(
(_
Etude de l'angiogénèse et développement d'un modèle animal pour l'étude du sarcome de Kaposi.
par
Robert L. Turgeon
Département d'anatomie et de biologie cellulaire
Mémoire présenté
à
la faculté de médecine en vue de l'obtention du grade demaître ès science (M.Sc.)
. .
Canadian Theses Se<vice Se<vice des lhèSes canadiennes
Ottawa. Canada
KIA ON4
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ISBN 0-315-76188-1
(
Titre . . ... . ... . .. . . .. ... . . ... .. ... ... ... . . · · · Table des matières . . . Il Liste des illustrations . . . VII Liste des tableaux . . . IX Liste des abréviations . . . X Résumé . . . XII !-INTRODUCTION SUR LE CONTROLE DE L'ANGIOGENÈSE . . . ... . . ... .
1. L'angiogénèse
1.1 L'angiogénèse dans les tumeurs . . . 2
1.1.1 Croissance cellulaire . . . 3
1.2 Techniques dans l'étude de l'angiogénèse ... .... ... . ... . . 1.2.1 Membrane chorioallantoïdienne . . . .. .. . . . ... . . . ... . ... . 4 5 1.3 L'angiogénèse au niveau cellulaire . . . 6
1.4 Contrôle de l'angiogénèse . . . 7
1.5 Enzymes impliqués dans l'angiogénèse . . . 7
1.5.1 Dégradation de la membrane basale . . . 8
1.6 Les facteurs stimulants de l'angiogénèse . . . 9
1. 7 L'importance de l'angiogénèse dans la néoplasie . . . 10
2. Moyens de contrer l'angiogénèse 2.1 Traitement antiangiogénique 11 13 2.2 MTP combiné avec différents stéroïdes . . . 14
3. Objectifs . . . 15
li-INTRODUCTION SUR LE MODELE DU SARCOME DE KAPOSI . . . 16
1. Le SIDA ... . . . .. . ; . . . ... .. . .... . . . .. . ... . ... . . .. .. . . 16
(
1.1.1 Forme classique
1.1.2 Forme endémique . . . .. 1.1.3 Forme iatrogénique ... ... . .. .. . .. .... . . .. ... .... . 1.1.4 Chez les femmes et les enfants .. . .. . . ... .. . ... . . 1.1.5 Forme épidémique ... . . ... ... . .... . .... ... . ... .... . 1.2 Distribution du sarcome de Kaposi . .... ... ... ... .... .. . ... . ... . 1.3 Etiologie du sarcome de Kaposi associé au SIDA .. . ... . .. . ... . . .. . 1.3.1 lmmunosuppression .. .... . ... .. .. ... ... ... . . . 1.3.2 L'utilisation de nitrites (poppers) .... . ... .. . .. . .. . ... . . . 1.3.3 Infections multiples aux MTS
1.3.4 Relations homo/bisexuelles
1.3.5 Autres agents causals . .. . ... . ... .. .... ... .. .. .. . .. . . 1.4 Thérapies dans les cas de sarcome de Kaposi
2. Les modèles animaux dans la recherche sur le VIH
2.1 Modèle animal dans l'étude du SK ... . ... . . ... . . ... .. . ... . 2.1.1 Historique . . .. .. ... . .. ... . .. . ... . . .... .. . . ... .. . . . 2.1.2 Angiosarcome expérimental . ... . . . .... .. . .. ... . 3. Projet MAIDS ... ... . . . .... . .. ... .. . ... . .. .... .. .. .. .. . .. .. . . .
3.1 Le virus LP-BM5
3.2 Pathologie induite par le virus LP-BM5 . .. .. ... .. . . .. . ... . .. . .. . 3.3 lmmunosuppression induite par le virus .... .. ... ... .. .. ... . . .. . . 3.4 Le virus LP-BM5 et le sarcome de Kaposi . ... .. . . . ... .. . 4. Objectifs . . . .. .. . . . Ill-MATERIEL ET METHODES SUR L'ANGIOGENESE . . ... ... . . . ... ... . . 1. La membrane chorioallantoïdienne . . . . .. ... .. .. . . ... .. .. . . . Ill 17 18 19 19 19 21 21 22 23 24 25 25 26 28 29 30 30 31 31 32 34 36 36 38 38
(
(_
1.2 Disques de méthylcellulose . . . 39
1.3 Protocole expérimental 40 1.4 Compilation des résultats . . . 40
IV-MATERIEL ET METHODES SUR LE MODELE DU SARCOME DE KAPOSI . . . 42
1. Induction d'angiosarcomes expérimentaux . . . 42
1.1 Les animaux . . . 42
1.2 Traitement au 1 ,2-climéthylhydrazine . . . 42
1.3 Accélération de l'apparition des angiosarcomes . . . 43
1.3.1 Miniblessures . . . 43
1.3.2 Huile de croton . . . 43
1.4 Combinaison MTP et stéroïdes . . . 44
2. Protocole projet MAIDS . . . 45
2.1 Dénombrement des lymphocytes T 2.2 Préparation des cellules spléniques 46 46 2.3 Stimulation en présence de Con A ou de LPS . . . 47
2.3.1 Calcul des indices de stimulation 2.4 Méthode de numération de plages d'hémolyse . ... .. ... . 3. Analyses statistiques . . . ... . .. .. . . 4. Préparation des tissus pour l'histologie V-RESULTATS SUR LE CONTROLE DE L'ANGIOGENESE . ... . ... . . .. . . .. . . . 1. Membrane chorioallantoïdienne .. . .. ... ... . ... ... . .. .... .... . 1.1 Tétrahydro S . ... .. . . .. ... ... ... . .. .. .. .. . 1.2 17 cx-hydroxyprogestérone .... ... . ... ... ... . . . .. . ... . 1.3 Cortisone 49 49 50 51 52 52 52 54 54 1.4 Héparine-Cortisone . . . 55 IV
(
1. Le DMH (dimethylhydrazine) . . . 56
1.1 Effets sur les animaux 1.2 Effets macroscopiques 56 57 1.2.1 Partie paratesticulaire . . . 58 1.2.2 Les poumons . . . 59 1.2.3 L'intestin . . . 59 1.2.4 Autres organes . . . 60 1.3 Observations microscopiques . . . 61 1.3.1 Le foie 1.3.2 Le rein 1.3.3 L'intestin .. . . ... . . .. . ... . 1.3.4 Le mésentère partie paratesticulaire 61 61 62 62 1.3.5 Les testicules . . . 62 1 .3.6 Les angiosarcomes . . . 63 2. L'huile de croton . . . 64 3. Miniblessures . . . 64 4. Le projet MAIDS . . . 65
4.1 Effets du virus LP-BM5 en combinaison avec le DMH . . . 65
4.1.1 La rate . . . 65
4.1.2 Les poumons . . . 66
4.1.3 Le foie . . . 66
4.1.4 Autres organes . . . 67
4.2 Taux de mortalité . . . 67
4.3 Statut immunitaire des animaux . . . 68
4.3.1 Réponse PFC . . . 68
(
4.3.3 Indice de stimulation en présence de LPS . . . 70
4.3.4 Comptes des lymphocytes T spléniques . . . 70
4.3.5 Comptes des lymphocytes T périphériques . . . 71
VII-DISCUSSION SUR L'ANGIOGENESE . . . 72
VIII-DISCUSSION SUR LE MODELE DU SARCOME DE KAPOSI . . . 81
IX-CONCLUSION . . . 88 X-REMERCIEMENTS . . . 90 XI-REFERENCES . . . 91 XII-FIGURES . . . 103 XIII-TABLEAUX . . . 125 XIV-ANNEXES . . . 127 VI
(
FIGURES: 1- 2- 3- 4- 5- 6- 7- 8- 9- 10- 11-12-Effet antiangiogénique du tétrahydro S sur la M.C.A.
Effet antiangiogénique du 17a OHprogestérone sur la M.C.A. Effet antiangiogénique de l'héparine-cortisone sur la M.C.A. Variation du poids des souris C57Bl/6 traitées au DMH. Illustration de l'hypertrophie de la rate.
Illustration d'un angiosarcome paratesticulaire.
Illustration d'un angiosarcome se développant sur le testicule droit.
Illustration d'une métastase pulmonaire d'un angiosarcome paratesticulaire. Coupe histologique d'un adénocarcinome intestinale.
Coupe histologique d'un angiosarcome paratesticulaire.
