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Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier Discipline ou spécialité : Immunologie et maladies infectieuses
JURY
Elisabeth MENU: Rapporteur Franck HALARY: Rapporteur Georges HERBEIN: Examinateur Stéphane BERTAGNOLI: Examinateur
Patrice MASSIP: Examinateur Christian DAVRINCHE:Directeur de thèse
Ecole doctorale : Biologie-Santé-Biotechnologies Unité de recherche : Inserm U563
Directeur(s) de Thèse : Christian DAVRINCHE Rapporteurs : Elisabeth MENU
Présentée et soutenue par RAUWEL Benjamin
Le 19 Mars 2010
Titre : Activation du récepteur nucléaire PPAR-gamma
par le Cytomégalovirus Humain: Implication dans la réplication virale et la perturbation de la migration placentaire
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Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier Discipline ou spécialité : Immunologie et maladies infectieuses
JURY
Elisabeth MENU: Rapporteur Franck HALARY: Rapporteur Georges HERBEIN: Examinateur Stéphane BERTAGNOLI: Examinateur
Patrice MASSIP: Examinateur Christian DAVRINCHE:Directeur de thèse
Ecole doctorale : Biologie-Santé-Biotechnologies Unité de recherche : Inserm U563
Directeur(s) de Thèse : Christian DAVRINCHE Rapporteurs : Elisabeth MENU
Franck HALARY
Présentée et soutenue par RAUWEL Benjamin
Le 19 Mars 2010
Titre : Activation du récepteur nucléaire PPAR-gamma
par le Cytomégalovirus Humain: Implication dans la réplication virale et la perturbation de la migration placentaire
UNIVERSITE PAUL SABATIER TOULOUSE III
ECOLE DOCTORALE BIOLOGIE-SANTE-BIOTECHNOLOGIE
2010
THESE
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE TOULOUSE III
Spécialité IMMUNOLOGIE ET MALADIES INFECTIEUSES
Benjamin RAUWEL
Activation du récepteur nucléaire PPAR
γγγγ par le Cytomégalovirus Humain :
Implication dans la réplication virale
et la perturbation de la migration et de l’invasion placentaire.
Directeur de thèse
Christian DAVRINCHE
Jury
Elisabeth Menu
Franck Halary
Georges HERBEIN
Stéphane BERTAGNOLI
Patrice MASSIP
Remerciements
Je tiens à adresser mes remerciements les plus sincères
Au Docteur Christian DAVRINCHE,
Pour m’avoir accueilli au sein de son laboratoire durant toutes ces années, pour m’avoir transmis la passion de la recherche ainsi qu’un esprit scientifique et pour son extrême gentillesse. Je lui exprime toute ma gratitude.
Aux Docteurs Elisabeth MENU, Franck HALARY ainsi qu’aux Professeurs Georges HERBEIN, Stéphane BERTAGNOLI et Patrice MASSIP,
Pour l’attention qu’ils ont porté à ce travail et pour m’avoir fait l’honneur d’être parmi le jury de cette thèse.
Au Docteur Thierry FOURNIER,
Pour m’avoir accueilli chaleureusement au sein de son laboratoire tout au long de notre collaboration, et pour toute son aide apportée à ce travail ainsi qu’à ma formation.
Au Docteur Danielle EVAIN-BRION,
Pour sa collaboration et son accueil au sein de son laboratoire.
A tous les membres de l’équipe CD/JI (anciens et actuels),
Pour l’excellente ambiance de travail, d’avoir supporté mon humour durant toutes ces années et pour les tennis et squash qui permettent de se détendre après des heures de manips ! Merci à vous tous : Les deux Jérôme, Mélinda, les Charlotte, Bernard, Stéphane (pour toutes ses contrepèteries et ses grands films), Michel, Franck, Hugo, Marie-Émilie, tous les gens de l’IFB. Et tous ceux que j’oublie.
Un remerciement tout particulier à Hélène, qui m’a tout appris, pour sa gentillesse et toute l’aide qu’elle m’a apporté.
A Aline DARMANA,
Pour toute son attention, sa gentillesse et tous ses petits gâteaux et gourmandises qui nous ont permis d’égayer nos journées !
Au Docteur Nathalie Vergnolle ainsi que toute son équipe,
Pour la collaboration sur mon projet de thèse et leur sympathie. Un grand merci à Nicolas pour son aide et ses réactifs !!!!
A toute ma famille,
Pour leur soutien durant toutes ces années et bien d’autres encore… Il n’y a pas de mots pour exprimer à quel point ils sont importants pour moi.
A ma belle famille,
Pour m’avoir accueilli au sein de leur famille et soutenu comme leur propre fils.
A tous mes amis,
Pour l’ambiance excellente qui règne au sein du groupe, leur amitié et leur soutien moral.
Et un grand merci à ma petite femme adorée,
Qui m’a soutenu et supporté mon humeur durant tout ce travail et toutes ces années. Sans qui la vie serait différente et nettement moins intéressante. Je t’aime.
Et à notre premier enfant,
Qui est encore dans le ventre de sa mère mais que nous attendons avec impatience pour le mois d’Août.
Sommaire
Remerciements ... 2 Sommaire ... 4 Abstract ... 6 Résumé ... 7 Abréviations ... 8 INTRODUCTION ... 9 LE CYTOMEGALOVIRUS HUMAIN ... 10 I. Historique ... 11 II. Généralités ... 11 III. Epidémiologie ... 12IV. Relevance clinique (Mocarski et al., 2007b) ... 13
V. Réponse immunitaire et vaccination ... 15
a. Réponse Immunitaire innée ... 15
b. Réponse immunitaire adaptative ... 16
c. Schéma récapitulatif de la réponse immune anti-CMV ... 17
d. Vaccination ... 17
e. Mécanismes d’échappement immunitaire du HCMV ... 19
VI. Biologie du HCMV ... 21
a. Structure de la particule virale et génome ... 21
b. Tropisme et entrée du virus ... 24
c. Cycle de réplication ... 25
d. Le MIEP et les protéines IE ... 28
VII. Peroxisome Proliferator Activated Receptor γ (PPARγ) ... 34
e. Généralités sur les PPARs ... 34
f. Structure de PPARγ ... 35
g. Rôle transcriptionel ... 36
h. Rôle de trans-répresseur ... 37
i. Les différents rôles de PPARγ ... 38
LE PLACENTA HUMAIN ... 41
I. Structure du placenta ... 42
II. Mise en place du placenta au cours de la grossesse... 44
IV. PAPP-A dans la grossesse ... 49
V. MMP et TIMP ... 50
VI. Les récepteurs PAR (Protease Activated Receptor) ... 52
VII. HCMV et pathologie de la grossesse ... 57
VIII. Objectifs du travail ... 59
TRAVAUX DE RECHERCHE ... 60
L’activation du récepteur nucléaire PPARγγγγ par le HCMV pour sa réplication perturbe la migration et les propriétés invasives du cytotrophoblaste. ... 61
Etude des mécanismes dépendant de l’activation de PPARγγγγ par le HCMV perturbant la migration et l’invasion du cytotrophoblaste. ... 90
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ... 102
BIBLIOGRAPHIE ... 108
Abstract
Activation of nuclear receptor PPAR
γγγγ
by Human Cytomegalovirus: Implication in viral replication and impairment of placental migration and invasiveness.Human Cytomegalovirus (HCMV), a member of the betaherpesvirus family contributes to the development of numerous diseases in immuno-compromised hosts, fetuses and newborns. Primary infection during the first trimester of pregnancy could lead to miscarriages or intrauterine growth retardation. It has been demonstrated that the virus benefits from inflammation by using Cyclooxygenase-2 (COX-2) pathway for the transcription of its immediate early genes, especially IE2 production which is essential for viral replication and whose transcription is under the control of the Major Immediate Early Promoter (MIEP). Up to now, mechanisms were still unknown. Interestingly, COX-2 activation leads to the production of a natural ligand for PPARγ, a transcription factor belonging to the nuclear receptors family.
