Universite de Sherbrooke
Elaboration d'une formulation liposomale pour le traitement des tumeurs cerebrates primaires malignes
Par
Marc-Andre Bellavance
Departement de Pharmacologie
Memoire presente a la Faculte de medecine et des sciences de la sante en vue de l'obtention du grade de
maitre es sciences (M.Sc.) en pharmacologie
Janvier 2010
Evaluateurs :
Dr David Fortin, departement de chirurgie, division de neurochirurgie et neuro-oncologie Dr Fernand Jr Gobeil, departement de pharmacologie
Dr Michel Grandbois, departement de pharmacologie Dr Frederic Calon, departement de pharmacie, Universite Laval
1*1
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TABLES PES MATIERES
LISTE DES ILLUSTRATIONS Ill
LISTE DES ABREVIATIONS ET SYMBOLES IV
RESUME VII
INTRODUCTION 1
1. LES TUMEURS CEREBRALES 1
1.1. Types et statistiques 1
1.2. Classification des gliomes 2
1.3. Therapie standard 3 1.4. Limitations therapeutiques 4 2. LA BARRIERE HEMATOENCEPHALIQUE 5 2.1. Historique 5 2.2. Roles et fonctions 5 2.3. Configuration et phenotype 6 2.4. Mecanismes de transport 8 2.4.1.Efflux 8 2.4.2.Influx 8
2.5. LaBHE : un obstacle en contexte therapeutique 10
3. STRATAGEMES EMPLOYES POUR CONTOURNER LA BHE 12
3.1. Approches chirurgicales 12 3.2. Approches vasculaires 13 4. LES LIPOSOMES 16 4.1. Historique 16 4.2. Classification 19 4.3. Methodes de production 21 4.4. Composition et proprietes 22 4.4.1.Glycerophospholipides 22 4.4.1.1. Charge 22 I
4.4.1.2. Geometrie 25
4.4.1.3. Temperature de transition 27
4.4.2. Cholesterol 31
4.5. Transport d'agents therapeutiques 31
4.6. Roles in vivo 31 4.7. Pharmacocinetique 32 4.7.1. Elimination 32 4.7.2. Biodistribution 33 4.7.2.1. Distribution passive 33 4.7.2.2. Distribution active 34 4.7.3. Mecanismes deliberation 35 4.7.3.1. Extracellulaire 35 4.7.3.2. Intracellulaire 36
5. HYPOTHESE ET OBJECTIFS DE RECHERCHE 40
AVANT-PROPOS DE L'ARTICLE 41 RESUME DE L'ARTICLE 41 ARTICLE 43 METHODES SUPPLEMENTAIRES 79 RESULTATS SUPPLEMENTAIRES 80 DISCUSSION 83 CONCLUSION 97 REMERCIEMENTS 100 REFERENCES 101
LISTE PES ILLUSTRATIONS FIGURES : Figure 1 7 Figure 2 9 Figure 3 20 Figure 4 24 Figure 5 26 Figure 6 29 Figure 7 38 Figure 8 81 Figure 9 82 TABLEAUX : Tableau 1 17 Tableau 2 18 Tableau 3 30 III
LISTE PES ABREVIATIONS ET SYMBOLES
ADN acide desoxyribonucleique
AJ jonctions d'ancrage (« adherens junctions ») ARN acide ribonucleique
AZT azidothymidine
BHE barriere hematoencephalique BrdU bromodeoxyuridine
cm3 centimetre cube
Da Dalton
DC-Choi 3/3- [N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]ch.olesterol hydrochloride DHPE l,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 16:0 PE
DOPE l,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, ou 18:1 (A9-Cis) PE
dox doxorubicine
DPPC 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, ou 16:0 PC (DPPC) DSPC 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, ou 18:0 PC (DSPC) EPR « enhanced permeability and retention »
FBS serum fetal bovin
GBM glioblastome multiforme (astrocytome de grade IV)
km kilometre
h heure
Hi phase hexagonale non inversee (non lamellaire) Hn phase hexagonale inversee (non lamellaire)
HDL lipoproteines de haute densite (« high-density lipoprotein ») IFN-P Interferon p
IT IV kDa LCR LDL LUV mAb MAO m2 MTIC MLV mm mM MRPs MTT nm N NO 0 OBHE OMS PA PC PE PEG PG P-gP intratumorale intraveineux kilodalton liquide cephalo-rachidien
lipoproteines de faible densite (« low-density lipoprotein ») large vesicule unilamellaire (« large unilamellar vesicle ») anticorps monoclonaux (« monoclonal antibodies ») monoamine oxydase
metre carre
methyltriazen-1 -yl-imidazole-4-carboxamide vesicule multilamellaire (« multilamellar vesicle ») millimetre
millimolaire
« multidrug resistance proteins »
bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium nanometre
azote
monoxyde d'azote oxygene
ouverture de la barriere hematoencephalique Organisation Mondiale de la Sante
acide phosphatidique phosphatidylcholine phosphoethanolamine polyethylene glycol phosphatidylglycerol glycoproteine P
PI PM PS r2 SNC RES SUV T./2 Tc Tf TJ VEGF um uM Y-GT P450 iodure de propidium poids moleculaire phosphatidylserine coefficient de correlation systeme nerveux central systeme reticulo-endothelial
petite vesicule unilamellaire (« small unilamellar vesicle ») temps de demie-vie plasmatique
temperature de transition transferrine
jonctions serrees (« tight junctions »)
facteur de croissance de 1' endothelium vasculaire micrometre
micromolaire
Y-glutamyltransferase cytochrome P450
Universite de Sherbrooke
Elaboration d'une formulation liposomale pour le traitement des tumeurs cerebrates primaires malignes
Par
Marc-Andre Bellavance Departement de pharmacologic
Memoire presente a la Faculte de medecine et des sciences de la sante en vue de l'obtention du grade de maitre es sciences (M.Sc.) en pharmacologic
Janvier 2010 RESUME
Le glioblastome multiforme (GBM) est l'une des tumeurs des plus letales qui soient. En depit du traitement optimal actuellement disponible, la survie mediane des patients atteints d'un GBM n'atteint que 14,6 mois et n'a pu etre amelioree de facon significative au cours des dernieres decennies. La barriere hematoencephalique endigue l'entree de la majorite des xenobiotiques au systeme nerveux central et handicape serieusement l'efficacite de la chimiotherapie. Une panoplie de stratagemes fut developpee afin de contourner cet obstacle majeur et l'emploi de liposomes comme vehicules recele un grand potentiel. Nous avons done entrepris 1'elaboration d'une formulation liposomale dediee a cette fin. Une formulation de base, inspiree de la litterature, a d'abord ete modifiee de facon a produire plusieurs formulations derivees. Le criblage de ces dernieres a permis d'identifier une formulation candidate ainsi que des proprietes favorables a la lipofection des lignees cellulaires gliales F98 et U-l 18 MG. L'internalisation cellulaire des liposomes et la liberation cytosolique de leur chargement hydrophile ont ete evaluees quantitativement en cytometrie de flux. La formulation cationique, sensible au pH et depourvue de polyethylene glycol (PEG) s'est averee la plus performante. Chez les deux lignees cellulaires, les liposomes de cette formulation vedette ont accede au milieu intracellulaire entre 4 et 6 h, et y ont libere leur cargaison sur plus de 24 h. Le balayage de cellules F98 et U-l 18 MG lipofectees en microscopie confocale a confirme la liberation intracellulaire du contenu des liposomes a 6 h, et a devoile un patron d'internalisation typique a l'endocytose. Enfin, cette formulation liposomale vedette s'est averee tres peu cytotoxique et aucun effet cytostatique n'a ete remarque chez ces deux lignees. La performance inferieure de la formulation de base et des autres derives indique qu'une reduction de la fluidite membranaire, l'inclusion de polymeres PEG ainsi que l'absence combinee d'une charge cationique et de la sensibilite au pH ont des consequences deleteres sur la capacite de lipofection des liposomes. Ces resultats soulignent avec emphase l'importance d'adapter la composition lipidique des liposomes au type cellulaire cible et corroborent le potentiel des liposomes cationiques et sensibles au pH pour Pacheminement intracellulaire de xenobiotiques. Des etudes in vivo permettront d'etablir le potentiel de la formulation liposomale vedette dans la therapie des GBM.
