Td 6 et 7

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TD N° 6

PLASMIDES ET ENZYMES DE RESTRICTION

EXERCICE 1 :

On se propose d’établir la carte de restriction d’un plasmide circulaire double brin avec les enzymes Pst I et EcoR V.

1) Quelle est propriété principale des sites de reconnaissance des enzymes de restriction

2) Schématiser les réactions catalysées par les enzymes Pst I et EcoR V. comment appelle t on les extrémités obtenues

3) Quelle est la probabilité théorique de trouver un site de coupure de l’ADN par Pst I et EcoR V on supposant que la composition et la répartition des bases soient aléatoires ? quelles serait la taille des fragments ainsi générés ?

4) La digestion du plasmide par Pst I et Eco R V donne les résultats suivants :

Enzymes

utilisées Taille des fragments en kbp

EcoRV 4.2 3.4

Pst I 3.6 2.7 1.3

Pst I et

EcoR V . 2.2 2 1.4 1.3 0.7

Etablir la carte de restriction de ce plasmide sachant que les sites de restriction pour Pst I et EcoR V sont respectivement les suivants : Pst I : CTGCA G

EcoR V : GAT ATC Exercice 2 :

Quelles sont les affirmations vraies :

1) Les sites de coupures d’enzymes de restriction sont le plus souvent des zones palindromiques,

2) La coupure se fait toujours au centre du site de restriction,

3) Les enzymes de restriction sont issues de bactéries dans lesquelles on a modifié le patrimoine génétique pou permettre leur production, 4) La séquence AluI correspond a un site de restriction,

5) Ces enzymes sont indispensables au clonage,

(2)

Combien de fragments d’ADN vont être produits par une enzyme de restriction que l’on fait agir sur un plasmide possédant un site pour cette enzyme ?

Sur un ADN linéaire d’un bactériophage possédant deux sites de restriction de cette enzyme ?

TD n°7 Exercice n°1 :

Une même quantité d’ADN viral double brin linéaire est complètement digérée par différentes enzymes de restriction utilisées seules (digestion simple) ou conjointement (digestion double). Après séparation par électrophorèse en gel d’agarose, la taille des fragments générés est estimée (tableau).

Enzymes utilisées Taille des fragments (en kpb)

Bam HI 6 et 12

Hind III 6 et 12

Sa lI 2 et 16

Bam HI + Hind III 2, 6 et 10

Hind III + Sa lI 2, 4 et 12 a) Rôle du Bromure d’éthidium

b) Représenter les fragments engendrés par chacune des coupures ou des doubles coupures.

Exercice n°2

Soit un ADN bicaténaire, la séquence du monobrin est la suivante :

5’CAATTGAATTCATCG ……….T120_{AGTAGGCCGTACA………}

…T340_{GCGTGGAATTCGTA………}

A608_{TGTGAATTCTGA……….A}890_{ATTTCCCTACATGGGCT………}

….A1100_{CGGCTAGTAGCGCTG………..A}1200_{TGGGCCATCGC…………}

………….G1400_{CTGGGCTGGAATTCGGTCTA 3’}

On réalise une digestion enzymatique en utilisant deux enzymes de restriction Eco RI (GAATTC) et Hae III (GGCC)

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1. On digère cet ADN avec l’enzyme Eco RI, quel est le nombre et la taille de chaque fragment obtenu ?

2. On digère cet ADN avec l’enzyme Hae III, quel est le nombre et la taille de chaque fragment obtenu.

3. On réalise une double digestion en utilisant les deux enzymes, quel est le nombre et la taille de chaque fragment obtenu ?