TPL3BIOMOL

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Les Travaux Pratiques à l’Université Oran1-Ahmed Ben Bella

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département de Biologie

Licence L3 Biologie moléculaire Semestre 5 et 6

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T.P. N°01

 Matière: Biologie Moléculaire

 Intitulé : Extraction de l’ADN végétal

 Protocole :

 Principe:

L’extraction de l’ADN est réalisée sur un végétal dont les cellules sont riches en ADN. La manipulation consiste à récupérer l’ADN contenu au cœur des cellules. La technique d’extraction comporte plusieurs étapes :

1-destruction mécanique des cellules (éclatement du tissu végétal et des cellules). 2-destruction chimique des membranes biologiques.

3-précipitation de l’ADN extrait (apparition sous une forme non soluble).

Produits chimiques Consommable /Verrerie Petits Matériels

SDS EDTA NaCl Ethanol absolu  Mortier Pillon Becher (deux de 100 ml) Papier filtre Tube à essai Bac à glace Scalpel Balance Bain marie Incubateur Micropipette p1000, p100, p10)

T.P. N°02

 Intitulé : Extraction de l’ADN plasmidique

 Protocole :

 Principe:

La préparation d'ADN plasmidique à partir de bactéries est l'une des techniques les plus courantes de la biologie moléculaire. Le principe de l'extraction est connu sous le nom de lyse alcaline. Cette méthode permet de préparer sélectivement l'ADN du plasmide contenu dans les bactéries, tout en éliminant l'ADN du chromosome bactérien. Le principe de cette méthode consiste à effectuer la lyse des cellules au moyen d'un détergent à pH alcalin. À ce pH, l'ADN chromosomique est dénaturé alors que l’ADN plasmidique, du fait de sa conformation compacte, résiste à cette dénaturation. On neutralise ensuite rapidement la solution, ce qui provoque la renaturation brutale. L'ADN chromosomique, très long (~10⁶ paires de base), ne parvient pas à se réapparier complètement et forme des enchevêtrements insolubles. On sépare alors les espèces par centrifugation. Les protéines précipitées, sont également éliminées avec le détergent et l'ADN chromosomique. L'ADN plasmidique est alors concentré par précipitation à

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l'alcool.  Objectifs :

- Décrire les étapes nécessaires à l’extraction d’ADN plasmidiques.

- Comparer entre les deux méthodes d’extraction (génomique et plasmidique).

Produits chimiques Consommable/Verrerie Petits Matériels

Tris-HCl EDTA SDS  NaOH Acétate de Na 3M Ethanol absolu

Embouts bleus et jaunes.

Tubes Eppendorf (1.5 ml) Micropipette p1000, p100, p10) Vortex Centrifugeuse

T.P. N°03

 Intitulé : Dosage d’ADN par spectrophotométrie

 Protocole :

 Principe:

Le spectrophotomètre est un appareil qui permet de mesurer l’absorbance A d’une solution homogène à une longueur d’onde λ donnée ou sur une région spectrale donnée selon la loi de Beer-Lambert, l’absorbance d’une solution est proportionnelle à la concentration des substances en solution, à condition de se placer à la longueur d’onde à laquelle la substance absorbe les rayons lumineux.

En biologie moléculaire, il est utilisé lors de l’extraction d’ADN, pour quantifier l’ADN et déterminer sa pureté. On utilise la longueur d’onde λ= 260nm qui est la zone d’absorbance maximale des acides nucléiques une seconde mesure à 280nm permet de contrôler la pureté de l’extraction, à savoir la présence de protéines. Pour une solution d’ADN purifiée, le rapport R. 260nm/280nm doit être compris entre 1.8 et 2. Si R ‹ 1.8 alors les protéines contamine la solution si R › 2, ce rapport indique une probable contamination par des ARN.

 Objectif:

- L’objectif principal de cette technique est de faire une estimation qualitative et quantitative de l’ADNd’après l’une de ces propriétés physiques (absorption de l’UV).

Produits chimiques Consommable_/Verrerie Petits Matériels

Cuves en Quartz

Embouts bleus et

Spectrophotomètre à UV

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jaunes.