Mots-cles : liposome, liberation intracellulaire, astrocytomes malins, microscopie confocale, cytometrie de flux
INTRODUCTION
1. LES TUMEURS CEREBRALES
1.1. Types et statistiques
Les tumeurs cerebrates designent de facon globale les cancers localises au systeme nerveux central (SNC) et represented un ensemble heterogene de plus d'une centaine de types de neoplasmes (LESNIAK et BREM, 2004). Selon leur mecanisme d'emergence au SNC, les tumeurs cerebrales peuvent etre sommairement classees en deux categories : les tumeurs cerebrales primaires et secondaires. Les tumeurs cerebrales primaires emanent du SNC alors que les tumeurs cerebrales secondaires, mieux connues sous le nom de metastases, resultent de la migration au SNC des cellules d'une tumeur localisee en peripheric (KEMPER et al, 2004; WRENSCH et al, 2002).
En 2009, la Societe canadienne du cancer estime que 2600 personnes ont recu un diagnostic de tumeur de Pencephale et que 1750 patients en sont decedes (SOCIETE CANADIENNE DU CANCER ET INSTITUT NATIONAL DU CANCER DU CANADA, 2009). La morbidite et la mortalite associee a ces cancers s'averent done considerablement disproportionnees (SATHORNSUMETEE et RICH, 2008; WEN et KESARI, 2008). Les tumeurs cerebrales primaires qui se developpent a partir des cellules gliales du SNC ont la plus forte incidence. Appelees gliomes, ces tumeurs representent plus de la moitie des
tumeurs cerebrates primaires, tout type confondu (AMERICAN BRAIN TUMOR ASSOCIATION, 2008; BARTSCH et al, 2005; WRENSCH et al, 2002).
1.2. Classification des gliomes
En fonction de lew composition gliale, 1'Organisation mondiale de la sante (OMS) recense plusieurs types de gliomes, soit les astrocytomes (astrocytes), les oligodendrogliomas (oligodendrocytes), les oligoastrocytomes (type mixe) et les ependymomes (ependymocytes). De ces types, les astrocytomes sont les plus recurrents et representent de 70 a 80 % des gliomes. La nomenclature de l'OMS echelonne plus specifiquement les astrocytomes en quatre grades pronostics : le grade I (astrocytome pilocytique), le grade II (astrocytome diffus), le grade III (astrocytome anaplasique) et le grade IV (glioblastome multiforme) (DEANGELIS, 2001; KLEIHUES et al, 2002; WEN et KESARI, 2008).
L'astrocytome de grade IV, ou glioblastome multiforme (GBM), est la declinaison la plus maligne. Le GBM surgit de novo ou resulte de la progression ineluctable d'astrocytomes de grade II et HI (VESCOVI et al, 2006). II se caracterise par un rythme de proliferation effrene, rinfiltration prononcee du parenchyme, l'induction soutenue de neoangiogenese et la presence de necrose (DEANGELIS, 2001; WEN et KESARI, 2008). Par surcroit, les GBM sont refractaires aux therapies actuelles et recidivent inevitablement (LOUIS et al, 2007). Le pronostic lie au GBM figure done parmi les plus sombres qui soient.
1.3. Therapie standard
L'approche multimodale preconisee pour le traitement des GBM consiste a la resection chirurgicale, suive de radiotherapie et plus recemment de chimiotherapie (SALVATI et al, 2009; SATHORNSUMETEE et RICH, 2008; VILLANO et al, 2009). La survie mediane des patients accables par un GBM n'atteint que de 9 a 12 mois malgre une exerese maximale, suivie de radiotherapie (GUPTA et TORCHILIN, 2007; KEMPER
et al, 2004). Suite a plusieurs etudes non concluantes sur les benefices de la
chimiotherapie, une etude multicentrique canado-europeenne a demontre depuis peu que la survie mediane pouvait etre prolongee a 14,6 mois grace a 1'administration de Temozolomide (Temodal®) concomitante et adjuvante a la radiotherapie. Le Temozolomide est un agent alcoylant administre per os, qui est rapidement converti en methyltriazen-l-yl-imidazole-4-carboxamide (MTIC) par hydrolyse spontanee a pH physiologique. Le MTIC produirait une activite cytotoxique par alcoylation des bases de guanine (positions O6 et N7) (DARKES et al, 2002; NIEDER et al, 2009; STUPP et al, 2005). Une phase de traitement concomitant par Temozolomide en association a la radiotherapie succede done maintenant a la resection chirurgicale dans la therapie standard des GBM. Lorsque la survie des patients le permet, 1'administration de cet agent alcoylant est meme maintenue momentanement apres les cycles de radiotherapie (phase de maintien) (). Hormis cette avancee majeure et relativement recente, le pronostic associe aux GBM est demeure statique au cours des trois dernieres decennies, et ce, en depit de progres considerables en neuro-oncologie (BEDUNEAU et al, 2007; RICH et BIGNER, 2004).
1.4. Limitations therapeutiques
En plus du comportement biologique hautement agressif des GBM, plusieurs limitations diagnostiques et therapeutiques entravent les progres du pronostic ainsi que l'elaboration d'une cure.
Par exemple, le diagnostic des GBM ne survient generalement qu'a la suite de manifestations symptomatiques d'une degradation de fonctions neurologiques (deficits cognitifs, sensitifs, moteurs) ou d'une elevation de la pression intracranienne (ex. : maux de tete, vomissements, crises). La taille de la tumeur et la dissemination de cellules gliales malignes dans le SNC ont alors une ampleur notable au moment du diagnostic et de l'initiation des traitements (BEHIN et al, 2003; KOO et al, 2006). La dispersion caracteristique des cellules gliales malignes dans le parenchyme adjacent a la tumeur previent la resection chirurgicale totale (KEMPER et al, 2004; VESCOVI et al, 2006). Qui plus est, l'etendue de la chirurgie est moderee lorsque des cellules tumorales se logent au sein de structures cerebrales qui ne peuvent etre endommagees. Les recidives postoperatoires des GBM s'averent done inevitables, en depit d'une exerese maximale (RICH et BIGNER, 2004). La radiotherapie procure quant a elle qu'une extension modeste de la survie mediane et dispose d'un index therapeutique etroit au SNC (SHAW et ROBBINS, 2006; WEN et KESARI, 2008). D'autre part, l'efficacite de la chimiotherapie est severement restreinte par plusieurs parametres, dont la resistance naturelle ou acquise des cellules gliales malignes et la barriere hematoencephalique (BHE) (HUWYLER et al, 2008; LOSCHER et POTSCHKA, 2005). Cette derniere constitue un obstacle majeur dans le traitement des GBM puisqu'elle exclut normalement la quasi-totalite des agents antineoplasiques du SNC (CALABRIA et SHUSTA, 2006; PARDRIDGE, 2002).
2. LA BARRIERE HEMATOENCEPHALIQUE
2.1. Historique
La premiere demonstration experimentale suggerant la presence d'une barriere entre le SNC et le sang fut realisee en 1885, par le Nobel Paul Ehrlich. A la suite a 1'administration intraveineuse de colorants hydrosolubles, Ehrlich observa que du corps entier, seul le cerveau demeurait exempt de toute coloration. Pres de 30 ans plus tard, Edwin Goldmann injecta les memes colorants dans le liquide cephalo-rachidien (LCR) et remarqua que la coloration se trouvait confinee au SNC (DE BOER et GAILLARD, 2007; HAWKINS et DAVIS, 2005). L'existence d'une cloison entre le SNC et la circulation sanguine fut ainsi confirmee. Le concept de la BHE fut developpe peu de temps apres par Lina Stern, tandis que les travaux de Reese, Karnovsky et Brightmann etablirent les bases anatomiques actuelles de la BHE (VEIN, 2008).