In this study, we have demonstrated for the first time that HCMV induced activation of PPARγ for its de novo replication and notably for IE2 transcription. Accordingly, we have identified three new functional DNA binding sequences for PPARγ (PPRE: PPar Response Element) into the distal part of the MIEP.
Then, we focused on the role of PPARγ in placental migration and invasion, with special care on consequences of its activation by HCMV. We have demonstrated that HCMV impaired migration and invasiveness of cytotrophoblast by activating PPARγ. Studies of sustained mechanisms allowed us to identify potential targets amongst which PAR receptors whose function was impaired by HCMV.
Further studies should allow to identify new targets useful in prognostic of pregnancy with high risk for newborns and to develop new therapeutic approaches.
Résumé
Activation du récepteur nucléaire PPAR
γγγγ
par le Cytomégalovirus Humain : Implication dans la réplication virale et la perturbation de la migration et invasion placentaire.Le cytomégalovirus Humain, membre de la famille des β-Herpèsvirus, est responsable de nombreux troubles chez les personnes immuno-déprimées, les fœtus et les nouveau-nés et une primo-infection de la mère durant le premier trimestre de grossesse peut entraîner des avortements spontanés ainsi que des retards de croissance intra-utérins. Il a été montré que le virus tire profit de l’inflammation en utilisant la voie de la cyclooxygénase-2 (COX-2) pour la transcription des gènes très précoces, aboutissant en particulier à la production de la protéine IE2, indispensable au cycle viral. Aucun mécanisme n’a été décrit jusqu’à présent. Cette protéine est sous le contrôle d’un promoteur majeur appelé MIEP (Major Immediate Early Promoter). En aval de la voie COX-2 se situe le récepteur nucléaire PPARγ, un facteur de transcription dont un des ligands naturels est un produit de cette voie enzymatique.
Dans cette étude nous avons pu démontrer pour la première fois l’utilisation de ce facteur de transcription par le HCMV pour sa propre réplication, et notamment pour la transcription de la protéine très précoce IE2. Nous avons alors identifié trois nouvelles séquences de fixation de PPARγ à l’ADN (PPRE : PPar Response Element) dans la partie distale du MIEP et la fonctionnalité de ces séquences a été démontré.
Dans un second temps, nous nous sommes intéressés au rôle de PPARγ dans la migration et l’invasion placentaire et plus particulièrement aux conséquences de son activation par le HCMV. Nous avons démontré que le HCMV perturbe la migration et les capacités invasives du cytotrophoblaste extravilleux en activant PPARγ. L’étude des mécanismes à l’origine de ce phénomène nous a permis d’identifier des cibles potentielles parmi lesquelles les récepteurs PAR (Protease Activated Receptor) dont la fonction est perturbée par l’infection.
L’étude approfondie des mécanismes impliqués devrait par ailleurs permettre d’envisager de nouvelles cibles afin de diagnostiquer les grossesses à risque ainsi que de nouvelles cibles thérapeutiques.
Abréviations
COX-2 : Cyclooxygénase-2
CTEV : Cytotrophoblaste Extravilleux CTV : Cytotrophoblaste Villeux
GPCMV : Guinea Pig Cytomegalovirus HCMV : Cytomégalovirus Humain HETE : Acide hydroxyeicosatétraénoïque
HIPEC : Human Invasive and Proliferative Extravillous Cytotrophoblast HODE : Acide hydroxyoctadécanoïque
IE : Immediate Early
IGF-II : Insulin-like Growth Factor IGF-II R : IGF-II receptor
MIEP : Major Immediate Early Promoter MMP : Matrix Metallo-Proteinase
M.O.I. : Multiplicity Of Infection
PAPP-A : Pregnancy Associated Plasma Protein-A PAR : Protease-Activated Receptor
PGC-1 : Ppar Gamma Co-factor-1
PPAR : Peroxisome Proliferator Activated Receptor PPRE : PPar Response Element
RAR : Retinoic Acid Receptor RXR : Retinoic X Receptor SCTV : Syncytiotrophoblaste
SUMO : Small Ubiquitin-like Modifier TIMP : Tissue Inhibitor of Metallo-Proteinase
PREMIERE PARTIE
I.
Historique
La première description de la pathogénie du cytomégalovirus date du début du XXe siècle.
C’est en 1904 que Ribbert, Jesionek et Kiolemenoglou décrivent pour la première fois la présence de grandes cellules à inclusion intranucléaire dans les reins, les poumons, le foie ainsi que la parotide de fœtus et d’enfants mort-nés, caractéristique de ce qu’ils désignent alors comme « la maladie des inclusions cytomégaliques ». L’origine virale de cette maladie est démontrée dans les années 20 par un rapprochement de ces lésions avec les cellules de lésions cutanées de la varicelle ainsi que l’étude histologique de glandes salivaires de cochons d’Inde infectés. En 1932, Farber publiera une étude démontrant que 12% des enfants mourant de pathologies variés sans point commun apparent possèdent des inclusions cytomégaliques dans leurs glandes salivaires. Il désigne alors ce virus comme le « virus des glandes salivaires ». Son isolement à été réalisé par la suite dans les années 50 par 4 groupes indépendants : Wyatt suggère la première technique de diagnostic qui consiste en la recherche de cellules caractéristiques de l’infection dans les urines de bébés. Technique qui sera appliquée dès 1952 par Fetterman. En 1956, Smith obtient la réplication du virus responsable de « la maladie des inclusions cytomégaliques » dans des cellules fibroblastiques humaines cultivées in vitro. Rowe va alors isoler la première souche à partir de tissu adénoïdien d’un enfant normal. Cette souche sera alors désignée comme AD169. En 1960, Weller et al. désignent ce virus du terme « cytomégalovirus » en raison de la morphologie des cellules infectées. Par la suite, des études sérologiques démontreront que l’infection à cytomégalovirus est largement répandue dans la population mondiale et son rôle étiologique dans les syndromes mononucléosiques est confirmé. Dans les années 60-70, le lien entre la baisse des défenses immunitaires et la réactivation du virus est démontré. Des études vont alors établir que les individus très jeunes, âgés, affaiblis ou immunodéprimés sont plus affectés par l’infection.
II.
Généralités
Le cytomégalovirus appartient à la famille des Herpesviridae dans laquelle il existe 8 virus infectant l’homme classés en 3 sous-familles, les alpha-, béta- et gamma herpesvirinae. Ces virus possèdent un large spectre d’hôtes et peuvent induire deux types d’infections : une infection lytique correspondant à une forte réplication du virus conduisant à la lyse de la
attendant un moment plus approprié tel qu’une immunodéficience ou l’expression de protéines nécessaires à l’aboutissement du cycle lytique. Ces virus ont un large tropisme mais un spectre d’hôte très étroit et sont résumés dans le tableau suivant :
Identification Génome
Désignation Nom usuel (abréviation anglo-saxonne) Sous-famille Taille (kpb)
HHV-1 Herpès simplex 1 (HSV-1) α 152
HHV-2 Herpès simplex 2 (HSV-2) α 152
HHV-3 virus de la varicelle (VZV) α 125
HHV-4 Virus d'Epstein Barr (EBV) γ 172
HHV-5 Cytomégalovirus Humain (HCMV) β 248
HHV-6 A roseolovirus β 159
HHV-6-B roseolovirus β 162
HHV-7 β
HHV-8 virus du sarcome de Kaposi (KSHV) α 230
Tableau 1 : Virus de la famille des Herpèsviridae infectant l’être humain. (Pellett and Roizman, 2007)
III.
