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Dégénérescence et régénération musculaires associées à l'infection au Mycobacterium ulcerans

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Academic year: 2021

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Germain Mabèrou HOUNGBEDJI

Dégénérescence et régénération musculaires associées

à l'infection au Mycobacterium ulcérons

Thèse présentée

à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval

dans le cadre du programme de doctorat en médecine expérimentale (réadaptation) pour l'obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)

FACULTE DE MEDECINE UNIVERSITÉ LAVAL

QUÉBEC

2010

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Résumé

L'ulcère de Buruli (UB) est une maladie infectieuse émergeante ulcéro-nécrotique et hautement invalidante causée par le Mycobacterium ulcerans (M. ulcerans). À l'heure actuelle, l'UB sévit dans plus de 30 pays au monde et touche sept mille nouvelles personnes par an. La plupart des sujets infectés habitent les zones tropicales et subtropicales pauvres des pays de l'Afrique au Sud du Sahara. Les données épidémiologiques indiquent qu'environ 3 sujets atteints sur 4 sont des enfants âgés de moins de 15 ans. Parmi eux, 58% porteront à la fin de la maladie des séquelles invalidantes : fibrose, ankylose ou même amputation. De plus, la caractérisation de l'impact musculaire de M. ulcerans et de sa toxine mycolactone n'avait jamais fait l'objet d'une étude alors que les observations cliniques des sujets porteurs des séquelles suggèrent une atteinte musculaire.

À partir d'un modèle expérimental utilisant des souris C57BL/6, nous avons montré que la présence de M. ulcerans et/ou de sa toxine entraîne une dégénérescence musculaire caractérisée par une réponse inflammatoire chronique et une nécrose des myofibres, laquelle dégénérescence était suivie six semaines après l'infection d'une absence de régénération, d'une diminution de la masse musculaire et d'une fibrose des tissus nécrosés. Les analyses d'immunobuvardage à la quantification des gènes (E3) atrogin-1/MAFbx et MuRF-1 ont également indiqué une régulation positive de la voie ubiquitine-protéasome. Les niveaux de ces gènes dans les muscles atteints sont respectivement de 7,4 et 3,0 fois plus élevées que dans les muscles contrôles suggérant que l'atrophie observée résultait d'une protéolyse. Ces données histologiques ont été également renforcées par le résultat des explorations fonctionnelles qui a indiqué une perte de 31% et 45% de la force maximale isométrique spécifique (sPn) développée respectivement par les muscles biceps situés à proximité de l'infection et les muscles solei injectés de mycolactone. Le nombre de fibres centronucléées ainsi que les niveaux des facteurs de régulation myogénique MyoD et myogénine sont demeurés faibles et stables sur toute la période d'étude. Ensemble, ces données suggèrent une perturbation voire une absence de la régénération des fibres

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d'évaluer leurs propriétés rhéologiques. Les données recueillies ont montré une réduction de la compliance de ces muscles en particulier, les muscles solei injectés de mycolactone dont la rigidité avait augmenté de 56% et le temps de demi-relaxation baissé de 46% par rapport aux contrôles. Ces derniers résultats corroborent parfaitement l'augmentation de

134% du contenu total en hydroxyproline dans ces muscles suggérant que la raideur avait été causée par la fibrose.

Bien que d'autres études in vivo et in vitro soient nécessaires pour comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels le M. ulcerans et sa toxine nécrosent le tissu musculaire, ces résultats viennent établir pour la première fois que l'ulcère de Buruli n'est pas seulement une maladie de la peau, mais une infection qui entraîne une dégénérescence musculaire suivie d'une absence de régénération, d'une atrophie et d'une fibrose. Nous espérons que ces données pourront servir de tremplin pour le choix de nouvelles stratégies en regard au diagnostic, aux médicaments et à la réadaptation des sujets souffrants d'UB.

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Abstract

Buruli ulcer (BU) is an emerging ulcero-necrotic and very debilitating infectious disease caused by Mycobacterium ulcerans (M. ulcerans). BU is widely distributed in over 30 countries, but is mainly concentrated in the poorest countries of Central and Western Africa. Currently, seven thousands new subjects are infected annually around the world. The disease occurs mainly in children under 15 years of age. While 58% among them will experience contracture, fibrosis and functional limitation of range of motion, no studies has investigated the impact of M. ulcerans infection on skeletal muscle.

Using an experimental model of C57BL/6 mice, we showed that the M. ulcerans and its toxin mycolactone caused muscular degeneration which is characterized by a chronic inflammatory response and myofiber necrosis which is followed by a loss of muscle mass, fibrosis and absence of muscle regeneration six weeks post-infection. Western blot analysis performed on these muscles demonstrated an upregulation of ubiquitin-proteasome pathways. Muscle specific ubiquitin-ligase (E3) atrogin-1/MAFbx and MuRF-1 rose respectively by 7.4 and 3.0 folds suggesting that these proteolytic pathways are involved in muscle atrophy. Consistent with these observations our functional data indicated a 31% and 45% decrease in maximum isometric specific force (sPo) in proximate-infected biceps muscle and mycolactone loaded solei respectively. The number of centronucleated myofibers and the levels of myogenic regulatory factors MyoD and myogenin were also weak and stable suggesting a perturbation in the regenerating process. Furthermore, rheological properties of the solei muscles showed that stiffness had rose by 56% and half relaxation time decreased to 46% in loaded muscles with mycolactone relative to control muscles. Together, these results fit perfectly with the 134% increase in muscle total hydroxyproline suggesting that fibrosis is responsible for the increase in muscle stiffness. Although further in vivo and in vitro studies are needed to clarify the molecular mechanisms by which M. ulcerans, and mycolactone lead to muscle necrosis, the present results showed for the first time that BU is an infectious disease that goes well beyond the

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hope that these data will unravel new strategies for the diagnosis, treatment and rehabilitation of BU patients.

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Avant-propos

La dégénérescence et la régénération musculaire sont deux processus physiologiques normaux strictement imbriqués qui succèdent à une agression des tissus musculaires d'origine traumatique, infectieuse ou d'immobilisation. Elles impliquent un système complexe de cellules et de molécules biologiquement actives. Au début de mes travaux de recherche, rien n'était connu de l'état du muscle squelettique situé à proximité de l'infection provoquée par le M. ulcerans. Sur la base des connaissances cliniques et empiriques de cette maladie infectieuse à forte propension invalidante, j'ai émis l'hypothèse que le M. ulcerans avait une incidence musculaire. Les résultats de mes investigations, analysés et publiés sous formes d'articles dans le journal Microbes and Infection (chapitres II et UI), en préparation (chapitre IV) ou soumis pour publication au journal Médecine/Sciences (chapitres V), constituent le corps de la présente thèse.

Les mises au point des différents protocoles, la réalisation des expérimentations in vivo et in vitro, les manipulations et la collecte des données histologiques, histochimiques, biochimiques, immunobuvardages (Western blot) et fonctionnelles ainsi que l'analyse des résultats, la confection des figures et la rédaction des articles ont été toutes entièrement faites par moi-même. J'ai aussi contribué efficacement aux côtés de mon directeur Jérôme Frenette à l'amélioration continue de chaque article que j'ai rédigé jusqu'à la version finale publiée ou soumise.

Enfin, le chapitre VI présente une discussion générale et fait ressortir les limites, les justifications, les perspectives et les champs d'investigations connexes émergents à l'issue

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Dédicaces

A

L'Eternel mon Dieu.

D T'a plu de me conduire jusqu'à la fin de ce cursus.

Je te prie de faire de moi un chercheur co-ouvrier dans ta créature, un instrument précieux et agréable à tes yeux. « Je bénirai l'Eternel en tout temps, sa louange sera toujours dans ma bouche » (Psaumes 34 :2). Car, « ...ce n'est ni par la puissance ni par la force, mais par mon esprit dit l'Éternel des armées » (Zacharie 4 :6). C'est pourquoi, je ne cesserai de témoigner et d'exhorter en disant : « Gravissez la première marche de la foi, inutile de voir tout l'escalier, gravissez juste la première marche » Martin Luther King (1929-1968). A Toi donc, Éternel mon Dieu, soient honneur, gloire et magnificence aux siècles des siècles. Amen !

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l \ Toute ma famille, en particulier à la mémoire de mes bien-aimés Ruben, Cécile, Aanou et Martin, respectivement mon fils, mon épouse, ma mère et mon père, tous décédés courant de ce travail qu'ils ont voulu et soutenu dès sa genèse. Ma douleur reste vive. Le vide créé par leur absence est immense. En cette circonstance, j'aimerais leur adresser quelques mots. Peut-être qu'ils m'entendront ?

Okry Ruben, tu avais été formé et responsabilisé pour t'occuper du système de communication entre la famille et moi; un travail que tu avais commencé avec zèle. Mais hélas, deux semaines avant mon départ de Cotonou pour l'Université Laval tu es passé de la vie à la Vie autrement dit, la mort t'a fauché sur le chemin de l'honneur brisant ainsi l'espoir de toute la famille.