2.2. Roles etfonctions
La BHE est une interface dynamique localisee au niveau des cellules endotheliales de la quasi-totalite des capillaires du SNC. Bien qu'elle fut initialement identified comme etanche, cette barriere est plus exactement un filtre a permeabilite hautement selective qui joue un role vital dans l'homeostasie du SNC. En effet, la BHE protege le microenvironnement du SNC des fluctuations abruptes de la composition sanguine et y empeche 1'introduction d'entites nuisibles, telles que les dechets metaboliques, les composes neurotoxiques exogenes et les microorganismes (BEGLEY, 2004). La BHE
regule finement les echanges entre le SNC et la circulation sanguine afin de preserver la composition du LCR et d'assurer l'approvisionnement du SNC en nutriments essentiels (CECCHELLI et al, 2007). Pour assumer de telles fonctions, cette barriere necessite la contribution de plusieurs types cellulaires et deploie differents mecanismes physiques et metaboliques pour le maintien homeostatique du SNC (BERNACKI et al., 2008).
2.3. Configuration et phenotype
A l'oppose des cellules endotheliales de la peripheric, celles de la BHE sont flanquees de prolongements astrocytaires, de pericytes, de neurones et de microglie (figure la). Cet assemblage multicellulaire complexe est nomme unite neurovasculaire. La cohesion et les interactions reciproques de toutes les composantes cellulaires sont essentielles a l'induction du phenotype distinctif de la BHE chez les cellules endotheliales du SNC (CECCHELLI et al, 2007; HAWKINS et DAVIS, 2005). Ce phenotype est caracterise par l'expression de jonctions serrees etanches, un nombre eleve de mitochondries, l'absence de fenestrations et un transport par pinocytose negligeable. Les jonctions serrees etanches arriment les cellules endotheliales entre elles de fa?on a former une cloison continue qui obstrue la diffusion paracellulaire, polarise asymetriquement la distribution de proteines membranaires et confere une resistance electrique transendotheliale. L'abondance de mitochondries decoule quant a elle du metabolisme energetique considerable des cellules endotheliales alors que l'absence de fenestrations et le peu de pinocytose accentuent l'etancheite de la BHE (BEGLEY, 2004; BERNACKI et al, 2008; LIU et al, 2008; LOSCHER et POTSCHKA, 2005).
2.4. Mecanismes de transport
2.4.1. Efflux
En plus de ses dispositifs physiques, la BHE protege le SNC au moyen de processus metaboliques. Elle possede une myriade d'enzymes capables de degrader les principes actifs et de nombreuses pompes a efflux qui les refoulent dans la circulation sanguine (figure lb et 2c) (ABBOTT et al, 2006; GLAVINAS et al, 2004; SZAKACS et al, 2006). Ces pompes sont distributes asymetriquement de part et d'autre des jonctions serrees etanches et travaillent de concert afin de detoxifier le SNC et de reguler la composition de ses fluides (CECCHELLI et al, 2007; LOSCHER et POTSCHKA, 2005).
2.4.2. Influx
La BHE n'est cependant pas qu'un systeme d'exclusion; elle autorise l'afflux selectif de nombreux composes essentiels au SNC. Puisque les jonctions serrees etanches endiguent la diffusion paracellulaire au SNC (figure 2a), la BHE y admet que les composes capables d'emprunter Tune des quatre voies d'acces transcellulaires (figure 2b-e) (ABBOTTSal, 2006).
La diffusion passive (figure 2b) est la seule voie non selective et s'avere strictement reservee aux molecules tres lipophiles ayant un poids moleculaire (PM) inferieur a 400-500 Da (BRASNJEVIC et al, 2009; PARDRIDGE, 2005). D'autres substances, telles que le glucose, les acides amines et les bases puriques, sont plutot acheminees au SNC par des transporters membranaires specifiques (figure 2c). Ces transporteurs saturables induisent la formation transitoire de pores membranaires pour permettre le passage de leurs substrats au SNC. Enfin, les composes plus imposants comme les proteines sont introduits au SNC par transcytose (figure 2d et e). Ce mecanisme de transport est initie par la liaison d'un ligand a son recepteur (figure 2d) ou encore par 1'adsorption d'entites cationiques a la membrane luminale des cellules endotheliales (figure 2e). Le materiel est alors internalise, transporte dans les endosomes et finalement relache dans le SNC (ABBOTT et al, 2006; DE BOER et GAILLARD, 2007; MAXFIELD et MCGRAW, 2004).
2.5. La BHE: un obstacle en contexte therapeutique
A l'instar de la forte majorite des xenobiotiques, les agents de chimiotherapie ne figurent pas parmi les composes qui sont selectivement importes au SNC et la plupart d'entre eux ne possedent pas les proprietes physico-chimiques requises pour y diffuser passivement. Les quelques molecules therapeutiques qui y parviennent sont generalement chassees du SNC par les enzymes ou les pompes a reflux de la BHE (figure lb et 2c). Par consequent, 98% des agents therapeutiques a petit PM et la totalite de ceux a haut PM sont exclus du SNC lorsque la BHE est saine et fonctionnelle (PARDRIDGE, 2007).
Cette nuance est importante puisque Pintegrite et les fonctions de la BHE sont alterees en contexte neoplasique. Afin d'assurer des besoins croissants en nutriments et en oxygene, les gliomes malins induisent une angiogenese effrenee qui genere des vaisseaux irreguliers, tortueux et truffes de fenestrations endotheliales grandes de 100 a 380 nm (DRUMMOND et al, 1999; MAMOT et al, 2003). Des perturbations locales entrainees par la perte de signaux inductifs, ou encore par la liberation tumorale de mediateurs permeabilisants (ex. : NO et VEGF) contribuent egalement a ce phenomene (ABBOTT et
al, 2006; JAIN et al, 2007; MAEDA et al, 2000). La neovascularisation contigue au
nodule tumoral presente done une BHE defectueuse, ce qui lui confere une permeabilite bien superieure aux vaisseaux sains du SNC. L'accumulation d'antineoplasiques au sein de la tumeur ne s'en retrouve pas pour autant accrue etant donne la faible retention de ces agents dans rinstertitium tumoral et la permeabilite excessivement variable des neovaisseaux selon la localisation tumorale (KRATZ et al, 2008). De plus, ces drogues doivent tout de meme contourner la BHE intacte afin d'eradiquer les cellules gliales malignes ayant infiltre le parenchyme sain, a distance du foyer tumoral (KEMPER et al., 2004; RICH et BIGNER, 2004). Pour ces raisons, la BHE represente une contrainte de taille dans la therapie des GBM.
3. STRATAGEMES EMPLOYES POUR CONTOURNER LA BHE
Une panoplie de strategies fut developpee dans le but de pallier les limitations imposees par la BHE en contexte therapeutique. La plupart de ces methodes, dont seulement quelques-unes seront abordees, empruntent une approche chirurgicale ou vasculaire.
3.1. Approches chirurgicales
Les methodes chirurgicales (ou voies transcraniennes) consistent a introduire les principes actifs directement dans le SNC, notamment par le biais d'implants inertes ou d'injections intracraniennes. Les implants inertes sont deposes sur les parois de la cavite chirurgicale produite par l'exerese d'une tumeur cerebrale maligne. Ces eponges biodegradables y demeurent plusieurs semaines, durant lesquelles elles liberent continuellement une substance tumoricide dans le parenchyme environnant (BEDUNEAU
et al, 2007; LESNIAK et BREM, 2004). De leur cote, les injections intracraniennes
consistent a introduire divers agents therapeutiques directement dans le parenchyme ou dans le LCR. Bien que de fortes doses puissent etre administrees au SNC a l'aide de ces deux techniques, la diffusion des principes actifs dans le tissu cerebral est insuffisante. En effet, elle ne se resume qu'a quelques millimetres alors que des cellules gliales malignes migrent a plusieurs centimetres du foyer tumoral (BEGLEY, 2004; DEEKEN et LOSCHER, 2007; KEMPER et al, 2004). Pour contrer cette problematique, les injections intracraniennes sont accomplies au moyen d'un gradient de pression positive. II en resulte
un mouvement de convection qui propulse les xenobiotiques a grande distance du site de depot et maximise ainsi l'exposition des cellules gliales malignes disseminees (FERGUSON et LESNIAK, 2007; HUYNH et al, 2006; MAMOT et al, 2004). Quoi qu'il en soit, le caractere hautement invasif, les couts considerables et les risques d'infection inherents aux techniques chirurgicales limitent l'application et les benefices de ce type d'approche (GARCIA-GARCIA et al, 2005).