Coupe histologique d'un angiosarcome près de l'épidydime testiculaire. Coupe histologique d'un angiosarcome montrant des cellules
fusiformes.
13- Coupe histologique montrant les vaisseaux anormaux et les espaces vasculaires rencontrés dans un angiosarcome.
14- Variation du poids des souris C57Bl/6 traitées au LP-BM5. 15- Coupe histologique de l'hyperplasie lymphoïde de la rate. 16- Coupe histologique de prolifération lymphoïde dans le poumon.
18- Indice de stimulation en présence de Con A. 19- Indice de stimulation en présence de LPS. 20- Dénombrement des cellules T de la rate. 21- Dénombrement des cellules T du sang.
(
1- Activité antiangiogénique de la combinaison du MTP et de stéroïdes.
(
c
CD4: Complexe de différentiation #4
CD8: Complexe de différentiation #8
CDC: Center of disease control
CMV: Cytomégalovirus
Con A: Concanavaline A
cpm: Coups par minute
DFMO: Difluorométhyle ornithine
DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium
DMH: Diméthylhydrazine
(
EB: Epstein BarrEDTA: Acide éthylènediamine-tétraacétique
EGF: Epidermal growth factor
Facs: Fluoresceine activated cell sorter
Fel V: Virus de la leucémie féline
FGF: Fibroblast growth factor
HLA-DR: Antigène d'histocompatibilité humain (locus DR)
10: Infection opportuniste
ip: lntrapéritonéale
LP-BM5: Lymphoproliferative bone marrow #5
LPS: Lipopolysaccharide
MTP: Mu LV: PAl-1: PBS: PFC: PVC: se: SIDA: SK: T-PAI: TGF: µCi: VIH:
l
Tétrapalmitate de maltose Virus de la leucémie murineInhibiteur de l'activateur du plaminogène Phosphate buffered saline
Plage forming cells " formation de plage d'hémolyse" Chlorure de polyvinyle
Sous-cutanée
Syndrome d'immunodéficience acquise Sarcome de Kaposi
Tissu-type plasminogen activator Transforming growth factor Microcurie
Virus de l'immunodéficience humaine
c
Etude de l'angiogénèse et développement d'un modèle animal pour l'étude du sarcome de Kaposi.Mémoire de Robert L.Turgeon, Département d'Anatomie et Biologie Cellulaire, Faculté de Médecine, Université de Sherbrooke, Québec, Canada.
X-RESUME
La progression du virus du SIDA chez l'humain a atteint une telle proportion qu'aucune classe de la société n'est à l'abri. L'avènement du SIDA a causé une incidence plus élevée de certaines pathologies, comme le sarcome de Kaposi (SK). Il s'agit d'un cancer des cellules endothéliales, pour lequel aucun modèle expérimental n'existait. Nous avons développé, dans le cadre de nos recherches, un modèle de souris qui mime en partie les conditions rencontrées chez les patients sidéens souffrant du SK.
Puisqu'il s'agissait d'une néoplasie des cellules endothéliales, nos recherches ont été dirigées vers des traitements antiangiogéniques. La première partie de l'étude a été effectuée sur l'angiogénèse, et consistait en des traitements apposés à la surface de la membrane chorio-allantoïdienne (CAM). Nous avons utilisé le tétraHydro S ainsi que le 17 a-hydroxyprogestérone combiné au MTP déposés en forme de disque à la surface de la CAM. Nous avons obtenu des zones avasculaires confirmant leur activité. La combinaison MTP-tétrahydro S a donné les meilleurs résultats.
La seconde partie contient l'objectif principal de cette recherche. Trente semaines d'injections hebdomadaires s.c. de DMH chez des souris C57Bl/6 mâles induisent l'apparition d'angiosarcomes dans 80 % des cas. Nous avons augmenté l'immunosuppression de ces souris en utilisant le virus LP-BM5. Les paramètres immunitaires ont été étudiés à l'aide: de stimulation en présence de Con A ou de LPS, de la réponse PFC et d'un dénombrement lymphocytaire du sang et de la rate.
Les résultats étaient les suivants:
Réponse de PFC. L'injection hebdomadaire de DMH après 20 semaines cause une diminution de la réponse PFC de 35 %. Ce niveau reste le même au-delà de 20 semaines. L'infection de ces souris avec le virus LP-BM5 ne réduit pas davantage la réponse PFC des cellules spléniques douze semaines après l'infection.
Stimulation par le Con A. Les souris traitées au DMH pendant 25 et 31 semaines voient leur indice de stimulation chuter de 30 %. L'infection par le virus cause une diminution significative de 60 % à 6 semaines, qui se poursuit après 12 semaines pour atteindre 80 %.
(
l'infection au LP-BM5, l'indice montre une forte baisse de 45 %. Au-delà de 6 semaines le niveau reste le même et à 12 semaines aucune baisse significative n'est détectable.
Dénombrement lymphocytaire. Le nombre de lymphocytes spléniques exprimant le marqueur L3T4 et Ly2 ne varie pas avec l'injection de 25 semaines de DMH. Cependant on observe une chute significative de l'expression du marqueur L3T4 et une augmentation significative de l'expression du marqueur Ly2 sur les cellules lymphocytaires de la rate suite
à
l'infection du virus LP-BM5à
6 et 12 semaines. Les angiosarcomes n'ont pas été affectés par le virus, leur nombre, leur apparition ainsi que leur localisation n'ont pas été modifiés.Les résultats obtenus avec notre modèle, par la combinaison de DMH et LP-BM5, ressemble
à
l'état clinique du SK épidémique. Ce qui nous permet de conclure que le modèle que nous avons développé, avec ces limitations, pourra être utile dans la recherche de traitements pour les patients sidéens. Nous avons réussià
mimer une partie du problème, mais il reste encore des étapesà
franchir pour permettre !'études de thérapeutiques in vivo. Ces études serviront à établir un traitement moins toxique efficace contre ce type de lésion.(
1-INTRODUCTION SUR LE CONTROLE DE L'ANGIOGENESE 1-L'angiogénèseLe terme angiogénèse fut utilisé pour la première fois en 1934 pour décrire la formation de vaisseaux sanguins dans le placenta lors de la grossesse. Il faut attendre quelques années avant que l'on commence
à
lui porter une attention plus particulière, notamment dans les cas de tumeurs cancéreuses. Durant l'angiogénè-se, phénomène par lequel il y a formation de nouveaux vaisseaux sanguins, les cellules endothéliales des capillaires semblent répondreà
une stimulation. Après avoir dégradé la membrane basale, elles envahissent l'espace interstitiel de la matrice extracellulaire et forment des bourgeons de capillaires (Ausprunk et Folk-man, 1977; Pepper et al., 1990).Elles répondent ainsi
à
une ou plusieurs substances présentes dans le milieu extracellulaire. Parmi celles-ci, l'on retrouve FGFa et b (fibroblast growth factor acid and basic), l'angiogénine, TGFa et B (transforming growth factor a and B) et plusieurs autres substances qui ont été classées comme étant stimulatrices de l'angiogénèse et dont certaines sont des lipides (Folkman et Klagsbrun, 1987).L'angiogénèse est un phénomène normal que l'on retrouve lors de la cicatrisation des plaies, lors du cycle menstruel chez la femme et lors du
(
développement embryonnaire chez le foetus. Il ne suscite un intérêt notoire que dans les cas où son contrôle se voit modifié.1.1 L'angiogénèse dans les tumeurs
Pendant environ vingt ans, une controverse divisait les chercheurs: Comment les tumeurs étaient-elles nourries? Par les vaisseaux sanguins déjà existants ou par la formation de néovaisseaux sanguins?
Parmi ceux qui favorisaient la néovascularisation, la formation de nouveaux vaisseaux sanguins, certains suggéraient que les cellules tumorales en prolifération induisaient la formation de nouveaux capillaires sanguins (Warren, 1989). D'autres affirmaient plutôt que la néovascularisation était une réponse à l'inflammation. D'autres croyaient encore que les tumeurs formaient elles-mêmes leurs canaux vasculaires dérivés directement de cellules tumorales (Folkman et Klagsbrun, 198-7;Warren, 1989).