Epidémiologie
L’infection par le HCMV concerne la population mondiale. Chaque espèce a son propre CMV, ce qui explique que le réservoir est strictement humain. La séroprévalence varie énormément selon les zones géographiques du globe. Elle peut aller de 50 à 90 % selon les pays, les ethnies ainsi que les conditions socio-économiques. Ces pourcentages sont intimement liés aux conditions sanitaires et aux modes de transmission du virus. Le HCMV étant un virus enveloppé, cela le rend fragile et non persistant dans le milieu extérieur. Il est sensible aux pH acides, détruit par les solvants et ne résiste pas à la chaleur. La contamination se fait donc via un contact étroit avec des malades ou des personnes séropositives asymptomatiques (porteurs sains) excrétant du virus dans les urines, les sécrétions cervicales, le lait, le sperme, la salive ainsi que les larmes. Après une primo infection, l’excrétion virale dans les urines est plus ou moins prolongée selon l’individu. Il existe différents modes de transmissions :
Tout d’abord, l’infection peut survenir lors de la grossesse (transmission verticale). La transmission se fait alors in utero par voie placentaire de la mère à l’enfant. En effet, 1% des nouveaux nés excrètent du HCMV dans les urines. La transmission peut aussi être périnatale
ou post-natale après acquisition du virus lors du passage des voies génitales ou lors de l’allaitement. Entre 8 et 60% des enfants sont infectés durant les 6 premiers mois de la vie à cause de l’alimentation par le lait maternel contaminé par le virus. Ce mode de transmission reste le plus répandu dans le monde (Reynolds et al., 1973; Stagno et al., 1984). Plus tardivement, les enfants peuvent se transmettre entre eux le virus par la salive durant la petite enfance (4 fois plus d’infections chez les enfants mis en crèche). Dans ce cas l’infection se fait par voie pharyngée.
Chez les adultes, le mode de contamination le plus répandu est la contamination par voie sexuelle du fait de la présence du HCMV dans les tractus génitaux. La séropositivité est alors en rapport avec le nombre de partenaires sexuels et l’âge du premier rapport sexuel. De plus le taux de prévalence des anticorps anti-HCMV chez les adolescents fait plus que doubler durant la première année d’activité sexuelle.
Enfin, il existe un dernier mode de transmission dans les pays industrialisés, l’infection iatrogène. Celle-ci se fera en l’occurrence par le sang ou les organes transplantés provenant de donneurs séropositifs. Pour la transplantation, il peut également y avoir une réactivation du virus essentiellement due aux traitements immunosuppresseurs (Kotton and Fishman, 2005).
IV.
Relevance clinique (Mocarski et al., 2007b)
La primo-infection est en général asymptomatique. Les malades symptomatiques vont présenter une fièvre, des myalgies ainsi qu’un syndrome mononucléosique identique à celui causé par le virus d’Epstein-Barr. Environ 8% des mononucléoses sont causées par le HCMV. Cependant l’atteinte d’un organe cible est exceptionnelle chez le patient immunocompétent : pneumopathie, myocardite, hépatite, encéphalite ou encore ulcérations coliques. Les réactivations et les réinfections ne se manifestent que rarement par un syndrome mononucléosique et sont en général asymptomatiques chez l’adulte non immunodéprimé. Il peut cependant y avoir des complications et de graves troubles de santé dans certains cas : Au cours de la grossesse, la primo-infection ainsi qu’une réinfection par une souche différente de HCMV durant le premier trimestre peut provoquer des avortements spontanés. Au-delà de ce phénomène, l’infection peut se transmettre au fœtus par le placenta avec une incidence qui varie de 0.2 à 2%. Elle est rarement symptomatique mais environ 5% des enfants infectés in
retard de croissance intra-utérin, une microcéphalie ou encore une chorio-rétinite. Tout ceci se traduit par de graves séquelles telles qu’un retard mental ou des troubles sensoriels (vision, ouïe) (Cheeran et al., 2009). Les réactivations durant la grossesse ainsi que les infections périnatales sont pour la plupart asymptomatiques et sans conséquence, cependant dans 5 à 10% des cas elles peuvent conduire plus tardivement à des séquelles neurologiques dont la plus fréquente est la surdité. Un chapitre sera consacré plus tard aux détails et aux conséquences de l’infection par le HCMV durant la grossesse.
Dans le cas de greffes, le HCMV occupe un des premiers rangs en termes de complications infectieuses. Chez les transplantés, les maladies à CMV représentent un risque majeur d’infection (60 à 100% des transplantés rénaux). Cependant ce pourcentage varie en fonction de la transplantation (organe solide ou moelle osseuse), de l’organe transplanté et du traitement utilisé lors de la greffe. Le rejet de greffe est alors très lié à l’infection HCMV dans de nombreux cas. En effet le traitement immunosuppresseur a une action activatrice sur le HCMV (réactivation ou primo-infection symptomatique), tandis que la réduction du traitement immunosuppresseur au cours de l’infection favorise le rejet.
Chez les patients atteint du VIH et au stade SIDA, le HCMV reste une des infections opportunistes les plus répandues. La prévalence du HCMV ainsi que ses voies de transmissions font que la majorité des patients infectés par le VIH le sont aussi pour le HCMV. L’infection reste asymptomatique dans un premier temps et se traduit uniquement par une excrétion du HCMV dans les urines, la salive et les sécrétions génitales. Cependant, lorsque le patient devient immunodéprimé, le HCMV se manifestera le plus souvent par une rétinite. L’atteinte de la rétine se traduit par une baisse de l’acuité visuelle et son extension est irréversible (Scholz et al., 2003). L’infection peut alors s’aggraver en troubles neuronaux tels qu’une encéphalite subaigüe. Encore une fois, le HCMV se manifeste de manière opportuniste et profite de l’immunodépression de son hôte pour se répliquer.
Le HCMV est aussi impliqué dans d’autres phénomènes tels que l’athérosclérose. En effet l’infection par le HCMV va stimuler la prolifération cellulaire et accélérer l’angiogénèse (Bentz and Yurochko, 2008). D’autres travaux contradictoires sur le sujet laissent un doute quant au réel impact de l’infection sur l’athérosclérose.
Enfin, bien que le HCMV ne soit pas répertorié comme un virus oncogène, son infection a été impliquée dans différents cancers. Un concept « d’oncomodulateur » permet de mieux expliquer son rôle mais les études sont encore en pleine expansion.(pour revue (Michaelis et al., 2009)).
Afin de contrecarrer le virus, il est important de comprendre la réponse immunitaire spécifique et de développer une vaccination et de meilleurs outils de diagnostic et thérapeutiques.
V.
Réponse immunitaire et vaccination
a. Réponse Immunitaire innée
La réponse immunitaire innée va jouer un rôle important dans la défense anti-HCMV et permettra par la suite d’activer la réponse immunitaire adaptative. Les principaux récepteurs pour cette réponse seront les Toll-like récepteurs (TLR) et plus particulièrement les TLR-3 et 9 pour la reconnaissance de l’ADN viral, mais aussi le TLR-2 au moment de l’entrée du virus notamment par sa fixation à la glycoprotéine d’enveloppe gB (Boehme et al., 2006; Compton et al., 2003). Cette activation du système immunitaire inné va induire une sécrétion de cytokines inflammatoires et engendrer l’activation des cellules dendritiques (DC), des macrophages ainsi que des cellules NK. Ces cellules pourront alors lyser directement les cellules infectées (NK) ou activer une réponse immunitaire adaptative (macrophages et DCs). La réponse immunitaire NK anti-CMV a été décrite pour la première fois chez la souris par une activité d’élimination ainsi que de protection contre l’infection (Bukowski et al., 1985; Bukowski et al., 1983; Polic et al., 1998).
Le rôle anti-CMV de ces cellules chez l’Homme est encore assez méconnu. Cependant il a été démontré que leur activité augmentait durant une infection HCMV et que leur absence était corrélée avec des primo-infections herpétiques sévères dont le HCMV (Biron et al., 1989; Venema et al., 1994).
