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Lactococcus lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis UL719 et la nisine : une nouvelle approche dans le traitement des infections à Clostridium difficile

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Academic year: 2021

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Lactococcus lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis

UL719 et la nisine : une nouvelle approche dans le

traitement des infections à Clostridium difficile

Thèse

Christophe Le Lay

Doctorat en sciences et technologie des aliments

Philosophiae doctor (Ph.D.)

Québec, Canada

(2)

Lactococcus lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis

UL719 et la nisine : une nouvelle approche dans le

traitement des infections à Clostridium difficile

Thèse

Christophe Le Lay

Sous la direction de :

Ismaïl Fliss, directeur de recherche

Marc Ouellette, codirecteur de recherche

(3)

iii

Résumé

Clostridium difficile est le microorganisme le plus fréquemment identifié dans les pathologies entériques pour des patients souffrants de coliques pseudomembraneuses et de diarrhées associées aux antibiotiques. Les drogues les plus communément utilisées pour traiter les maladies associées à C. difficile sont limitées au métronidazole et à la vancomycine puisque de nombreuses souches isolées cliniquement de C. difficile sont résistantes à de nombreux antibiotiques couramment utilisés pour traiter des infections à bactéries Gram positif. La recherche de nouveaux traitements pour limiter l’incidence de C. difficile demeure une urgence pour le secteur de la santé. L’usage de probiotiques, particulièrement de bactéries lactiques métaboliquement actives, a récemment été proposé à la communauté médicale comme une alternative.

Dans ce contexte, le but de cette étude est d’évaluer la capacité de la bactérie lactique Lactococcus lactis UL719 et la nisine à inhiber C. difficile dans les conditions intestinales. Dans un premier temps, l’activité antibactérienne de la nisine contre des souches cliniques de C. difficile a montré que la nisine était active à des concentrations minimales d’inhibition comprises entre 0,8 et 51,2 µg/mL dépendamment des souches. De plus, la nisine est capable d’inhiber la germination des spores de C. difficile. Suite à ces résultats, la survie de la souche productrice de nisine, L. lactis UL719 et la stabilité physicochimique de la nisine ont été évaluées à l’aide d’un simulateur du tractus gastro-intestinal. Les résultats ont démontré la capacité de la souche productrice de nisine à survivre au tractus gastro-intestinal avec un taux de survie de 0,5 % et, malgré les conditions de stress gastro-intestinal, à garder la capacité à produire sa bactériocine. Par contre, la nisine seule perdait son activité antimicrobienne suite à son passage dans le duodénum. Finalement, quand l’activité antimicrobienne a été évaluée dans un modèle in vitro de fermentation colique simulant les conditions physiologiques intestinales, L. lactis UL719 n’a pas d’effet sur C. difficile mais la nisine a montré une inhibition totale de ce pathogène. Il a aussi été observé que la nisine avait un léger effet inhibant sur la population bactérienne à Gram-positif dans le modèle colique in vitro humain mais l’effet est temporaire.

(4)

iv

Abstract

Clostridium difficile is the most frequently identified enteric pathogen in patients with nosocomial antibiotic-associated diarrhea and pseudomembranous colitis. The most common drugs used to treat diseases associated with C. difficile are limited to metronidazole and vancomycin since most clinically isolated C. difficile strains are resistant to many antibiotics currently used to treat Gram-positive bacterial infections. The search for new treatments to limit the impact of C. difficile becomes an urgent need for the health sector. The use of probiotics, particularly metabolically active lactic acid bacteria, was recently proposed as an alternative for the medical community.

In this context, the aim of the study was to investigate the capacity of the lactic acid bacteria Lactococcus lactis UL719 and nisin to inhibit C. difficile in intestinal conditions.

First, the antibacterial activity of nisin against clinical strains of C. difficile showed that it was active with minimum inhibitory concentrations between 0.8 and 51.2 µg/mL, depending on the strains. In addition, nisin was able to inhibit spore germination of C. difficile. Given these results, the survival of the nisin-producing strain, L. lactis UL719 and the physicochemical stability of nisin were evaluated using a simulator of the gastrointestinal tract. The results demonstrated the ability of the nisin producing strain to survive the gastrointestinal tract with a 0.5 % survival rate and, despite the conditions of gastrointestinal stress, to keep its ability to produce the bacteriocin. However, the nisin alone lost its antimicrobial activity after its passage through the duodenum. Finally, when the antimicrobial activity was evaluated in an in vitro model of colic fermentation simulating physiological intestinal conditions, L. lactis UL719 had no effect on C. difficile, but nisin showed a complete inhibition of this pathogen. It was also observed that nisin had a slight inhibitory effect on the Gram-positive bacterial population in the in vitro human colic model, but the effect was temporary.

