Points de contact entre les protéines HM:; 1 et 2 et les histones dans la chrcanatine et leur niveau de poly(ADP-rilx::>sylation).
par
IDlrise Deschênes
Département de Biochllnie
Mélroire présenté à la Faculté de médecine en vue de l'obtention
du grade de maître ès sciences (M. Sc.)
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ISBN 0-315-61232-0
:Liste des figures •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• vi :Liste des abréviations ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• ix
Rést.J:IIé.. • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • xi 1. IntrOOuct.ion ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 1
1.1 - la chrarratine ••••••••••••••••••••••••••••••••••.•••••••••.••• 2
1.1.1 - L'acide désoxyrilx>nucléique (AL'N) •••••••••••••••••••• 2 1. 1. 2 - I.es histol'leS ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 3 1. 1. 3 - I.e nucléc::>sc::aœ, •••••••••••••••••••••••••••••••• ; ••••••• 3
1.1.4 - Etats de la chrarratine •••••••••....•••••••••...•••• 9
1.2 - la réaction de poly(ADP-ribosylation) ••••••••••••••••••••••• 10 1.2.1 -
Sb:ucture
du polymère poly(ADP-ribose) •••••••••••••• 11 1.2.2 - Enzyne; irrpliquées dans la réaction depoly-(ADP-ril:x>Sy'lation) •••••••••••••••••••••••••••••••••• 11 1.2.3 - Fonction de la réaction de poly(ADP-ribosylation) ••• 14 1. 3 - I.es protéirles HM:; • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 15 1.3.1 - Propriétés générales des protéirles HM:; •••••••••••••• 15
1.3.2 -
Sb:ucture
des protéirles HM3 1 et 2 •••••••••••••••••• 17 1.3.3 - Fonction des protéirles HM3 1 et 2 ••••••••••••••••••• 18 1.3.4 - I.ocalisation nucléaire des protéirles HM3 1 et 2 ••••• 20 1.3.5 -Sb:ucture
des protéirles HM3 14, 17 et I ••••••••••••• 22 1.3.6 - Fonction des protéirles HM3 14, 17 et I •••••••••••••• 25 1.3.7 - I.ocalisation des protéirles HM3 14, 17 et I •••••••••• 271. 4 - IY;Je11ts de retiClllation •.•.•.••••.••••.••••••••••••... 34 1. 5 - ait du "tra.va.il • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 3 5 2 • J.1ël.tériel et Iné.t:llc::xles •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 3 7
2 • 1 - Jwia.tériel •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 38 2. 2 - ~tllcxies •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 39 2.2.1 -
Extraction
des protéines Hr-K; •••••••••••••••••••••••• 39 2.2.1.1 - Préparation de l'horro:;Jénat ••••••••••••••••• 39 2.2.1.2 - Isolenent des protéines •••••••••••••••••••• 39 2.2.2 - Fractionnenent de la chramatine ••••••••••••••••••••• 43 2.2.2.1 - Isolenent des noyaux ••••••••••••••••••••••• 43 2.2.2.2 - Digestion et fractionnenent •••••••••••••••• 43 2.2.2.3 - Précipitation à l'acide sulfurique ••••••••• 44 2.2.2.4 - Réaction de poly(ADP-ribosylation) ••••••••• 47 2.2.3 - Réactions de réticulation ••••••••••••••••••••••••••• 48 2.2.3.1 - Réticulation dans la fractionœ ...
482.2.3.1.1 - Vérification de la présence de la
liaison Hr-K;-nucléosome dans la
fra.ction
œ ...
4 9 2.2.3.2 - Réticulation dans la fraction "noyauxdig~·· •..•.•.••.•••....••••....••.••... 50
2.2.3.2.1 - Vérification de la spécificité de
la liaison Hr-K;-nucléosome ••••••••••••••• 51 2.2.4 - Hydrolyse acide des ban:ies à deux c:x:irrposantes ••••••• 52 2.2.5 - Réticulation en présence des protéines HM:; 1 et 2
exc:>çJèrles •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 52 2 • 2 • 6 - Ge.ls d' élec:trop11orèse. ••••••••••••••••••••••••••••••• 53 2.2.6.1 - Gels I.aemmli ••••••••••••••••••••••••••••••• 53
2.2.6.2 - Gels .AIJ et MJr ••••••••••••••••••••••••••••• 54 2.2.6.3 - Gels d'agarose ••••••••••••••••••••••••••••• 54
2.2.6.4 - Coloration des gels Iaemmli et AU (MJr) •••• 55
2.2.6.4.1 - Coloration au bleu de Cbaroassie ••••••••• 55 2.2.6.4.2 - Coloration à l'argent (AgN03) ••••••••• 56 2.2.6.5 - Gels Iaemmli en seoc:>n:le dimension •••••••••• 56 2.2.6.6 - Coloration des gels d'agarose •••••••••••••• 56 2.2.6.7 - Déterminations densitanétriques •••••••••••• 57
3 . Résultats • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 58
3 .1 - Extraction des histones du coeur nucléosamal, des his-tones Hl et des protéines mt:; à partir de thynn.JS de
vea.u . ... -; ... 59
3.2 - Détennination de la fraction de la chramatine appropriée
pour la réaction de réticulation •••....•... 59 3. 2 .1 - Analyse de la taille des dlaînes de nucléosomes ••••• 62 3.2.2 - Analyse électrophorétique des protéines
obte-nues dans ch.aame des fractions de la chramatine •••• 65 3.2.3 - Analyse électrophorétique des protéines
ADP..-ril:>C>sy" lées •••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 68
3.3 - Réactions de réticulation ..•...•..•...••. 75 3.3.1 - .Apparition d'une barrle nonunée <P dans la
frac-tian
œ
réticulée ••••••••••••••••••••••••••••••••••• 753.3.1.1 - Présence probable d'une liaison
électrostatique IIM3-nucléosone dans la
fra.ction
œ ...
783.3.2 - Mise en évidence de la barrle <P après
réticu-lation dans la fraction "noyaux digérés" •••••••••••• 81 3.3.2.1 - Spécificité de la liaison protéine
HM:;-nucléosone dans la fraction "noyaux
3.4 Hydrolyse acide de la barrle <fJ et des
tém:>ins
d'histones ••••• 92 3.5 Disparition des barrlestf
etw
lors de l'ajout desprotéines HM; exogènes aux chaînes de nucléosanes •••••••••• 103 4. Di.sa.ission et c:x::>llC!lusion ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 107
4.1 Extraction des protéines HM:; ••••••••••••••••••••••••••••••• 108
4.2 Réactions de réticulation dans les fractions
œ
et11Tcy"allX digérés'' .•....•••••••••••••••••••••••••••••...••.•. 108
4.3 - Hydrolyse acide de la barrle <fJ obtenue dans la fraction
11Tcy"aUX digérés" réticulée, ••••••••••••••••••••••••••••••••• 112
4.4 - Disparition des barrles l/;et
w
lors de l'ajout des protéines HM; 1 et 2 aux chaines de nucléosanes J;>OUrla réaction de réticulation •••••••••••••••••••••••••••••••• 116 5 • ~ieillell.ts •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 118 6 . Bibli~e •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 119
Figure 1 Figure 2 Figure 3 Figure 4 Figure 5 Figure 6 Figure 7 Figure 8 Figure 9 Figure 10 Figure 11
USTE DES FIGURES
Modèles détaillés de la structure du coeur
nuclée-SCllllëll • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 4
Modèle proposant l'emplacement de !'histone fil sur
le nucléosare . ... 7
Schéma m:>ntrant la stnicture du polymère de
poly-(ADP-ribose) et les enzymes ilrpliquées dans sa
synthèse et sa dégradation ..•••••••••••••••••••••...•. 12
Modèle proposé pour dénontrer les interactions entre l'.AI:N et les protéines HM3 1 et 2 dans la
chromati-Ile. eritière . ... 23
Modèle représentant la localisation de la protéine HM3 14 sur le nucléosare détenninée par digestion à
la ~ase 1 ... 29
Modèles m:>ntrant les m:xles de liaison des protéines
HM; 14/17 sur le coeur nucléosomal •••••••••••••••••••••• 31 Schéma résurnant l'extraction des protéines HM3 à
partir
de thynrus de veau ...•... 41Schéma résumant les étapes du f ractionneJœnt de la
dli::'arnéiti.Jle • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 4 5
Analyse électrophorétique des différentes fractions obtenues lors de l'extraction des protéines HM3 à
partir
de thynrus de veau ...•... 60Analyse électrophorétique de la taille des chaînes de nucléosomes retrouvées dans chacune des fractions
de la dli::'arnéiti.ne • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 63
Figure 12 Figure 13 Figure 14 Figure 15 Figure 16 Figure 17 Figure 18 Figure 19
dans cllaa.me des fractions
œ,
NCh et NSh dela cll.l:::'clrratine •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 66
Electrophorèse en secome dbnension, sur gel de ix>lyacrylamide en présence de
sœ,
des différentes fractions de la cll.l:::'clrratine après avoir effectué laréaction de ix>ly(ADP-rilx>sylation) •••••••••••••••••••••• 69
Autoradiogramrœs des gels de la migration en
secome dimension des échantillons
ix>ly-(ADP-ribosylés) pour cllaa.me des fractions de la
-cl'l.I:'c:n'nëltine. • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 71
Electrophorèse en secome dbnension sur gel de ix>lyacrylamide de la fraction
œ
avant et aprèsla réaction de réticulation en présence d'EmC •••••••••• 76 Vérification de la présence d'une liaison
élec-trostatique protéine IM:;-nucléosame dans la
fra.ction
œ . ...