Les récepteurs mis en jeu dans cette reconnaissance sont présentés dans la revue de Guma (Guma et al., 2006).
b. Réponse immunitaire adaptative
Au cours de la réponse immunitaire adaptative, la réponse humorale sera traduite par une activation des lymphocytes B sécrétant des anticorps neutralisant avec pour cible principale la glycoprotéine d’enveloppe gB (Britt et al., 1990). Parallèlement à cela, la réponse immunitaire médiée par les lymphocytes T reste le mécanisme prédominant de contrôle de l’infection par le HCMV. Il existe un large panel de reconnaissance des antigènes du HCMV par les lymphocytes T CD4 et CD8, résumés dans la figure 1.
Figure 1 : Représentation schématique des antigènes viraux reconnus par la réponse immunitaire
médiée par les cellules T CD4 et CD8 chez les personnes en bonne santé. La réactivité relative indiquée est basée sur les réponses T détectées ex-vivo et in-vitro (Gandhi and Khanna, 2004).
A côté de cela, il a été démontré que les lymphocytes Tγδ, et plus particulièrement les Vδ2neg, pouvaient être activés par les cellules infectées par le cytomégalovirus ainsi que les cellules épithéliales intestinales tumorales (Halary et al., 2005).
c. Schéma récapitulatif de la réponse immune anti-CMV
Figure 2: Contrôle du HCMV par l’immunité innée et adaptative. L’infection primaire par le HCMV
chez les individus en bonne santé commence typiquement dans les épithéliums des muqueuses (A), après quoi le virus se dissémine dans les cellules myéloïdes incluant les monocytes et les cellules CD34+, ou il établira sa latence (B). Une expression restreinte des gènes viraux est observée dans ces
cellules infectées de manière latente ce qui limite leur reconnaissance par les cellules effectrices. La différenciation de ces monocytes infectés en macrophage ou cellule dendritique peut initier l’infection productive (C). Les particules virales ou les corps denses (voir chapitre sur le cycle viral plus loin) peuvent être présentés par les cellules dendritiques pouvant alors stimuler les cellules T spécifique de l’antigène (D). Parallèlement à cela, les DCs activées via les TLR peuvent aussi secréter un panel de cytokines activant les cellules effectrices de la réponse innée (D). Les macrophages infectés peuvent aussi activer directement les lymphocytes T spécifique d’antigène (C). Ces lymphocytes T activés (CD8, CD4 et γδ) et les cellules NK peuvent directement lyser les cellules infectées par cytolyse ou bloquer la réplication viral au travers de la sécrétion de cytokines telles que l’IFN-γ ou encore du TNF (E). Une autre réponse importante est médiée par les lymphocytes B activés qui vont contrôler les virions libres dans le milieu extracellulaire par le biais de la production d’anticorps neutralisant (F) (Crough and Khanna, 2009).
d. Vaccination
Actuellement il n’existe aucun vaccin contre le HCMV. Bien que de considérables avancées thérapeutiques aient été faites, cela reste un véritable challenge. Dans un premier temps, l’utilisation de virus atténué basée sur le concept de la vaccination jennérienne n’a hélas rien
recombinants plus immunogènes que la souche sauvage atténuée. Plus récemment, certains groupes ont testé de nouveaux vaccins basés sur l’utilisation de protéines virales recombinantes ou encore de vecteurs viraux tels que les poxvirus ou les adénovirus. Les principales techniques utilisées en vaccination sont résumées dans la figure 3.
Parmi les modèles animaux actuellement utilisés le modèle cochon d’Inde offre des avantages uniques en comparaison avec les autres modèles. Un argument clé est que le GPCMV (CMV du cochon d’Inde) va traverser la barrière placentaire et causer des infections
in utero. C’est pourquoi ce modèle est extrêmement bien adapté pour étudier la vaccination
dont le rôle est de bloquer la transmission du virus (Schleiss, 2008). De plus le génotypage récent du GPCMV a permis d’améliorer les approches techniques pour l’élaboration des vaccins, notamment grâce aux recombinaisons génomiques désormais possibles et facilitées par l’apparition d’une nouvelle technique de modification du génome viral : la technique du BAC (Bacterial Artificial Chromosome). Nous détaillerons le principe de cette technique par la suite.
Figure 3 : Les différentes stratégies de vaccination développées contre le HCMV. (Crough and
e. Mécanismes d’échappement immunitaire du HCMV
Tout comme la plupart des Herpesviridae, le HCMV a développé de nombreux mécanismes d’échappement aux acteurs de la réponse immunitaire innée et adaptative. Le virus va utiliser différents moyens pour bloquer cette réponse, en diminuant l’expression des molécules de CMH de classe I et II pour limiter la reconnaissance des antigènes viraux par les lymphocytes T et leur activation. Une protéine homologue du CMH de classe I (UL18) codée par le virus va limiter la reconnaissance des cellules infectées (Beck and Barrell, 1988). L’expression des peptides (UL16 et UL40) qui se lieront aux CMH non classiques pour inhiber l’activation des cellules NK est un autre moyen de limiter la réponse anti-virale. Toutes ces protéines virales spécifiques sont appelées des immuno-évasines et sont décrites dans la revue de Powers (Powers et al., 2008). Un dernier exemple est celui de l’homologue viral de la cytokine IL-10 (UL111a) visant à limiter l’inflammation et l’apoptose pour faciliter la dissémination du virus (Kotenko et al., 2000). Après avoir démontré pour la première fois la présentation croisée d’antigènes viraux (Arrode et al., 2002; Arrode et al., 2000) pouvant palier le blocage de l’activation des lymphocytes T, notre équipe s’intéresse désormais aux mécanismes encore méconnus de la perturbation de la différenciation des monocytes en cellules dendritiques, autre mécanisme de contrôle de l’inflammation découvert récemment (Gredmark and Soderberg-Naucler, 2003; Moutaftsi et al., 2004; Moutaftsi et al., 2002).
Très récemment, il a été découvert un système de micro-ARN viraux pouvant inhiber le système immunitaire (Grey et al., 2005; Stern-Ginossar et al., 2007). Actuellement, 11 micro- ARNs ont été identifiés dans le génome du HCMV par des moyens bioinformatiques. Cependant les cibles ainsi que la fonction de la plupart de ces micro-ARN restent méconnus. Il existe deux scénarii possibles quant à leur fonction, la régulation des gènes cellulaires afin d’installer un environnement favorable à la réplication virale, ou encore la régulation des gènes viraux pour optimiser la réplication virale en fonction du tissu ou de la cellule infectée. L’hypothèse actuelle est la cohabitation de ces deux théories car il a été démontré que certains micro-ARN viraux pouvaient diminuer l’expression de la protéine très précoce IE1, inhibant alors l’infection aigüe pour installer une latence, alors que d’autres avaient pour cibles des gènes cellulaires, tels que MICB (MHC class-I related chain B), responsable de la reconnaissance suivie de la lyse des cellules infectées par les cellules NK via le récepteur NKG2D. La diminution de cette protéine par les micro-ARN viraux aurait ici un rôle d’échappement au système immunitaire. Voir les revues de Dolken et de Grey pour plus d’informations (Dolken et al., 2009; Grey and Nelson, 2008).
Figure 4 : Récapitulatif des différents gènes viraux et cellulaires induits par l’infection, impliqués
dans l’échappement à la réponse immunitaire. Chaque gène viral est indiqué avec sa localisation dans le génome viral et sa fonction associée (Gandhi and Khanna, 2004).
Malgré tout, la fonction de ces immuno-évasines n’a été démontrée qu’in vitro. En effet, ces mécanismes ont été démontrés comme inefficaces in vivo dans des souris immunocompétentes (Holtappels et al., 2002) et qu’il existait même des lymphocytes T CD8 spécifiques de ces protéines (Elkington et al., 2003). Tous ces mécanismes ne seraient efficaces que chez un hôte dont le système immunitaire est affaibli, démontrant bien l’existence d’un équilibre entre la réplication du virus et la réponse immune. Pour bien comprendre ce phénomène, il est important de connaître la biologie du virus et comment se déroule son cycle de réplication.