Et toi Cécile Togbossou, me voici à la fin de la première étape du rêve commun que nous avons eu : contribuer à comprendre ce qui se passe dans les muscles squelettiques des enfants rendus invalides à vie par l'ulcère de Buruli (UB). Bien qu'à l'époque nous ne sachions pas comment y parvenir, nous y avions cru. Ta foi inébranlable te rassurait que Dieu répondra à nos multiples prières et jeûnes si cela était dans son plan pour notre vie. Et cela fut fait. Puis pour faciliter mon détachement et me rendre libre de tout souci, tu t'étais engagée en ta qualité d'épouse et amie, comme conseillère et pilier de notre foyer. Mais alors que tout était bien parti, les problèmes commencèrent. D'abord ce fut la mort de notre fils Okry Ruben après seulement trois jours de fièvre; ensuite les troubles politico-militaires dans un pays voisin avec la fermeture complète de ses frontières pourtant il me fallait traverser ce pays pour me rendre au Ghana chercher mon visa pour le Canada. Tu fus ferme, présente et encourageante. Jusqu'en fin décembre 2005, tu avais ton oreille collée au téléphone afin de m'assurer ton soutien depuis l'autre côté de l'Atlantique. Mais pour m'affaiblir davatange, la mort vint t'enlever, me replongeant profondément dans l'affliction. J'ai erré dans un désert vaste et profond. J'ai exercé ma foi aux côtés de la science. Je suis encore faible, mais j'ai compris que dans ma détresse, le Seigneur était plus que jamais présent. Maintenant que le rêve s'accomplit, pendant combien de temps vais-je t'attendre Cécile?

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Quant à vous maman et papa, vous m'avez appris que « tant qu'il y a à faire, c'est que rien n 'est fait ». Je vous remercie pour votre amour.

Enfin, où que vous soyez tous, recevez mes sentiments de profonde gratitude. A bientôt; je vous aime.

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Remerciements

Depuis le Bénin, choisir travailler avec le Dr Jérôme Frenette ou avoir son projet sélectionné parmi le projet des nombreux étudiants qui se bousculent à la porte de son laboratoire provient-il d'un hasard? La question demeure et la réponse me parrait philosophique. En 2004, en acceptant m'ouvrir la porte de son laboratoire, le Dr Jérôme Frenette avait commencé à écrire avec moi une nouvelle page de ma vie. Par ce geste, il m'a donné l'opportunité de réaliser mon projet de recherche. Ce qui m'a permis d'apprendre et de grandir. En sa qualité de scientifique expérimenté, riche en amour et suffisamment fort des expériences personnelles qu'il a vécues, Jérôme a su me suggérer aux bons moments des conseils et m'accompagner dans des anticipations nécessaires à l'accomplissement de mon rêve. Au labo comme en dehors du labo, Jérôme a toujours créé à l'équipe que constitue le personnel qui travaille avec lui, un environnement très convivial. Par exemple, lors de nos activités à Cap santé, Éliane et lui nous ont toujours réservé un accueil chaleureux. Je me souviendrai des bons moments que nous avons partagés durant le congrès mondial de l'OMS sur l'UB qui s'est tenu au Bénin, notre aventure au parc de Penjari, la nuit à la belle étoile sur le bord du lac Ahémé.... Dans l'ensemble mes cinq années passées sous sa direction resteront je n'en doute point, parmi les plus belles de ma vie. Bon succès et que Dieu bénisse les œuvres de tes mains Jérôme.

La réalisation de mon travail a été également facilitée par l'implication de mes filles Danielle, Ruth et Esther Houngbédji ainsi que leurs cousines Joséphine Tchanou et Perpétue Idjiwa, leur cousin François Adjidomè, mon jeune frère Vincent Houngbédji, ma sœur Véronique Houngbédji, mon grand frère le pasteur Thomas Idjiwa et tous mes parents et beaux-parents. Les filles, ont gardé le cap. Leur écoute active a été très reconfortante. François a accepté de rejoindre les filles et partager quatre années de sa vie avec elles. Le pasteur a laissé sa fonction de responsable régionale au centre du pays pour se rapprocher des filles à Cotonou. Il a fait plusieurs fois par semaine, la navette entre sa résidence et mon domicile. Elisabeth et Jacques Koussé étaient présents malgré leur occupation. Le Dr Raphael Dègbédji s'était impliqué au début pour l'obtention de mes prêts bancaires. A

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Plusieurs membres passés et présents de l'équipe des Drs Jérôme Frenette et Claude H. Côté à savoir : David Marsolais, Charles Godbout, Nicolas Dumont, Élise Duchesne, l'étudiante d'été Rosalie Bilodeau et l'assistant Patrice Bouchard, ont influencé d'une manière ou d'une autre mes activités au laboratoire. Je me souviendrai des chaudes discussions sur l'injustice et les dérives de la société humaine animées par Charles Godbout et bien d'autres encore. A chacun d'eux un grand merci.

J'adresse mes remerciements au Dr Claude H. Côté qui a été une personne spéciale, ouverte à toutes nos sollicitations tant scientifiques qu'informatiques. J'ai beaucoup appris en le côtoyant. Nous avons également vécu ensemble des moments de bonheur aux soupers traditionnels de Noël chez lui et sa blonde Claire à qui j'adresse ici mes sincères remerciements pour les messages encourageants qu'elle m'avait adressés durant les moments difficiles que j'ai traversés et à l'occasion de mes anniversaires.

J'adresse aussi mes chaleureux remerciements au personnel du Centre National Hospitalier et Universitaire de Cotonou (CNHU-C), aux chefs du service de rééducation et de réadaption fonctionnelle du CNHU-C passés et actuel à savoir : les Drs Honoré Odoulami, Léonard Jijoho Padonou et Toussaint G. Kpadonou.

Je dis un grand merci aux amis, frères et sœurs en Christ, en particulier à Aline Afora et ses frères Amen et Arnaud, à Marie-France Lapierre, Anne et Denis Thibault, Lucie Dogbé, Elisabeth Loko, Léon Biaou, Damien Asseya, Jean Aliou, Bazoumana Ouattara, Comi Mati et Alphonse Gaglozoun.

Enfin, j'adresse un cordial remerciement à tous mes amis qui sont au Bénin, aux Drs Célestin Y. Y. Hounkpè et Gilbert Dossou AVODÉ respectivement ancien Vice-Recteur de l'Université d'Abomey-Calavi au Bénin et ancien Vice-doyen de la Faculté des Sciences de la Santé de Cotonou au Bénin, à l'association des Béninois de Québec ainsi qu'aux membres du jury qui, malgré leurs occupations, ont pu consacrer une partie de leur précieux temps à l'évaluation de ma thèse.

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Table des matières

Résumé ii Abstract iv Avant-propos vi Table des matières xii Liste des figures xviii

Chapitre I : Introduction générale 1 1.1. Problématique et raison de notre projet de recherche 2

1.2. L'infection aux Mycobacterium ulcerans (ulcère de Buruli) 5

1.2.1. Définition de l'Ulcère de Buruli 5

1.2.2. Historique 6 1.2.3. Epidemiologic 7 1.2.4. Agent causal et mode de contagion 9

1.2.5. Réponse immunitaire et pathogénie de TUB 16 1.2.5.1. Réponse immunitaire et balance Thl/Th2 16 1.2.5.2. Mécanismes pathologiques du M. ulcerans et réponses immunitaires....21

1.2.6. Manifestations cliniques 27 1.2.6.1. Étude clinique de l'UB 27 1.2.6.2. Stade pré-ulcératif 27 1.2.6.3. Stade d'ulcération 30 1.2.6.4. Stade de guérison 30 1.2.7. Les complications et autres formes cliniques 30

1.2.8. Diagnostic 31 1.2.8.1. Diagnostic positif 31

1.2.8.2. Diagnostic différentiel 33 1.2.9. Moyens et méthodes de traitement 33

1.2.9.1. La chirurgie : 33 1.2.9.2. Le traitement médicamenteux : 34

(13)

1.2.11. Prévention 37 1.2.11.1. Hygiène vestimentaire et soins des blessures cutanées fraîches 37

1.2.11.2. Le vaccin 37 1.3. Le muscle squelettique 39

1.3.1. Structures histologiques du muscle squelettique 39

1.3.1.1. Description 39 1.3.1.2. Biomécanique contractile 42

1.3.2. La dégénérescence musculaire 45 1.3.2.1. Modèles expérimentaux , 45

1.3.2.1.1. Les aminoamides et aminoesters (Marcaïne, lidocaïne.) 45 1.3.2.1.2. Les endotoxines ou antigènes bactériens (LPS et LTA) 46 1.3.2.1.3. Les extraits des venins de serpents (phospholipases A2) 47 1.3.2.2. Implication de la réponse inflammatoire dans la dégénérescence

musculaire 48 1.3.3. La régénération musculaire 49

1.3.3.1. Chronologie et participation des acteurs de la réponse inflammatoire dans

la régénération musculaire 49 1.3.3.2. Implication des cellules satellites 51

1.3.3.3. Les facteurs de régulation myogénique (MRFs) 53

1.3.3.3.1. MyoD 53 1.3.3.3.2. Myf5 et Myf6 54

1.3.3.3.3. Myogénine (Myf4) 55 1.3.3.4. Les facteurs de croissance et leurs voies de signalisation 57

1.3.3.4.1. La protéine TGF-p 57 1.3.3.4.2. La protéine CTGF 58 1.3.3.4.3. IGF-1 et Les voies IGF-1/PI3K/Akt et IGF-1/MAP-Kinase 60