79Electrophorèse en secome dbnension sur gel de ix>lyacrylamide de la fraction "noyaux digérés" avant et après la réaction de réticulation en
préserlce d' EmC ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 82
Schéma de l'identification des systèmes à deux
corrposantes fonnés d 'histones du coeur proposé par
Bc>ulika.s ( 1988) •.••..•..•.••.•...•.•••••.•... 84
Vérification de la liaison protéine ~nucléosame en préserlce de différentes cx:mcentrations de
chloru-re de sOO.il.Iln. • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 8 7
Migration électrophorétique des téroc>ins
Figure 20
Figure 21
nes, des protéines HM:; 1-2 et de la ban1e <P après
hydrolyse, acide ... ... 93
Représentation densitométrique du profil de migration électrophorétique de chacun des échantillons
hydro-lysés ... . 95
Migration en seconde cilinension sur gel de :p::>lyacry-lamide des chaînes de nucléosanes réticulées en
a.a. Ar.N APC Arg ARN ARNm A'IC AU AU!' cAIN
Ci
cmooase
EDàC EDl'A g His HM3 kb KU Lys M mCi min. mlLISI'E DES ABRE.VIATIONS
acide aminé
acide désoxyribonucléique acide perchlorique; HClo4 arginine
acide ribonucléique
acide ribonucléique messager
acide trichloroacétique; Cl3C-<XX)H acide acétique-urée
acide acétique-~iton
acide désoxyribonucléique cœplélœntaire curie
centllnètre
désoxyri.bonucléase
1-éthyl-3 {3 diinéthylamino pcopyl) carlxxli:intlde acide éthylène diaminetétra acétique
granune ou coéfficient de gravité universelle histidine
protéine non-histone de groupe de haute m::>bilité
kilabase
kilo-unité lysine molaire mil li curie minute millilitre ixnnn nM nmole MNase N NAD 32p p pb
™
RIM sœ TI.CK Tris ug ul U.V. V millimètre millilnolaire millilnole nucléase micrococcal.e nucléosamenicotinarnide adénine dinucléotide isotope du phosp10re
poids
paire de bases poids m::>léculaire rotation par minute
dodécylsulfate de sodium
Na-p-tosyl-Ir-lysine chlorornéthylcétone Tris (hydroxyrnéthyl) aminométhane
micrograrnrre microlitre ultraviolet volrnœ
Université de Shei:brooke
Points de contact entre les protéines HM:; 1 et 2 et les histones dans la chromatine et leur niveau de poly(ADP-ri.bosylation).
par
Louise Deschênes
Départenent de Biochinri.e
Mé.m:>ire présenté à la FaCl.ù té de œdecine en vue de l'obtention
du grade de maître ès sciences (M. Sc. ) Mars 1990
L'interaction des protéines 1 et 2 du groupe de mobilité électrophorétique élevée (protéines HM:;) avec l 'c:x::tamère d 'histones à
l'intérieur du nucléosorre et leur niveau de poly(ADP-ri.bosylation) ont été étudiés. Extraite de thynn.is de lapin et digérée par des enzyrres, la chromatine a été traitée avec le 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) ca:rbodiimide, lequel catalyse la fonnation de liens covalents entre les résidus de protéines en contact. I.es produits fonnés par la réaction de réticulation ont été séparés sur un système de gel en deux dimensions acide-urée/ soditnn dcx:lécyl sulfate (SI:S), excisés et clivés par une hydrolyse acide partielle. I.es constituants peptidiques des bandes découpées ont été ensuite identifiés par électrophorèse sur gel de
l'intérieur du coeur nucléosanal. En secx>rrl lieu, l'interaction des protéines HM:; 1 et 2 (extraites de thyimJs de veau) avec les histones
nucléosamales a été étudiée dans \ll1 systèrre reconstitué. Ies résultats
m::mtrent la disparition des produits de réticulation constitués en nK>itié de ! 'histone Hl lors de ! 'ajout des protéines HM:; 1 et 2. Ceci
suggère le déplaceiœnt de ! 'histone Hl par les protéines HM:; 1 et 2
dans la chromatine. Les résultats d'expériences de poly(ADP-r.ibosylation) nK>ntrent que les protéines HM:; 1 et 2 peuvent
être mono(ADP-r.ibosylées) a:rnme l'est ! 'histone Hl et qu'elles se retrouvent presque entièrement dans \llle seule fraction de la chromatine. Ies histones du coeur nucléosanal sont poly(ADP-r.ibosylées) dans les mêrres corrlitions expérimantales.
1.1 - Ia chromatine.
Ia chromatine est la principale cœposante du noyau. Elle est
corrposée d 'ArN, d 'histones et de protéines chraoosana.les non histones. De l 'ARN nouvellement synthétisé peut aussi être associé à la chromatine.
1.1.1 - L'acide désoxyribonucléique (AJ:N).
L'AJ:N est fonnée de quatre bases; adénine (A), thymine (T), guanine (G) et cytosine (C), d'un sucre, le désoxyribose et de
groupements monophosphates. Elle code p:>Ur l' infonna.tion génétique
responsable de la biosynthèse d'un répertoire de plus de 50, 000 protéines différentes pour une seule cellule de mannnifère. Ia
stru.cture des ARNs ribosamaux et de transfert, constituants essentiels
p:>Ur la biosynthèse des protéines dans le cytoplasme, est aussi encodée
par l 'MN nucléaire. Claque noyau diploïde de mannnifère contient 5 X 109 pb d'M:N ce qui représente, si l'AIN est sous fonre allongée, 170 cm. Pourtant ces IlX)lécules s 'ac:::canm:x:lent dans un noyau de O, 0008 cm de diamètre. Ceci est possible par 4 niveaux de corrlensation de l 'ArN double hélice qui requièrent l'aide des histones et la participation d'un gran:1 nombre de protéines non histones telles les protéines IM:;.
1.1. 2 - I.es histones.
Il y a cinq principa.ux types d 'histones associées à l 'ALN soit les histones Ill, H2A, H2B, ID et H4. Ce sont toutes des protéines de faible msse IIX)léculaire et dlillgées positivement dont la sb:ucture primaire a été déterminée chez plusieurs espèces. I.es histones sont stabilisées dans la dlramatine via les interactions électrostatiques de leurs groupenents Lys, Arg et His avec les groupes ~tes de
11 ALN. On retrouve aussi des interactions hydrqilabes, des liens
hydrogènes et des interactions électrostatiques histones-histones (Boulikas, 1987a).