3.2. Approches vasculaires
D'autres strategies exploitent les caracteristiques vasculaires phenomenales du SNC. Le cerveau humain contient 100 milliards de capillaires, qui forment un reseau d'une longueur cumulative de pres de 650 km et d'une surface endotheliale d'environ 20 m . Chaque cm3 est done irrigue par 1 km de microvaisseaux, distances d'a peine seulement 50 jxm (ABBOTT et al, 2006; DE BOER et GAILLARD, 2007; PARDRIDGE, 2005). Cette angioarchitecture colossale confere un enorme potentiel therapeutique aux tactiques vasculaires, telles que l'ouverture de la BHE (OBHE), 1'administration systemique de prodrogues ou de liposomes.
L'OBHE consiste a la permeabilisation transitoire des capillaires du SNC par la rupture reversible de ses jonctions serrees endotheliales. Elle peut etre notamment executee par 1'administration intra-arterielle d'une solution hyperosmolaire (ex. : mannitol, arabinose), d'agents pharmacologiques vasoactifs (ex.: bradykinine, RMP-7), ou encore a l'aide d'ultrasons focalises (BORLONGAN et EMERICH, 2003; HYNYNEN, 2008; MEAIRS et ALONSO, 2007; RAPOPORT, 2000). L'ouverture temporaire de la voie
paracellulaire (figure 2a) alloue ou amplifie la diffusion de xenobiotiques du compartiment sanguin au SNC. Comme cette voie d'acces est non selective, elle autorise aussi l'entree de composes endogenes inoffensifs en circulation, mais toxiques pour les neurones. Les methodes d'OBHE peuvent alors engendrer un stress physiologique considerable en exposant du tissu cerebral sain a des composes neurotoxiques et/ou en provoquant un oedeme cerebral qui eleve la pression intracranienne (KOO et al, 2006; MILLER, 2002; SIEGAL et al, 2000). La securite de la procedure d'ouverture osmotique a toutefois ete etablie en contexte standardise chez l'humain (DOOLITTLE et al, 2000; FORTIN et al, 2007). Elle est actuellement la seule technique d'ouverture pratiquee de facon courante en clinique pour le traitement des tumeurs cerebrales malignes refractaires aux therapies conventionnelles (DE BOER et GAILLARD, 2007).
Une autre alternative consiste a modifier les proprietes physico-chimiques des agents therapeutiques faiblement distribues au SNC de maniere a ameliorer leur transport au-dela de la BHE. II s'agit plus exactement de la conversion de principes actifs en prodrogues, dont la forme transformee est reconnue par des transporteurs de la BHE ou diffuse passivement a travers la BHE (figure 2b et c). L'optimisation adequate des proprietes physico-chimiques ainsi que la preservation de la selectivity et de Pactivite biologique des drogues alterees representent toutefois des defis tres complexes, parfois meme impossibles (KRATZ et al, 2008; LOCKMAN et al, 2002). Les contraintes associees au developpement de prodrogues ont done pour corollaire une restriction severe des composes parvenus en clinique jusqu'a maintenant.
Enfin, l'utilisation de liposomes comme vehicules therapeutiques est susceptible d'accentuer considerablement la biodisponibilite d'une panoplie de composes actifs au 14
SNC. Cette tactique, qui se demarque substantiellement en raison de son innocuite, de sa versatilite et de son faible cout, detiendrait alors un grand potentiel pour la therapie des tumeurs cerebrates primaires malignes (FENSKE et al, 2008; SRINIVASAN et BURGESS, 2009; YOSHIDA et MIZUNO, 2003).
4. LES LIPOSOMES
4.1. Historique
Les liposomes furent initialement decrits en 1965 par Alec Bangham. En etudiant la structure et le comportement des membranes cellulaires, il decouvrit que les liposomes etaient spontanement formes lorsque des lipides amphiphiles sont disperses dans l'eau (BANGHAM et al, 1965; RONGEN et al, 1997). Peu apres cette decouverte, l'usage des liposomes en tant que vehicules pour racheminement de composes actifs fut propose (HARRINGTON et al, 2002). Cet exploit fut d'abord realise in vitro a la fin des annees 80, alors que Philip Feigner rapporta une forte expression cellulaire de plasmides combines a des liposomes (BARTSCH et al, 2005). D'autres avancees se succederent, si bien que les liposomes devinrent des vehicules pharmaceutiques de choix pour de nombreuses applications biomedicales. A l'heure actuelle, plusieurs agents therapeutiques complexes a des liposomes sont deja employes en clinique, mais aucun n'est encore assigne au traitement des gliomes malins (Tableau 1) (GUO et SZOKA, 2003; TORCHILIN, 2005). Des resultats encourageants ont toutefois ete obtenus dans plusieurs etudes precliniques et cliniques pour la therapie de ce type de neoplasmes (Tableau 2) (GARCIA-GARCIA et al., 2005; HUYNH etal, 2006; TORCHILIN, 2005).
4.2. Classification
Les liposomes sont des vesicules lipidiques qui appartiennent a la famille des transporteurs colloi'daux, famille qui regroupe egalement les micelles, les nanoparticules et les emulsions (LAQUINTANA et al, 2009; TORCHILIN, 2006a). En fonction de leur taille et du nombre de bicouches lipidiques qu'ils possedent, les liposomes sont classes en trois categories : les vesicules multilamellaires (MLV > 0,5 urn a 2 mm), les vesicules unilamellaires de petite (SUV ~ 10 a 50 nm) et de grande (LUV ~ 50 a 200 run) taille (figure 3a-c) (BEDUNEAU et al, 2007; PINTO-ALPHANDARY et al, 2000). Parmi ces types, les LUV de 100 a 200 nm sont les plus utilises pour le transport de substances pharmacologiques. II fut demontre experimentalement qu'un calibre de 100 nm confere aux liposomes une stabilite maximale in vivo tout en conservant une capacite de chargement pratique. De plus, ce diametre est compatible avec la taille des endosomes des cellules endotheliales de la BHE (figure 2d et e) et permet de franchir les fenestrations endotheliales des neovaisseaux des gliomes malins (DRUMMOND et al, 1999; FENSKE et al, 2008; WATERHOUSE et al, 2005).
4.3. Methodes de production
Les liposomes LUV sont generalement confectionnes a partir d'un film lipidique, selon une methode developpee par Bangham (BANGHAM et al, 1965). Brievement, cette technique consiste a dissoudre un melange de phospholipides, de sterols et autres molecules amphiphiles a l'aide d'un solvant organique (ex.: chloroforme). Ce dernier est ensuite retire de la mixture lipidique par evaporation rotative sous pression reduite, ce qui precipite la distribution planaire des lipides au fond du recipient spherique utilise. Le film lipidique qui en resulte est hydrate par une solution tampon et agite vigoureusement afin d'induire la formulation aleatoire de liposomes MLV de fort calibre (> 1 mm) (BEDUNEAU et al., 2007). Enfin, les liposomes MLV sont fragmented de facon controlee en de plus petites vesicules (LUV) par sonication ou extrusion.