VI.
Biologie du HCMV
a. Structure de la particule virale et génome
Le HCMV est un virus à ADN double brin de très longue taille (~248 kpb). Cette double hélice est protégée par une capside icosaédrique d’un diamètre d’environ 100 nm, elle même entourée d’une matrice composée de protéines du tégument protégées par une enveloppe d’origine cellulaire. Les 4 composants principaux du virion sont présentés dans la figure 5.
Figure 5 : Structure du virion HCMV, (d’après (Streblow et al., 2006)).
9 La nucléocapside est composée de 5 protéines majeures :
La protéine majeure de la capside (ou MCP pour « Major Capsid Protein »), codée par le gène UL86, est comme son nom l’indique, le composant principal de la capside (Chee et al., 1989). Cette protéine est située au niveau des capsomères et forme les unités pentamériques et hexamériques de la structure icosaédrique.
La protéine mineure de liaison à la capside (ou mCBP pour « minor Capsid Binding Protein »), codée par le gène UL46, est localisée sur la face interne de la capside et va
Ces deux protéines vont s’organiser autour d’une charpente nécessaire à leur assemblage. Cette « pré-capside » est composée de fragments de l’Assembly protéin (codée par le gène UL80) et de la protéine mineure de la capside (ou mCP pour minor Capsid Protein codée par le gène UL85) Ces protéines vont former des triplexes pour lier les pentanes et hexanes entre eux.
Enfin il a été récemment démontré que la plus petite protéine de la capside (SCP pour Smallest Capsid Protein, codée par le gène UL48-49) est essentielle à l’assemblage de la particule infectieuse, notamment au travers des interactions avec les protéines du tégument (Borst et al., 2001).
9 Les composants du tégument :
La majorité des protéines du tégument sont des protéines phosphorylées. (Mocarski et al., 2007b). La protéine pp65 (ppUL83) constitue environ 95% du tégument. Cette protéine comporte des signaux de transfert nucléaires (Gallina et al., 1996) expliquant sa localisation dans le noyau des cellules quelques minutes seulement après l’infection. Cependant sa fonction reste inconnue. Parmi les phosphoprotéines de structure du tégument, pp150 (ppUL32) représente à elle seule environ 20% de la masse du virion. A coté de cela, certaines protéines moins abondantes vont jouer un rôle important dans la réplication, telles que pp71 (ppUL82) qui est un transactivateur de l’expression des gènes viraux. La phosphoprotéine pp28 (ppUL99) est hautement immunogène et est retrouvée à la périphérie de la capside. Bien d’autres protéines sont retrouvées dans cette matrice, telles que pp130 (ppUL56 impliqué dans la maturation du virion), ppUL84, ppUL47, ppUL69 etc. Cependant, bien qu’un rôle dans la régulation de l’expression des gènes viraux ou la modification de la réponse cellulaire aient été démontré pour certaines (comme pp28 (ppUL99) (Britt et al., 2004) (Silva et al., 2003)), la fonction de la plupart de ces protéines reste indéterminée.
Certaines protéines cellulaires spécifiques sont emportées dans ce tégument, telles que la cPLA-2 (Allal et al., 2004) ou encore la Caséine Kinase II (Nogalski et al., 2007), protéines qui auront le rôle d’activer plus rapidement certaines voies de signalisation (NF-κB pour la CK-II) et faciliter ainsi qu’accélérer la réplication virale.
En complément de ces protéines, le tégument contient de nombreux ARN cellulaires et viraux (Bresnahan and Shenk, 2000; Greijer et al., 2000) dont la quantité incorporée est proportionnelle à leurs quantités présentes dans la cellule (Terhune et al., 2004). Ces ARN
permettraient à certains gènes viraux d’être exprimés directement après l’entrée du virus dans la cellule, et ceci en absence de transcription du génome viral.
9 L’enveloppe virale :
L’enveloppe est constituée d’une bicouche lipidique d’origine cellulaire (Golgi) et possède à sa surface une multitude de glycoprotéines virales : gB, gH, gL, gO, gM et gN (codées respectivement par les gènes UL55, UL75, UL115, UL74, UL100 et UL73). La plupart ont été démontrées comme étant essentielles à la production de particules infectieuses (Hobom et al., 2000). Ces protéines vont jouer un rôle essentiel à la pénétration du virus dans la cellule hôte, dans la transmission du virus de cellule à cellule et dans la formation de syncitia (Keay and Baldwin, 1992; Navarro et al., 1993). Ces protéines portent de nombreux épitopes reconnus par des anticorps neutralisant et seront les principales cibles de la vaccination.
9 Le génome viral :
Le génome du HCMV est le plus grand de tous les Herpesviridae. Il est constitué de deux régions uniques non répétées : une région longue (UL : Unique long) et une région courte (US : Unique Short). Ces deux régions sont flanquées de séquences répétitives terminales (TR : Terminal Repeat) appelées TRL à l’extrémité de la séquence UL et TRS à l’extrémité de la séquence US. La jonction des 2 segments UL et US est constituée de la répétition inversée des TRL et TRS appelées respectivement IRL et IRS. Au cours de la réplication, il apparait 4 isoformes différentes du génome viral selon l’orientation des séquences UL et US, illustrée dans la figure 6. On dénombre environ 200 cadres ouverts de lecture dont les gènes sont nommés selon leur localisation au sein des différentes séquences (exemple : US1, US2 … UL1, UL2 …) (Mocarski et al., 2007a).
Après séquençage de la totalité du génome de plusieurs souches, une différence importante à été remarquée entre les souches dite « de laboratoire » et les souches « cliniques ». En effet, bien que montrant près de 98% de séquences identiques, les souches cliniques codent au minimum 19 gènes supplémentaires, surement perdus dans la souche de laboratoire par de nombreuses délétions et réarrangement lors de ses nombreux passages en culture de laboratoire. Ces gènes sont impliqués dans la virulence et le tropisme, pouvant expliquer la plus grande virulence ainsi que le tropisme plus large (endothéliotrope) des souches cliniques.(Cha et al., 1996).
Figure 6 : Structure du génome du cytomégalovirus Humain.
b. Tropisme et entrée du virus
L’infection à CMV est spécifique d’espèce. Aucune lignée d’origine animale ne permet la réplication du HCMV. In vivo, le HCMV peut infecter une grande variété de cellules comme les monocytes/macrophages/dendritiques, les cellules endothéliales, épithéliales, les cellules musculaires lisses, les fibroblastes, les cellules stromales, les neutrophiles, les hépatocytes (Plachter et al., 1996; Sinzger and Jahn, 1996; Sinzger et al., 1996) ainsi que les cellules progénitrices neuronales, les neurones et les astrocytes (Luo et al., 2008). Le tropisme diffère cependant entre les souches cliniques et les souches de laboratoire. Ce tropisme cellulaire est basé sur un « îlot génétique de tropisme » comprenant trois ORF : UL128, UL130 et UL131A. Ces trois gènes seraient actifs dans la souche clinique mais inactifs dans les souches de laboratoire, perdus après de nombreux passages sur fibroblastes (Jarvis and Nelson, 2007). Actuellement l’attachement et l’entrée du virus est celui décrit par Teresa Compton (Compton, 2004) et illustré dans la figure 7. L’attachement du HCMV commence par des interactions de basse affinité entre les molécules d’Heparane Sulfates (HSPG) et les molécules gM/gN et gB de l’enveloppe virale. Cependant, bien que strictement requises, ces interactions ne sont pas suffisantes pour l’infection. Elles seraient suivies de l’attachement du virus à ses récepteurs et d’un recrutement de co-récepteurs puis de la fusion (avec ou sans endocytose selon le type cellulaire infecté) de la membrane virale et de la membrane cellulaire et libération de la capside dans le cytoplasme. Immédiatement après l’entrée du virus, les protéines structurales de la capside sont dégradées et l’ADN du virus entre dans le noyau. A côté de cela, la fixation aux TLRs activerait la réponse immunitaire innée.