1.1.3 - Ie nucléosome.
ra
c.hramatine possède donc plusieurs niveaux d'organisation dont le mieux défini est le nucléosome. En effet, l 'ALN double hélice de mannnifère est d'abord organisée en 25 millions de nucléosomes (Boulikas, 1990). O'laque nucléosome mnsiste en 200 pb d'ALN associées avec les cinq histones (Komberg, 1974) • Ie coeur nucléosamal est une particule de 11 X 11 X 5, 7 rnn, corrp::>Sé d'un octamère d'histones entourépar 1, 75 tour (145 pb) d 'ArN supe:rhélice à main gauche (figure 1) •
SUivant le nroèle de la figure 1, les histones H2A, H2B, ID et H4 cx:cupent l'intérieur du nucléoso!re d'où leur vient le nom d'histones du coeur nucléosomal. Conune la chromatine est une répétition de nucléosames, on suppose aussi la présence d'un lien d'Ar.N présent entre les nucléosornes et qui serait, de plus, important pour la liaison de
Partie supérieure.
Modèle de la
structure
du coeur nucléosarnal proposé par Klug et al. (1980) • L'AIN double hélice est représenté par un tube de plastique. I.es nombres -7 à +7 inliquent les distances le long de l 'Am pour m::>ntrer les 14 tours de la double hélice cx:>ntenus dans les 14 6 paires de base d 'ADN. La position des nombres correspon:i approxllna.tivement aux sites de clivage par la J:Nase I. L'octamè.re d 'histones se présente dans l'ordre H2A1 H2B1 H41 H31 -H32 _ H42 _ H2B2 _ H2A2.Partie inférieure.
l 'histone Ill. Notons que l 'histone Ill, non pas les histones du coeur nucléosamal, peut être préférentiellement relacil.ée de la chromatine par extraction avec O, 5 -
o,
6M NaCl (Boulikas, 1987a) • CeIilénamène
reflète donc mie localisation et mie stabilité différentes de l'histoneIll dans la chramatine par rapport à celles des autres histones. Un m::xièle a été proposé dans lequel l 'histone Ill scelle les deux tours
d 'Am à son point d'entrée et de sortie du nucléosaœ (figure 2) • Par des expériences de réticulation utilisant le 1-éthyl-3-(3-dllnéthylaminopropyl) cartxxliinrl.de (EDAC) , Boulikas (1980) a déloontré que l 'histone Ill
est
en contact avec l 'octamère d 'histones du coeur nucléosamal, plus particulièrement avec l 'histone H2A. SUr le lien d 'Am, l 'histone Illest
donc principalement stabilisée par des interactions électrostatiques avec l 'Am et par formation d'interfaces hydrophobes avec 1 'histone H2A dans le coeur nucléosomal. Contrairement au coeur nucléosamal qui ne possède pas d 'histone Ill, le chromatosone ex>ntient, en plus de l 'octamère d 'histones, mie copie del'histone Ill et 167 pb d'Am.
Constituant le premier ni veau de condensation de 1 'ADN (Felsenfeld, 1978), les nucléosomes, à leur tour, fontlfallt les struc-tures seco:rrlaires, tertiaires et quaternaires encore mal comprises de l 'Arn afin de ex>nstruire les stades intenœdiaires de la chromatine ex>IXlensée jusqu'au chromosone retrouvé durant la mitose. Enfin, il y a évidence pour soutenir l'idée que la chromatine, dans les cellules eucaryotes, est de plus organisée en domaines, c.haClil1 ex>ntenant 50 à
1000 nucléosornes {10 à 200 kb d'AI:N). Ceci est possible par la fixation en boucle de la chromatine à un élément squelettique appelé la matrice
Figure 2
Modèle proposant 1 'emplac::enent de ! 'histone H1 aux :i;:x:>ints d'entrée et de sortie de l 'Am du nucléosarne. I.es trois nucléosames sont ici considérés canune étant une partie d'un solénoïde contenant 6 nucléosarnes par
tour.
I.es acides aminés 40 à 116 (segment hydrophobe)sont en contact avec l' octamère d 'histones du coeur nucléosamal tarxlis que les segments N- et
c-
tenninaux interagissent avec le lien d 'Am. Ce lien contient 40 paires de base et fonce O, 5 tour faisant ainsi0
alterner de 180 ! 'histone H1 à l'intérieur du solénoïde. Ce modèle a
2
116
nucléaire (Hancock et Boulikas, 1982) qui est fo:rmée par une série
spécifique de protéines non histones (Paulson et Iaemnli, 1977; Harx::ock.
et Hughes, 1982) • Dans une boucle de diranatine, les nucléosaœs
peuvent être arrangés en ligne, sous fo:rme de solénoïde ou de
supersolénoïde.
1.1. 4 - Etats de la chranatine.
ra
chromatine peut se présenter sous trois états différents; soit sous fo:rme de chromatine transcriptionnelleiœnt active (gènesspécifiques au type cellulaire, gènes représentés en ARNm), de
chromatine transcriptionnellement inactive ou de chromatine inactive mais potentielleiœnt active (gènes irrluctibles) (Boulikas, 1987b).
la chromatine transcriptionnellement inactive est sous fonne corrlensée et est souvent en contact avec l'enveloppe nucléaire (Fakan
et Bernhard, 1971) tamis que la chromatine transcriptionnelleiœnt
active est sous fonne décorrlensée et est préférentiellement digérée par
la
rnase
1 dans les noyaux intacts (Weintraub et Groudi.ne, 1976).L'histone Hl, connue in vitro pour corrlenser la chromatine (.Reru: et al., 1977), existe en quantité :miniinale ou même est totalement absente
des fractions de la chromatine active. Ainsi, les chromatines
transcriptionnelleiœnt et potentielleiœnt actives peuvent être plus accessibles aux nucléases à cause du plus
gram
nombre de nolécules de nucléases accessibles par nucléosc.aœ dans la chromatine dispersée (fraction active) que dans la chromatine corrlensée (fraction inactive) .Goodwin et al. (1979) et Jackson et Rill (1981) ont dén'Dntré que les chromatines transcriptionnellement et p:>tentiellement actives sous forme de mononucléosomes représentent une fraction soluble sous con:litions ioniques physiol<XJiques, dénuée d'histones H1 et enrichie en protéines HM:;. Enfin, un haut taux d'histones du coeur nucléosamal
acétylées, spécialement pour ID et H4, peuvent être associées avec la chranatine active (Chahal et al., 1980).
Il existe donc des variations dans la structure des nucléosomes. Cette variation est due à la présence des fo:rmes multiples des histones, à des nodifications post-transcriptionnelles variées se prcrluisant sur des sites spécifiques dans la stnicture
primaire des histones et à la fixation des protéines non histones, principalement les protéines HM:; aux nucléosaœs.
1.2 - la réaction de poly(ADP-ri.bosylation).
la réaction de poly(ADP-ri.bosylation) peut être envisagée comme étant une nodif ication post-transcriptionnelle telle que la méthylation et l'adénylation des protéines. Ce qu'il y a de particulier ceperrlant,
est que les résidus formés n'affectent pas seulement la fonction de la protéine cible à travers les nodifications covalentes. En effet, par leur longueur hétérogène, leur cxxrplexité et leur charge, ces résidus peuvent aussi agir irrléperrlarnment sur d'autres irolécules de faç:xm non covalente.