Entre les années 1935 et 1955, pas ou très peu d'évidences suggéraient que la croissance tumorale dépendait de la croissance des capillaires déjà présents (Pepper et al., 1990; Folkman et Klagsbrun, 1987; Warren, 1989). Il fallut attendre en 1963 où des expériences d'implants tumoraux amenèrent l'observation de la vascularisation dans la croissance tumorale (Folkman et Klagsbrun, 1987). Folkman émit plus tard l'hypothèse que la formation des tumeurs solides était
(
dépendante de l'angiogénèse (Folkman, 1990; Folkman, 1974), et que l'approche antiangiogénique pourrait être envisagée comme moyen thérapeutique. L'hypo-thèse était simple: l'augmentation de la population cellulaire tumorale devait être précédée d'une croissance de nouveaux capillaires convergeant vers la tumeur (Folkman et Klagsbrun, 1987).1.1.1 Croissance cellulaire
La prolifération cellulaire in vivo d'une tumeur solide expérimentale, est limitée par la présence de néovaisseaux sanguins, sa dimension maximale observée au stade prévasculaire est de 1
à
2 millimètres de diamètre. Cependant, lorsque la vascularisation s'initie, on note une forte croissance des tissus tumoraux (Folkman et Klagsbrun, 1987). On peut donc dire que meilleure est la vasculari-sation, meilleure est la prolifération des cellules tumorales (Kallinowsky F., 1989) L'angiogénèse et la microvascularisation sont essentielsà
la livraison des nutriments età
l'excrétion des déchets métaboliques (Jain R.K. 1988).Les cellules tumorales entourent de façon concentrique les capillaires, formant des cylindres d'environ 150
à
200 micromètres, distance équivalenteà
la diffusion de l'oxygène. De plus, il a été observé que la synthèse de l'ADN par les cellules tumorales est inversement proportionnelleà
la distance du plus proche capillaire (Folkman et Klagsbrun, 1987).(
Il y a donc une forte association entre la présence de capillaires et la vitesse de croissance tumorale. Mais les réponses aux questions suivantes: pourquoi y a-t-il formation de néovaisseaux? et qu'est-ce qui induit la formation de ces vais-seaux? n'étaient pas encore trouvées.L'hypothèse de la présence de facteurs diffusibles fut alors évoquée. Il fallait nécessairement qu'il y ait un ou des messagers, probablement chimiques, qui informent les cellules endothéliales à proximité de la tumeur. Ces facteurs induisaient les cellules endothéliales à se libérer de leur membrane basale et à la digérer en partie, de façon à pouvoir entrer en cycle de division. Elles n'ont par la suite qu'à se glisser dans l'espace interstitiel et à proliférer en direction de la tumeur.
Certaines évidences suggéraient la libération d'un ou de plusieurs facteurs angiogéniques par les cellules tumorales, bien que l'on n'ait pu écarter l'explication d'une dégradation d'un inhibiteur de l'angiogénèse par les cellules tumorales (Folkman et Klagsbrun, 1987). Il devient donc nécessaire de comprendre plus en détail la biologie de l'angiogénèse afin d'arriver à l'analyse biochimique du phénomène (Folkman et Klagsbrun, 1987).
1.2 Techniques dans l'étude de l'angiogénèse
Plusieurs techniques ont été mises au point dans le but de comprendre le phénomène de l'angiogénèse et d'élucider certains mécanismes de l'induction de
c
l
la prolifération des cellules endothéliales. Différents modèles de l'induction et du contrôle de l'angiogénèse ont été étudiés:
i) la technique de la micropochette cornéenne chez le lapin, surtout
utilisée pour vérifier l'effet angiogénique d'un produit (Gimbrone et al., 1974);
ii) les études sur les polymères biocompatibles dans le but de libérer des facteurs angiogéniques in vivo (Langer et Folkman, 1976); iii) la membrane chorioallantoïdienne, utilisée dans l'étude de fractions
d'extraits tumoraux purifiés (Auerbach et al., 1974; Crum et al., 1985); iv) la purification de facteurs de croissance
à
partir d'extraits provenant deculture de cellules endothéliales de veines ombilicales, d'aorte ou de capillaires (Folkman et Klagsbrun, 1987);
v) finalement l'induction de l'angiogénèse sur la rétine de lapin dans l'étude de la rétinopathie diabétique.
La technique que je vais approfondir est: la membrane chorioallantoïdienne
1.2.1 Membrane chorioallantoïdienne
Certains de ces modèles ont été utilisés dans l'étude de traitement antian-giogénique non toxique. Le principal fut la membrane chorioallantoïdienne sur lequel nous avons étudié l'effet de la combinaison de différents stéroïdes et du MTP.
c
l
Cette technique fort simple consiste au transfert d'embryons de poulets, âgés de trois jours, de l'oeuf dans une boîte de Petri. Il ne faut pas endommager la membrane chorioallantoïdienne une microdéchirure compromet grandement les chances de survie. Ces boîtes de Petri sont incubées pour 48 heures dans un incubateur
à
37°
c et 3à
5 % de C02 avant de leur appliquer un traitement.1.3 L'angiogénèse au niveau cellulaire
L'angiogénèse au niveau cellulaire a surtout été étudiée pour déterminer la séquence d'événements dans la croissance des capillaires ln Vivo. Cette for-mation de nouveaux capillaires proviendrait généralement de bourgeons de petits vaisseaux sanguins (Ausprunk et Folkman 1977), et aurait comme étape principale la dégradation locale de la membrane basale des vaisseaux parentaux, suivie du mouvement et de la prolifération des cellules endothéliales. Elles répondraient
à
une stimulation chimique (Ausprunk et Folkman 1977; Folkman et Klagsbrun, 1987). Les cellules endothéliales une fois dans l'espace interstitiel s'aligneraient de façon à créer un bourgeon solide. (Folkman et Klagsbrun, 1987; Moscatelli et Rifkin, 1988) L'apparition de la lumière serait due au recourbement de chaque cellule endothéliale donnant naissanceà
leur propre lumière (Ausprunk et Folkman 1977; Folkman et Klagsbrun, 1987). Lorsque deux bourgeons se rejoignent, ils se fusionnent et forment un capillaire où le sang pourra circuler. Par la suite, de nouveaux bourgeons se formentà
l'apex du capillaire, et ainsi de suite.(
Il existe donc trois étapes dans le phénomène de l'angiogénèse (Folkman et Klagsbrun, 1987; Pepper et al., 1990):i) la dégradation de la membrane basale; ii) la migration des cellules endothéliales;
iii) la prolifération des cellules endothéliales.
1.4 Contrôle de l'angiogénèse
Il serait donc possible de contrôler l'angiogénèse sur un de ces trois niveaux:
i) soit en bloquant la dégradation de la membrane basale, par
( l'utilisation d'un inhibiteur de la collagénase et des polysaccharide que l'on
retrouve dans la membrane basale;
ii) soit en empêchant la migration des cellules endothéliales, inhibant leur sortie dans l'espace interstitiel;
iii) soit en bloquant leur prolifération par des inhibiteurs de composantes du cycle cellulaire.
1.5 Enzymes impliqués dans l'angiogénèse
La première étape
à
franchir dans l'angiogénèse est la dissolution de la membrane basale des vaisseaux sanguins (Ausprunk et Folkman, 1977; Moscatelli et Rifkin, 1988). On explique la résistanceà
l'invasion du cartilage par la présence(
d'une forte concentration d'inhibiteurs des protéases de type sérine (Moscatelli et Rifkin, 1988; Folkman, 1990). Certaines observations minutieuses en microscopie optique ont permis d'étudier la migration des cellules endothéliales à travers la barrière de fibres de collagène. D'autres expériences ont consolidé ce point de vue en suggérant la nécessité d'enzymes protéolytiques durant l'angiogénèse (Moscatelli et Rifkin, 1988).1.5.1 Dégradation de la membrane basale
Plusieurs études ont démontré qu'à l'instar des cellules tumorales, les cellules endothéliales produisent un nombre élevé d'enzymes protéolytiques qui leur permettraient de dégrader la plupart des matrices extracellulaires et des membranes basales (Moscatelli et Rifkin, 1988).