Cuves en Quartz

Vortex

T.P. N°04

 Intitulé : Electrophorèse d’ADN sur gel d’Agarose

 Protocole :

 Principe:

L'électrophorèse est une technique séparative. Le principe consiste à soumettre un mélange de molécules à un champ électrique ce qui entraine la migration des molécules chargées. En fonction de différents paramètres (charge, masse, forme, nature du support, conditions physico-chimiques) la vitesse de migration va être variable, ce qui permet la séparation des différentes molécules.

A pH neutre ou alcalin, les groupements phosphates de l’ADN sont ionisés; il en résulte que les chaînes polynucléotidiques deviennent polyanioniques qui, une fois soumises à un champ électrique, migrent de la cathode (–) vers l'anode (+).

Ce processus d’électrophorèse se déroule sur un polymère d’agarose ou d’acrylamide qui forme un maillage tridimensionnel. Les molécules progressent selon leur taille à travers les pores du gel. En fonction de la taille de ces derniers, on peut donc

efficacement séparer des molécules situées dans une fourchette approximative de masses moléculaires. Il suffit d’adapter la réticulation du gel à l'échantillon à traiter en choisissant la concentration du produit.

La visualisation des fragments d’ADN après électrophorèse s’effectue grâce au BET (qui joue le rôle d’un intercalant fluorescent des bases nucléiques (orange à l’excitation aux UV). L’intensité de la fluorescence émise dépend de la quantité de BET intercalé. Il existe également des techniques de coloration, moins sensibles, mais non

cancérigènes (Bleu de Nil, Azure A ou bleu de méthylène). On peut déterminer la taille des fragments d’ADN par comparaison avec un marqueur de taille.

 Objectif:

- Réalisation d’une électrophorèse de l’ADN génomique bactérien extrait lors du TPN°2 sur un gel d’agarose à 0,8% ;

- Révélation de l’ADN par la coloration au BET. Les étudiants apprendront à :  Effectuer une électrophorèse d’ADN ;

 Visualiser l’aspect de l’ADN extrait après migration ;  Estimer la taille du ou des fragments obtenus

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Borate

EDTA

Agarose

Marqueur de taille (100pb) -20°C

Tampon de charge au bleu de bromophénol (4°C)

Bromure d’Ethidium (BET)

horizontal

Pointes bleues et jaunes

Portoirs pour eppendorf (0,2ml / 0,5ml / 1,5ml)

Boites pour pointes bleues

Boites pour pointes jaunes

Parafilm Papier essuie-tout Gants taille S, M et L Erlenmeyer 5 jeux de micropipettes (1 (200µl) + 1 (20µl) + 1 (10µl) + 1(1ml)) * 5 Plaque à UV.

T.P. N°05

 Intitulé : Sélection de souches bactérienne par la technique des répliques sur velours

 Protocole :

 Principe:

Le principe de la technique est la sélection de souches bactérienne sensibles à un antibiotique par la technique des répliques sur velours.

 Objectif:

Sélection des souches sensibles à l’ampicilline à partir d’une suspension bactérienne hétérogène par la technique des répliques sur velours.

Agar-Agar 1 Tubes à vis

Boites de pétri

Embouts jaunes et bleus

Tubes à eppendorf (1.5 ml)

Dispositif pour réplique sur velours (stérile) Pipettes pasteur Bec bunsen Micropipettes (p1000, p100)

T.P. N°06

 Matière : Biologie Moléculaire

 Intitulé : Transformation bactérienne par le PUC 19

 Protocole :

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La transformation est un phénomène de transfert de matériel génétique entre bactéries. Ce phénomène naturel a été initialement mis en évidence chez certaines bactéries gram (+) notamment chez Streptococcus pneumoneae (Griffith, 1928). Ultérieurement, de nombreux chercheurs ont tenté de transformer (in vitro) plusieurs bactéries dont essentiellement E. Coli. Le premier protocole a été mis au point par (Lederberg et

Cohen, 1972), en se basant sur la transformation chimique par choc thermique.

D’autres méthodes de transformations ont, depuis, été mis au point.  Objectif:

Transformation d’une souche bactérienne sensible à l’ampicilline à l’aide d’un vecteur plasmidique (pUC19) porteur du gène de résistance à l’ampicilline.

Comparaison de deux variantes de la technique de transformation chimique (choc thermique Vs micro-ondes).

CaCl2 Boites de pétri

Tubes à eppendorf

Pipettes Pasteur

Embouts bleu et jaunes

Micropipettes

Centrifugeuse

Spectrophotomètre

Bain marie