Il n’existe pas de récepteur spécifique au HCMV. En effet, les glycoprotéines d’enveloppe interagissent avec tellement de protéines cellulaires qu’il est difficile de définir un récepteur type. Le principal récepteur actuellement décrit est le récepteur à l’Epithelial Growth Factor
(EGF-R) dont l’interaction avec l’intégrine αvβ3 est essentielle pour la transmission du signal (Wang et al., 2005; Wang et al., 2003). Cependant il existe une polémique à ce sujet, en effet selon différents auteurs, ce récepteur est essentiel (Bentz and Yurochko, 2008) ou non (Isaacson et al., 2007). Il faut toutefois prendre en compte le type cellulaire infecté, l’EGFR n’étant pas exprimée sur la majeure partie des cellules hématopoïétiques, pourtant très largement infectées in vivo. D’autres récepteurs sont définis comme la molécule DC-SIGN qui permettrait la trans-infection des cellules dendritiques aux autres cellules permissives (Halary et al., 2002), ou encore le PDGF-R via l’interaction avec la gB (Soroceanu et al., 2008).
Figure 7 : Illustration du mécanisme général d’entrée du HCMV dans les cellules (Compton, 2004).
c. Cycle de réplication
Le cycle naturel de l’infection par le HCMV oscille comme tous les Herpesviridae entre une primo-infection, l’installation d’une latence et des épisodes de réactivation ou de réinfection. Dans le cas de latence, le HCMV persiste indéfiniment dans l’organisme. Des ARN messagers transcrits des gènes IE sont présent mais en très faible quantité. Les réactivations surviennent avec fréquence lors des réactions allogéniques (transplantation) ou lorsque l’hôte est immunodéprimé. Parfois, certains signaux spécifiques tels que des signaux de stress,
d’inflammation ou simplement l’apport d’une molécule permettant l’activation de certains facteur de transcription suffisent à réactiver le virus (Meier, 2001).
Les cellules dans lesquelles le virus va installer sa latence sont les cellules progénitrices CD34+ et leur différenciation en monocyte puis en macrophage ou cellules dendritiques va alors induire la réactivation du virus (Figure 8). Pour une revue complète sur la latence du HCMV voir : (Sinclair, 2009; Sinclair and Sissons, 2006).
Figure 8 : Hypothèse actuelle du modèle de latence et de la réactivation du HCMV chez une personne saine. Bien que l’ADN viral puisse être détecté dans toutes les cellules myéloïdes durant
l’infection latente, l’expression des protéines IE n’est remarquable que durant la différenciation des cellules en macrophages ou cellules dendritiques, cette expression conduisant alors à la réactivation du virus (d’après (Sinclair and Sissons, 2006)).
Dans le cas d’une infection active, le cycle du HCMV varie de 96 à 120 heures. L’infection est initiée par la fixation du virus sur la membrane cellulaire, la fusion des membranes virales et cellulaires ou l’endocytose du virion suivie de la fusion des membranes. Après libération de la capside, l’ADN viral est directement transloqué au noyau. La circularisation en épisome du génome viral se fait environ 4 heures après l’infection, ce qui indique que cette étape nécessite l’assistance de protéines virales ou cellulaires (McVoy and Adler, 1994). La transcription des gènes viraux s’effectue en 3 phases coordonnées : les phases IE, E et L.
9 Une phase très précoce IE (Immediate Early)
Durant cette phase, les protéines régulant les transcriptions virales ultérieures vont être produites. Les deux protéines très précoces principales et essentielles à l’aboutissement du cycle viral sont les protéines IE1 et IE2, codées respectivement par les gènes UL123 et UL122, tout deux sous contrôle d’un même promoteur majeur appelé le MIEP (Major Immediate Early Promoter). Cette région activatrice contient de nombreux éléments de réponses à différents facteurs de transcription que nous décrirons plus en détails par la suite, celle-ci étant un des objets principaux de notre étude.
9 Une phase précoce E (Early)
Cette phase va aboutir à la production des protéines correspondant aux enzymes de réplication virale (ADN-polymérase virale codée par le gène UL54) ainsi que le produit du gène UL44 qui s’associera à cette dernière pour permettre sa progression sur le brin matriciel. Une autre protéine importante sera exprimée durant cette phase, il s’agit de la protéine kinase UL97, intervenant dans la phosphorylation du ganciclovir, drogue antivirale utilisée actuellement en clinique.
9 Une phase tardive L (Late)
C’est durant cette phase que le génome viral sera dupliqué et les protéines structurales exprimées, telles que les protéines majeures et mineures de la capside (UL86 et UL46). Les capsides seront alors assemblées dans le noyau et s’envelopperont dans la membrane nucléaire en migrant vers le cytoplasme. Elles acquièrent alors les protéines du tégument dont la synthèse en excès dans les saccules de l’appareil de Golgi forme les « corps denses », très antigèniques comme indiqué précédemment. Une inclusion cytoplasmique va alors se former, caractéristique du HCMV et les virions seront libérés après acquisition d’une enveloppe à partir du reticulum endoplasmique. Un schéma récapitulatif du cycle viral est proposé dans la figure 9.
Figure 9 : Cycle de réplication du HCMV dans la cellule d’après (Crough and Khanna, 2009)
d. Le MIEP et les protéines IE
Les protéines IE1 et IE2 sont deux protéines très précoces du HCMV essentielles à l’accomplissement du cycle viral. En effet une délétion d’IE1 dans le génome viral entraîne des perturbations dans la réplication à faible m.o.i. (Mocarski et al., 1996) et la délétion d’IE2 empêche le virus de se répliquer par une incapacité à exprimer des gènes lytiques précoces (Marchini et al., 2001). Ces deux protéines sont issues d’un épissage alternatif d’un gène (UL122-123) sous contrôle du promoteur majeur MIEP.
9 Le MIEP :
Ce promoteur contient de nombreuses séquences répétées pouvant fixer différents facteurs nucléaires tels que NF-κB, AP-1 ou des sites de fixation CRE (Cyclic AMP response element) (Stamminger et al., 1990), SRE (Serum Responsive Element) ou encore RARE (Retinoic Acid Response Element) (Ghazal et al., 1992). Un aperçu global de l’organisation du MIEP est proposé en Figure 10.
Figure 10: Organisation générale du MIEP, d’après (Meier and Stinski, 2006).
Le facteur de transcription considéré comme nécessaire à l’activation du MIEP est NF-κB. Cependant, certaines études démontrent que le virus peut très bien se répliquer sans utilisation de ce facteur de transcription, notamment dans les cellules épithéliales de la rétine (Cinatl et al., 2001) durant les premières heures suivant l’infection. Cela dit, d’autres groupes ont démontré que dans ce type cellulaire, l’activation de NF-κB était nécessaire dans des temps plus tardifs (Hooks et al., 2006).
D’autres éléments de réponse à différents facteurs de transcription ont été mis en évidence comme cela à été précisé précédemment, certaines séquences étant plus importantes que d’autres dans le splicing IE1/IE2 (Meier et al., 2002; Netterwald et al., 2005). La plupart de ces éléments de réponse ayant été localisés dans la partie distale du MIEP, il a été démontré que ces séquences jouaient un rôle uniquement à faible m.o.i. (multiplicity of infection) et que le virus arrivait à palier leur absence à forte m.o.i. dans le cas de délétion complète de cette partie du génome viral (Keller et al., 2003; Meier and Pruessner, 2000; Meier and Stinski, 1997).
Il a été démontré récemment que les sous-unités de NF-κB utilisées par le virus étaient différentes selon le type cellulaire et la phase de l’infection (précoce ou tardive). Ainsi le virus utilisera les sous-unités p50/p65 dans les fibroblastes ou durant les phases précoces de l’infection dans les macrophages, alors qu’il utilisera les sous-unités p100/Bcl-3 dans la phase tardive de l’infection de ces mêmes cellules (Khan et al., 2009). Tout ceci montre bien la complexité de la régulation du MIEP et des acteurs régulant son activation au cours du cycle viral.