La sonication accomplit la rupture des liposomes MLV grace a l'energie acoustique. La taille des vesicules produites depend simplement de la duree de sonication en bain ou par une sonde (LAPINSKI et al, 2007; MAULUCCI et al, 2005; WOODBURY et al, 2006). De son cote, l'extrusion consiste sommairement a forcer les liposomes MLV a travers les pores de filtres de polycarbonate (2) superposes, au moyen d'un systeme d'extrusion pressurise ou d'un dispositif a pistons. Le calibre des liposomes recueillis est module selon la taille des pores des filtres de polycarbonate employes; approximativement 10 cycles d'extrusion (filtrations) suffisent pour conferer aux liposomes un diametre similaire a celui des pores (COLLETIER et al, 2002; MUI et al, 2003). Bien qu'elle necessite plus de temps que la sonication, l'extrusion est davantage pratiquee pour la production de liposomes LUV puisqu'elle genere des distributions de taille plus homogenes et surtout plus reproductibles (LAPINSKI et al, 2007).
4.4. Composition et proprietes
Les liposomes sont fabriques a l'aide d'un melange de glycerophospholipides et de cholesterol analogue a la composition lipidique primaire des membranes cellulaires (LANGNER et KRAL, 1999; MEER et al, 2008). A cette constitution de base se greffe ensuite un large eventail de lipides biocompatibles d'origine naturelle ou synthetique. La composition lipidique des liposomes est d'une importance cruciale, car elle influence les parametres pharmacocinetiques et determine les proprietes membranaires comme la fluidite et la charge ionique (FENSKE et al, 2008; HUWYLER et al, 2008).
4.4.1. Glycerophospholipides
La structure des glycerophospholipides correspond a une tete hydrophile, liee a deux chaines d'acides gras hydrophobes par un groupement glycerol (figure 4a) (ULRICH, 2002). La nature chimique du groupement de tete et la longueur et le degre de saturation des chaines d'acides gras dictent les proprietes des glycerophospholipides, telles que la geometrie hydratee, la temperature de transition (Tc) et la charge ionique.
4.4.1.1. Charge
La charge ionique des liposomes est dictee par les groupes charges ou neutres presents a leur surface membranaire. La charge des glycerophospholipides depend du groupement chimique qui compose leur tete hydrophile. A pH physiologique, les glycerophospholipides les plus abondants dans les membranes biologiques possedent une charge neutre (phosphatidylcholine et phosphatidylethanolamine) ou negative (acide phosphatidique, phosphatidylglycerol, phosphoinositols, phosphatidylserine) (figure 4b) 22
(LIAN et HO, 2001; SAMAD et al, 2007). Une charge positive s'avere toutefois benefique pour des fins therapeutiques, puisque les liposomes cationiques forment des interactions electrostatiques favorables avec les proteoglycans, des proteines anioniques qui coiffent la membrane plasmique des cellules eucaryotes (MEDINA-KAUWE et al, 2005; MINTZER et SIMANEK, 2009; SALVATI et al, 2006). De plus, une telle charge pourrait vraisemblablement promouvoir l'entree des liposomes au SNC (figure 2e) (ABBOTT et al, 2006; BRASNJEVIC et al, 2009; DE BOER et GAILLARD, 2007).
4.4.1.2. Geometrie
Grace a leur caractere amphiphile, les glycerophospholipides s'organisent naturellement en milieu aqueux de maniere a ce que les chaines hydrophobes soient enchassees au sein des complexes lipidiques formes. La configuration de ces complexes est determinee par la geometrie hydratee des glycerophospholipides qui les composent (figure 5). Lorsque l'aire relative occupee par la tete hydrophile est nettement superieure a celles des chaines d'acides gras, ces lipides ont une forme conique positive qui autorise la formation de micelles non inversees (Hi). La forme conique negative resulte de la geometrie inverse et entraine la formation d'un reseau tubulaire hexagonal (Hn) de micelles inversees. Finalement, la forme cylindrique apparait lorsque les aires sont approximativement egales. Cette derniere permet la disposition des phospholipides en bicouches concentriques qui, lors de leur formation, emprisonnent un volume aqueux dans leur cavite et forment ainsi les liposomes (LANGNER et KRAL, 1999; WASUNGU et HOEKSTRA, 2006).
4.4.1.3. Temperature de transition
Les glycerophospholipides subissent des changements conformationnels sur des plages de temperature tres etroites, designees comme les temperatures de transition de phase (Tc) ou de fusion (Tm). La Tc correspond a la temperature a laquelle un glycerophospholipide donne transite entre la phase gel solide et ordonnee (LBO, et la phase liquide-cristalline plus fluide et permeable (L„) (figure 6). Cette transition s'opere par le biais d'importantes modifications de la disposition spatiale et de la mobilite de leurs chaines hydrocarbonees. En deca de leur Tc, les glycerophospholipides ont la capacite de former des bicouches lipidiques cohesives, grace a une disposition dense et ordonnee qui est autorisee par l'immobilite relative et la conformation allongee (anti) de leurs chaines hydrophobes. Cet etat caracterise la phase gel (< Tc), qui confere une fluidite et une permeabilite minimales aux membranes lipidiques. En revanche, lorsque la Tc des glycerophospholipides est excedee, leur assemblage en une bicouche lipidique est plus relache etant donne que les chaines d'acides gras sont repliees (conformation gauche) et qu'elles jouissent d'une mobilite superieure. La phase liquide-cristalline predomine alors, ce qui amplifie la fluidite et la permeabilite des membranes lipidiques. En somme, la fluidite et l'etancheite des membranes lipidiques sont largement influencees par la phase fhermodynamique adoptee par ses constituants a une temperature donnee.
La Tc des glycerophospholipides est dictee par leur structure moleculaire, et peut etre modifiee par leur environnement chimique (presence d'ions, interactions avec des molecules lipophiles ou entites proteiques, etc.). La Tc croit generalement avec la longueur, le degre de symetrie et de saturation des chaines d'acides gras. Par consequent, des glycerophospholipides ayant une Tc superieure a 37°C, soit habituellement ceux dotes de
chaines hydrocarbonees symetriques de plus de 16 carbones, sont couramment integres dans la composition lipidique des liposomes voues a un usage therapeutique in vivo (tableau 3). De tels constituants lipidiques minimisent la fluidite membranaire des liposomes de facon a leur conferer une retention optimale de leur contenu ainsi qu'une stabilite accrae en conditions physiologiques (LIAN et HO, 2001; TORCHILIN et WEISSIG, 2003; WEISSIG, 2010).
4.4.2. Cholesterol
Le cholesterol est un autre element frequemment retrouve dans les formulations liposomales. Cette molecule amphiphile est un ingredient cle qui ameliore la stabilite et Petancheite des liposomes dans la circulation sanguine en prevenant les perturbations induites par des proteines seriques et en colmatant les imperfections membranaires (DRUMMOND et al, 1999; WATERHOUSE et al, 2005).
4.5. Transport d'agents therapeutiques
Les liposomes disposent de trois compartiments dans lesquels une panoplie d'agents therapeutiques ou diagnostiques, tels que les drogues, agents de contraste, proteines, enzymes, ADN et ARN, peuvent etre emmagasines (TEMPLETON, 2002). Les agents hydrophobes sont stockes au sein des membranes lipidiques, alors que les agents hydrophiles sont pieges dans la phase aqueuse interne ou plus rarement conjugues a la surface periliposomale (figure 3c) (PINTO-ALPHANDARY et al, 2000; TORCHILIN, 2005). En plus de lew polyvalence notable, les liposomes se demarquent des autres nanotechnologies de transport par leur faible cout de production, leur securite biologique et leur capacite de chargement appreciable (GLOVER et al, 2005).
4.6. Roles in vivo
Les liposomes masquent les parametres physico-chimiques des principes actifs qu'ils vehiculent et bonifient la pharmacocinetique de leur cargaison en fonction de leurs
propres parametres physico-chimiques (DRUMMOND et al, 1999; MAMOT et al, 2003). Les liposomes facilitent la diffusion des xenobiotiques qu'ils transportent a travers les membranes biologiques, telle que la BHE (BRASNJEVIC et al, 2009; GARCIA-GARCIA
et al, 2005). lis protegent leur contenu de la degradation enzymatique, de la reconnaissance
par le systeme immunitaire et des conditions denaturantes, mais le liberent de facon soutenue au site d'interet (BARTSCH et al, 2005). Grace a ce role dichotomique de protection-liberation, les liposomes accroissent considerablement Pinnocuite, l'efficacite et la biodisponibilite des xenobiotiques qu'ils vehiculent (LIAN et HO, 2001).