1.2.1 - structure du JX>lyn'ère JX>ly{ADP-ribose).
nrrant cette mxlification, le groupement adénosine dii;iiosphate ribose du NAD+ est enzymatiquement transféré aux histones et à d'autres protéines. Ia figure 3 présente la nature chintlque du JX>lyn'ère ainsi que les enzyires inpliquées dans la synthèse et la
dégradation de ce dernier {Boulikas, 1988) •
ra
structure prinaire du poly(ADP-rihose) a d'abo:rd été élucidée par le groupe de Mandel (Chaman et al. , 1966; Doly et Peter, 1966) • Les groupementsJX>ly{ADP-ribose) sont attachés à la protéine via l'atarce d'oxygène des groupements carboxyliques des résidus d'acide glutamique ou des groupements carboxy-terminaux pour fonner des liens o-glycosides {Marrlel et al. , 1982) • Il y a introduction de 1, 7 chal'.ge négative pour chaque ADP-ribose ajouté (
Pi
7,0). Deux réaction sont alors présentes soit l 'élo~tion qui fonne un squelette ribose a:{l
11
2 ) ribose-Jilosphate-i;ilOS!ilate et le branchement qui se produit à chaque 30 à 50 résidus via un lien a: (11 - 21) ribose-ribose (Miwa
et al., 1981). Par contre, plus récermnent, les résultats de Boulikas (1989) et de Boulikas et al. (1990) dénontrent que, sur ! 'histone H2B, le JX>lymère est branché à chaque dizaines de résidus d'ADP-ribose. Néarnroins, le JX>lymère JX>ly(ADP-ribose), retrouvé dans les cellules eucacyotes, constitue des chaînes de lo~eurs variables allant de 2 à
plus de 200 résidus (Hayashi et al. , 1983) •
1.2.2 - Enzymes ililpliquées dans la réaction de
Schéma rrontrant la structure du polymère de poly(ADP-ribose) et les enzymes impliquées dans sa synthèse et sa dégradation (Boulikas, 1987a).
OH 1' 2' i"\/ \.:.:"' O-O 1' / / / Poly (ADP-Ribose) ,, Glycohydrolase / / / / / / BRANCHING
(ADP-ribosylation) •
L'enzyme responsable de la fonnation du polymère soit de la monomodif ication du groupement carboxylique, de l'élongation
subséquente et du brancherrent est la poly(ADP-r.ibose) polymérase. Elle a été prrifiée dans divers tissus. En résumé, le schéma de base des
réactions de la poly(ADP-r.ibose) polymérase est le suivant:
Accepteur + nNAD+ Arn ~ Accepteur-(ADP-r.ibose) n + nH+
poly(ADP-r.ibose)
+
n(nicotinamide) polyméraseIes enzyrres poly(ADP-r.ibose) glycahydrolase (Ueda et al., 1972; Miwa et al., 1974) et ADP-ribosyl protéine lyase (Oka et al., 1984), sont nonnalernent présentes dans les cellules eucaryotes et dégradent le polymère de poly(ADP-r.ibose) (Figure 3) •
1.2.3 - Fonction de la réaction de poly(ADP-ribosylation).
Pannis les accepteurs pour les produits de réaction, on retrouve les histones (Yoshihara et al. , 1981) , les protéines HM3 (Reeves et
al., 1981), la topoisamérase I (Ferro et Clivera, 1984), la I:NA ligase II (Yoshihara et al., 1984a et 1985b) ainsi que la polymérase elle-même
(Kawaishi et al., 1981). D'autres auteurs ont également dérrontré que les histones du coeur nucléosomal étaient poly(ADP-ribosylées) dans des
noyaux et des nucléosaœs (Giri et al., 1978; Hultesky et al., 1985).
Une caractéristique cx:mm.me des accepteurs semble être leur capacité d'interaction avec l 'AI:N. Notons à ce fait que plus de 95% de la réaction de poly (ADP-ribosylation) est confinée au carpartiment
nucléaire. L'évidence biologique suggère que cette réaction est inlpliquée dans les fonctions majeures de la dlranatine telles que la réparation de l 'AI:N (Boulikas, 1989) , la réplication et l'activité transcriptionnelle (Althaus et Richter, 1987).
Enfin, d'un point de vue technnique, les protéines IŒ et les histones peuvent être visualisées par autoradiograp:tle après incubation des noyaux avec du NAD+ marqué au i;:tiosplore-32. Cette néthode demeure donc une façon utile de vérifier la présence ou l'absence de
ces protéines dans diverses fractions de la chrana.tine.
1.3 - les protéines HM:;.
1.3.1 - Propriétés générales des protéines IŒ.
les protéines HM:; sont pannis les protéines non histones les plus abo:OOantes. (B.ltler et al. ,1985). leur nan abbrévié provient de protéines non histones de groupe de haute IOObilité et in:lique leur migration rapide sur gel de polyacrylamide (Boulikas, 1987a). Ces dernières se retrouvent chez les animaux, les plantes et les champignons (Spiker et al., 1978; Weber et Isenbel:g, 1980; Mayes,
1982). I.es protéines HM3
ont
été isolées initialement de thynrus de veau ( Goodwin et al. , 1973) • SUr une base opérationnelle, les protéines m«;peuvent
être lm:gement définies carmœ étant des protéines solubles dans 2% (P/V) ATC ou dans 5% (V/V) APC; associées à la chranatine, elles peuvent être extraites par 0,35 M NaCl. Ccmnœ les histones, les protéines HM3 sont aussi sujettes à des m:xlifiœ.tions post-transcriptionnelles.Cllez les manunifères, il y a sept principales protéines dans cette classe dont les protéines HM3 1,2,14,17 et 20.
ra
protéine HM3 20 est l 'ubiquitine. On retrouve aussi les protéines m«; I et m«; Y. Les nombres manquants dans cette littérature étaient originellement assignés à des barrles qui ont été plus tard identifiées carmœ étant des produits de protéolyse (Boulikas, 1987a). D'après leurs masses Il'Dléculaires et leurs propriétés biochimiques, les protéines HM3 sont regroupées en 2 familles soit les protéines m«; de hautes masses Il'Dléculaires; les HM3 1 et 2 (Mr: 26 000 - 29 000), et les protéines HM3 de basses masses Il'Dléculaires; les m«; 14, 17 (Mr: 9 000 - 10 500)(Stros et al., 1985), I et Y. I.es protéines m«; 1 et 2 ont une charge nette négative opposée à la charge nette p:>Sitive des protéines m-x; 14 et 17. Ces deux groupes de protéines ont été associés avec les régions de la chromatine transcriptionnellement active (I.evy et al., 1979). Les deux protéines HM:; de basses masses Il'Dléculaires, m-x; I et HM:; Y,
constituent un groupe de protéines qui diffèrent des protéines bien caractérisées, HM:; 14 et HM3 17 (Karlson et al., 1989).
ra
protéine HM3I, aussi connue sous le nom de protéine a (Stauss et Varshavsky, 1984), est la plus étudiée de ce groupe. Notons, de plus, que la
protéine désignée HM:; Y par I..urxi et al. (1983)
est
un isofonœ de cette dernière (Iehn et al., 1988).Enfin comme on retrouve 105 à 106 copies de chacune des protéines m.t:; par noyau cellulaire, soit 1 protéine HM:; à chaque 5 à 10
nucléosomes, ces dernières composent dorx:: la majeure classe de protéines non histone. C'est pourquoi, on croit qu'elles sont impliquées dans la sb::ucture de plus haut ordre de la chranatine et non impliquées dans le contrôle spécifique des gènes (Walker et al., 198Qa) . Par contre, les résultats de Ibmic et Wittig (1987) m:mtrent qu'il y a des protéines HM:; 14 et 17 dans la région codante du gène
d'ovalbumine du IXJU.let et non en anont du i;x:>int d'initiation de la transcription. I.e rôle des protéines HM:; deireure donc assez confus
quoique l'ensemble des résultats expérilœntaux suggère une activation transcriptionnelle des gènes (voir section 1. 3. 6) •
1.3.2 - stnicb.rre des protéines HM:; 1 et 2.
Plusieurs protéines HM:; 1 et 2 obtenues à partir de thynu.IS de
veau ont été séquencées (Wallœr et al. , 1980a) . D'autres infonnations sur la strucb.rre prilllaire de ces protéines proviennent du séquençage des cADNs (Lee et al., 1987; Tsuda et al., 1988). Des études sérologiques suggèrent que les deux protéines diffèrent seulement de 6 à 8% dans toute - leur strucb.rre et qu'elles sont très co:nsei:vées à travers différentes espèces (Romani et al. , 1979) . leurs structures
natives sont approximativement fonnées de 40 à 50% d'hélice a (Orry et
al., 1976). Un p::>int à noter chez ces protéines est que plus de 50% de leurs résidus d'acides aminés sont chargés.
o:mne
chez les histones, 25% de ces denrl.ers sont basiques. Cepenjant, au contraire des histones, les deux protéines contiennent aussi 30% d'acides aminésacides (Walker et al. , 1980b) • Ces résidus sont assymétriquement distribués dans 3 danaines structuraux dont deux, référés aux danaines N-terminal et central, sont basiques. I.e danaine
c-terminal
rontient un gran:i nombre de résidus acides (Reeck et al. , 1982; cacy et al. ,1983).