1.3.3.4.4. Notch, voie de signalisation et interaction avec les voies HGF/c-Met

etPI3/Akt 63 1.3.4. Régénération musculaire incomplète 65

(14)

1.4. Objectifs 69 Chapitre II : L'injection sous-cutanée de Mycobacterium ulcerans provoque une

nécrose, une réponse inflammatoire chronique et une fibrose des tissus

musculosquelettiques 72 Subcutaneous injection of Mycobacterium ulcerans causes necrosis, chronic inflammatory

response and fibrosis in skeletal muscle 73

2.1. Introduction 76 2.2. Material and methods 77

2.2.1. Animals 77 2.2.2. Mycobacterium ulcerans 77

2.2.3. Injection procedures 77 2.2.4. Histological and immunohistological analyses 78

2.2.5. RNA isolation, reverse transcription and gene detection by real-time

polymerase chain reaction 78 2.2.6. Assessment of muscle damage 79

2.2.7. Passive mechanical properties and hydroxyproline content of biceps

muscles... 81 2.2.8. Statistical analysis 81

2.3. Résultats 82 2.3.1. Pathological appearance oï Mycobacterium ulcerans infections 82

2.3.2. The concentration of leukocytes in the proximate-infected biceps

muscles 82 2.3.3. The levels of cytokines and growth factors mRNA in the proximate-infected

biceps muscles 82 2.3.4. Mycobacterium ulcerans infections cause histological changes and muscle

damage 86 2.3.5. The Mycobacterium ulcerans infection induced muscle fibrosis 86

2.4. Discussion 88 2.5. Acknowledgments 91

(15)

Chapitre III : Dommages histologiques et limitation de la réparation présentés par le

muscle squelettique injecté de mycolactone 95 Limited repair and structural damages displayed by skeletal muscles-loaded with

mycolactone 96 Mycolactone and skeletal muscle wasting 96

Contact information 96 3.1. Introduction 99 3.2. Materials and methods 100

3.2.1. Animal 100 3.2.2. Experimental design 100

3.2.3. Mycolactone inoculation protocol and surgical procedure 100

3.2.4. Histological and immunohistological analyses 101

3.2.5. Contractile and mechanical testing 101 3.2.6. Total hydroxyproline content from soleus muscle 102

3.2.7. Statistical analysis 102

3.3. Results 103 3.3.1. Sustained neutrophil and macrophage infiltrates in mycolactone-loaded

muscle 103 3.3.2. The mycolactone-loaded muscle displayed damage and impaired

regeneration 103 3.3.3. Prolonged loss of function displayed by the mycolactone-loaded

muscle 107 3.3.4. Stiffness and fibrosis in mycolactone-loaded muscle 110

3.4. Discussion I l l 3.5. Acknowledgments 113

3.6. References 114 Chapitre IV : Le Mycobacterium ulcerans entraîne une atrophie musculaire et une

perte progressive de la force du muscle 117 Mycobacterium ulcerans infections cause progressive muscle atrophy and loss of force .118

(16)

4.2.1. Animal care and feeding 122 4.2.2. Experimental design 122 4.2.3. M. ulcerans injection protocol and surgical procedure 122

4.2.4. Measurements of contractile properties in vitro 123 4.2.5. Assessment of the cross-sectional area of myofibers, regenerative capacity,

edema and fibrosis 124 4.2.6. Protein Sample Preparation and Western Blotting 124

4.2.7. Statistical analysis 125

4.3. Results 127 4.3.1. M. ulcerans causes significant loss in muscle force 127

4.3.2. M. ulcerans causes edema and muscle damage, provokes muscle atrophy

and fibrosis and limits muscle regeneration 127

4.4. Discussion 134 4.5. Acknowledgments 136

4.6. References 137 Chapitre V: L'ulcère de Buruli, une infection qui va au-delà de la nécrose cutanée :

impact sur le tissu musculaire 141

5.1. Introduction 145 5.2. Réponses inflammatoire et immunitaire du muscle squelettique en présence du M.

ulcerans 145 5.3. Nécrose du muscle squelettique en présence du M. ulcerans 148

5.4. L'atrophie des tissus musculaires en présence du M. ulcerans 150 5.5. Réparation / régénération des muscles squelettiques dans l'UB 152

5.6. Conclusion 155 5.7. Références : 156 Chapitre VI : Conclusion générale et perspectives 159

6.1. L'UB provoque une réponse inflammatoire aiguë et chronique atypique du

muscle squelettique sous-jacent à l'ulcération cutanée 160 6.2. L'UB entraîne une nécrose du muscle squelettique adjacent à l'ulcération cutanée

(17)

6.3. L'UB induit une perte progressive de la force musculaire et une atrophie 164

6.4. Contributions générales et implications 164

6.4.1. Contributions générales 164 6.4.2. Implications en physiothérapie et réadaptation 165

6.5. Futures orientations 166

Annexes 168 Bibliographie 170

(18)

Liste des figures

Chapitre 1 1 Fig. 1.1 : Les multiples formes de mutilations physiques chez les enfants atteints de l'UB...4

Fig. 1.2 : Vaste ulcération de la peau mettant à nu les tissus sous-jacents 5 Fig. 1.3 : Les zones endémiques de l'ulcère de Buruli dans le monde 8 Fig. 1.4 : Hémiptères aquatiques reconnus comme potentiels réservoirs du M. ulcerans.... 13

Fig. 1.5 : Réponses immunitaires innée et acquise, les cellules recrutées et influences

facilitatrices et inhibitrices 17 Fig. 1.6 : Interactions des APCs avec les T-naïves et l'environnement favorisent leur

differentiation 18 Fig. 1.7 : Autorégulation des lymphocytes T-facilitateurs et influences exercées sur les

macrophages et les cellules tueuses naturelles (NK) 20

Fig. 1.8 : Mycolactone de formule C44H70O9 21 Fig. 1.9 : Évolution clinique et réponses inflammatoire locale et immunitaire systémique de

l'ulcère de Buruli 24 Fig. 1.10 : Signes cliniques au stade pré-ulcératif 28

Fig. 1.11 : Signes cliniques au stade d'ulcération 29 Fig. 1.12 : Arbre phylogénique des mycobactéries construit à partir de racine Nocardia

farcinica 32 Fig. 1.13 : Limitation fonctionnelle au membre supérieur droit chez un jeune de 18 ans ...35

Fig. 1.14 : Muscle squelettique. Structures du muscle strié squelettique du macroscopique

aux moléculaires 41 Fig. 1.15 : Structures biomécaniques du muscle squelettique 43

Fig. 1.16 : Propriétés biomécaniques du muscle squelettique 44 Fig. 1.17 : Processus régénératif du muscle après blessure 52 Fig. 1.18 : Progression spatiotemporelle des facteurs de régulation myogénique exprimés

durant la réparation du tissu musculaire blessé 56 Fig. 1.19 : Interférence entre les voies de signalisation de HGF/EGF et TGF-fi 59

(19)

Fig. 1.21 : Représentation schématique de la voie d'interaction entre HGF/c-Met, PI3K/Akt

et la voie de signalisation Notch 64 Fig. 1.22 : Processus d'installation de la fibrose et de l'atrophie dans une situation

d'inflammation inappropriée 68

Chapitre II 72 Fig. 1: Histological examinations of skin and proximate-infected biceps muscles on day 42

post-infection 83 Fig. 2: The concentration of leukocyte subsets in mice biceps muscles 84

Fig. 3: Comparative real-time PCR 85 Fig. 4: Histological, biochemical and biomechanical assessments of mouse biceps muscles

87

Chapitre III 95 Fig. 1 : The concentrations of neutrophils (A) and macrophages (B) 104

Fig. 2 : Histological observations from control, sham and mycolactone injured soleus

muscle 105 Fig. 3: Frequency-force relationships for soleus muscle 109

Fig. 4 :.Hydroxyproline content from CTR, sham and MYCOL injured soleus muscle.... 110

Chapitre TV 117 Fig. 1: Isometric contractile properties of biceps muscles 129

Fig. 2: Histological staining of biceps muscle cross sections 130

Fig. 3: Morphometric analyses of biceps muscles 131 Fig. 4: Levels of expression of myogenic regulatory factors 132

Fig. 5: Levels of expression of ubiquitin-ligases atrogin-1 and MuRF-1 in biceps muscles 133

Chapitre V 141 Fig. 1 : Coloration de Ziehl 147

Fig. 2 : Schéma hypothétique de l'évolution de l'infection aux M. ulcerans et de la réponse

(20)

.Annexes 167 Fig. annexes 1 : Amplitude de la variation de l'LFN-y et de I'LL-10 dans le sang de souris

(21)

Liste des tableaux

Chapitre 1 1 Tableau 1.1 : Classification de Runyon des mycobactéries 11

Tableau 1.2 : Liste des mycobactéries connues actuellement 12 Tableau 1.3 : Différentes mycolactones caractérisées àcejour 26

Chapitre II 72 Table 1: Primer sequences 80

Chapitre III 95 Table 1 : Data are given for body mass, dry mass and dry mass/wet mass ratio 106

Table 2 : Contractile and passive properties for soleus muscles 108

Chapitre IV 117 Table I: Morphological characteristics 126

Chapitre V 141 Tableau 1 : Nécrose et régénération du muscle squelettique en présence de M. ulcerans.

