence, whether a filament can re-grow or not depends on how it was broken.

2.4 Introduction

The bacterial flagellum of enteric bacteria consists of three main structural parts : (i) a basal body complex that spans the inner to the outer membrane and is embedded in the cell wall ; (ii) an external, flexible linking structure (the hook) and (iii) a rigid, helical filament made of several thousand flagellin subunits[16,13]. The basal body complex harbors a flagellum-specific protein export machine [13]. This flagellar-specific type-III secretion system exports most extra-cytoplasmic building blocks of the flagellum in a proton motive force (PMF) dependent manner[14,15]. Secreted flagellar substrates travel through a narrow channel to the tip of the growing flagellum where they self-assemble with the help of capping proteins[13,42]. The flagellar filament is connected to the basal body and the hook structure via two hook-associated proteins (FlgK, FlgL or HAP1, HAP3) and polymerization of filament subunits (flagellin, FliC or FljB in Salmonella enterica) requires the filament cap protein (FliD or HAP2)[22,23].

In Salmonella enterica, expression of flagellar genes is temporally coupled to the assembly state of the flagellum and ordered in a transcriptional hierarchy of three promoter classes[43,

44]. The flagellar master regulatory complex FlhDC is expressed from the Class 1 promoter and directs RNA polymerase together with 𝜎70 _{to transcribe from Class 2 promoters. Gene}

products expressed from Class 2 promoters include the components of the hook basal body complex, as well as regulatory proteins, e.g. the flagellar-specific, alternative 𝜎28 _{factor and}

its cognate anti-𝜎 factor FlgM. The completion of the hook-basal-body complex results in a switch in secretion specificity within the type-III secretion apparatus from secretion of early (hook basal body-type) substrates to the secretion of late (filament-type) substrates. After the switch in secretion specificity, FlgM is secreted as a late substrate thus freeing 𝜎28_{to activate}

transcription from Class 3 promoters[18]. Class 3 gene products are needed for completion of the flagellum (e.g. the filament subunits, the filament cap, the motor-force generators) and the chemotaxis system. Thus, by secreting the FlgM protein after the secretion specificity switch, the cell ensures that genes needed after hook basal body completion are only expressed after a functional hook basal body complex has been assembled.

The flagellar filament consists of several thousand subunits of flagellin and grows to a length of 10 to 15 µm. It is presumed that shearing of flagellar filament frequently occurs in nature, however it is not clear if a sheared flagellum can re-grow[45]. A sheared flagellum would need to re-assemble the filament cap structure, as the original cap would have been removed by the shearing event. In Salmonella enterica, the filament cap gene is transcribed from both a Class 2 and a Class 3 promoter[46]. The presence of FliD cap protein prior to hook basal body completion would allow for an efficient transition to filament assembly after the switch in substrate specificity. FliD expressed from its Class 2 promoter would be secreted together with FlgM prior to flagellin gene expression, thereby circumventing competition with flagellin secretion. FliD might be expressed from its Class 3 promoter in case of a shearing event to allow the formation of a new cap, which would be a prerequisite for the regeneration of a sheared filament.

Rosu and Hughes have previously analyzed the dynamics of Class 3 gene expression after flagellar shearing in S. enterica[45]. FlgM is constantly secreted during flagellar growth and it was presumed that the rate of secretion decreases exponentially with length of the filament[47]. Thus, shearing of a filament would result in a sudden increase in the rate of FlgM secretion, which would result in a burst of Class 3 gene expression needed for filament regeneration. However, the levels of intracellular FlgM and Class 3 gene expression remained unchanged after flagellar shearing[45].

In a recent study, Turner and colleagues used fluorescent bi-color labeling of flagellar filaments to measure filament growth in Escherichia coli in a population-approach[48]. They used dif-ferential fluorescent labeling of flagellar filaments to distinguish new filament growth from old filament growth and concluded by measuring the length of hundreds of filaments that the growth of filaments is independent of their length. By comparing the length distributions of a population that had not been sheared with one that had been sheared, the authors concluded that flagellar filaments of E. coli that were broken by mechanical shearing by viscous forces continued to grow.

In this study, we examined whether filament re-growth occurs after mechanical damage on an individual cell basis. To meet this challenge, we first used a S. enterica mutant that assembled only a single filament. Then ultrashort laser pulses were used to cut individual filaments in a process called laser ablation. Finally, a motorized microscope stage allowed us to revisit the filaments that were damaged after a two-hour incubation period and a second fluorescent labeling of a different color. The experimental setup is shown in Figure2.1.

This is yet another example of the enormously fruitful approach of working at the single cell level, which often reveals crucial aspects hidden in population observations. We envision that the specific methods developed here consisting of laser ablation to disrupt individual cellular systems coupled with time-lapse microscopic approaches will be applicable to a number of

Figure 2.1 – Schematic of the experimental setup. The femtosecond laser is added to the optical axis through a dichroic filter (DF) and focused on the sample with a 100X 1.3 NA objective. The same objective is used for fluorescence imaging. The sample is illuminated with a broadband light source and a fluorescence cube selects the excitation and emission wavelengths. The bacterial filaments are then visualized on an EMCCD camera. Every figure in this chapter is taken from [41]

different single-cell applications in the study of microbial physiology.

2.5

Results

In order to unambiguously identify individual filaments on a microscope slide over multiple hours, we required the majority of cells to possess on average a single filament. A serendi-pitous discovery was made that a strain deleted for the fliO gene, harboring a PflhD P1 and P4 promoter up mutation[49] and in addition missing the anti-𝜎 factor FlgM (termed ΔfliO*) preferentially assembled only a single filament (Figure 2.2). The FliO component of the flagellar-specific type-III secretion apparatus is essential for export apparatus function and a ΔfliO strain is non-flagellated under normal export substrate conditions[50, 51]. Ho-wever, it was recently found that the requirement for fliO could be bypassed by mutations in

fliP[52]. We found that the ΔfliO* strain retained slight motility in soft-agar plates (Figure

2.2A) and that more than half of the cells of the ΔfliO* strain produced at least one flagellum (Figure2.2 B and C).

We next introduced a single cysteine amino acid substitution (T237C) in the flagellin fliC into the ΔfliO* strain to allow observation of flagellar filaments by fluorescent microscopy. Residue T237 in the variable loop of the FliC flagellin of S. enterica was chosen for cysteine substitution

Figure 2.2 – (A) Enhanced motility of strain TH16123 that is deleted for fliO and that has increased flagellar gene expression resulting from deletion of the negative-regulator FlgM and a promoter-up mutation in the flhDC operon (ΔfliO*). Motility plates were incubated overnight for 18 hours before imaging. The parental strain TH10548 deleted for fliO displays a non-motile phenotype. (B) Fluorescent microscopy analysis revealed the preferential forma-tion of a single flagellum in the ΔfliO* strain TH16123. Exemplary fluorescent microscopy image of the ΔfliO* strain. Flagellin FliC was immunostained as described in Materials and Methods. Membranes were stained using FM-64 and DNA using DAPI. Scale bar 2 µm. (C) Quantification of numbers of flagella per cell of the ΔfliO* strain by anti-FliC immunostai-ning. (D) Graphical visualization of the surface localization of the cysteine-substituted residue T237 (shown in red) using PDB no. 1IO1 of flagellin. (E) Relative swimming motility of strain TH9671 harboring a T237C substitution in the flagellin FliC compared to the wildtype control TH6232. Swimming motility was assayed using soft-agar swimming plates containing 0.3 % agar.