1.3.3 - Fonction des protéines HM3 1 et 2.
I.e rôle des protéines HM3 1 et 2 dans la structure et le fonctionnement de la chromatine deœure encore peu ronnu mais, leur capacité d'influencer la stabilité de la double hélice d 'AJ:N
(Javaherian et al., 1978, 1979; Yoshida et al., 1984), leur liaison préférentielle à l 'AJ:N sinple brin (Isackson et al. , 1979; Bonne et al., 1982), leur médiation in vitro à associer les histones en tétramères et en octamères et à les assembler avec l 'AJ:N :pour fonner les nucléosomes (Bonne-Arrlrea et al. , 1984) sugg-èrent leur inplication dans la structure de la chromatine (stress et al., 1985). Cepe.rrlant,
leur rôle reste mal défini; certains résultats semblent mêrce
rontradictoires. Par exemple, Waga et al. (1989) ont dém::>ntré que les protéines HM:; 1 et 2 supprinent l'assemblage du nucléosarne à force
ionique physiologique, ce qui s'oppose à ce qui a été énoncé
aux différentes techniques utilisées. Par contre, certains auteurs ont déloontré que la liaison des protéines lm 1 et 2 causerait soit un dérouleiœnt (Dlguet et De Recorrlo, 1978), soit tme superenrouleiœnt local de l'hélice d 'ADN (Bonne-Andrea et al., 1984) selon les corrlitions expérilnentales. Il a aussi été noté que la protéine lm 1
semble reconnaître spécifiqueiœnt les stn.ictures d '.AI:N c:rucifonœs. Elle peut donc ainsi jouer un rôle dans la recœt>inaison génétique ou dans le contrôle de l'expression de gènes spécifiques contenant des
séquences palimrômes (Bianchi et al., 1986).
En sarmne, les protéines lm 1 et 2 pourraient être illlpliquées dans plusieurs processus nucléaires. Entre autre, elles semblent affecter l 'ARN polymérase III en stinrulant la synthèse des produits de
réaction de cette enzyire soit l'ARN ri.bosanal SS et les précurseurs de
l 'ARN de transfert (Stoute et Marzluff, 1982) • les résultats de Tremethick et Mollay (1986, 1989) sont en aa:::ord avec ce résultat en démontrant que les protéines HMG 1 et 2 peuvent stinruler la transcription en agissant sur les prcm::>teurs des ARN polymérases II et III. De plus, :même s'il n'existe pas de preuve directe pour les rôles spécifiques de ces protéines, il a été observé que le taux de protéines HM3 2 va de pair avec l'activité prolifératrice des cellules (Seyedin et IG.istler, 1979) et que le taux des deux protéines est diminué et
même iniétectable dans les cellules en tenninaison de différentiation (Seyedin et al. , 1981) • ra protéine HM31 du foie de rat stinrule les Arn polymérases lorsque les cellules entrent en
Ii1ase
de synthèse d'Arn (Bonne et al., 1982). Il a été aussi suggéré que la partie c-tenninale acide des protéines HM3 1 et 2 (Tremethick et Mollay, 1989) peut êtredirectement impliquée dans 1 'activation transcriptionnelle. Cette suggestion provient de la règle de Ftashne (1988) qui énonce que les activateurs transcriptionnels doivent répomre à deux exigences; soit celui de posséder tm damai.ne de liaison à l'Ar.N et celui d'exposer une surface chargée négativenent. Les protéines mt:; 1 et 2 possèdent ces deux caractéristiques. Elles se lient à l 'Ar.N (Solaoon et al., 1986; Bianchi et al. , 1989) et contiennent une portion très acide d'environ 41 résidus d'acides aminés.
Enfin, par le fait que les protéines mt:; 1 et 2 lient préférentiellenent les silnples brins d 'Ar.N, certains auteurs prop:::>sent rm rôle d'aide pour l'ouverture des deux brins lors de la transcription ou la réplication. suivant cette suggestion, elles joueraient le rôle de protéines déstabilisatrices d'Ar.N (Boulikas, 1987a; Waga et al.,
1989).
1.3.4 - localisation nucléaire des protéines mt:; 1 et 2.
A cause de leur caractéristique dipolaire, on s 'atterrl à ce que les protéines mt:; 1 et 2 entrent simtù:tanénent en interaction avec l'AIN et les protéines asscx::iées à celle-ci. (Bernués et al., 1986). Par exeirple, Isackson et al. (1981) ont rapporté que les protéines HM:;
1 et 2 se liaient plus fortement à la chromatine qu'au double brin d'AIN dénué de ses protéines.
tm relâchement de m::>no- et de courts oligonucléosares enrichis en protéines m-x; 1 et 2, mais apauvris en histone Ill ou Ill et H5 selon le tissu
utilisé
(Jackson et al., 1979; Olambers et Rill, 1984a). Par ce relâchement préférentiel durant les étapes initiales de la digestion, les protéines HM; de hautes wsses m::>lé.culairessont
probablement liéesà la chromatine active et localisées sur le lien d 'ArN, de façon similaire aux histones dites "spécifiques au lien d'ArN'' soit les histones Ill et H5 (I.Bvy et Dixon, 1978). Une hypothèse a donc été émise suggérant que les protéines HM:; 1 et 2 se lient au lien d'ArN et
déplacent ainsi l 'histone In, donnant tm état de la chromatine qui
requiert spécifiquement l'absence de cette histone, c'est-à~ la
chromatine active (cary et al., 1984).
D'autres résultats ont été obtenus à partir d'expériences utilisant le fo:rmaldéhyde c::omrœ agent réticulant. stress et al. (1985) ont déroc>ntré qu' approxiJnativeiœnt deux m::>lé.cules de protéines HM; 1 et
2 sont liées par particule nucléosanale d.é{:xJurvue d'histone Ill et H5 et
possédant une longueur d'environ 185
?J.
En utilisant les mêlœstechniques, aucune liaison n'est obseI:vée dans le cas des coeurs nucléosomaux possédant une longueur d'AIN d'environ 145
?J.
Auparavant, par électropiorèse sur gel, il avait été conclu qu'une m::>lé.cule de HM3 1 et 2 se liait aux 40 i;iJ du lien d 'ArN (Schrëfer et Bode, 1982) • Pardes expériences de réticulation i;::ilotochi:mique, Bernués et al., (1986) ont déroc>ntré que les protéines m-x; 1 et 2 interagissent avec le clliœ.re H2AXH2B et aussi avec le tétramère (H3XH4) 2• n:ins le
secom
cas, cela semble se faire via !'histone H3.Enfin, par des expériences de réticulation au m:>yen du cis-diami.ne didùoroplatine (II), un m:xièle a été proposé pour nontrer les interactions protéine Iro 1, 2-AI:N dans la drranatine entière
(figure 4).
1.3.5 - structure des protéines Iro 14, 17 et I.
Les protéines HMG 14 et 17 sont de petites protéines chrœosomales structurelleirent et fonctionnelleirent très similaires. Elles possèdent peu de groupements non i;x::>laires, pas de groupements aranatiques, un
gram
nombre de résidus p:roline et 45% d'acides aminés chargés quisont
localisés dans la région centrale basique et la région c-tenninale acide (Walker, 1982) . I.es séquences de ces protéines ont été élucidées par Walker et al. (1977; 1979) à partir de thymus de veau et par I.arrlsrnan et al. (1986a et b; 1989) à partir de cultures de cellules humaines. Les séquences primaires ont été très conservées durant 11 évolution (I.arrlsrnan et al. , 1988; Srikantha et al. , 1988) •Les protéines HM:; 14 et 17 sont enroulées au hasard en solution mais
constituent des éléments structuraux plus définis lorsqu 1 elles sont
liées à la chranatine (Bradbw:y, 1983) •
ra
structure primaire de la protéine iro Y humaine a été établie excepté pour quelques acides aminés situés dans les parties N et c- tenninales de la protéine. De plus, il a été obserJ'é que cette séquence est identique à celle de la protéine HM:; I, à l'exception de seuleirent 11 acides aminés (Karlson etal., 1989). D'autres infonnations ont été rapportées par Johnson et al.