Parmi ces enzymes, on retrouve l'activateur du plasminogène (VanHins-bergh et al., 1987; Moscatelli et Rifkin, 1988) et la collagénase de type IV (Mosca-telli et Rifkin, 1988; Herran et al., 1986). Cette collagénase se retrouve dans les cellules tumorales
à
un niveau plus élevé que dans les autres tissus (Moscatelli et Rifkin, 1988).L'activité de tous les enzymes est limitée par des inhibiteurs spécifiques, eux aussi synthétisés par les cellules. Celui que l'on rencontre le plus souvent est le PAl-1 (plasminogen activator inhibitor) sous deux formes, active et passive. Cette
c
(
l
protéase est celle qui est la plus souvent sécrétée dans les cellules endothéliales en culture(Moscatelli et Rifkin, 1988; VanMourik et al., 1984). La PAl-1 dans sa forme active inhibe tout aussi bien la t-Pa (tissue-type plasminogen activator) que la u-Pa (urokinase-type plasminogen activator) (Moscatelli et Rifkin, 1988; Van-Mourik et al., 1984).
Sous une stimulation, la cellule endothéliale pourrait augmenter la synthèse de différents enzymes résultant en la dégradation de la matrice extracellulaire. Le facteur de stimulation proviendrait de l'extérieur des cellules affectées et tout porte
à
croire que la cellule néoplasique en serait la source (Moscatelli et Rifkin, 1988).1.6 Les facteurs stimulants de l'angiogénèse
Parmi les facteurs qui stimulent l'angiogénèse, on retrouve le TGFa: et B
(transforming growth factor a: et B) et FGF (fibroblast growth factor)./n vitro TGFB
inhibe la croissance et la migration des cellules endothéliales en culture (Mosca-telli et Rifkin, 1988; Yang et Moses, 1990) et agit comme un régulateur de l'angiogénèse. Son activité angiogénique ln vivo serait indirecte; TGFB servirait de signal pour les monocytes, qui relâcheraient
à
leur tour les facteurs angiogéniques. (Wahl, 1987; Moscatelli et Rifkin, 1988). Pour TGFa il possède 35 % d'homologie avec le EGF, qui lui permet d'occuper le même récepteur, avec une affinité quasi identique (Moscatelli et Rifkin, 1988).(
(
Le FGF induit la croissance des cellules endothéliales, (Esch et al., 1985; Moscatelli et Rifkin, 1988) il a été étudié dans la stimulation de l'angiogénèse ln
vivo. On retrouve du FGF libre lors de la dégradation de la membrane basale, qui
agit comme un facteur endogène sur les cellules endothéliales.
D'où vient la source de stimulation de l'angiogénèse? La première possibilité serait que certains facteurs indirects mobiliseraient les macrophages et les stimuleraient
à
sécréter des facteurs de croissance (Folkman et Klagsbrun, 1987). La seconde possibilité consisterait en une libération de facteurs contenus dans la matrice extracellulaire stimulant les cellules endothéliales (Folkman et Klagsbrun, 1987). Une troisième possibilité consisterait en une libération de facteurs de croissance stockésà
l'intérieur des cellules endothéliales (Folkman etKlagsbrun, 1987).
Plusieurs patrons d'induction de l'angiogénèse peuvent exister, comme dans le cas des cellules tumorales qui pourraient sécréter leurs propres facteurs angiogéniques, leur association conditionnerait les cellules endothéliales
à
se détacher,à
migrer età
proliférer (Folkman et Klagsbrun, 1987).1. 7 L'importance de l'angiogénèse dans la néoplasie
Une meilleure compréhension des mécanismes de l'angiogénèse permettra d'entrevoir un contrôle possible de ce phénomène et de découvrir un traitement
c
(
agissant sur une des trois étapes de l'angiogénèse. Il deviendrait alors possible de contrôler, voire guérir des pathologies où l'angiogénèse est primordiale: la rétinopathie diabétique; l'arthrite rhumatoïde; la croissance des tumeurs solides, tel le sarcome de Kaposi multifocal rencontré chez des patients atteints du syndrome d'immunodéficience acquise.
Comme le rapporte Folkman, dans son article de 1990, les tumeurs sont limitées dans leur croissance
à
un stade de unà
deux millimètres de diamètre. Cependant, dès qu'il y a vascularisation, on observe une forte croissance du tissu néoplasique et son taux de croissance est inversement proportionnelà
la distance qui le sépare du plus proche capillaire (Folkman, 1986; Folkman, 1990).2. Moyens de contrer l'angiogénése
En 1962, les expériences de Folkman amenèrent
à
penser que la croissance tumorale pouvait être supprimée, si les tumeurs étaient gardées dans un état prévasculaire (Folkman et al., 1963). Il suffisait de connaître les détails de la croissance des capillaires, et surtout ce qui la contrôlait (Folkman, 1990). Dianna Ausprunk en 1977 a étudié des implants tumoraux et a effectué une série d'ob-servations au microscope électronique qui ont permis d'élucider les étapes séquentielles de la croissance d'un capillaire. Ces caractéristiques sont semblables quelle que soit la source de stimulation angiogénique:c
(
(
i) Les nouveaux capillaires émergent de petits vaisseaux dépourvus de muscles lisses;
ii) Sous l'influence d'un stimulus angiogénique, induit par exemple par une petite tumeur, les cellules endothéliales du vaisseau commencent à dégrader la membrane basale et se glissent dans l'espace interstitiel; iii) Leur migration permet l'alignement cellulaire et la formation du bourgeon;
iv) La prolifération se produit à l'intérieur du bourgeon et la lumière du Mur capillaire se forme par le recourbement des cellules;
vi) Le sang commence à circuler lorsque l'apex de deux bourgeons se fusion-nent pour former le capillaire;
vii) Finalement une nouvelle membrane basale est synthétisée.
Folkman, à partir de plusieurs travaux précédents, émet l'hypothèse selon laquelle les tumeurs relâcheraient continuellement des facteurs angiogéniques. Ces derniers stimulent la croissance des capillaires jusqu'à une distance de 2-5 mm (Folkman, 1990), qui a leur tour expriment un programme déterminé menant
à
la production de nouveaux vaisseaux sanguins.Folkman et collaborateurs, en 1989, rapportent que l'angiogénèse précèderait la formation de la tumeur, et résulterait de l'hyperactivité cellulaires des tissus prétumoraux. Des essais ln vitro sur l'hyperplasie ont démontré que l'angiogénèse n'est pas obligatoire à la croissance tumorale. Cependant ln vivo les deux sont inséparables (Folkman et al., 1989).
(
2.1 Traitement antiangiogéniqueLes tumeurs solides induisent une angiogénèse persistante, contrairement
à
ce qui est observé dans les tissus normaux, où l'angiogénèse se limite par elle-même. Le système circulatoire est le même dans les deux cas, avec la particularité dans les tissus néoplasiques de deux types de vaisseaux, que l'on ne retrouve pas dans les tissus normaux. Il s'agit des bourgeons de capillaires et des canaux sinusoïdes, ces derniers sont formés de cellules endothéliales et de cellufes tumorales (Jain R.K. 1988).L'angiogénèse est contrôlée par les tissus normaux, et ne se manifeste que dans des cas particuliers. La perte de ce contrôle résulte en une hyperactivité des cellules endothéliales, qui résulte en une hyperplasie
à
long terme. Notre hypothèse est que le développement d'un traitement antiangiogénique n'aurait que très peu d'impact sur les tissus normaux puisque l'angiogénèse y est inexistante. L'absence d'angiogénèse dans les tissus normaux permettrait le contrôle de l'an-giogénèse par des substances antiangiogéniques dans les tissus tumoraux, sans affecter les cellules endothéliales normales (Benrezzak et al., 1989).Le problème du contrôle de l'angiogénèse demeure entier, aucune solution applicable chez l'homme n'est encore disponible, plusieurs observations ont cependant été rapportées. En effet, la combinaison d'héparine et de cortisone permet d'arrêter l'angiogénèse (Folkman et al., 1983), la toxicité de ces produits
(
l
nous laisse peu d'espoir face à son utilisation en clinique. La recherche de produits non toxiques pour remplacer la cortisone et l'héparine est déjà en route et des études sur la combinaison de différents stéroïdes avec l'héparine ont déjà été faites sur la membrane chorioallantoïdienne (Crum et al., 1985).
Sandor Szabo avait, en 1985, suggéré que l'activité antiangiogénique de la cortisone était indépendante de l'activité glucocorticoïde. Cette hypothèse fut vérifiée en 1986 par Folkman, qui a utilisé un isomère inactif de l'hydrocortisonele le 11 a-épicortisol. Le groupement hydroxyle en position 11 est sous le plan de la molécule, contrairement à la cortisone où il est au-dessus du plan. En présence d'héparine, il bloque l'angiogénèse de la membrane chorioallantoïdienne du poulet (Folkman, 1986). Selon eux, la nécessité d'avoir une activité glucocorticoïde ou minérale-corticoïde n'a pas de liens semble-t-il sur l'effet antiangiogénique noté (Crum et al., 1985; Crum et Folkman, 1984; Folkman, 1986).