(22)

Liste des abréviations

ADN AFB ANOVA AP-1 APC ARN BCG bFGF BMP (1-2) C/EBP-b Camk CCN cDNA CTGF CYR61 DNA dNTP EGF eLF2B ERK FGF FoxO GAPDH GMCSF GRO-o/p GSK3 HGF Acide désoxyribonucléique Acid fast bacilli

Analysis of variance Activator protein-1 Antigen presenting cell Acide ribonucléique

Bacille de Calmette et Guérin basic Fibroblast growth factor Bone morphogenic protein (1-2) CCAAT/enhancer binding protein-b

Protéine kinase calcium-calmodulin-dependant

Acronyme utilisant chaque lettre des facteurs : CTGF, Cyr61, Nov. Complementary DNA

Connective tissue growth factor

Cysteine-Rich 61 (membre CCN chez la souris) Deoxyribonucleic acid

Deoxynucleotide-triphosphate Epidermal growth factor Eukaryotic Initiation Factor 2B Extracellularly regulated kinase Fibroblast growth factor

Forkhead box O

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Granulocyte-macrophage colony stimulating factor Growth-related gene product-a/p

Glycogen Synthase Kinase 3 Hepatocyte Gowth Factor

(23)

ICAM IGF-1 IgG IL-1 iNOS JNK LPS LTA MAFbx MAPK MCP-1 MEC MEF2 MMPs Mpa mRNA mTOR MuRF-1 N NF NK NO NOS Nov PBS PCR PDGF PG PI3K RNA

Intercellular adhesion molecule

Insulin like growth factor / facteur de croissance-1 apparenté à l'insuline Immunoglobulin G

Interleukine-1

Inducible nitric oxide synthase c-Jun N-terminal Kinase Lipopolysaccharide

Lipoteichoic and Teichoic acid

Muscle atrophy F-box protein (Atrogin-1) Mitogen-activated protein kinase

Monocyte chemotactic protein -1 : Matrice extracellulaire

Myocyte enhancer factor-2

Métalloprotéinases dirigées contre la MEC Mégapascals

Messenger Ribonucleic Acid Mammalian Target Of Rapamycin Muscle-specific RLNG-finger 1 Newtons

Nuclear factor Natural killer Nitric oxide

Nitric Oxide Synthase

Nephroblastoma Overexpress Protein (membre CCN chez le poulet) Phosphate buffered saline

Polymerase chain reaction Platelet-derived growth factor Prostaglandine

Phosphatidyl-inositol-3 kinase Ribonucleic acid

(24)

RT-PCR : Reverse transcriptase polymerase chain reaction SEM : Standard error of the mean

Shh : Sonic hedgehog

SMAD : Sma (C. elegans) + Mad (Drosophile) TGF-p : Transforming growth factor beta Thl-2 : T-helper 1-2

TLR2-4 : Tool like receptor 2-4 TNF : Tumor necrosis factor

(25)
(26)

1.1. Problématique et raison de notre projet de recherche

Le muscle squelettique représente 40 à 45% de la masse totale du corps [1]. Il constitue en outre, le capital moteur de la vie relationnelle. Une maladie qui touche le muscle influence négativement le bien-être. C'est le cas de certaines maladies virales ou bactériennes à forte propension handicapante telles que la poliomyélite, la lèpre et l'ulcère de Buruli (UB). Longtemps négligée, l'UB qui est une maladie causée par le Mycobacterium ulcerans (M. ulcerans) a gagné progressivement du terrain au sein des populations démunies des pays pauvres situés dans la zone intertropicale, entre les tropiques du cancer et celui du capricorne. Actuellement, l'UB est devenue la troisième maladie mycobactérienne du monde après la tuberculose et la lèpre. Son incidence mondiale avait été estimée en 2008 à 7000 nouveaux cas chaque année [2] et son taux de morbidité est de 2 à 5% de la population des zones endémiques [3]. Les pays de l'Afrique de l'ouest sont les plus touchés. Par exemple, le Bénin, la Côte d'Ivoire et le Ghana déclarent à eux seuls près de 60% des nouveaux cas enregistrés chaque année dans le monde [4]. De plus, dans certaines régions de ces pays, en particulier en Côte d'Ivoire et au Ghana, le taux de morbidité de l'UB atteignait à la fin des années quatre-vingt-dix respectivement 16% et 22% de la population active [5, 6]. Parmi l'ensemble des sujets infectés par le M. ulcerans dans le monde entier, 70% sont des enfants âgés de moins de 15 ans [4] et plus de la moitié guérissent avec des séquelles fonctionnelles invalidantes à type de contracture, de fibrose retractile, de limitation d'amplitudes articulaires et d'amputation [7] (fig. 1.1). Ces séquelles induisent une grave altération de la qualité de vie de ces personnes et réduisent complètement leur participation sociale dans un contexte régional et économique préalablement pauvre. Sous l'impulsion de l'OMS, les recherches épidémiologiques, cliniques, diagnostiques et thérapeutiques se sont accentuées dès 1997. Mais malgré les avancées significatives obtenues, le doute persistait sur la présence d'une réponse inflammatoire et immunitaire consécutive à l'infection par le M. ulcerans. Qui plus est, aucun des travaux de recherche conduits à terme jusqu'en 2005 ne mettait en lumière l'impact du M. ulcerans sur les muscles situés à proximité de la nécrose cutanée. La plupart des publications qui se rapprochaient de ce volet se concentraient sur la partie cutanée de la

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à court terme pour guérir de l'UB et très peu de professionnels de la santé avaient de solides connaissances médicales sur cette maladie à ce moment-là.

Avant mon arrivée à l'Université Laval, j'avais été appelé, en tant que physiothérapeute, à me joindre à l'équipe de dépistage et de traitement de l'UB de mon pays la République du Bénin. Au cours de nos nombreuses visites de travail, j'avais été touché par la souffrance des malades, en particulier, par les enfants qui présentaient de larges ulcérations aux membres et au tronc et d'importantes séquelles fonctionnelles nécessitant un programme de réadaptation bien lourd pour le budget de santé de notre pays. Si la nature et le mode d'installation de ces séquelles suggéraient une implication musculaire, la littérature scientifique, comme je le disais plus haut, ne fournissait pas de données sur l'impact du M. ulcerans et/ou de sa toxine la mycolactone sur le muscle squelettique. Par contre, l'analyse de nos différentes interventions durant ces missions m'a permis de constater que le taux d'échec des soins de récupération des fibroses rétractiles et des limitations d'amplitudes articulaires engendrées par la maladie elle-même et/ou par la chirurgie réparatrice était très élevé. Ces fibroses pourraient théoriquement résulter d'une perturbation de la régénération musculaire consécutive à la dégradation architecturale et protéinique induite par la toxine mycolactone.

Face à ces éléments interpellateurs que j'avais récoltés à l'issue de mes recherches documentaires appuyées par mes expériences sur le terrain, j'avais entrepris sous la direction du Dr Jérôme Frenette, d'explorer à partir d'un modèle animal, les modifications histologiques, biochimiques et fonctionnelles qui accompagnent la dégénérescence et la régénération du muscle squelettique en présence de M. ulcerans et/ou de sa toxine mycolactone. J'espère que les résultats de mes travaux pourront éventuellement contribuer à asseoir un protocole thérapeutique limitant les répercussions physiques de cette maladie infectieuse invalidante.

(28)

Fig.1.1 : Les multiples formes de mutilations physiques chez les enfants atteints de l'UB. Plus de la moitié des enfants infectés par le M. ulcerans présentent une déformation du membre atteint. Plus le sujet infecté est jeune, plus il est susceptible de présenter de vastes atteintes et par conséquence d'importantes séquelles. (Image accessible sur le site de l'OMS (2009) : http://www.who.int/buruli/photos/complications/en/index.html).

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1.2. L'infection aux Mycobacterium ulcerans (ulcère de Buruli)

1.2.1. Définition de l'ulcère de Buruli

L'infection causée par le Mycobacterium ulcerans (M. ulcerans) appelée ulcère de Buruli (UB) est une maladie infectieuse émergeante ulcéro-nécrotique et hautement invalidante. Le M. ulcerans pénètre l'organisme humain en la faveur d'une piqûrere d'insecte aquatique ou d'une effraction de la peau sur une zone préalablement souillée. Dans l'organisme infecté, le M. ulcerans secrète une toxine polykétide cytotoxique appelée mycolactone qui nécrose la peau et les tissus sous-jacents (fig. 1.2).