4.7. Pharmacocinetique
4.7.1. Elimination
Des leur introduction dans le systeme vasculaire, les liposomes sont exposes a une multitude de proteines qui alterent leur integrite ou precipitent leur elimination. Les lipoproteines de haute (HDL) et de faible (LDL) densite echangent des lipides constitutifs avec les liposomes, ce qui destabilise la bicouche lipidique des vesicules et provoque la relache prematuree de leur bagage dans le sang (HARRINGTON et al, 2002). D'autre part, des anticorps, des proteines du complement, la fibronectine et d'autres opsonines s'adsorbent a la surface des liposomes. Ce phenomene, nomme opsonisation, entraine la reconnaissance et 1'elimination expeditive des liposomes par les macrophages mononucleaires du systeme reticulo-endothelial (RES). Ce systeme physiologique assure Fexclusion des macromolecules et des particules exogenes du compartiment vasculaire. Les cellules phagocytaires du RES sont presentes partout dans rorganisme, mais le foie et la
rate sont les organes qui en abritent le plus (HUWYLER et al, 2008; TORCHILIN, 2006b; YAN etal, 2005).
Les glycerophospholipides neutres a chaines d'acides gras satures (14 a 18 carbones), le cholesterol et le polyethylene glycol (PEG) sont des ingredients cles des liposomes qui amenuisent l'elimination des liposomes (DRUMMOND et al, 2008; GABIZON, 1995). Parmi eux, le PEG est sans contredit le plus efficace (KLIBANOV et
al, 1990; PAPAHADJOPOULOS et al, 1991). Ce polymere inerte, non ionique et
hydrophile est generalement ancre a la tete polaire de glycerophospholipides (PE) dans les formulations liposomales (figure 3d et 4b). II ameliore la solubilite aqueuse des liposomes, stabilise leur bicouche lipidique et forme une barriere sterique periliposomale qui previent efficacement les permutations de lipides avec les lipoproteines ainsi que l'adsorption des opsonines (GARBUZENKO et al, 2005; YAN et al, 2005). Les liposomes qui contiennent seulement de cinq a dix mol% de PEG-PE echappent aux macrophages du RES et beneficient d'un temps de demie-vie plasmatique (Ti/2) de plusieurs dizaines d'heures chez l'humain (LIAN et HO, 2001; SAMAD et al, 2007).
4.7.2. Biodistribution 4.7.2.1. Distribution passive
Les liposomes qui sont susceptibles aux opsonines, comme ceux qui arborent une charge globale positive, sont essentiellement captures par le RES et confines au foie et a la rate (DRUMMOND et al, 1999). A 1'oppose, ceux qui possedent un T>/2 superieur a 6 h s'accumulent preferentiellement au sein de tissus permeables comme les tumeurs solides en obeissant au phenomene « enhanced permeability and retention » (EPR) (MAEDA et al,
2000; MATSUMURA et MAEDA, 1986). De tels liposomes circulent suffisamment pour se faufiler a travers les fenestrations endotheliales des neovaisseaux qui irriguent la masse neoplasique. Suite a leur extravasation, ils demeurent pieges dans le stroma tumoral compte tenu des anomalies du systeme lymphatique des tissus neoplasiques. En effet, le drainage lymphatique est defaillant au niveau des tumeurs peripheriques, et meme absent au SNC (HARRINGTON et al, 2002; SAPRA et ALLEN, 2003). La liberation locale du chargement liposomal survient generalement suite a la destabilisation des vesicules dans le milieu extracellulaire et peut s'etendre sur une periode de plusieurs semaines apres une seule administration (MAMOT et al, 2003; PARK et al, 2004).
Dans le cas precis des astrocytomes malins, les bienfaits therapeutiques du phenomene EPR sont potentiellement moderes la diffusion limitee des liposomes et des xenobiotiques dans le parenchyme cerebral. L'epanchement du liquide interstitiel dans le LCR et le renouvellement rapide de ce dernier minorent l'exposition des cellules malignes ayant infiltre le parenchyme sain de facon extensive (BEGLEY, 2004; CHEN et al, 2004; GARCIA-GARCIA et al, 2005). En definitive, Pefficacite therapeutique maximale ne peut qu'etre obtenue avec des liposomes capables de penetrer la BHE saine.
4.7.2.2. Distribution active
Les liposomes sont adresses activement vers un organe, un tissu ou une population cellulaire specifique par des vecteurs conjugues a leur surface membranaire ou ancres a l'extremite distale de leurs polymeres PEG (figure 3e) (HUWYLER et al, 1996; TORCHILIN, 2005). La distribution active ne s'applique generalement qu'aux liposomes peguyles puisque la destabilisation et/ou l'elimination precoce des liposomes prives de
polymeres PEG rendent Pusage de vecteurs de surface completement futile. Une grande variete de vecteurs diriges contre des antigenes uniquement exprimes ou du moins surexprimes par les cellules tumorales est actuellement eprouvee pour la therapie de divers neoplasmes. Les antigenes vises sont majoritairement des recepteurs de la membrane cytoplasmique etant donne qu'ils autorisent l'entree cellulaire des liposomes lors de leur internalisation (figure 2d). En plus de conferer une specificite et un acces intracellulaire aux liposomes, certains vecteurs (ex. : anticorps monoclonal anti-HER2) evitent meme l'initiation de cascades intracellulaires nuisibles (ex. : promouvant la survie ou la proliferation cellulaire) en antagonisant leur recepteur cible (PARK et al, 2001; PARK et
al, 2004). Dans le contexte de la therapie des gliomes malins, ces vecteurs amplifient
specifiquement les interactions des liposomes avec les neovaisseaux tumoraux (ex. : peptide RGD) ou les cellules gliales neoplasiques (ex. : folate), et favorisent meme le passage de la BHE (ex. : anticorps monoclonaux contre les recepteurs de la transferrine ou de l'insuline) (BEDUNEAU et al, 2007; QIAN et al, 2002; SAPRA et ALLEN, 2003; TORCHILIN, 2005).
4.7.3. Mecanismes de liberation 4.7.3.1. Extracellulaire
Au site tumoral, les liposomes liberent leur cargaison dans le milieu extracellulaire a la suite de leur destabilisation par des lipases tissulaires ou des agents oxydants, a l'adsorption stable aux cellules ou encore a l'echange de lipides avec la membrane cellulaire (figure 7a et b) (BRASNJEVIC et al, 2009; TORCHILIN, 2005). Les principes actifs sont alors exposes a Fenvironnement acide de la tumeur, a une multitude d'enzymes
catalytiques et a des pompes a efflux (LEE et al, 2008; LOSCHER et POTSCHKA, 2005; TREDAN et al, 2007). Par surcroit, la majorite des antineoplasiques doivent penetrer les membranes des cellules malignes pour rejoindre leur site d'action. Ces obstacles locaux limitent potentiellement les benefices encourus par l'utilisation des liposomes.
4.7.3.2. Intracellulaire
La liberation intracellulaire s'opere quant a elle par deux mecanismes distincts : la fusion directe et l'endocytose (figure 7c et d) (PINTO-ALPHANDARY et al, 2000; TEMPLETON, 2002). La fusion directe consiste a l'unification des membranes liposomale et plasmique; le contenu des liposomes est alors deversee directement dans le cytosol des cellules receptrices (TEMPLETON, 2009; XI et al, 2008). Ce processus de lipofection produit une biodisponibilite intracellulaire maximale, mais demeurerait toutefois un evenement rare comparativement a l'endocytose (MANCONI et al, 2007; SALVATI et al, 2006).