Figure 4
Modèle proposé pour dénontrer les interactions entre l 'Arn et les protéines HM; 1 et 2 dans la chromatine entière (Scovell et al. ,
1987) . I.es protéines HM; 1 ou 2 entrent en interaction avec l 'Arn dans
le sillon majeur de 1 'Arn intemucléosomal. I.e schéma m::mtre ici un segment de chromatine contenant deux nucléosames.
génanique et l'expression tissulaire des protéines HM:;-I(Y).
1.3.6 - Fonction des protéines HM3 14, 17 et I.
les protéines HM3 de basses masses noléculaires sont relâchées sélectivement de la chrcmatine par le
traitement
des noyaux à lamaser
sous des corili.tions qui dégradent préférentiellement les gènes actifs (Vidali et al., 1977; IBvy et al., 1977).ra
présence de ces protéines est apparenurentrequise pour
la sensibilité à lamase
I observée chez la chromatine transcriptionnellement active. De plus, cette sensibilité peut être restaurée en reconstituant la chrcmati.ne (lavée préalablement avec 0,35M NaCl) avec des protéines HM3 14 et 17 (Weisbrod et Weintraub, 1979; Gazit et al., 1980). Ces observations ont donc mené à l'hypothèse que ces protéines seraient des protéines structurales dans la chrcmati.ne active (Butler et al., 1985) et potentiellement active, et pourraient être inq:>liquées dans quelquesaspects de la régulation et de la transcription des gènes (I..arrlsman et al., 1986) • En effet, il a été suggéré que les protéines HM3 14 et 17 peuvent conférer des propriétés l.llliques aux régions de la chrcmati.ne contenant des gènes actifs (I.arrlsman et al., 1986).
Cette hypothèse est également appuyée par des expériences de reconstitution avec des nucléosomes isolés (Sarrleen et al., 1980), par des expériences qui ont in:liqué que la microinjection d' antico:rps anti-HM3 17 dans les cellules scanatiques inhibe la transcription (Einck et Bustin, 1983), par des études d' immunofluorescence qui ont in:tiqué
que les anticorps dirigés contre la protéine HM:; 14 colorent les
régions actives des chrœDsaœs polytènes (Westennann et Grossba.ch, 1984), par des expériences d'i.mrm.mo-fractionnement qui ont dénaitré que les régions de la chromatine enrichies en protéine HM:; 17 sont
enrichies de gènes transcriptionnellement actifs (Drukmann et la. , 1986) et d 'histones acétylées (Malik et al., 1984) et par des expériences d' inmn.moprécipitation avec les anticorps spécifiques qui
ont nv::>ntré que cette protéine est associée avec des gènes transcrits activement (Dort:>ic et Wittig, 1986; 1987). Il apparait ainsi que les protéines HM:; 14 et 17 pourraient maintenir des chaînes de nucléosanes spécifiques dans une confonnation transcriptionnellement active. Certains auteurs (Weisbrcxl et Weintra.ub, 1981) ont mêlœ, en prenant avantage de la spécificité connue d'interaction des protéines HM:; 14 et
17 avec la chromatine active, réticulé ces protéines à l 'agarose pour en faire une colonne servant à purifier les nucléosarnes actifs par affinité.
Cepenjant, en dépit de tout cela, la fonction des protéines HM:;
14 et 17 demeure encore peu connue (Iarrlsman et al., 1989). Enfin, ces deux protéines possèdent aussi une affinité préférentielle pour les simples brins d 'AI:N. Weisbrcxl et Groudine (1980) ont suggéré 'lD1 rôle
connne protéines pouvant ouvrir les nucléosanes durant la transcription ou la réplication. Pour ce qui est des protéines HM:; I, il a été
observé qu'elles se retrouvaient préférentiellement dans les cellules en phase de division active (Illrrl et al., 1983; Elton et Reeves, 1986). En effet, il a été démontré que les protéines HM:; I sont présentes à 'lD1
retouvé dans les cellules qui ne se divisent pas. Ce fait amène donc la possibilité de penser que les protéines HM:; I peuvent être requises pour la prolifération de certaines cellules (Goodwin et al. , 1985) •
Selon certaines expériences, il ~t que les p:rotéines HM:; I
se lient spécifiqueirent à la région 3 ' - non traduite (IIDtif (TA'IT) n consei:vé) du cAI:N de l' interleukine - 2 de bovin (Reeves et al. , 1987) et aux régions riches en A et T retrouvées dans la partie 3 ' - non traduite des autres gènes de mammifères (Russnak et al., 1988). Ces protéines HMG pourraient donc jouer un rôle camne régulateur de l'activité :post-transcriptionnelle d'une classe spécifique de gènes comprenant ces séquences. Par ailleurs, il a été observé que les protéines HM:; I :p:>UVaient jouer un rôle dans la mise en
Ji1ase
desnucléosames retrouvés dans l '.AI:N-satellite des singes verts d'Afrique (SolQil'K)n et al. , 1986) , dans les intéractions .AI:N-matrice nucléaire (Elton et al., 1987), dans la condensation de la chromatine métaphasique (Il.m:l et al. , 1983) et dans la maturation de la fin 3 ' des gènes (Reeves et al., 1987; Russnak et al., 1988). Enfin, EcJmer et Bil:nstiel (1989) ont fait exprhner les cAI:Ns codant pour les protéines
HM:; I et HM:; Y dans une bactérie. A ce m::ment, les deux protéines se
lient spécifiqueiœnt à l 'octamère A'IGC AAM retrouvé dans la région p1'.'CHOOtrice des chaines légères des immunoglobulines suggérant que les modifications :post-transcriptionnelles ne sont pas nécessaires pour
leur liaison spécifique à l'.AI:N.
1.3.7 - I..ocalisation des protéines HM:; 14, 17 et I.
Plusieurs travaux ont été effectués concenlallt la localisation des protéines HMG 14 et 17 dans le nucléosame. Des domlées irrlicatrices sur la localisation exacte des protéines mG proviennent d'expériences de digestion à la
mase
I de coeurs nucléosanaux enridtls ou non en protéines HM3 14 et 17 (Mardi.an et al., 1980). lar:nase
I est connue pour produire une série de c::ouprres à l'intérieur des 146 pb d 'AIN entourant le coeur nucléosanal. Après liaison des protéines HM3 de basses m:isses m:>léculaires, ! 'activité de ! 'enzyme est diminuée àdeux sites en particulier tamis que les autres sites possèdent une activité qui est augmentée. les deux sites le long de l'AIN où la diminution de l'activité enzymatique a été observée peuvent alors représenter les sites de liaison des protéines mG 14 et 17, soit d'environ 20 à 25 pb à partir de chaa.m des bouts 5' et 3 ' de l'AIN. Cette association HMG-histones causerait alors une neutralisation partielle des charges positives des histones rerrlant les régions d 'AIN adjacentes plus accessibles à la DNase I (figure 5) • Cette localisation a été aussi confinnée par des expériences de réticulation protéine-AJ:N (Shick et al., 1985) et par des études de dénaturation thermique (Sarrleen et al., 1980). Dans ce travail, les auteurs affinnent que sur un intezvalle considérable de concentration de sel, les deux m:>lécules de HM3 14-17 peuvent être liées fortement mais de façon réversible sur chaque nucléosame.