Fig. 1.2 : Vaste ulcération de la peau mettant à nu les tissus sous-jacents. La plaie semble être en phase de granulation. Photo OMS : Professeur H. Assé, Côte d'Ivoire accessible (2009) au http://www.who.int/buruli/photos/foims large/en/index .html. On remarque l'exposition à vif des muscles de la cuisse et de la jambe c'est-à-dire : le jumeau gastrocnémien latéral, le tibial antérieur, le biceps fémoral et le quadriceps. Le creux poplité est rempli de pus ou possiblement de graisse nécrosée.

(30)

1.2.2. Historique

En 1897, Sir «Albert Cook décrit chez des habitants de la vallée de Buruli en Ouganda des ulcères cutanés d'évolution chronique [8]. Mais il faut attendre jusqu'en 1948 avant que le professeur MacCallum et ses collègues eussent publié la première description d'un ulcère chronique appelé ulcère de Bairnsdale chez six fermiers Australiens [8]. L'agent causal dénommé Mycobacterium ulcerans (M. ulcerans) fut identifié quelques années plus tard [9]. Faisant référence à la vallée de Buruli en Ouganda où Sir Cook avait observé les premiers cas d'ulcère en 1897, Dodge et Lunn (1962) vont désigner cette infection par « ulcère de Buruli » [10-12]. Bien qu'il y ait eu des travaux axés surtout sur des études épidémiologiques, bactériologiques ainsi que sur les moyens d'investigation et de traitement de l'ulcère de Buruli [3, 13-25], peu d'actions prophylactiques ont été menées pour contrer la maladie qui n'a cessé de progresser dans plusieurs régions du monde. Grâce à l'insistance des pays touchés, la communauté scientifique internationale fit organiser en Côte d'Ivoire en 1997, la première réunion mondiale sur l'UB ; soit cent ans après la description de la maladie par Sir Albert Cook. Le docteur Hiroshi Nakajima alors directeur général de l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) s'était engagé cette année-là, à mobiliser des ressources et une expertise mondiale pour la lutte contre l'UB. Puis en 1998, l'OMS lança l'initiative mondiale contre l'ulcère de Buruli (Global Buruli Ulcer Initiative, GBUI). Cette coalition mondiale avait comme objectif principal de contrôler et de coordonner les efforts de recherche. Dès lors les choses ont progressé rondement et de grandes découvertes se sont succédé. Plus particulièrement, Dr George et al isolent en 1999 la toxine mycolactone sécrétée par le M. ulcerans [26] confirmant par conséquence les résultats des travaux de Read et al (1974), Pimsler M. et al (1988) qui suggéraient l'implication d'un médiateur toxique dans les dommages observés par cette maladie [16, 24, 26, 27]. La même année, Dr Stinear et al (1999) identifient et caractérisent les deux séquences répétées IS2404 et IS2606 qui semblaient caractériser le M. ulcerans [28]. Dès lors sa détection par la technique de réaction de polymérisation en chaîne (PCR) était devenue un des moyens sûrs de diagnostic [29-32]. Sous la même impulsion, une équipe de recherche coordonnée par le Dr Cole découvre en 2004 que les gènes mis A1, mlsA2, mlsB

(31)

gènes étaient portés par un seul et même plasmide géant nommé pMUMOOl [33]. Forte des résultats non négligeables obtenus par les chercheurs en si peu de temps et pressée par le fait que l'UB était devenu un véritable problème de santé publique en terme de morbidité, de prise en charge thérapeutique et de handicaps résiduels, la conférence des experts de l'OMS tenue à Genève en mai 2004 avait adopté une résolution appelant à augmenter les efforts de surveillance et à intensifier la recherche en vue d'aboutir à des méthodes de diagnostic, de traitement et de prévention de la maladie [34]. Dès lors, la plupart des pays concernés avaient formalisé la mise sur pied de structures de dépistage et de traitement de l'UB et augmenté les investissements en direction des populations touchées.

1.2.3. Epidemiologic

L'UB est une maladie émergente des zones tropicales et subtropicales humides [4, 35]. Plus précisément, l'UB se rencontre majoritairement aux proximités des cours d'eau à débits lents et/ou qui ont subi une modification due à l'activité humaine (deforestation, barrage, collecte de sable lagunaire...) [36]. L'incidence de l'UB a augmenté de façon drastique dans les années 1980 devenant la troisième maladie mycobactérienne observée chez le sujet immunocompetent après la lèpre et la tuberculose. A l'heure actuelle, l'UB a été signalé dans trente-trois pays [37] (Fig. 1.3) repartis suivant les différentes régions du monde à savoir :

- En Afrique Centrale : Angola, Cameroun, Congo, Gabon, Ouganda, Soudan, ex-Zaïre ;

En Afrique de l'Ouest : Bénin, Burkina Faso, Côte d'Ivoire, Ghana, Guinée, Libéria, Nigeria, Sierra Leone, Togo ;

En Amérique Centrale et du Sud : Mexique, Brésil, Guyane française, Suriname, Pérou ;

Au Pacifique Oriental : Australie, Papouasie-Nouvelle-Guinée ; - En Asie : Chine, Japon, Malaisie

(32)

atteint respectivement 16% et 22% de la population active [5, 6]. Cependant, bien que l'UB soit devenu un vrai problème de santé publique, son ampleur varie d'une région à une autre.

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Fig. 1.3 : Les zones endémiques de l'ulcère de Buruli dans le monde [37] (source : http://www.who.int/buruli/country/en/index.html)

En Australie, l'UB a été officiellement signalé pour la première fois en 1948, [8] mais c'est dans les années 1990 que le nombre de cas a augmenté fortement du fait de plusieurs nouveaux foyers décelés aux environs de Melbourne : à Philip Island, dans le district de Franckston/langwarrin et dans la péninsule de Bellarine [38]. On estime qu'environ trente nouveaux cas ont été recensés dans ces régions par an depuis les douze dernières années [35].

L'Afrique de l'Ouest est la région du monde la plus touchée. Depuis 2004, près de soixante mille personnes seraient infectées par le M. ulcerans dans cette région. L'exemple de la

(33)

enregistrés dans ce pays qui ne compte que huit millions d'habitants [35]. Pire, la conclusion de la réunion d'évaluation des programmes nationaux de lutte contre l'UB publiée en février 2009 a indiqué une incidence de 15,04 cas pour 100 000 habitants, soit 80 nouveaux cas diagnostiqués par mois en 2007 en République du Bénin [39]. De façon générale, la plupart de personnes atteintes vivent dans des régions rurales marécageuses et dans des conditions socio-économiques et sanitaires très misérables [37].

Dans environ 70% des cas, les personnes infectées sont des enfants âgés de moins de 15 ans [6, 40, 41]. Plus d'un sujet malade sur deux (58%) présente inéluctablement à la phase de guérison, des incapacités fonctionnelles dues aux rétractions musculaires ou à la limitation d'amplitude dans une ou plusieurs articulations ou à l'amputation [7]. Le sexe ne semble pas être un facteur de risque mais par contre le risque semble accru pour les personnes de moins de 15 ans d'âge et celles âgées de plus de 49 ans [42]. L'observation de plusieurs enfants de mêmes parents atteints par l'UB avait amené des chercheurs à suggérer une possible prédisposition génétique [43, 44]. En général, les lésions sont observées dans 60% des cas aux membres inférieurs, 30% aux membres supérieurs et 10% sur le reste du corps [4]. Les complications osseuses surviennent dans 15% des cas au Bénin [45]. D s'agit souvent des ostéomyélites par contiguïté. Les ostéomyélites métastasiques sont plus rares. Enfin, retenons que l'incidence mondiale de l'UB est estimée à 7000 nouveaux cas chaque année [2]. Le Bénin, la Côte d'Ivoire et le Ghana déclarent ensemble près d'un de ces nouveaux cas sur deux. Au Pacifique occidental, l'Australie et la Papouasie-Nouvelle Guinée sont les zones les plus endémiques. En dehors des quelques cas notifiés récemment en Chine [46], de nombreux pays en particulier ceux de l'Asie ne donnent presque pas d'informations sur l'incidence de la maladie dans leur région.

1.2.4. Agent causal et mode de contagion

M. ulcerans est l'agent causal de l'UB. Selon la classification de Runyon (1959), il est du groupe II, donc scotochromogène (Tableau 1.1). E appartient à une grande famille de

(34)

Plus précisément, le M. ulcerans fait partie d'un ensemble appelé mycobactéries opportunistes [47] ou agents pathogènes occasionnels. Les études épidémiologiques ont montré que M. ulcerans est présent dans l'environnement [48]. Ds colonisent les biofilms dans certaines niches écologiques [49]. En 2004, une équipe dirigée par le Dr Cole avait découvert que le génome du M. ulcerans est constitué d'un chromosome et d'un plasmide circulaire de poids moléculaire de 174 kb [33]. Ce plasmide nommé pMUMOOl porte un cluster de gènes qui codent pour les polykétides synthases. Son rôle biologique est la production de la toxine mycolactone, médiatrice de la pathogénie de l'UB [33]. Notons qu'un plasmide est un groupement de gènes indépendant du chromosome de la mycobactérie qui se transmet d'une mycobactérie à une autre, par transfert horizontal. L'on pense que le M. ulcerans aurait acquis sa virulence du M. marinum par transfert horizontal du plasmide pMUMOOl [31, 33, 50-53].