(5)

v

Table des matières

Résumé ... iii

Abstract ... iv

Table des matières ... v

Liste des tableaux ... xi

Liste des figures ... xii

Liste des abréviations ... xv

Remerciements ... xvii

Avant-propos ... xix

Introduction ... 1

Chapitre 1 Revue de littérature ... 3

1.1 Le microbiote gastro-intestinal ... 3

1.1.1 La répartition des microorganismes dans le tractus gastro-intestinal ... 3

1.1.2 L’établissement et l’évolution du microbiote colique au cours du temps ... 4

1.1.3 Les facteurs qui influencent le développement du microbiote colique ... 5

1.1.3.1 Le mode d’accouchement et le terme à la naissance ... 5

1.1.3.2 Les habitudes alimentaires et d’hygiène ... 6

1.1.3.3 Le mode d’alimentation ... 6

1.1.3.4 L’usage d’antibiotiques ... 7

1.1.4 Les interactions du microbiote avec l’hôte ... 7

1.1.4.1 Le développement et la maturation du système immunitaire grâce au microbiote intestinal ... 7

1.1.4.2 La protection de l’hôte par le microbiote intestinal ... 8

1.1.4.3 Le développement de la structure et des fonctions normales du tractus gastro-intestinal grâce au microbiote ... 9

1.1.4.4 La nutrition et le métabolisme ... 10

1.1.4.4.1 Le métabolisme des glucides ... 10

1.1.4.4.2 Le métabolisme des protéines ... 11

1.1.4.4.3 Le métabolisme des lipides ... 12

1.1.5 Techniques d’étude de la diversité bactérienne du microbiote intestinal ... 12

(6)

vi

1.1.5.2 Les techniques d’empreintes moléculaires ... 14

1.1.5.3 Les techniques d’hybridation... 15

1.1.5.4 Les méthodes de séquençage ... 15

1.1.6 Modèles in vitro de fermentation pour étudier le microbiote colique ... 17

1.1.6.1 Les systèmes de fermentation en «batch» ... 17

1.1.6.2 Les systèmes de fermentation en continu ... 18

1.1.7 La perturbation du microbiote adulte ... 21

1.1.7.1 Le stress ... 21

1.1.7.2 La diète ... 21

1.1.7.3 Les antibiotiques ... 22

1.2 Clostridium difficile ... 23

1.2.1 Historique ... 23

1.2.2 Les mécanismes de toxicité (pathogénicité et virulence) ... 24

1.2.2.1 Les toxines A et B ... 24

1.2.2.2 La toxine binaire ... 27

1.2.3 Les facteurs de risques ... 29

1.2.4 La gestion et le traitement des infections à C. difficile ... 30

1.2.5 La récurrence et la résistance ... 31

1.2.6 Les traitements alternatifs des infections à C. difficile... 32

1.3 Les probiotiques ... 33

1.3.1 Le mode de sélection ... 34

1.3.1.1 L’identification de la souche ... 35

1.3.1.2 L’évaluation du potentiel probiotique par des essais in vitro ... 36

1.3.1.3 L’évaluation de l’innocuité de la souche ... 36

1.3.1.4 L’évaluation de l’efficacité du probiotique par essai clinique sur animaux ou humains ... 36

1.3.1.5 La réglementation en terme d’allégations santé et d’étiquetage ... 37

1.3.2 Les mécanismes d’action des probiotiques ... 37

1.3.2.1 La modulation des défenses de l’hôte ... 38

1.3.2.1.1 L’effet sur la fonction barrière de l’épithélium... 38

(7)

vii

1.3.2.1.3 L’effet sur le système immunitaire ... 39

1.3.2.1.4 L’effet sur la production de peptides antimicrobiens ... 40

1.3.2.2 L’action directe sur les microorganismes commensaux ou pathogènes ... 40

1.3.2.2.1 La compétition pour les nutriments ... 40

1.3.2.2.2 L’exclusion compétitive... 40

1.3.2.2.3 L’effet antitoxine ... 41

1.3.2.2.4 La production de composés antimicrobiens ... 41

1.3.2.2.4.1 Les acides organiques ... 41

1.3.2.2.4.2 Le peroxyde d’hydrogène ... 41

1.3.2.2.4.3 Les bactériocines ... 41

1.4 Les bactériocines ... 42

1.4.1 La classification des bactériocines produites par des bactéries à Gram positif ... 43

1.4.1.1 La classe I : les bactériocines avec modification post-traductionnelle ... 43

1.4.1.1.1 La classe Ia (les lantibiotiques) ... 44

1.4.1.1.2 La classe Ib (les labyrinthopeptines)... 44

1.4.1.1.3 La classe Ic (les sactibiotiques)... 44

1.4.1.2 La classe II : les bactériocines sans modification post-traductionnelle ... 44

1.4.1.2.1 La classe IIa (les bactériocines ressemblant à la pédiocine) ... 45

1.4.1.2.2 La classe IIb (les bactériocines à deux peptides) ... 45

1.4.1.2.3 La classe IIc (les bactériocines circulaires) ... 45

1.4.1.2.4 La classe IId (les bactériocines linéaires ne ressemblant pas à la pédiocine) ... 45

1.4.1.3 Les bactériolysines ... 45

1.4.2 Le mode d’action des bactériocines ... 46

1.4.2.1 Le mode d’action de la classe I ... 46

1.4.2.2 Le mode d’action de la classe II ... 46

1.4.2.3 Le mode d’action des bactériolysines ... 46

1.4.3 La nisine ... 47

1.4.4 Les bactériocines pour lutter contre les infections nosocomiales et gastro-intestinales ... 50

(8)

viii

2.1 Problématique ... 52

2.2 Hypothèse ... 52

2.3 Objectifs ... 52

Chapitre 3 La nisine est un inhibiteur efficace des cellules végétatives et de la germination des spores de Clostridium difficile ... 53