Par des expériences de réticulation en présence d'iminothiolane, Cook et al. (1986), ont suggèré que la protéine HM3 17 est localisée près du domaine globulaire de !'histone H2A à l'intérieur du nucléosarne
Figure 5
Modèle représentant la localisation de la protéine HM:; 14 sur le
nucléosome détenninée par digestion à la désoxyribonucléase 1. Dans ce m:::rlèle, la portion de liaison à l'Am d'tme m:>lécule d'HM.:; 14 est liée à l 'Am nucléosomal aux sites 1 et 2 (sites 13 et 12 sur le brin corrplémentaire) et protège cette région de la réaction.
ra
portion acide de la m:>lécule est liée aux histones dans le sillon de la supertlélice, neutralisant ainsi leurs charges positives et rerrlant le tour adjacent de la superhélice plus accessible à la INase 1. Ceci explique l 'augrrentation de l'activité enzymatique aux sites 9 et 103
11'.13
-
~
111
3
Figure 6
Partie supérieure.
Modèle nontrant les sites de liaison de la protéine HM:; 17 dans le coeur nucléosarnal. I.es astérisques nontrent approximativerrent les sites de réticulation HM:; 14/17-AJ:N soit aux positions - 0,25, 125 et 43 paires de base à partir de chaque bout 5' de l 'AJ:N nucléosarnal. I.es régions pointillées (0 - 20
ID
ET 120 - 140ID)
sont protégées de la digestion à la rnase I (Cook et al., 1986).Partie inférieure.
Modèle nontrant le mode de liaison des protéines HM:; 14/17 sur le coeur nucléosarnal. I.e bout tenninal OJOH de la protéine HM:; 17
interagit avec ! 'histone H2A. Une secorrle nolécule de HM:; 17 se lie à
la face opposée du coeur nucléosarnal. Ia longueur du squelette de la protéine HM:; 17 n'est pas à l'échelle (Cook et al. , 1989) •
(figure 6a) • En 1989, par spectroscopie de résonnance magnétique nucléaire, certains de ces auteurs, (Cook et al., 1989), ont awrofonti ces résultats et déroc>ntré que la m:>lécule entière de HrwG 17 entre en interaction avec le coeur nucléosCJnal dans ces comitions de force ionique physiologique.
ra
région c-tenninale acide se lie plus faibleiœnt à l'AIN tamis que la région centrale basique se lie plus forterœnt à l 'AI:N du coeur nucléosCJnal • Ils concluent alors que c'est le groupe C-tenninal de la protéine HrwG 17 qui interagit avec !'histone H2A et proposent alors un autre IOOdèl.e (figure 6b) •En étudiant ! 'effet de la protéine HrwG 17 sur la stabilité thennique des oligonucléosarces, Yau et al. (1983) ont conclu qu'il y
avait deux sites de liaison pour la protéine HrwG 17 par nucléo.scme. Ces sites sont localisés entre les points d'entrée et de sortie du nucléo.scme et la région centrale d 'AIN forterœnt carplexée. I.es mêmes auteurs ont
ensuite
dém:>ntré qu'il existait aussi deux sites de liaisonpour la protéine HrwG 17 et ce, par nucléo.scme contenant des protéines histones acétylées.
Enfin, par des expériences de dispersion de neutrons, Ubel:bacher et al. (1982) ont dém:>ntré qu'il était ai:parent que la liaison des protéines HrwG 14 aux nucléosarces de la drranatine entière est la cause des changeiœnts subtils à la confonnation de la supertiélice d 'AIN et que cette liaison ne produit pas de changeiœnt majeur au niveau du réarrangeiœnt des histones du coeur nucléosarnal. Tous leurs IIO.ièles rrontrent une augmentation radiale de la supertiélice d 'AIN par un léger dérouleiœnt de la supertiélice. Des techniques de biréfrirgence de flots
(Harrington et al. , 1982) ont aussi déioontré 11 augioontation radiale de
la supertiélice d'AIN des nucléosaœs cœprenant la protéines HM:; 14.
1. 4 - Agents de réticulation.
La plupart des informations obtenues sur les contacts histone-histone et histone-protéine chromosomale non histone proviennent de réactions de réticulation drimiques effectuées sur la cllranatine. les réactifs les plus utilisés sont ceux cammmément appelés "agent de réticulation à distance
zéro".
On retrouve dans cette classe le tétranitrométhane, l'irradiation aux rayons ultraviolets, l'oxydation des groupeiœnts sulfydl:yles en disulfures et les cartxxliinùdes. Ainsi ccmne ces agents ne possèdent pas de bras pour lier les deux m:>lécules en contact, il y aura alors établisseiœnt d'un lien covalent entre ces deux dernières et ce, seulerrent si elles se trouvent en contact électrostatique.L'agent de réticulation utilisé dans le présent travail est le 1-éthyl-3-(3-dllnéthylaminopropyl) cartxxliinùde ou ~c. Ce derivé
cartxxliilnide catalyse principalerœnt la fonnation de liens amides entre les groupements camoxyliques et amines des protéines qui sont en interaction électrostatique.
ra
capacité des cartxxlii.mides à réticuler les histones dans la chromatine est grandement réduite avec 1' accroissement de la force ionique, démontrant ainsi que les groupements réticulés se trouvent à une distance permettant l'interaction ionique (Boulikas, 1987a).1. 5 - But du travail.
I.e but du présent travail est d'étudier l'interaction des protéines H[Ç 1 et 2 avec l 'octamère d 'histones à l'intérieur du
nucléosare et leur niveau de poly(ADP-ribosylation).
A l'aide de l'agent réticulant Erl1\C, il est théoriquenent possible de détenniner la localisation des protéines H[Ç 1 et 2 sur le
nucléosare, à savoir avec quelle histone du coeur nucléosamal ces denrlères seront réticulées. Après réticulation, il y aura alors fonna.tion d 'nn dllnère. Ce denrler peut être brisé par des techniques de clivage chinrl.que ou enzymatique afin de permettre l'identification
de chacune des deux ll'Dlécules en contact.
En effet, lors de l'ajout de l'agent réticulant à la chromatine, il y aura fonna.tion d 'nn lien amide entre les ll'Dlécules en contact électrostatique. Par exemple, les histones H2A, H2B, H3 et H4, qui
occupent l'intérieur du nucléosane, vont fonœr entre elles une série de systèmes à deux c::arrposantes. I.es protéines H[Ç 1 et 2, dé.Ioontrées à
être en interaction électrostatique avec les histones du coeur nucléosamal, devraient donc, à leur tour, fonœr nn dbnère avec une de ces denrlères. Etant donné leurs masses ll'Dléculaires plus élevées, les
dbnères ainsi fomtés seront facile à situer; leur vitesse de migration sur gel d'électrophorèse sera ll'Dins rapide que celle des ll'Dlécules seules.
ra
barrle atterrlue à contenir à la fois la protéine HM:; 1(2) etune des histone du coeur nucléosomal sera découpée.
Une hydrolyse acide pennettra de briser le dllnère en plusieurs peptides. En parallèle, des histones et des protéines HM; 1 et 2 de
référence subiront le nêne traitement. En carparant les peptides de clivage obtenus pour chacun des téroc>ins avec ceux obtenus pour la barrle découpée, il sera alors possible d'identifier chacun des deux constituants du dllnère. Ce résultat va donc pennettre l'identification de 1 'histone du coeur nucléosomal en contact électrostatique avec la protéine HM; 1 ( 2) .
2.1 - Matériel.