Nous avons donc voulu approfondir certaines expériences en utilisant le MTP, qui a déjà fait l'objet d'études dans le laboratoire du Dr Nigam depuis plusieurs années, en combinaison avec différents stéroïdes.
2.2 MTP combiné avec différents stéroïdes
Une thérapie antiangiogénique, essayée sur des animaux de laboratoire, consistant en une combinaison de stéroïdes angiostatiques et du maltose
(
tétrapalmitate (MTP),substance développée par l'équipe de Nigam et al. (Benrez-zak et al., 1989; Madarnas et al., 1989), a prouvé qu'elle était un des meilleurs agents de contrôle de la croissance tumorale. Il a de plus l'avantage de ne pas être toxique et d'être applicableà
la suite de traitements conventionnels. Il réduit la taille de la tumeur et affecte aussi les résidus tumoraux et métastatiques.L'utilisation thérapeutique de l'antiangiogénèse chez l'humain n'est pas encore commencée. Les difficultés majeures
à
résoudre pour l'instant sont le choix d'un stéroïde angiostatique non toxique et le moyen de détruire les résidus tumoraux restant,à
la suite du traitement antiangiogénique stéroïde-MTP.3. Objectifs
1- Faire l'étude des modèles sur l'angiogénèse de la membrane chorioallan-toïdienne et de la rétine de lapin. Ensuite contrôler l'angiogénèse présente dans ces modèles par des traitements contre la prolifération, tels que la combinaison de MTP-stéroïdes.
2- Trouver une combinaison où la cortisone serait remplacée par un stéroïde moins toxique.
(
li-INTRODUCTION SUR LE MODELE DU SARCOME DE KAPOSI 1. Le SIDALe SIDA fut caractérisé initialement au "Center for Disease Contrai, Atlanta U.S.A.", premièrement par la forte présence de la forme épidémique du sarcome de Kaposi et deuxièmement par la présence accrue d'infections opportunistes. La découverte du virus d'immunodéficience humaine (VIH), chez les patients atteints du SIDA, était en relation directe avec le développement de l'immunosuppression et s'accompagnait d'infections opportunistes.
Les patients dont l'état immunitaire est réduit, (sidéens, greffés rénaux, etc.) développent une série d'infections opportunistes que l'on ne trouve que très rarement dans la population. Ce sont des infections latentes acquises durant l'en-fance et qui se manifestent lors de la chute du système immunitaire. Elles possèdent deux caractéristiques principales: elles sont plus agressives et leur nombre est plus élevé que dans la population en générale (loachim, 1990).
Dans le cas des tumeurs associées au SIDA, le patron est semblable et les plus fréquemment rencontrées sont les sarcomes de Kaposi et les lymphomes non-Hodgkin, ces deux types de tumeurs sont généralement très rares dans la population (loachim, 1990).
(
(
1.1 Le sarcome de Kaposi (S. K.)
Décrite par le Dr Moriez Kaposi en 1872, cette pathologie consiste en un sarcome multifocal pigmenté et idiopathique. Elle affecte principalement les hommes (on n'en dénombre que quelques rares cas chez la femme) et affecte les tissus vasculaires (Harawi, 1989). C'est le résultat d'une prolifération démesurée des cellules endothéliales, cette maladie affecte surtout le derme des extrémités. Chez les sidéens cependant, on peut la retrouver dans tous les organes et elle ne semble pas se limiter
à
aucun de ceux-ci en particulier.Selon la forme, la néoplasie est plus ou moins agressive, varie d'un patient
à
l'autre et dépend surtout de l'état général de ce dernier. La forme la plus agressive se retrouve chez les sidéens homo\bisexuels mâles et ce, même si le nombre de patients atteints du sarcome de Kaposi a tendanceà
diminuer depuis 1983 (Friedman-Kien et al., 1990).1 . 1.1 Forme classique
C'est l'une des formes de cancers la plus rare rencontrée chez l'humain. Elle ne constitue que 0.06 % de tous les cancers rencontrés dans la population normale (Yang et Moses, 1990; Penn, 1986). Ce cancer se rencontre chez les personnes âgées d'origine juive habitant la région méditerranéenne et portant l'allèle HLA-DR5 (Siegel et al., 1969; Harawi,1989; Volberding, 1989). Il semble
c
(
(_
que ce soit un cancer des cellules endothéliales des vaisseaux lymphatiques, sanguins ou les deux. Plusieurs études se contredisent
à
ce sujet. Cependant plus d'études parlent de l'implication des cellules endothéliales originant du système sanguin (Harawi, 1989). On peut retrouver chez ces patients des lymphomes, mais statistiquement, la présence des deux cancers est très rare et seule quelques cas ont été rapportés.1.1.2 Forme endémique
Une autre forme de sarcome de Kaposi est rencontrée en Afrique équato-riale dans la ceinture de la malaria endémique. Cette forme de sarcome de Kaposi est confinée, elle aussi, aux extrémités des membres comme la forme classique. Toutefois, elle est plus avancée et les lésions sont nodulaites, lymphoadéno-patiques, infiltrées et ses formes sont plus agressives que la forme classique. Cette forme de cancer existe dans cette région depuis 1960 (et probablement avant) et constitue 9 % de la totalité des cancers qui y sont rencontrés (Friedman-Kien et al., 1989).
Dans les régions centrales et australes de l'Afrique, il semble que les lymphomes de Burkitt et le sarcome de Kaposi africain sont les deux formes majeures de cancer. Le sarcome de Kaposi africain diffère de la forme classique puisqu'il touche une classe plus jeune d'individus sexuellement actifs, âgés de 25
à
44 ans (Volberding, 1989).c
(_
1.1.3 Forme iatrogénique
Cette forme de sarcome de Kaposi est rencontrée et décrite chez les patients qui ont subi une transplantation rénale. On note une augmentation de l'incidence chez ceux qui ont reçu des traitements immunodépressifs tels que l'azathioporine, la prednisone et les sérums antilymphocytaires (Siegel et al. 1969; Friedman-Kien, 1990). Cependant, la pathologie la plus fréquemment observée chez ces patients est le lymphome; le rapport est de 31 :3 face au sarcome de Kaposi (Penn, 1986).
1.1 .4 Chez les femmes et les enfants
Il est intéressant de noter que, dans les trois formes précédentes de sarcome de Kaposi, les femmes sont l'un des deux groupes les moins touchés avec une incidence de 3
à
7% et que le groupe le moins touché sont les jeunes de 1à
16 ans dont l'incidence est en deça de 3 % (Harawi, 1989)1.1 .5 Forme épidémique
La forme du sarcome de Kaposi observée chez les sidéens est la forme épidémique. Elle est différente de la forme classique par l'étendue systémique de la néoplasie, sa forme plus agressive, ainsi que par l'état d'immunosuppression rencontré chez les patients atteints.
(
Dans les années 1979à
1981, on note l'apparition d'une forme plus virulente et épidémique du sarcome de Kaposi parmi les mâles homo /bisexuels. Ceux-ci possèdent un nombre réduit de cellules T auxiliaires, et seront par la suite classifiés dans la catégorie patients atteints du SIDA ayant contracté le VIH.Le sarcome de Kaposi associé au SIDA fut considéré à l'état épidémique entre les années 1979 et 1989, en atteignant 42 % des mâles homo/bisexuels VIH positifs en 1983. Il chute ensuite aux environs de 13 % en 1988 (Friedman-Kien et al., 1990) et reste stable
à
15 % depuis mars 1989 (Serai et al., 1990). Cependant, pendant cette même période, les critères d'admission des cas dans la catégorie SIDA ont été élargis par le CDC.On explique aussi la chute du nombre de cas chez les patients sidéens homo\bisexuel, par le changement des moeurs et des pratiques sexuelles. Ainsi, ils auraient un nombre moins élevé de partenaires sexuels et utiliseraient des moyens de protection lors des relations génito-anales, de façon
à
réduire les risques de transmission du VIH (Friedman-Kien, 1990).Selon Friedman-Kien en 1990, ceci expliquerait la chute dans la transmission du HIV par voie sexuelle chez les homo/bisexeul mâles, mais non la chute du sarcome de Kaposi dans ce même groupe.