L'endocytose des liposomes est generalement precedee de 1'adsorption des vesicules a la membrane cellulaire, mais peut egalement survenir sur-le-champ (figure 7d et e). Le captage des liposomes s'effectue par le biais d'invaginations de la membrane de la cellule receptrice, qui se forment selon trois sous-mecanismes: la voie clathrine-dependante, la voie calveole-dependante et la macropinocytose (HUTH et al, 2006; IVANOV, 2008). Ces trois voies participent simultanement a l'endocytose des liposomes LUV, mais la voie clathrine-dependante est de loin la plus sollicitee (GONG et
al, 2008; MAXFIELD et MCGRAW, 2004; TARRAGO-TRANI et STORRIE, 2007).
Cette derniere se distingue des autres voies par le fait que les endosomes, au terme de leur
maturation, fusionnent avec les lysosomes (figure 7f). Les lysosomes renferment un pH acide (pH 5,0) et plus de 40 enzymes qui degradent les liposomes et leur chargement (BAREFORD et SWAAN, 2007; MEDINA-KAUWE et al, 2005; SMITH et GUMBLETON, 2006).
Pour declencher la liberation intracellulaire des endosomes avant cette etape terminate, des lipides sensibles au pH ou des peptides fusogeniques d'origine virale (ex.: influenza) sont incorpores dans les formulations liposomales (MASTROBATTISTA et al, 2002; WASUNGU et HOEKSTRA, 2006). Lorsque les endosomes s'acidifient au cours de leur maturation, les lipides sensibles au pH subissent un changement conformationnel et destabilisent les membranes liposomales et endosomales. L'un des plus repandus et des mieux caracterises est le dioleoylphosphoethanolamine (DOPE), un glycerophospholipide pourvu de chaines d'acides gras symetriques de 18 carbones portant chacune une seule instaturation (A9 cis) (figure 4b et tableau 3). Lorsque le pH intra-endosomal chute, le DOPE passe de la phase lamellaire (bicouche lipidique) a hexagonale inversee (Hn), destabilisant du coup l'integrite de la bicouche lipidique des liposomes et des endosomes (figure 5b et c) (CHEN et al, 2007; EWERT et al, 2008). Les lipides sensibles au pH precipitent done la relache du bagage liposomal dans le cytosol avant sa destruction dans les lysosomes, et evitent qu'il demeure sequestre dans les endosomes (figure 7g) (MERDAN et al, 2002; TARRAGO-TRANI et STORRIE, 2007). En definitive, la liberation de la cargaison liposomale dans le cytosol procure une biodisponibilite intracellulaire optimale, et permettrait meme d'echapper a Taction des pompes a efflux localisees a la membrane plasmique (KOBAYASHI et al, 2007; MAMOT et al, 2003; SAPRA et ALLEN, 2003). Ces pompes, qui participent a la chimioresistance intrinseque ou acquise de plusieurs types de cellules malignes, sont surexprimees par les cellules neoplasiques des astrocytomes malins (CALATOZZOLO et al, 2005; HENSON et al, 1992; LOSCHER et POTSCHKA, 2005).
5. HYPOTHESE ET OBJECTIFS DE RECHERCHE
L'hypothese proposee stipule que l'utilisation de liposomes LUV comme vehicules d'antineoplasiques est une alternative therapeutique plus securitaire et plus efficace que la chimiotherapie classique pour la therapie des GBM. Nous pensons done que cette technologie a le potentiel d'ameliorer le pronostic et la qualite de vie des patients affliges d'un GBM.
Pour y arriver, une formulation liposomale capable deverser son contenu a l'interieur des cellules gliales malignes doit d'abord etre elaboree. Les conditions de lipofection qui prevalent in vivo et in vitro sont differentes et les resultats recueillis ne peuvent etre directement transposes d'un contexte a l'autre (BARTSCH et al, 2005). II est neanmoins primordial de debuter par des essais in vitro afin d'optimiser la composition lipidique des liposomes pour la lipofection des cellules gliales malignes. Les objectifs qui s'inscrivent dans cette visee sont les suivants :
a) elaborer un protocole pour la production controlee et reproductible de differentes formulations de liposomes LUV;
b) evaluer la taille, la morphologie et la concentration des liposomes produits;
c) determiner quantitativement Fefficacite de lipofection continue (captage et liberation intracellulaire) des differentes formulations liposomales envers les lignees cellulaires gliales F98 et U-l 18 MG, sur une periode de 24 h;
d) etudier la distribution intracellulaire de la formulation vedette et de sa cargaison chez les deux memes lignees cellulaires, sur une periode de 24 h.
AVANT-PROPOS DE L'ARTICLE
L'article ci-joint fut soumis dans la revue «International Journal of
Pharmaceutics » pour revision par comite de pairs avant publication. Intitule « Uptake and
intracellular release kinetics of different liposomes in glioma cell lines », cet ouvrage fait l'objet des resultats obtenus dans le cadre de recherches menees dans le laboratoire du Dr. David Fortin, sur Pelaboration d'un vehicule liposomal destine au traitement des tumeurs cerebrales primaires malignes. Le present article fut redige par Marc-Andre Bellavance, assiste des Dr Marie-Belle Poirier et Dr David Fortin. La methodologie, les experimentations, les resultats et les figures sont entierement issus du travail de Marc-Andre Bellavance.
RESUME DE L'ARTICLE
Le glioblastome multiforme (GBM ou astrocytome malin de grade IV) est le type le plus malin et le plus letal des tumeurs cerebrales primaires chez l'adulte. Le pronostic qui y est associe demeure severement limite, en depit d'un traitement optimal et de plusieurs decennies de recherches. La barriere hemato-encephalique est l'une des contraintes therapeutiques majeures, puisqu'elle reprime l'entree de la presque totalite des
xenobiotiques disponibles au systeme nerveux central (SNC). Plusieurs strategies furent developpees pour accroitre racheminement d'agents therapeutiques au SNC et l'utilisation de liposomes comme vehicules parait comme l'une des plus prometteuses. Dans cette etude, nous decrivons une nouvelle formulation liposomale cationique et sensible au pH pour la lipofection des cellules gliales malignes (GBM). Les liposomes de cette formulation vedette (DPPC:DC-Chol:DOPE:DHPE Oregon Green) ont fortement ete internalises par les cellules gliales F98 et U-l 18 MG et ont libere activement leur chargement fluorescent dans le cytosol de ces cellules. Quatre autres formulations derivees ont permis d'etudier l'impact de la reduction de la fluidite membranaire, de la stabilisation sterique par le polyethylene glycol et de la perte concomitante de la charge cationique et de la sensibilite au pH sur les cinetiques de lipofection. Le captage cellulaire des liposomes et la liberation intracellulaire de leur cargaison hydrophile furent analyses par cytometric de flux et microscopie confocale sur 24 h. Le phospholipide fluorescent DHPE Oregon Green et l'iodure de propidium (PI) ont ete respectivement employes comme traceur de la membrane liposomale et mimetique d'un compose tumoricide hydrophile. L'internalisation de la formulation vedette est principalement survenue au cours des six premieres heures d'exposition. Les liposomes captes ont converge vers le noyau dans les 12 h, tandis que la liberation intracellulaire de PI a ete graduellement deployee durant les 24 h de l'etude. Les formulations derivees ont ete moins performantes; les modifications des parametres physico-chimiques de la formulation vedette (enumeres ci-haut) ont reduit l'internalisation et/ou la liberation intracellulaire chez les deux lignees cellulaires. Nous proposons done une nouvelle formulation liposomale pour racheminement de composes a mecanisme d'action intracellulaire, tels que les agents de chimiotherapie et petits ARN interferents, au sein des cellules gliales malignes (GBM).