Les thymus de veau ont été obtenus à 1 'abattoir Giroux (Branptonville) tan:lis que les lapins proviennent de l'animalerie de la faculté de médecine de l'Université de Shert>rooke
le bleu de Coomassie brillant R-250, la
pyronine
Y, le sucrose, le sœ, le bleu de b~énol et l'agarose (ultra ?Jl'.'e ~grade) ontété fournis par la compagnie Bio-Rad I.abora.tories, Mississauga, Ontario.
ra
nucléase micrococcal.e, le sulfate de protamine, le 2-mercaptoéthanol, le TLCK et le branure d' éthidium proviennent de la compagnie Sigma Cll.emical Co., st-IDuis, Missouri. le1-éthyl-3-(3-dllnéthylaminopropyl) carlx:xlii.mide et le Triton X-100 sont de Pierce Cll.emical Co., Rockfo:rà., IL. le Trizrna base et l 'acrylamide proviennent de la c:arrpagnie Terochem I.abora.tories Ltd. Toronto, Ontario. le KCl, la glycérine, l'acide trichloroacétique, l'EIJI'A et le nitrate d'argent proviennent de la compagnie Fisher Scientific, Montréal, Québec. L'acide perchlorique, le ca.C12, l'acétone, le chlorure de sodium et l'acide acétique glacial sont de Produits chimiques BCH ltée, Ville st-Iaurent, Québec. L'acide sulfurique et le chlorure de magnésium proviennent de la c:arrpagnie J. T. Baker Cll.emical Co. , Rtllipsburg, New Jersey. Enfin l'acide hydrochlorique provient d'Anachemia canada Inc.,
Iachine, Québec et l'urée ultra pure d 1 ICN Biamed.icals canada Ltée. ,
st-Iaurent, Québec.
L' (adénylate-32PJ NAD+ (activité spécifique de 30 Ci/nuoole) provient de la c:arrpagnie
r::u
Pont, Wilrnington, Delaware.2.2 - Méthodes.
2.2.1 - Extraction des protéines IM:;.
N.B. Toutes les maniµllations s'effectuent sur bain de glace.
2.2.1.1 - Préparation de l'hamogénat.
I.e thymus de veau de lait fraichement prélevé (erwiron 150 g) est d'abord nettoyé de ses tissus sanguins et adipeux. Un voluiœ de 200 ml du t.airpon X (0,3 M sucrase, 50 nM Tris-HCl
PI
6,8, 25 nM KCl, 4nM M:JC].2 , 1 nM
caci
2 eto,
1% (P/V) de 2-nercaptoéth.anol) contenant 30% (V/V) de glycérol est ajouté. I.e tissu est ensuite hamogénéisé au froid avant d'être passé à travers deux ép.3isseurs de rrousseline. L'hamogénat est consfilVé à-ao
0c
jusqu'à utilisation.L'hamogénat de thymus de lapin est préparé selon la même néthode que celle décrite ci-haut. Ceperrlant, quatre thymus d'erwiron 4 g cila.Clill sont utilisés et hamogénéisés dans 40 ml du t.alrpon X contenant 30% de glycérol. Les thymus proviennent de lapins pesant erwiron 900 g.
2.2.1.2 - Isolement des protéines.
A 25 ml d 'h.aoogénat de thynus de veau, on ajoute 100 ml d'une solution A contenant 5 nM MJC].2 et 10 nM Tris-Hel
IiI
6,8 pour ensuite centrifuger à 2500 RIM pemant 5 minutes. Ie culot ootenu (noyaux) est resusperrlu dans 30 ml de la solution A et 25 ml d'une solution froide d'acide chlomydrique 1 M. Après avoir laissé rep:>Ser 5 minutes sur la glace, le mâlaDJe est centrifugé à 6000 RIM durant 20 minutes.D:lns le sw:nageant alors ootenu, on retrouve les histones du coeur nucléosamal, les histones Ill et les protéines HM:;. les histones du coeur nucléosamal sont précipitées par un ajout de 5% (P/V) d'acide perchlorique (HC104). Ie mâlaDJe est gardé sur glace durant 5 minutes et centrifugé à 6000 RIM durant 20 autres minutes. Au sw:nageant sont ajoutés 3 volurœs d'acétone afin de faire précipiter les histones Ill durant une heure à -20°c tamis que le culot contenant les histones du coeur nucléosamal est conservé. les histones Ill sont obtenues par centrifugation ( 6000 RIM, 30 min. ) , tamis que les protéines HMG sont obtenues en ajoutant 3 volurœs additionnels
d'acétone au :ncx.weau sw:nageant. Ces dernières précipitent durant la nuit et sont retrouvées dans le culot ootenu après une centrifugation de 20 minutes à 6000 RIM.
Tous les culots obtenus (histones du coeur nucléosamal, histones Ill et protéines IM:;) sont lavés 3 fois à l'acétone et séchés sous hotte. les poudres alors obtenues sont gardées à -20°c. Pour les analyses électrophorétiques, ces dernières sont dissoutes dans de l'eau distillée ( 1 ng/ml pour les histones du coeur nucléosamal et les histones Hl, 2 ng/ml pour les protéines IM:;) et à 2/3 d'un volune de
Figure 7
Schéma résumant l'extraction des protéines HM:; à partir de
2 500 RFM, 5 min., 4°C
culot (noyaux) surnageant
0,5 M HCl, 5 min., 4°C 6 000 RFM, 20
min.,
4°Cculot SUrnageant: Hl, ~, H2A, H2B,
H3, H4
5% (P/V) HClo4 , 5min., 4°C 6 000 RFM, 20
min.,
4°CSUrnageant: Hl, ~ culot: histones
du coeur nucléosornal 3 vol. d'acétone, 60 min., -20°c
6 000 RFM, 30 min., 4°C
1=~
3 vol. d'acétone 16 hrs, -20°c 6 000 RFM, 20min.,
4°C sm:nageantces solutions est ajouté 1/3 du mélange spécifique au gel de Iaemrnli.
2.2.2 - Fractionnement de la dn:'Clnatine.
N.B. Toutes les manip.llations s'effectuent sur bain de glace.
2. 2. 2 .1. - Isolement des noyaux.
A O, 5 ml d 'homogénat de thym.is de lapin déposé dans tm tube de
plastique (Epperrlorf), on ajoute 0,1 ml de 10% (P/V) Triton X-100 afin de lyser les cellules. Ie tout est mélangé et 0,5 ml d'une solution de
tarrpon X (sans sucrase) contenant 60% (V/V) de glycérol est ajouté pour fonœr tm coussin dans le fom du tube pernettant de retenir les autres
organelles cytoplasmiques. Les noyaux sont alors ?-Jrifiés par une centrifugation (environ 10 000 x g) de 2 minutes à travers le coussin de glycérol. Le surnageant est alors jeté et les noyaux sont
resusperrlus dans O, 05 ml de tan'pon X contenant en plus 2 nM TLCK.
2.2.2.2 - Digestion et f:ractio:nnerœnt.
A O, 1 ml de noyaux resusperrlus sont ajoutés 11, 5 RU de nucléase micrococcale. Ie tout est resusperrlu et digéré pen:3ant 7 minutes à 37°C. En centrifugeant 2 minutes (10 000 x g), une f:raction identifiée
œ
est obtenue et constitue le surnageant qui contient surtout lesmononucléosames en solution qui sont préférentiellement clivés par l'enzyme et qui sont enrichis en protéines IM:;. Ie culot est alors
resuspen:lu dans
o,
5 ml d'une solution contenant 2 ll'M EDI'A et 3 IIM Tris-HelIif
6,8. Parcette
étape, les chaînes de nucléoscaœs de longueurs variables (NCh) sont alors relâchées et sont récupérées dans le smnageant par une centrifugation de 2 minutes (10 000 x g).Ie culot obtenu, qui contient les chaînes de nucléosares liées à la matrice nucléaire (NSh) , est resuspeirlu d.i.rectelœnt dans
o,
1 ml du mélange spécifique au gel dans lequel il migrera. Une certainequantité du mélange spécifique au gel utilisé sera aussi ajouté à une
certaine quantité des smnageants
œ
et NCh lors de leur migration électrophorétique.2.2.2.J - Précipitation à l'acide sulfurique.
A 0,05 ml de la fraction
œ
est ajoutée de l'acide sulfurique (H2so 4 ) à une concentration finale deo,
26 M. la précipitation s'effectue durant 10 minutes à 0°C. Une centrifugation (10 000x
g) de5 minutes est alors effectuée. Ie culot est lavé à l'acétone et séché. Ie smnageant est précipité avec 25% (V/V) d'A'IC et le culot obtenu après une centrifugation de 2 minutes (10 000 x g) est aussi lavé à l'acétone et puis séché. les deux culots finaux sont alors solubilisés dans
o,
02 ml du mélange spécifique au gel Iaenunl.i utilisé pour l'expérience.Figure 8