A côté de cela, l’interaction du MIEP avec des protéines de structure de l’ADN cellulaire telles que les nucléosomes va jouer un rôle important dans la transcription des gènes viraux. Nous allons assister à une dynamique d’assemblage et de désassemblage des nucléosomes avec l’ADN viral (Nitzsche et al., 2008) ainsi qu’une véritable régulation de l’acétylation des
histones présent sur ce dernier, notamment via l’interaction directe entre les protéines IE et les histones déacétylase HDAC-1, -2 et -3, paramètre essentiel au contrôle de la transcription des gènes viraux dans les cycles lytiques ainsi que la latence (Murphy et al., 2002; Reeves et al., 2005; Woodhall et al., 2006). Tous ces paramètres vont donc réguler l’expression des protéines IE et pourront être rétro-régulés eux-mêmes par ces dernières.
9 Les protéines IE :
Les protéines IE sont issues d’un épissage alternatif. Bien qu’IE1 et IE2 soient les deux protéines très précoces principales il existe d’autres formes alternatives selon les exons sélectionnés pouvant jouer un rôle de co-activateurs (Shirakata et al., 2002) mais dont la fonction principale reste méconnue :
Figure 11 : Les différents produits de l’épissage alternatif du transcrit primaire IE, d’après (Meier and
Stinski, 2006).
Ces protéines sont localisées dans le noyau de la cellule à proximité des domaines cellulaires ND10 et leur fonction principale est de réguler la transcription des gènes viraux précoces et tardifs, soit en agissant directement comme facteur de transcription soit en interagissant avec certaines protéines cellulaires impliquées dans la répression ou l’activation des gènes viraux mais aussi cellulaires.
En effet, la protéine IE1 va stimuler de nombreux promoteurs viraux et cellulaires via son interaction physique avec de nombreuses protéines cellulaires telles que CTF-1, SP1, E2F1 à 5, TAFII130/TAF4, p107, HDAC-2, PML et Daxx (Meier and Stinski, 2006; Nevels et al.,
2004), mais aussi via une activité kinase inhérente sur certains facteurs de transcription comme Rb, E2F et c-jun (Pajovic et al., 1997). Cette protéine peut également induire l’expression des sous-unités de NF-κB et disloquer les domaines ND10 cellulaires pour empêcher leur rôle répressif sur la réplication virale (Muller and Dejean, 1999; Woodhall et al., 2006). Cette dernière fonction est en particulier permise par la SUMOylation d’IE1, c'est-à-dire la liaison covalente avec la protéine SUMO-1 (Small Ubiquitin-like Modifier). Il a été en effet démontré que les protéines IE pouvaient être modifiées de cette manière afin d’acquérir de nouvelles fonctions (Sadanari et al., 2005). La protéine IE2 SUMOylée va quant à elle, jouer un rôle essentiel dans la réplication virale (Berndt et al., 2009; Hofmann et al., 2000; Lee et al., 2003).
Le rôle fondamental de la protéine IE2 a pu être démontré aux moyens de virus dont la majorité de la séquence du gène UL122 (codant la protéine IE2) a été délétée (Marchini et al., 2001). Cette construction a été possible grâce à la technique des BAC mise au point par Martin Messerle (Messerle et al., 1997), consistant à cloner le génome viral entièrement dans un chromosome bactérien artificiel, insérer ce chromosome dans E.coli permettant alors d’effectuer de la mutagénèse sur le génome viral. Ce chromosome est alors produit en bactérie puis extrait pour être ensuite transfecté dans des fibroblastes où son expression et sa réplication produira de nouveaux virions dont le génome contient les mutations désirées. Le principe de la technique est résumé dans la figure 12.
IE2 va donc jouer un rôle trans-activateur de promoteurs cellulaires et viraux de la même manière qu’IE1 (Meier and Stinski, 2006) mais joue également un rôle trans-répresseur sur son propre promoteur via sa fixation sur la séquence CRS (cis-repression signal) localisée entre la TATA box et le site de départ du MIEP (Pizzorno and Hayward, 1990).
Figure 12 : Principe de la technique BAC. (A) Le clonage du génome HCMV dans le BAC. Le
réplicon BAC (en bleu) flanqué de séquences virales est transfecté dans des fibroblastes infectés par la suite par le HCMV. Le génome viral qui a été incorporé dans le BAC par recombinaison homologue est isolé puis transféré dans E.coli. (B) Le principe de la génération de HCMV mutant par la technique BAC. Le génome viral maintenu dans le BAC dans E.coli est utilisé comme substrat pour introduire la mutation désirée (M en rouge). Le BAC contenant le génome viral mutant est alors purifié et transfecté dans des fibroblastes afin de reconstituer des virus mutants. D’après (Brune et al., 2006)
9 Régulation des transcripts IE2 par l’activité enzymatique COX-2 :
Les protéines IE1 et IE2 étant essentielles à l’aboutissement du cycle viral, de nombreuses études se sont portées sur la régulation de leur expression. Comme il a été précisé auparavant, de nombreux facteurs de transcription jouent un rôle dans cette régulation mais de manière intéressante, il a été démontré que le virus pouvait tirer profit de l’inflammation, notamment via l’utilisation de l’activité enzymatique de la cyclooxygénase-2 (COX-2). En effet, l’expression d’IE2 ainsi que la production de nouveau virions sont très fortement diminuées lorsque cette enzyme est inhibée (Zhu et al., 2002). Cependant les mécanismes sous-jacents n’ont jamais été décrits et l’hypothèse d’un rôle de l’AMPc en réponse à la stimulation par les prostaglandines PGE2, un des produits éventuels de cette activité COX-2, a été émise
Figure 13 : Schéma proposé pour l’implication de COX-2 et de l’AMPc dans la régulation de
l’expression d’IE2 et la réplication virale (Mocarski, 2002).
Parmi les différents produits de cette cascade enzymatique se trouve la prostaglandine 15d-PGJ2, ligand naturel du récepteur nucléaire PPARγ (Peroxisome Proliferator Activated
Receptor γ).
Nous avons émis l’hypothèse que suite à l’activation de la cascade enzymatique COX-2 induite par l’infection, une H- ou L-PGD synthase permettrait la production de la prostaglandine 15d-PGJ2 à partir de la PGH2, servant alors à l’activation du récepteur
nucléaire PPARγ. Ce récepteur nucléaire étant un facteur de transcription, il pourrait alors interagir directement avec l’ADN viral ou induire l’expression de certains gènes cellulaires nécessaires à la transcription des gènes IE. Dans tous les cas, notre hypothèse a été que l’activation de ce facteur de transcription aurait des conséquences sur la régulation de l’expression des gènes très précoces IE du HCMV et plus particulièrement sur l’expression de la protéine IE2.
C’est pourquoi nous nous sommes intéressés au rôle de ce facteur de transcription dans l’activation du MIEP et la réplication virale.
Notre hypothèse est présentée dans la figure 14, les différents rôles de PPARγ, ainsi que les protéines interagissant avec ce facteur de transcription et intervenant dans sa fixation à l’ADN ainsi que dans la régulation de l’expression des gènes seront présentées en détails dans le chapitre suivant.
Figure 14 : Cascade enzymatique conduisant à la synthèse de 15d-PGJ2 dépendante de COX-2,
permettant l’activation du facteur de transcription PPARγ. Une fois PPARγ activé par son ligand, une hétérodimérisation avec le récepteur à l’acide rétinoïque RXR, lui-même couplé à son ligand, va permettre la fixation de cet hétérodimère à l’ADN sur des séquences précises appelées PPRE, et le recrutement des complexes co-activateurs induisant la transcription des gènes, d’après (Scher and Pillinger, 2005).
VII.