Des travaux sont encore nécessaires pour répertorier de façon exhaustive les réservoirs du M. ulcerans. À l'heure actuelle, le M. ulcerans a été détecté dans des échantillons d'eau prélevés dans les zones de poussée d'UB [54, 55] et dans les glandes salivaires des insectes récoltés sur les racines de plantes aquatiques des zones marécageuses [56, 57] respectivement en Australie et dans les régions d'endémie au Bénin et au Ghana. Ces insectes incriminés sont des hémiptères aquatiques. Il s'agit de Naucoridae, de Belostomatidae et plus récemment de Gerridae (Fig. 1.4). Ils constituent tous de potentiels réservoirs du M. ulcerans [48, 56, 57] qu'ils transmettraient aux sujets humains par piqûres durant le travail à la riziculture, la pêche ou durant la nage ou toutes autres activités effectuées dans les zones marécageuses infestées [49].

(35)

Tableau 1.1 : Classification de Runyon des mycobactéries

Classification de Runyon

Mycobactéries qui présentent un pigment jaune ou Photochromogène rouge à la lumière mais restent non pigmentées

(blanchâtre) à l'obscurité.

Mycobactéries qui se pigmentent d'office à la lumière et à l'obscurité.

Mycobactéries qui ne se pigmentent ni à la lumière, ni à l'obscurité.

Mycobactéries dont la croissance se fait dans une Groupe IV Croissance rapide période inférieure à 8 jours. Elles peuvent être de

l'un ou l'autre des trois précédents groupes Groupe I

Groupe II Scotochromogène

Groupe III Achromogène

Le M. ulcerans est d'office de coloration jaune tant à la lumière qu'à l'obscurité. D est du groupe fi de la classification de Runyon. D est dit scotochromogène.

(36)

Tableau 1.2 : Liste des mycobactéries connues actuellement (Source :

http://www.dsmz.de/microorganisms/bacterial nomenclature info.php?genus-MYCOBACTERIUM)

MYCOBACTERIUM

abscessus kansasu intiacellul.il e psychrotolerans africamun komossense kumamotonense pulvens a a n kubicae pyrenivorans aichiense cookii Lacus

alvei cOMiieticum lentiflavum rhodesiae ,

arosiense leprae

arupense diemhoferi lepraemurium salmoniphilum asiaticum dohcum Uatzerense saskatchewaiiense aubagueuse duvalii scrofulaceiun auruin madagascahense senegalense austroafricauum elephantis mageritense senuense avium malmoeuse seoulense avium subsp. avium fallax mariniun septicimi avium subsp.

paratuberculosis farcinogenes massiliense seteuse avium subsp. silvaticum flavescens microti shimoidei

floreutiiium monacense shottsn boenickei fluoranthenivorans montefiorense simiae bobemicum fortuitum mohokaense smegma tis bolletii fortuitum subsp.

acetamidolyticum mucogenicum sp ha 2111 botniense fortuitum subsp. fortuitum murale stomatepiae bo vis frederiksbergense szulgai bovis subsp bovis nebraskense

bovis subsp caprae gadium neoaunim terrae

branden gastri neworleaiisense thermoresistibile brisbaneuse genavense noiicliromogeiiiciuii tokaiense bnunae gilvum novocastrense triplex ■

goodii triviale

caiiariasense gordonae obuense tuberculosis

caprae tuberculosis subsp. caprae celamm haemoptulum palustre tuberculosis subsp.

tuberculosis cheloiiae hassiacum parafortuitum rusciae chelonae subsp. abscessus heckeshornense parascrofulaceum

cheloiiae subsp. chelonae heidelbergense paratuberculosis ulcerans

chimaera hiberniae parmense .

chitae hodleri peregrinum vaccae chlorophenolicuin holsaticum phlei vanbaalenii chubuen.se houstouense phocaicum

colombiense pinnipedii wolinskyi conceptionense immunogenum porcinum

(37)

(A)

(B)

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Fig. 1.4 : Hémiptères aquatiques reconnus comme potentiels réservoirs du M. ulcerans. (A) Naucoridae, (B) Belostomatidae, (C) Gerridae Afrotropical appelé Limnogonus hypoleucus [48, 56, 57]

(38)

Tout récemment, des chercheurs ont mis en évidence au sud de l'Australie, l'ADN de M. ulcerans dans des opossums et des moustiques [4, 58]. Le résultat de leurs travaux sur les opossums et les moustiques soulignait que près d'un opossum sur deux et de 43 moustiques sur 10 mille étaient colonisés [4, 58]. Ces données importantes suggèrent que l'UB pourrait être une zoonose transmise à l'humain par l'opossum via le moustique [4]. Le risque apparaît ainsi accru pour les sujets des zones tropicales et subtropicales qui sont souvent piqués par les moustiques !

Sur le plan phylogénique, le M. ulcerans est une bactérie à croissance lente [59-61]. Son temps de génération est de 20 heures [60]. De plus le M. ulcerans est sensible à la chaleur [56]. La température idéale à sa croissance est 32°C [56, 62]. Une forte chaleur exerce un effet nuisible non seulement sur la croissance des M. ulcerans mais aussi et surtout sur sa viabilité. Des essais conduits par Meyers et al (1974) ont indiqué qu'exposée à 37°C durant 24 h, la croissance du M. ulcerans s'arrête et se trouve complètement inhibée après une exposition à 40°C durant 10 jours [14]. A ces données s'ajoutent celles de Portaels qui indiquaient que 90% des M. ulcerans meurent après un séjour de 24 h à 41 °C [56, 60]. Il en résulte qu'à partir de 40°C, une élévation additionnelle d'un degré Celsius suffisait pour induire la mort de près de 90% des M. ulcerans. Cette fragilité relative du M. ulcerans à la chaleur, va susciter l'exploration de la piste d'une thermothérapie [14, 63, 62]. C'est ainsi que Meyers et autres vont effectuer sur une période allant de 4 à 10 semaines environ, le traitement de l'UB par la thermothérapie à 40°C seule ou en association avec d'autres adjuvants [14, 62]. Alors que la praticabilité de ce moyen thérapeutique était peu satisfaisante, les résultats par contre avaient réjoui plus d'un étant donné qu'aucune rechute n'était survenue après 22 mois [14]. Notons que l'effet bienfaisant de la chaleur avait été démontré dans bien des domaines [64]. Tout récemment, Junghanss (2009) et al ont proposé un nouveau matériel qui semble non seulement d'utilisation plus facile, mais donnerait aussi des résultats satisfaisants [63]. Dans l'ensemble, l'effet thérapeutique de la chaleur dans le traitement de l'UB pourrait être dû d'une part, à l'action néfaste directe qu'elle exerçait sur la viabilité du M. ulcerans et d'autre part, à un effet indirect sur la vasodilatation des vaisseaux qui entraînerait une amélioration de la pénétration de l'arsenal

(39)

aussi sensible à l'oxygène [18]. Au laboratoire, le M. ulcerans peut croître sur plusieurs milieux solides classiques de pH compris entre 5,4 à 7,4 en 6 à 8 semaines de culture. La croissance est cependant meilleure sur le milieu de Lowenstein-Jensen incubé à 32°C avec 5% CO2 que sur les milieux d'Ogawa ou de Middlebrook. [48].

En résumé, nous retiendrons que l'UB est causé par un agent pathogène environnemental à croissance lente appelé M. ulcerans. Son mode de contagion reste encore flou. On estime aujourd'hui qu'il ne se transmet pas d'une personne à une autre [66]. Le mécanisme le plus plausible est que le M. ulcerans infecte l'humain suite une effraction traumatique de la peau sur une zone préalablement contaminée ou suite à une piqûre d'insectes porteurs du M. ulcerans [67]. Il faut cependant noter qu'à l'heure actuelle, en dehors des cas expérimentaux, aucun cas d'infection aux M. ulcerans causée par piqûre d'insectes [57] n'a été rapporté dans la littérature scientifique et que le M. ulcerans est beaucoup plus présent dans l'environnement que dans les insectes incriminés. Ce qui suggère que ces insectes seraient des porteurs accidentels du M. ulcerans ou qu'ils agiraient comme des vecteurs mécaniques du M. ulcerans [15,48].

(40)

1.2.5. Réponse immunitaire et pathogénie de l'UB 1.2.5.1. Réponse immunitaire et balance Thl/Th2

Une agression bactérienne se manifeste cliniquement par un syndrome infectieux et physiologiquement par une réponse inflammatoire et une réponse immunitaire innée et/ou acquise d'intensité proportionnelle à la virulence de l'agent pathogène en cause. Les réponses inflammatoire et immunitaire visent à combattre l'antigène rencontré, débarrasser le site lésionnel des débris matriciels et cellulaires et amorcer la réparation des dommages concomitants. La réponse immunitaire, quelle soit innée ou acquise est par conséquent, le résultat d'un système complexe de défense du corps qui fonctionne grâce à l'ensemble composé des cellules immunitaires, des tissus et des organes de la réponse immunitaire ainsi que des médiateurs moléculaires biochimiques exprimés à différents niveaux du système. Ce système de défense utilise deux modes de communications à savoir : une communication directe cellule-cellule et une communication indirecte par l'intermédiaire des médiateurs chimiques que sont les cytokines.