(
(
l
1.2 Distribution du sarcome de Kaposi
Le sarcome de Kaposi épidémique ne se limite pas au derme des extrémités des membres inférieurs, ni
à
la peau, comme rencontré dans la forme classique. Les lésions épidémiques du sarcome de Kaposi peuvent être observées dans les viscères, tout particulièrement dans la cavité anale, le tractus intestinal, le foie, les poumons, les ganglions lymphatiques, ainsi que dans la rate. Le VIH s'attaque aux lymphocytes et cause leur diminution, ce qui résulte en une chute de l'état immunitaire.Les capillaires sanguins forment des foyers de sarcome de Kaposi sur plusieurs régions du corps. Ces foyers peuvent être sporadiques ou multiples et distribués sur tout le corps. Il y a transformation des cellules endothéliales partout dans le corps (Friedman-Kien, 1982).
1.3 Etiologie du sarcome de Kaposi associé au SIDA
Il semble que l'état immunitaire des patients atteints de la forme classique ou africaine du sarcome de Kaposi soit impliqué dans le développement du cancer. Les deux groupes de patients ont une réponse immunitaire faible lors de l'injection d'antigènes dans le derme et lors de la stimulation lymphocytaire, ainsi qu'un taux d'immunoglobuline élevé dans le sérum. Le taux élevé d'IG serait la
(
l
conséquençe d'une activation polyclonale des lymphocytes B par un antigène, probablement un polysaccharide d'une bactérie ou d'un protozoaire.
:. ~ ~ ··-~On n.e s'explique pas l'étiologie du sarcome de Kaposi, puisque le génome
.duv.in:is:VlH: n'a pas été détecté dans les cellules tumorales (Bovi et al., 1986). De 'fDlus- ·J!iFlcidence est presque exclusive aux hommes homo/bisexuels, si on la compare aux autres groupes
à
risque, positifs pour le VIH (Haverkos et Drotman,1985)_ . .
-1.3.1 lmmunosuppression
L'état immunitaire des patients affectés par le sarcome de Kaposi épidémique est toutefois supérieur
à
celui rencontré chez les patients sidéens qui développent des infections opportunistes (Phillips et al., 1991). En général, les patients sidéens ont un rapport T4/T8 qui a tendanceà
diminuer avec l'avance-ment de la maladie (loachim H.L. et al., 1990). Les patients VIH positifs dévelop-pent des infections opportunistes lorsqu'ily
a une chute abrupte dans le nombre des cellules T circulant dans le sang, tandis que les cas de sarcome de Kaposi se développent si la chute de ces lymphocytes est moins rapide (Phillips et al., 1991).Un sidéen affecté par un sarcome de Kaposi pourra plus tard développer des infections opportunistes. Le contraire est plutôt rare, où des patients affectés d'infections opportunistes développent un sarcome de Kaposi. Les patients qui
(
(
l
développent des infections opportunistes ne survivent pas assez longtemps pour permettre le développement du sarcome de Kaposi, ces derniers succombent rapidement
à
leurs infections (Phillips et al., 1991).1.3.2 L'utilisation de nitrites (poppers)
Le facteur causant le sarcome de Kaposi n'a pas encore été identifié, cependant, dans plusieurs articles, les auteurs font allusion à l'utilisation de substances nommées nitrites organiques en grande quantité chez les mâles homo\bisexuels ayant développé par la suite un sarcome de Kaposi (Haverkos et al., 1985; Friedman-Kien et al. 1982). Ces substances illégales ont déjà été utilisées dans l'industrie de la viande (nitrites inorganiques) où elles ont été interdites à la suite des recherches démontrant leur toxicité. Elles étaient aussi prescrites dans certains cas de problèmes cardiaques, avant d'en voir l'interdiction. Toutefois, aucun sarcome de Kaposi n'a été rapporté chez les patients qui avaient reçu des traitements avec ces substances.
Ces substances sont des drogues qui ont comme propriété le relâchement des muscles lisses des sphincters, dont le sphincter anal. Un des rôles suggérés pour ces gaz serait des effets encore inconnus sur les vaisseaux sanguins qui agiraient en promoteurs du sarcome de Kaposi (Haverkos et al., 1985). Les dérivés nitrés de ces amyle, butyle nitrites (Haverkos et al., 1985) pourraient être
(
(
des substances carcinogènes induisant la prolifération directe ou indirecte des cellules endothéliales des vaisseaux sanguins.
1.3.3 Infection multiple aux MTS
Le VIH est transmis par des contacts sexuels non protégés ou par l'utilisation de seringues souillées, échangées entre une personne infectée et une personne saine. Plus le nombre de partenaires est élevé plus les chances d'infec-tion augmentent. Les mâles homo/bisexuels ont généralement une histoire médicale de multiples et répétitives maladies transmises sexuellement (MTS) (syphilis, gonorrhée, herpès génital, etc.) (Friedman-Kien et al., 1990 et 1982), d'infections virales (hépatite A et B, etc ... ) (Haverkos et al., 1985), d'infections parasitaires intestinales et surtout une utilisation très élevé d'amyle et/ou butyle nitrite (poppers) (Friedman-Kien et al., 1990 et 1982). Leur état immunitaire n'est pas affaibli au point de ne pas survivre aux infections survenant avant l'infection au VIH et au développement d'un sarcome de Kaposi.
Puisque le SIDA semble avoir été transmis par les contacts hétérosexuels chez les Africains, il pourrait y avoir une MTS impliquée dans sa transmission. Dans ces régions, on note une forte association entre les personnes atteintes du SIDA et leurs antécédents de plusieurs MTS répétitives. Les MTS facilitent la pénétration du virus par les lésions qu'ils occasionnent dans la peau et dans les muqueuses (Volberding, 1989).
(
1.3.4 Relations homo/bisexuellesIl a été suggéré que l'agent causal du sarcome de Kaposi soit d'origine africaine. Certains suggèrent que la transmission jusqu'en Amérique du Nord proviendrait d'immigrants des Cara·1bes par des contacts homosexuels. Cette voie expliquerait la propagation parmi les groupes homo/bisexuels (Beral et al., 1990).
La transmission, par les mâles bisexuels, de l'agent causal occasionnerait une incidence de seulement 7 à 1 O % du sarcome de Kaposi chez les femmes (Serai et al., 1990).
Toutefois, des données ont démontré que l'incidence du sarcome de Kaposi, chez les femmes ayant contracté le VIH par contacts bisexuels, est quatre fois plus élevée que chez celles l'ayant contracté par l'utilisation de seringues souillées lors de l'injection intraveineuse de drogue. (Beral et al., 1990).
1.3.5 Autres agents causals
Il est possible aussi qu'un agent étiologique, autre que le VIH existe chez les homo\bisexuels atteinds du sarcome de Kaposi, et que seule cette partie des patients VIH séropositifs y soient exposés (Beral et al., 1990). Si un tel agent existe réellement, il est probablement transmis par des voies relativement semblables à celles déjà connues pour le VIH, principalement par la voie sexuelle dans la semence, puisque les autres groupes
à
risques VIH séropositifs tels que les(
(
utilisateurs de drogues, les transplantés, les hémophiles ont une incidence plus faible de l'ordre de 3 % (Serai et al., 1990).
Il existe d'autres hypothèses qui stipulent que l'agent causal des pathologies associées au SIDA, telles que le sarcome de Kaposi et les lymphomes, soit un virus endogène dans la population en général qui deviendrait cancérigène à la suite de l'état immunosuppressé des patients. Si c'était vrai, le sarcome de Kaposi épidémique et les lymphomes seraient retrouvés dans les même proportions dans les autres groupes à risques pour l'infection au VIH (Serai et al., 1990). Il a été suggéré qu'un autre agent, susceptible d'être le cofacteur, serait absent chez les hétérosexuels (Volberding et al., 1990).
Enfin, plusieurs ont suggéré que le CMV serait probablement l'agent causal du sarcome de Kaposi. Aucune étude de génie génétique sur le génome des cellules du sarcome de Kaposi, n'a pu prouver la présence de séquences du CMV, ni d'autres virus connus tels que le virus de l'herpès , le virus ES, le virus VIH, ou le virus papilloma.