ARTICLE
Uptake and intracellular release kinetics of liposome formulations in glioma cells
Marc-Andre Bellavance1, Marie-Belle Poirier2, David Fortin2
'Department of Pharmacology, Universite de Sherbrooke, Sherbrooke, Quebec, Canada department of Surgery, Division of Neurosurgery and Neuro-oncology, Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke, Sherbrooke (CHUS), Universite de Sherbrooke, Quebec, Canada
ABSTRACT
Glioblastoma (GBM) is the most malignant primary brain tumor in adults, and its prognosis remains very limited despite decades of research. Enhanced drug delivery to GBM using liposomes represents a promising therapeutic strategy. In this study, we describe a novel cationic and pH-sensitive liposome formulation composed of DPPC:DC-Chol:DOPE:DHPE Oregon Green producing efficient internalization and intracellular delivery to F98 and U-118 GBM cells. With a series of derived modifications of the lipid composition, we investigated the impact of membrane fluidity, steric stabilization and loss of both cationic and pH-sensitive components on cellular uptake and intracellular release kinetics. Lipofection kinetics and intracellular fate of liposomes were analyzed by flow cytometry and confocal microscopy. DPPC:DC-Chol:DOPE:DHPE Oregon Green liposomes were strongly internalized in both cell lines within 6 h. Following cellular uptake, liposomes traveled towards the nucleus (12 h) and gradually released their cargo in the cytosol (over 24 h). Modifications in liposomal composition of our original formulation had detrimental consequences on both the uptake and intracellular release kinetics in the two tested cell lines. Thus, we report a novel potent liposomal formulation for efficient cytosolic delivery of intracellular therapeutics such as chemotherapy agents and siRNAs to GBM cells.
KEYWORDS: liposomes, pH-responsive, PEG, glioblastoma, blood-brain barrier
INTRODUCTION
Glioblastoma (GBM) is the most common and malignant type of primary brain tumors in adults (DeAngelis 2001; Vescovi et al., 2006; Bondy et al., 2008). The current standard treatment of newly diagnosed GBM consists of maximal surgical resection and a combination of radiotherapy and chemotherapy (temozolomide). The median survival of GBM patients is 12 to 14 months with optimal treatment (Stupp et al., 2005; Koo et al., 2006). This dismal prognosis has not improved significantly since decades despite active research and numerous technological advances in neuro-oncology (Rich et al., 2004; Wen et al., 2008). The therapeutic approaches to GBM remain challenging because of several factors, such as the highly proliferative and infiltrative behavior of malignant glial cells, their inherent or acquired resistance to chemoradiotherapy and the very limited drug delivery to the central nervous system (CNS) (Rich et al., 2004; Nakada et al., 2007; Claes et al., 2007).
Systemic delivery of therapeutics to primary brain tumors is severely hindered by the blood-brain barrier (BBB). The BBB lies at the endothelium of CNS capillaries and prevents xenobiotics entry to the CNS by sealing the paracellular pathway with endothelial tight junctions (Wolburg et al., 2002; Abbott et al., 2006; Cecchelli et al., 2007; Correale et al., 2009). Only lipophilic drugs displaying a molecular weight smaller than 400 Da have the ability to cross the BBB (Kemper et al., 2004; Deeken et al., 2007; Pardridge2007). However, the very few drugs that possess such physicochemical properties are likely to be expelled from the CNS by BBB multi-drug efflux transporters, such as P-glycoprotein (P-gp) (Glavinas et al., 2004; Chen et al., 2004; Loscher et al., 2005; Szakacs et al., 2006).
More so, glial tumor cells can also express these efflux transporters, thus creating a second layer of impediment to delivery (Henson et al., 1992; Loscher et al., 2005; Calatozzolo et al., 2005). As a consequence, more than 98% of available drugs cannot reach malignant glial cells in therapeutic concentrations (Pardridge2005; de Boer et al., 2007). Many delivery strategies have thus been developed to circumvent theBBB in order to increase the CNS bioavailability of a wider therapeutic arsenal (Begley2004; Chen et al., 2004; Garcia-Garcia et al., 2005; Tiwari et al., 2006; Brasnjevic et al., 2009). Liposomes stand among the most widely used technologies for brain delivery and their clinical use has already been approved in different indications (Merdan et al., 2002; Harrington et al., 2002; Garcia-Garcia et al., 2005; Huynh et al., 2006; Tiwari et al., 2006). Considering the extensive angioarchitecture of the CNS, as well as the active vascular proliferation induced by GBM, liposomes represent one of the most promising systemic delivery strategies for GBM therapy (Kemper et al., 2004; Fenske et al., 2008; Wen et al., 2008).
Liposomes are inert and polyvalent colloidal carriers made of concentric membranes bilayers containing biocompatible phospholipids. These particulate vehicles alter the pharmacokinetics and the biodistribution of entrapped compounds by masking their physicochemical properties, which provide many advantages over the free form of the equivalent agent. Liposomes increase drug bioavailability by protecting their therapeutic cargo from degradation by the immune system, enzymes and unfavorable conditions (Pinto-Alphandary et al., 2000; Brasnjevic et al., 2009). Due to their lipophilic nature, liposomes facilitate diffusion of entrapped drugs through the BBB and other biological membranes (Drummond et al., 1999; Langner et al, 1999; Mamot et al., 2003; Waterhouse et al., 2005; Sapra et al., 2005). Liposomes can also potentiate the efficacy of chemotherapy and other
intracellular active drugs by bypassing multi-drug resistance pumps, thus achieving intracellular delivery to targeted cells (Mamot et al., 2003; Torchilin2005; Brasnjevic et al., 2009). To fulfill the aforementioned functions in malignant glial tumor therapy, liposomes must first be properly designed to lipofect malignant glial cells; it is well recognized that the lipofection efficiency of distinct cell types is greatly dictated by the lipid composition of liposomes, and thus, a liposomal fomulation can't be universal in terms of its application (Fenske et al., 2008).
With this caveat in mind, we have undertaken the design and optimization of a liposomal formulation specifically intended for therapeutics delivery to malignant glial tumor cells. We opted for a mean liposome diameter of approximately 100 nm, since it provides a convenient carrying capacity while maximizing blood residence times and CNS biodistribution across the BBB (Uchiyama et al., 1995; Drummond et al., 1999; Koo et al., 2006; Fenske et al., 2008). We also elected to work with a cationic liposomal charge as it promotes spontaneous electrostatic interactions with highly anionic proteoglycans of eukaryotic cells, and thus yield a high lipofection efficiency via absorptive endocytosis (Merdan et al., 2002; Medina-Kauwe et al., 2005; Salvati et al., 2006; Hoekstra et al., 2007). Likewise, positively charged liposomes may also benefit from a greater CNS bioavailability since cationization of numerous compounds readily increases their CNS entry via adsorptive-mediated endocytosis and subsequent transcytosis at the BBB (Abbott et al., 2006; Beduneau et al., 2007; Brasnjevic et al., 2009). Finally, cationic lipids may also contribute to the intracellular release of liposomal contents in lipofected cells, as proposed by Xu and Szoka (Xu et al., 1996).
The following report details the design and the in vitro lipofection efficacy of several liposomal formulations in two GBM cell lines (F98 and U-118 MG). Specifically, the impact of liposomal charge, membrane fluidity and incorporation of PEG-modified lipids on cellular uptake and intracellular release was studied. These experiments were conducted in the F98 cell line in the scope of upcoming in vivo studies using our syngeneic F98 Fisher rat model, which closely reproduces the human behavior of GBM (Mathieu et al., 2007; Barth et al., 2009). The U-118 MG cell line was used as the human counterpart.
2. MATERIALS AND METHODS
2.1 Materials
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), cholesterol (Choi), 3J3-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyljcholesterol hydrochloride (DC-Choi), l,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DPPE-PEG2000) were purchased from Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). The fluorescent phospholipid lipid analog Oregon Green 488 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DHPE Oregon Green) and the membrane impermeant dye, propidium iodide (PI), were acquired from Invitrogen (Burlington, Ontario, Canada). HEPES and NaCl were obtained from Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canada) while chloroform was purchased at Fisher Scientific (Ottawa, Ontario, Canada).
2.2 Cell lines and culture
Rat F98 and human U-118 MG cell lines were obtained from American Type Culture Collection (Rockville, MD) and were both grown in Dulbecco's modified Eagle essential medium (DMEM) supplemented with 10% FBS (v/v), penicillin (100 IU/ml) and streptomycin (100 ug/ml) kindly provided by Wisent Bioproducts (St-Jean-de-Baptiste,