La réponse immunitaire innée survient rapidement au contact du corps avec l'antigène, mais n'est que de courte durée. Elle mobilise un capital de défense antérieurement initié, composé d'enzymes lytiques et de nombreux leucocytes dont les cellules tueuses naturelles (Natural killers, NK), les neutrophiles, les monocytes et les macrophages (fig. 1.5). Elle stimule la production massive par le foie de protéines de phase aiguë telles que la C-réactive, l'al-antitrypsine, l'a2-macroglobuline, les facteurs de coagulation et du complément, pour ne citer que celles-là. La réponse immunitaire acquise par contre démarre plus lentement, mais dure plus longtemps. Elle mobilise les leucocytes composés principalement de lymphocytes T-facilitateurs (T-helper, Th) et de lymphocytes B (fig. 1.5). Les lymphocytes T ou lymphocytes thymo-dépendants doivent leur nom au thymus qui influence leur devenir alors que les lymphocytes B sont dits burso-dépendants ou « bone marow «-dependant parce qu'influencés par la bourse Fabricus chez l'oiseau ou la moelle osseuse chez le mammifère. Nous ne parlerons que des T-facilitateurs.

(41)

\ - /

Infection

Activation

Immunité innée

(Rapide, mais limitée)

i

Activation

Immunité adaptée

(Retardée, de longue durée)

Libération d enzymes lytiques

N Activation «tes cellules Natural Killer (NK), des APCs et macrophages

1

réel

Activation des leucocytes (Lymphocyte, monocyte, granulocyte)

r

zs

Lymphocytes B (Immunité humorale)

Neutralisation de l'agent pathogène

Fig. 1.5 : Réponses immunitaires innée et acquise, les cellules recrutées et influences facilitatrices et inhibitrices.

(42)

Les lymphocytes T-facilitateurs sont des cellules lymphoïdes d'origine hématopoïétique. Us sont issus du même précurseur cellulaire T-naïve CD4+ à partir duquel ils se différencient

suivant un mécanisme génétique qui reste encore flou [68]. L'on sait que cette différenciation des T-naïves CD4+ en Thl ou en Th2 est fortement liée à l'environnement

en particulier, aux types de cytokines en présence, à la nature de l'antigène communiqué aux T-naïves par les cellules présentatrices d'antigène (APCs), à la distribution des APCs à travers les tissus et à leur mode de communication [69 , 70] (Fig. 1.6). Dans une infection, les APCs recrutées sont composées principalement des cellules dendritiques (DCs), des monocytes et des macrophages. Durant nos travaux, nous nous sommes concentrés sur les macrophages du fait que le marquage des DCs dans le tissu musculaire par les techniques d'immunohistochimie n'avait pas été concluant dans notre cas.

Fig. 1.6 : Interactions des APCs avec les T-naïves et l'environnement favorisent leur differentiation. Adapté de Lafaille JJ., The role of helper T cell subsets in autoimmune diseases. Cytokine & Growth Factor Revs 1998; 9:139-151 par Kidd P., Thl/Th2 balance: the hypothesis, its limitations, and implications for health and disease. Altern Med Rev, 8 (2003) 223-246.

(43)

Les lymphocytes Thl jouent un rôle clé dans la lutte contre les mycobactéries telles que le M. tuberculosis et le M. ulcerans [71-73]. En effet, les lymphocytes Thl agissent en produisant principalement les cytokines proinflammatoires JPN-y, IL-2 et surtout le TNF-a qui est indispensTNF-able TNF-au contrôle des mycobTNF-actéries [74, 75]. Us TNF-accroissent lTNF-a production des opsonines et activent les macrophages. Ils induisent l'immunité cellulaire ou immunité de type 1. Cette immunité combat les agents pathogènes intracellulaires dont les virus, élimine les cellules néoplasiques et accroît le retard de la réaction d'hypersensibilité (delayed-type hypersensitivity - DTH) [71]. La differentiation des T-naïves CD4+ en

lymphocytes Thl est favorisée par un environnement d'IFN-Yet IL-12 (fig. 1.6). De même, il a été démontré que 1TL-12 stimule les cellules tueuses naturelles (Natural Killer; NK) qui répondent en produisant davantage de cytokine IFN-y, laquelle cytokine renforce à son tour la différenciation des T-naïves CD4+ en Thl [71]. L'importance de 1TL-12 dans cet arsenal

de défense ne fait aucun doute puisque de récentes études ont démontré que le récepteur IL-12R|32 est exprimé spécifiquement par les Thl et que ce récepteur est impliqué dans l'orientation de la differentiation des T-naïves CD4+ en Thl [76].

Les lymphocytes Th2 quant à eux produisent une panoplie d'interleukines (IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 et IL-13) qui agissent comme facteurs de croissance ou de différenciation des lymphocytes B; ce qui conduit à l'immunité de type 2 ou immunité humorale [77]. L'immunité humorale combat les agents pathogènes extracellulaires tels que les parasites multicellulaires, stimule la production des immunoglobulines E et A (IgE et IgA), accroît le développement et la differentiation des mastocytes et des éosinophiles [71, 73]. Cette immunité humorale est surtout observée dans les réactions allergiques. Les cytokines IL-4, IL-10 et IL-13 agissent également comme inhibiteurs des macrophages [68, 72, 78-80]. Aussi, dans un environnement contenant plusieurs cytokines, la présence d'EL-4 prime sur les autres et favorise la differentiation des T-naïves CD4+ en Th2 [68].

Notons que les lymphocytes Thl et Th2 s'autorégulent par l'entremise respectivement dTL-2 et IL-4. De plus ces deux cellules clés de l'immunité adaptée possèdent un rétrocontrôle négatif faisant de l'un l'inhibiteur de l'autre (fig. 1.7).

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IL-2

Fig. 1.7 : Autorégulation des lymphocytes T-facilitateurs et influences exercées sur les macrophages et les cellules tueuses naturelles (NK). IL-2 et IL-4 agissent de façon autocrine sur les Thl et Th2 respectivement. Dans le même sens, IL-12 agit en potentialisant l'activité des NK et des macrophages. Le retro-contrôle négatif de Th2 est assuré par IL-4 sur les Thl alors que celui de Thl sur Th2 est assuré par INF-y.

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1.2.5.2. Mécanismes pathologiques du M. ulcerans et réponses immunitaires

La période d'incubation du M. ulcerans dans l'organisme humain reste encore floue en regard aux données actuelles de la littérature scientifique. De notre côté, nous avons observé chez la souris C57BL/6, une période de latence d'environ 3 semaines suivant l'injection de IO5 cellules M. ulcerans avant l'apparition des signes physiques [81]. Ces

signes qui constituent les premières manifestations cliniques qui accompagnent l'UB, sont liés à la diffusion de la mycolactone [82-84]. Nous pensons que le temps de latence observé dans notre modèle avait été suffisant pour que les concentrations des mycobactéries et de mycolactone soit franchement pathogène.

La mycolactone est une toxine polykétide, cytoxique de structure semblable aux macrolides (fig. 1.8). Elle pénètre et reste dans le cytoplasme cellulaire, augmente de façon dose-dépendante le calcium intracellulaire tout en respectant la barrière nucléaire [84]. Elle induit ensuite une altération du cytosquelette de la cellule qui plus tard meurt par apoptose [65].