1 .4 Thérapies dans les cas de sarcome de Kaposi
Jusqu'à ce jour, aucun traitement ne peut-être considéré curatif dans tous les cas du sarcome de Kaposi. Plusieurs thérapies sont utilisées selon le type, le stade, et la localisation des lésions. Dans le cas du sarcome de Kaposi classique,
c
(
les lésions sont habituellement localisées et facile d'accès. Le traitement consiste en une excision chirurgicale des lésions, suivie d'un traitement radiothérapeutique, de façon
à
enrayer toute réapparition des lésions. Ce traitement est efficace sur des lésions en petit nombre qui nuisentà
Javie quotidienne ouà
l'esthétique.Dans le cas du sarcome de Kaposi associé au SIDA, les lésions sont dispersées sur la totalité du corps, dans les viscères et plusieurs lésions primaires sont difficilement visibles. Il est quasi impossible de traiter de la même façon ces lésions. Plus souvent qu'autrement, le médecin recommande des traitements chimiothérapeutiques avec deux agents différents ou en combinaison avec la radiothérapie. Cependant les résultats sont loin d'être enviables, l'efficacité demeure en deça de 50 % et dans la majorité des cas, le traitement aggrave l'état immunitaire du patient le rendant très susceptible aux infections opportunistes (Friedman-Kien, 1988).
D'autres méthodes thérapeutiques peuvent être utilisées tel l'interféron a, dont les effets secondaires sont
à
considérer même avec des patients peu immunosuppressés.Il serait utile d'avoir un modèle animal qui mimerait avec précision le sarcome de Kaposi humain associé au SIDA, qui pourrait seNir
à
effectuer différents tests pour trouver le traitement le plus efficace avec le moins d'effets secondaires.(
2. Les modèles animaux dans la recherche sur le VIHPour l'instant, aucun modèle véritable n'a été mis sur pied dans l'étude du SIDA. Tout d'abord il faut se souvenir que le VIH n'infecte que 2 espèces connues soit l'homme et le chimpanzé (Baum, 1989), même si deux équipes, l'une italienne et l'autre américaine, ont rapporté dernièrement l'infection du lapin par le VIH (Filice et al., 1988). Parmi ces trois espèces, seul l'homme développe une maladie
à
la suite de l'infection par le virus (Baum, 1989).Les souris SCID (severe combined immunodefiency) sont un modèle intéressant dans l'étude du SIDA, elles sont dépourvues en totalité d'activité des lymphocytes T ou B. Elles n'ont aucune possibilité de réponse cellulaire ou humorale fasse
à
un antigène, et normalement meurent très jeunes d'infections opportunistes. Des greffes de tissus foetauxhumains ont été effectuées sur ces souris; rate, thymus, foie et ganglions lymphatiques, par la suite elles ont été infectées avec le virus VIH. Le virus s'est implanté dans les tissus lymphoïdes humains, où l'on observe de la réplication virale (Mosier et al., 1988).
Dernièrement, lors de l'implantation chez la souris SCID du VIH plus haut mentionné, des modifications ont été acquises par le virus lors de sa réplication chez son nouvel hôte. En effet, le contact d'un virus endogène commun de la souris, le MuLV (Murine leukemia virus) a permis au VIH de modifier l'information
(
qu'il détenait. Ces nouvelles informations lui ont permis de se multiplier plus rapidement et d'infecter de nouvelles cellules (Mosier et al., 1988). Pour l'instant, il ne semble pas avoir acquis l'information qui pourrait modifier sa voie d'entrée. Cette nouvelle souche de VIH a modifié les limites des expériences avec le VIH, puisque l'utilisation du VIH dans à grande échelle des animaux pourra occasionner des problèmes le rendant plus dangereux.
D'autres modèles n'utilisant pas le VIH sont déjà à l'étude et, dans cette catégorie, on retrouve le FeLV (feline leukemia virus) et le MAIDS (murine AIDS). Ce dernier comporte plusieurs caractéristiques que l'on rencontre dans l'infection au VIH chez l'humain (Mosier et al., 1985). Des expériences avec différentes substances thérapeutiques telle l'AZT (Basham et al., 1990) ont permis de constater la ressemblance du MAIDS au SIDA. Ce sont deux virus appartenant à deux classes différentes, c'est-à-dire lentivirus pour le VIH et rétrovirus pour LP-BM5 (Friedman-Kien,A.E. 1988).
2.1 Modèle animal dans l'étude du SK
La recherche pour élucider l'agent causal du sarcome de Kaposi associé au SIDA sera longue et difficile, il est donc nécessaire d'avoir un modèle animal sur lequel l'on pourra vérifier l'efficacité de nouveaux médicaments. Les critères de sélection sont les suivants: premièrement, les animaux doivent avoir un état
(
(
d'immunosuppression semblable
à
ce que l'on retrouve chez les sidéens et, deuxièmement, comporter des lésions semblables au sarcome de Kaposi.2.1.1 Historique
Parmi les substances non virales qui induisent la néoplasie des cellules endothéliales, le diméthylhydrazine (DMH) en est un, l'autre étant le chlorure de vinyle (Toth et Wilson, 1971). Le DMH était au début utilisé comme inducteur de tumeurs du colon (Bolognesi C. et al., 1988), l'équipe du Dr Nigam a observé que le DMH provoque l'apparition d'angiosarcomes après 30 semaines d'injections hebdomadaires (Benrezzak et al., 1987).
2.1 .2 Angiosarcome expérimental
Benrezzak et al ont noté chez la souris CD1, traitée au DMH pour 30 semaines, suivie par un traitement au DFMO, une augmentation du taux de survie des animaux. De plus, l'incidence des angiosarcomes était plus élevée chez les animaux traités au DMH
+
DFMO, puis que la cause de mortalité principale, c'est-à-dire les tumeurs colorectal était réduite, ce qui donnait le temps de développer les angiosarcomes. (Benrezzak et al., 1987). Le groupe Nigam, qui a étudié le site d'apparition des angiosarcomes, ainsi que leur pathologie, a vérifié l'état immunitaire des souris traitées au DMH. Ces souris ne comportaient que peu d'immunosuppression comme l'avait déjà décrit Szakal et al. en 1980.c
(
Suite à nos expériences avec le DMH sur des souris C57BL/6, nous avons donc décidé d'injecter ces souris avec une suspension d'un virus, le LP-BM5, pour augmenter leur état d'immunosuppression. Nous avions déjà en notre possession un modèle d'angiosarcome semblable au sarcome de Kaposi, il ne nous restait plus qu'à diminuer l'état immunitaire de façon à le rapprocher de celui des patients sidéens.
3. Projet MAIDS
La lignée irradiée du virus de la leucémie murine produite par Laterjet-Duplan (MuLV) est différente de la plupart des autres virus puisqu'elle induit un lymphome chez la souris de type non thymique plutôt que thymique (Mosier et al., 1985). Cette équipe a extrait, de la moelle osseuse des souris C57Bl/6 infectées avec le MuLV, le virus LP-BM5 ayant des propriétés immunosupressives.
3.1 Le virus LP-BM5
Le LP-BM5 après avoir porté plusieurs autres noms, fut finalement nommé LP-BM5 pour "lymphoproliferative-bone marrow #5" (Mosier et al., 1985; Mosier et al., 1987). Il n'infecte que deux types de souris, la souris C57Bl/6 et la BL/10, où il induit une forte immunosuppression. Lorsque l'on infecte des jeunes souris adultes avec ce virus, celles-ci développent une lymphoadénopathie et une
c
(
splénomégalie proliférative rapide et meurent avec une hypertrophie massive de ces tissus (Mosier et al., 1985; Mosier et al., 1987).
Les lésions observées chez ces animaux ne sont pas néoplasiques mais semblent provenir d'une réponse immunitaire de l'hôte face au virus. Mosier et collaborateurs rapportent dans leur article sur la lymphoprolifération que l'injection de la suspension virale chez les souris C5781/6 cause une rapide induction de la prolifération cellulaire, non seulement des lymphocytes B, mais aussi des lymphocytes T, et des cellules lymphoïdes non T, non B (Mosier et al., 1985; Mosier et al., 1987).
Les cellules B montraient des évidences d'activation polyclonale, dont plusieurs produisaient des anticorps. Au début, on note une brève période d'augmentation immunitaire, qui est suivie d'une profonde immunosuppression qui affecte tous les aspects de l'immunité cellulaire et humorale (Mosier et al., 1985; Mosier et al., 1987).