Peroxisome Proliferator Activated Receptor
γγγγ (PPARγ)
γ)
γ)
γ)
e. Généralités sur les PPARs
Les PPARs sont des facteurs de transcription appartenant à la super famille des récepteurs nucléaires aux hormones (famille des récepteurs d’hormones stéroïdes). Ils vont transformer une grande variété de signaux de l’environnement, nutritionnels et inflammatoires en réponses cellulaires.
Il existe 3 isoformes de PPARs qui sont les produits de trois gènes différents, couramment désignés sous les noms de PPARα, PPARγ et PPARδ. Ces protéines présentent une organisation structurale commune à tous les autres récepteurs nucléaires. Les séquences des domaines de liaison à l’ADN sont très conservées entre les trois sous-types, tandis que celles des sites de liaison des ligans le sont moins, signifiant des caractéristiques pharmacologiques différentes pour chaque sous-type. En effet, chaque isoforme présente des distributions tissulaires différentes et des spécialités fonctionnelles malgré leurs fortes homologies de séquence.
Ces facteurs de transcription sont donc activés par des ligands spécifiques. Différents types d’acides gras dont les acides gras insaturés peuvent se fixer et activer les PPARs avec une certaine spécificité. De plus, les éicosanoïdes produits à partir du métabolisme de l’acide arachidonique sont aussi des ligands efficaces pour activer spécifiquement les différents isoformes de PPARs. Ceci inclut les leucotriènes (LTs) produits par la cascade enzymatique impliquant la 15-lypoxygénase, mais aussi les acides hydroxyeicosatétraénoïques (5-HETE, 12-HETE et 15-HETE) produits respectivement par les 5-, 12- et 15-lipoxygénases. Les prostaglandines produites par les COX sont aussi impliquées comme précisé précédemment. La 15d-PGJ2, métabolite provenant de la PGD2 est un puissant ligand de PPARγ in vitro mais
à forte concentration uniquement, tout comme les prostaglandines A2 et D2 pouvant elles aussi activer ce facteur de transcription dans les mêmes conditions (Vamecq and Latruffe, 1999). Des métabolites oxydés de l’acide linoléique (les acides 9 et 13 hydroxy octadécanoïques 9- et 13-HODE), dérivés des LDL oxydés sont aussi des ligands de ce récepteur nucléaire (Nagy et al., 1998; Tontonoz et al., 1998).
A coté de cela, il existe des ligands synthétiques activateurs de PPARγ. Parmi eux se trouvent des molécules utilisées dans le traitement du diabète de la famille des thiazolidinediones (troglitazone, rosiglitazone, ciglitazone …) (Lehmann et al., 1995). C’est également le cas des anti-inflammatoires non-stéroïdiens tels que l’indométacine ou encore l’ibuprofène.
f. Structure de PPARγγγγ
Chez l’homme, il existe 3 ARNs messagers (ARNm) de PPARγ (γ1, γ2 et γ3) (Fajas et al., 1998; Rocchi and Auwerx, 1999). Les ARN messagers de γ1 et γ2 sont traduits en la même protéine, à savoir PPARγ1. PPARγ2 contient quant à lui 30 acides aminés de plus à l’extrémité NH2 terminale. La forme PPARγ1 est prédominante et PPARγ2 sera surtout
exprimée dans les adipocytes (Tontonoz et al., 1998). Les principaux domaines fonctionnels des PPARs sont communs avec les autres membres de la famille des récepteurs stéroïdiens. Le domaine C est le domaine de liaison à l’ADN (Chandra et al., 2008). Le domaine E/F carboy-termianl est le domaine de liaison du ligand (Ligand Binding Domain LBD). Enfin, le domaine A/B est la région NH2 terminale. La liaison de PPARγ à son ligand est régulé par une
communication intramoléculaire entre le domaine A/B et le LBD (Shao et al., 1998; Vamecq and Latruffe, 1999).
Récemment, il a été développé un inhibiteur spécifique non réversible de PPARγ dont le mode d’action consiste à modifier une cystéine au niveau du site de fixation du ligand (Leesnitzer et al., 2002).
g. Rôle transcriptionel
Comme tous les PPARs, PPARγ est activé par la liaison à son ligand. Une fois activé, les PPARs sont capables de réguler l’expression de gènes cibles possédant un élément de réponse au PPAR (PPRE pour PPAR response element) dans leur promoteur. Ces séquences PPRE sont constituées de deux séquences hexanucléotidiques de même sens (AGGTCA) séparées par un nucléotide aléatoire. Ces séquences sont alors appelées DR1, mais il peut également exister des séquences allant de DR2 à DR6, dans lesquelles les deux séquences héxanucléotidiques sont séparées par plusieurs nucléotides aléatoires (de 2 à 6 selon la séquence PPRE). Cependant ces séquences peuvent varier légèrement et la séquence en 5’ joue un rôle quant à l’intensité de la transcription (Palmer et al., 1995).
Pour la liaison à l’ADN au niveau de ces séquences particulières, une hétérodimérisation avec le récepteur nucléaire RXR (Retinoic X receptor) couplé lui-même à son propre ligand, l’acide rétinoïque, est nécessaire (Rocchi and Auwerx, 1999; Vamecq and Latruffe, 1999). Ainsi ce sont les hétérodimères PPARγ/RXR qui se lient aux séquences PPRE présentes dans les régions régulatrices des promoteurs des gènes cibles (Figure 15).
Figure 15 : Schéma de l’activation transcriptionnelle de PPARγ, ici activée par la 15d-PGJ2 ( ), le
Va s’en suivre un recrutement de protéines co-activatrices pour permettre la transcription des gènes. Ces protéines comprennent celles modifiant la structure de la chromatine par leur activité histone acétylase (SRC et CBP/p300), celles du complexe DRIP/TRAP interagissant avec la machinerie de transcription et enfin celles dont les fonctions sont particulières ou encore mal définies, comme la protéine PGC-1 (PPAR Gamma Co-factor 1) intervenant dans l’épissage et « l’exon-skiping » (Kornblihtt, 2005). En effet, l’interaction de PPARγ et de PGC-1 permettrait d’empêcher ou d’exclure un exon situé entre deux autres lors de l’épissage de l’ARN. Ce mécanisme interviendrait notamment grâce à l’interaction de la protéine PGC-1 avec la polymérase II ou d’autres protéines du complexe de pré-initiation de la transcription telles que le facteur d’épissage SRp40.
La fonction transcriptionnelle associée à PPARγ peut alors être limitée à plusieurs facteurs qui sont :
9 la disponibilité de la protéine RXR dans le noyau et qui ne doit pas être déjà associée en hétérodimère avec une autre protéine comme le récepteur aux œstrogènes par exemple.
9 La disponibilité des cofacteurs de transcription. En effet, ces protéines sont également impliquées dans l’activité d’autres facteurs de transcription comme NF-κB, AP-1, STAT1, et un phénomène de compétition peut conduire à la limitation du pool disponible (Li et al., 2000b; Ricote et al., 1999).
9 La phosphorylation de PPARγ peut également inhiber son activité transcriptionnelle
via les MAP kinases (Adams et al., 1997). Cette phosphorylation sur un résidu sérine
112 de la région NH2 terminale va gêner la communication entre les domaines A/Bet
LBD conduisant à une perte d’affinité pour la liaison du ligand et une diminution de son activité (Shao et al., 1998).
h. Rôle de trans-répresseur
Parallèlement à son rôle trans-activateur, il a été démontré que PPARγ pouvait inhiber l’expression de gène sous contrôle de certains promoteurs tels que NF-κB, AP1 ou encore STAT (Welch et al., 2003). Si dans un premier temps l’hypothèse de la compétition au niveau du pool de cofacteurs comme expliqué précédemment a été émise, un nouveau mécanisme de trans-répression à été découvert, impliquant la SUMOylation de PPARγ (Pascual et al., 2005). Ce mécanisme ferait intervenir la liaison covalente de la protéine SUMO-1 à PPARγ sous