Mycolactone

Ri

°w°

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Quoique l'ensemble des travaux de recherche sur le mécanisme pathologique du M. ulcerans ait établi la responsabilité de la mycolactone dans la pathogenèse de l'UB, plusieurs divergences entretiennent néanmoins un flou dans la physiopathologie et 1'histopathologic de la maladie. Sur le plan physiopathologique, des études ont montré que la mycolactone inhibe la réponse inflammatoire et induit une immunosuppression [24, 26, 85, 86]. Ces effets biologiques néfastes se traduisent par la paralysie des fonctions cellulaires des lymphocytes T et des macrophages [24, 85-87]. Le groupe du Dr Gooding (2001), a évalué la réponse immunitaire consécutive à l'infection aux M. ulcerans en stimulant in vitro les cellules mononucléaires périphériques de sang des patients en phase aigùe ou ayant un antécédent d'UB ainsi que celles des patients contrôles sans aucun antécédent d'UB. Us ont observé une augmentation de la production d'IFN-y par les Thl chez les sujets contrôles alors que le taux de cette cytokine est resté très bas chez les sujets malades ainsi que chez ceux ayant un antécédent d'UB [87-89]. De même, Coutanceau et collaborateurs ont découvert que la mycolactone supprimait de façon sélective la fonction présentatrice d'antigènes des cellules dendritiques [90] en bloquant le mécanisme posttranscriptionnel du mTOR (mammalian Target Of Rapamycin) [91]. Ces différents résultats sont en parfaite concordance avec la conclusion de certaines études antérieures qui stipulaient que la mycolactone induisait une immunosuppression, d'une part, en bloquant au stade G0/G1 du cycle cellulaire les fibroblastes L929 [26] et, d'autre part, en inhibant la production de TNF-a et dTL-10 par les monocytes ainsi que la production de IL-2 par les lymphocytes T [92]. Cette action immunosuppressive de la mycolactone pourrait être à l'origine du retard de la réponse immunitaire systémique précoce à l'antigène du M. ulcerans observé chez les patients qui, malgré qu'ils présentent des lésions évolutives, ne réagissaient pas à l'administration intradermique de la buruline [19]. La buruline est une suspension injectable préparée à partir de la culture de M. ulcerans et contenant l'antigène de la mycobactérie. L'injection de cette buruline dans la peau fait réagir le système immunitaire du sujet ayant été auparavant en contact avec l'antigène en provoquant une réaction locale cutanée positive appelée intradermoréaction qu'on observe physiquement sous forme de peau d'orange. Chez les malades UB, l'intradermoréaction ne devenait positive à la buruline qu'à la phase de guérison, c'est-à-dire à l'apparition des granulomes

(47)

développer. Ces dernières données sont corroborées par les travaux de Schipper et collaborateurs qui ont observé une augmentation de la quantité de l'IFN-y produite en phase ulcerative [93]. La fig. 1.9 suivante qui est adaptée de Demangel et collaborateur (2009), présente la corrélation entre l'évolution clinique de l'UB, la charge bactérienne et l'évolution systémique de lTFN-y.

(48)

Lésions pré-ulcératives Lésions ulcéra tives Guérisou spontanée. Traitement Inflammation locale Charge Nécrose et réponse bactérienne des tissus systémique dTfN-7

Fig. 1.9 : Évolution clinique et réponses inflammatoire locale et immunitaire systémique de l'ulcère de Buruli. Adaptée de Demangel et collaborateurs (2009) [53]. La phase pré-ulcérative est caractérisée par une faible charge bactériale mais une réponse inflammatoire locale et immunitaire franche. Cette réponse inflammatoire se traduit par une accumulation des neutrophiles et des macrophages et une régulation positive des cytokines pro-inflammatoire (TNF-a, IL-ip, IL-2, IL-6 et IL-12P) [81]. La charge bactérienne augmente progressivement jusqu'à la phase ulcerative alors que les réponses inflammatoire locale et immunitaire systémique semblent être partiellement réprimées par l'infection. A ce stade, lTFN-y est détecté dans les tissus en faible quantité ou carrément inhibé [81]. La réaction de défense croît de nouveau progressivement et une guérison spontanée peut se produire, en général avec de multiples séquelles (fibrose retractile, ankylose ...).

(49)

Contrairement à la thèse d'inhibition de la réponse inflammatoire et immunitaire développée ci-dessus, se trouvent d'autres analyses qui soutiennent que l'ulcère de Buruli induit une inflammation chronique [94-97] chez l'homme comme chez l'animal. En effet, une accumulation de macrophages et de cellules lymphocytes CD4/CD8 ainsi que l'expression de l'IFN-y, IL-10, TNF-cc et du TGF-P furent observées dans les biopsies cutanées de patients au prise avec l'UB [95, 98]. Mieux, sur toutes les phases de la maladie, les niveaux des cytokines IL-10, TNF-a, TGF-P n'avaient pas significativement varié par rapport aux niveaux de base. Seul lTFN-y avait connu une augmentation significative de son niveau à la phase ulcerative. Une des données mises en exergue par les travaux qui soutiennent la thèse inflammatoire est la différence fondamentale qui existe entre les deux types de lésions histologiques observés dans l'UB. Les lésions avec granulome présentaient un taux d'IFN-y élevé alors que dans les lésions ulcératives non granulomateuses, c'est l'IL-10 qui était la plus exprimée [95]. Le M. ulcerans induit également chez les kératinocytes humains, l'expression de TLR2, de TLR4 et de la decline-1. Les TLR2, TLR4 et la decline-1 sont des protéines fortement impliquées dans l'internalisation du M. ulcerans par les phagocytes ainsi que dans la production des ROS et dans l'expression de chimiokines et du peptide antimicrobien LL-37 [99]. Une récente étude a mis en évidence l'expression d'autres peptides antimicrobiens : les P-defensine 3 et 4 par les cellules de la peau en réponse à l'infection par le M. ulcerans [100]. En somme, l'expression de ces médiateurs chimiques impliqués dans la réaction de défense de l'organisme suggère qu'une réponse immunitaire innée s'active en présence de M. ulcerans.

Rappelons que la mycolactone induit une nécrose de la graisse sous-cutanée, laquelle nécrose constitue à son tour, un excellent milieu de culture favorisant la multiplication des M. ulcerans [26]. De récentes études ont relevé, que la quantité et la toxicité de la mycolactone sécrétées par le M. ulcerans varient d'une région à l'autre du globe (tableau

1.3) [101-103]. Toutefois, en dépit de ce polymorphisme, tous les différents types de mycolactone ont démontré in vitro une action cytotoxique [102].

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mycolactone diffuse à travers les tissus [82]. Cette diffusion peut se limiter aux tissus avoisinants entraînant des dommages localisés ou au contraire, la mycolactone peut se propager à distance du foyer infectieux aboutissant à de vastes lésions de la peau, des tendons et des muscles.

Tableau 1.3 : Différentes mycolactones caractérisées à ce jour

Types de

Mycolactone Mycobactéries Références

Mycolactone A/B

Mycolactone C

Mycolactone D

Mycolactone E

M. ulcerans d'origine Africaine, Malaysienne

M. ulcerans d'origine Australienne

M. ulcerans d'origine Asiatique

M. liflandii

Mve-Obiang A et al, 2005

Stinear TP et al, 2005 Hong h et al, 2005

Mycolactone F M. pseudoshottsii et M. marinum en

provenance d'Israël Ranger BS et al, 2006

Six différentes sortes de mycolactone produites par les mycobactéries ont été caractérisées à ce jour [101, 103, 104]. Le type .A/B est produit par le M. ulcerans originaire de l'Afrique. Elle semble être la plus destructrice [100].

(51)

1.2.6. Manifestations cliniques 1.2.6.1. Étude clinique de l'UB

Cliniquement, l'infection aux M. ulcerans est d'abord une maladie de la peau. Elle est très souvent indolore du fait de la destruction du nerf périphérique par le pathogène [105] et de son évolution qui est lente. Elle peut être localisée, diffuse ou multifocale. Plusieurs atteintes identiques ou différentes peuvent également se retrouver sur un même sujet sans altération notable de son état général [106]. L'infection aux M. ulcerans n'épargne aucune partie du corps et peut atteindre aussi les tissus sous-jacents à la nécrose cutanée [81]. La présente description clinique distinguera trois stades cliniques :

1.2.6.2. Stade pré-ulcératif

Au stade initial, l'UB peut se présenter sous quatre différents aspects cliniques [106, 107] à savoir :

Un nodule de la taille d'un citron (2 à 3 cm), fortement attaché à la peau mais bien mobile au plan profond (Fig. 1.10A). Il peut être parfois entouré d'un œdème indolore.

Une papule (Fig. 1.10B) prurigineuse indissociable à la peau mais clairement distinct des zones saines.

Un placard indolore qui se présente sous forme de zone de peau hypopigmentée à bords tranchés (Fig. 1.1 OC).

Un œdème, volumineux de la base au sommet, froid, plus ou moins douloureux aux limites floues et ne prenant pas le godet (Fig. 1.10D). Il peut s'étendre sur tout un membre, sur une région du tronc, au visage ou même occupé toute la région inguinale [106].

(52)

Fig. 1.10 : Signes cliniques au stade pré-ulcératif : Nodule (A); Papule (B); Plaque (C); Œdème (D). (Sources : Houngbédji Mabèrou Germain (A), WHO (B-C) et Centre de Dépistage et de Traitement de l'UB (CDT)/Allada-Bénin (D)).

(53)

Fig. 1.11 : Signes cliniques au stade d'ulcération : (A) Ulcération chez la souris; (B) Vaste nécrose du galbe de l'épaule chez l'humain (Sources : (A) Germain Mabèrou Houngbédji (B) CDT/Allada-Bénin).

Figure

Fig. 1.2 : Vaste ulcération de la peau mettant à nu les tissus sous-jacents. La plaie semble  être en phase de granulation
Fig. 1.3 : Les zones endémiques de l'ulcère de Buruli dans le monde [37] (source :  http://www.who.int/buruli/country/en/index.html)
Tableau 1.1 : Classification de Runyon des mycobactéries
Fig. 1.4 : Hémiptères aquatiques reconnus comme potentiels réservoirs du M. ulcerans. (A)  Naucoridae, (B) Belostomatidae, (C) Gerridae Afrotropical appelé Limnogonus hypoleucus  [48, 56, 57]
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