3.2 Pathologie induite par le virus LP-BM5
La pathologie induite par l'injection du virus LP-BM5 chez les souris C57Bl/6 possède plusieurs caractéristiques correspondant
à
une infection rétrovirale murine. Premièrement, l'infection par le virus LP-BM5 induit une lymphoprolifé-ration, telle que postulée par Pattengale et collaborateurs en 1982 et non un(
(
lymphome malin des cellules B. Deuxièmement, l'injection néonatale de la suspen-sion virale n'est pas nécessaire
à
l'induction de la maladie. Troisièmement, la lymphoprolifération et l'immunosuppression débutent presque sans période de latence. Quatrièmement, le degré d'immunosuppression est tel qu'après quatre semaines d'infection, pratiquement aucune activité immunitaire n'est détectable. Cinquièmement, le mécanisme d'immunosuppression pourrait être unique, particulièrement dans l'activation des lignées cellulaires 8, où la plupart des cellules étaient impliquées dans l'activation polyclonale vers la maturation et la production d'anticorps. Finalement, le mécanisme d'activation pourrait être dépendant de la présence de lymphocytes T impliqués dans l'activation des cellules B (Mosier et al., 1985).Il semblerait que l'immunosuppression observée chez ces animaux soit causée par l'induction de l'activité polyclonale des lymphocytes, qui résulterait en une perte d'activité des lymphocytes B. Cette dernière semble reliée
à
l'activité des lymphocytes T suppresseurs. Cependant, aucune preuve formelle ne prouve que ceux-ci soient la cause directe de l'impossibilité des lymphocytes B à se multiplier (Mosier et al., 1985). Toutefois, les lymphocytes B in vitro semblent conserver leur propriété de production d'anticorps spécifiques (Mosier et al., 1985; Klinman et Morse, 1989), comme le prouvent les résultats de PFC (plaque forming cell) avec les globules rouges de moutons (Mosier et al., 1987; Klinman et Morse, 1989).c
La
multiplication des virus dans l'organisme serait dépendante de la présence de lymphocytes T. De plus le développement complet du virus nécessite-rait un processus impliquant une association entre les lymphocytes T et B (Mosier et al., 1985; Cerny et al., 1990).3.3 lmmunosuppression induite par le virus
Ce qui est intéressant selon l'article de Mosier et al. en 1985, c'est le rapprochement qu'ils ont fait avec le SIDA. On retrouve les mêmes symptômes que dans la première phase du SIDA soit, une lymphoadénopathie, une hyper-gammaglobulinémie et l'activation polyclonale des cellules B du système immuni-taire (Mosier et al., 1987; Klinman et Morse, 1989) ainsi que la susceptibilité aux infections opportunistes (Yetter et al., 1988). Selon eux, il se pourrait que les derniers stades de l'infection au LP-BM5 ressemblent davantage au syndrome d'immunodéficience acquise humain, si les souris étaient soumises aux mêmes ni-veaux de pathogènes que le sont les personnes
à
risques (Mosier et al., 1985).L'on sait que le virus VIH utilise les lymphocytes T auxiliaires par l'intermé-diaire de leur récepteur CD4
+
pour se multiplier et activer indirectement les cellules B (Mosier et al., 1987). Dans le cas du LP-BM5, l'infection diminue l'activité des lymphocytes T auxiliaires, cependant, il n'est pas encore connu si l'altération dans les cellules Test reliéeà
l'activité polyclonale des cellules B (Mosier et al., 1987; Yetter et al., 1988 ).c
(
l
Des expériences, par Yetter et Morse sur la réplication du virus LP-BM5 chez des souris sélectionnées pour leur déficience en L3T 4 + , ont montré la non-susceptibilité de ces souris
à
développer les symptômes du MAIDS (Murine AIDS), confirmant le rôle des cellules T auxiliaires dans la réplication du virus (Mosier et al., 1987; Yetter et al., 1988).Des expériences sur l'utilisation d'anticorps dirigés contre le marqueur des cellules T auxiliaires, nommé L3T4+ chez la souris, ont prouvé que l'élimination de ces récepteurs avant l'infection rendait les souris pratiquement résistantes
à
l'infection par le virus LP-BM5, et que l'élimination de ces récepteurs après l'infection diminuait fortement les symptômes que l'on retrouve dans l'infection au virus LP-BM5 (Yetter et al., 1988; Morse et al., 1988).L'hypothèse s'avère donc que le modèle MAIDS serait un modèle très inté-ressant dans l'étude comparative du SIDA et d'autant plus intéinté-ressant grâce aux coûts moins élevés de la recherche avec des souris. De plus, des études avec le virus LP-BM5 et l'AZT ont amené des résultats très intéressants. Les souris premièrement infectées par le virus et ensuite traitées
à
l'AZT, exprimaient des titres réduits du virus. Le traitement retarderait l'inactivité immunitaire et prolonge-rait la vie des animaux tprolonge-raités (Basham et al., 1990).(
(
l
3.4 Le virus LP-BM5 et le sarcome de Kaposi
Les souris injectées avec le virus LP-BM5 ne développent cependant pas de sarcome de Kaposi. Notre hypothèse est de rapprocher le modèle encore plus près de la réalité du SIDA en injectant aux souris traitées pendant 20 semaines au DMH, le virus LP-BM5. Nous voulions obtenir des souris fortement immunosup-pressées et porteuses d'angiosarcomes semblables au sarcome de Kaposi épidémique.
Nos résultats sur ce modèle pourront vraisemblablement aider
à
l'établisse-ment d'une thérapie antiangiogénique sur le contrôle, des foyers multifocaux du sarcome de Kaposi associé au SIDA.4. Objectifs
1- Pour faire suite aux recherches sur l'angiosarcome expérimental, nous voulons étudier différentes combinaisons de MTP-stéroïdes, de façon
à
contrôler la croissance des angiosarcomes induits par le DMH.(
(
l
2- Utiliser le virus LP-BM5 chez les souris traitées au DMH, pour mimer l'état immunitaire rencontré dans les patients atteints du SIDA, ainsi que la pathologie néoplasique du sarcome de Kaposi dans le but de développer un modèle peu coûteux de sarcome de Kaposi sur lequel différents traitements pourront être étudié. Ce modèle servira de contrôle préliminaire, avant l'utilisation des médica-ments en phase clinique sur les patients sidéens.
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Ill-MATERIEL ET METHODES SUR L'ANGIOGENESE
1. La membrane chorioallantoïdienne
Les oeufs ont été achetés au Couvoir Humbert inc. (1714 King Est, Sherbrooke) et étaient âgés de 3 jours. Au couvoir, les oeufs ont été gardés dans un incubateur automatique
à
42°
c qui tournait les oeufsà
toutes les heures. Ils ont été transportés en voiture du couvoir au laboratoire dans une boîte de carton de façonà
conserver la température le plus près possible de 37°
c.1. 1 Culture des embryons
Comme décrit par Auerbach et al. en 1974, les oeufs fertilisés de trois jours furent lavés avec une solution diluée de formaldéhyde (1 :4000), et séchés
à
l'air. Ils étaient ensuite badigeonnés avec de la providone-iodine (Bétadine). On laissait reposer quelques minutes les oeufs sur le flanc, de façonà
permettre aux embryons de se positionner dans la partie supérieure de la coquille. Dans une boîte de Petri on ajoutait 5ml de solution saline physiologique (PBS) avant de transférer l'embryon. La coquille fut fracturée en la frappant délicatement dans sa partie inférieure sur le côté de la boîte de Petri, on ouvrait ensuite la coquille. On ne conservait que les embryons dont la membrane chorioallantoïdienne n'était pas endommagée. Cette boîte de Petri était déposée dans une seconde plus grande,c
(
contenant une fine couche d'eau pour conserver l'humidité. Les embryons sont incubés
à
37°C et 3à
5 % C02.Note de l'auteur: L'annexe 5 contient de plus amples informations sur les produits utilisés.
1.2 Disques de méthylcellulose
Les disques de méthylcellulose étaient déposés
à
la surface de la membrane chorioallantoïdienne et servaient de véhicule aux substances étudiées, ce qui permettait de localiser les traitementsà
la surface de la membrane chorioallantoïdienne.Comme décrit par Crum et al en 1985, nous faisions une solution de méthylcellulose
à
0.45 % en diluant le méthylcellulose de la compagnie Sigma avec de l'eau distillée. Cette solution était autoclavée pendant 30 minutes,à
121°c (181bs/p2 ) , ensuite agitéeà
4°c pendant 48 heures (annexe 3).Les manipulations suivantes ont eu lieu dans un milieu stérile. Les substances