3.1 Résumé ... 54

3.2 Abstract ... 55

3.3 Introduction ... 56

3.4 Materials and methods ... 57

3.4.1 Bacterial strains and growth media ... 57

3.4.2 Antibiotics and antimicrobial substances ... 57

3.4.3 Measurement of bacteriocin activity ... 58

3.4.4 Susceptibility of C. difficile isolates to antibiotics and to nisins A and Z ... 58

3.4.5 Transmission electron microscopy ... 59

3.4.6 Spore preparation ... 59

3.4.7 Spore viability in the presence of nisin ... 60

3.4.8 Effect of nisin on C. difficile spore germination ... 60

3.4.9 Statistical analyses ... 60

3.5 Results ... 61

3.5.1 Susceptibility of clinical isolates of C. difficile to antibiotics and nisin ... 61

3.5.2 Transmission electron microscopy ... 65

3.5.3 Effect of nisin A on C. difficile spores ... 65

3.5.4 Effect of nisin A on C. difficile spore germination ... 65

3.6 Discussion ... 68

3.7 Acknowledgments ... 70

Chapitre 4 Survie de Lactococcus lactis ssp lactis biovar diacetylactis UL719 aux conditions du tractus gastro-intestinal proximal dans un modèle in vitro dynamique. ... 71

4.1 Résumé ... 72

4.2 Abstract ... 73

4.3 Introduction ... 74

(9)

ix

4.4.1 Bacterial strains and growth media ... 76

4.4.2 Nisin Z production and purification ... 76

4.4.3 TIM-1 dynamic model ... 76

4.4.4 Digestion and sampling ... 78

4.4.5 Assessment of bacteriocin activity ... 79

4.4.5.1 Agar well diffusion test ... 79

4.4.5.2 Critical-dilution micromethod ... 79

4.4.6 Double-agar layer technique ... 80

4.4.7 Statistical analyses ... 80

4.5 Results ... 81

4.5.1 Survival of L. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis UL719 in the dynamic GI TIM-1 model ... 81

4.5.2 Capacity of the strain to produced nisin after passage through GIT ... 83

4.5.3 Stability of nisin Z in dynamic gastro-intestinal conditions ... 83

4.6 Discussion ... 87

4.7 Acknowledgements ... 90

Chapitre 5 Compétitivité de Lactococcus lactis UL719 et la capacité de la nisine (Nisaplin®) à inhiber Clostridium difficile dans un modèle de colon humain. ... 91

5.1 Résumé ... 92

5.2 Abstract ... 93

5.3 Introduction ... 94

5.4 Materials and methods ... 95

5.4.1 Bacterial strains and growth conditions ... 95

5.4.2 Development of large intestine fermentation model ... 96

5.4.2.1 Feces collection and immobilization in gel beads ... 96

5.4.2.2 Nutritive medium ... 96

5.4.2.3 Experimental setup and sampling ... 96

5.4.3 Microbiota composition analysis using q-PCR coupled to PMA treatment ... 97

5.4.4 Analyses of metabolites ... 98

5.4.5 Statistical analysis ... 98

(10)

x

5.5.1 Microbiota composition during stabilization period ... 101

5.5.2 Lactococcus lactis UL719 alone or in presence of C. difficile ATCC43255 have no perturbing impact on intestinal microbiota under simulated colonic conditions ... 101

5.5.3 A nisin concentration of 20× the MIC is required to effective inhibition of C. difficile ATCC43255 in a model of human colon ... 102

5.6 Discussion ... 109

5.7 Acknowledgments ... 111

Conclusion générale et perspectives ... 112

(11)

xi

Liste des tableaux

Tableau 1.1 : Techniques utilisées pour l’étude du microbiote intestinal. ... 13 Tableau 1.2 : Avantages et limites des modèles in vitro de fermentation [118]. ... 20 Tableau 1.3 : Guide pour le traitement des infections à C. difficile. ... 31 Table 3.1 Minimal inhibitory concentration (µg.mL-1)a of bacteriocins and antibiotics against

strains of Clostridium difficile. ... 63 Table 5.1 Primers used for the detection of different bacterial groups in inoculum or fermentation samples by real-time qPCR analysis. ... 100 Table 5.2 Bacterial cell counts in the fecal inoculum and during the fermentation at the end of the stabilization period of the continuous culture measured by qPCR. ... 103 Table 5.3 Impact of Lactococcus lactis UL719 (109 CFU/mL) and/or C. difficile

ATCC43255 (5×106 CFU/mL) addition on the microbiota. ... 104

Table 5.4 Concentration of short chain fatty acids (SFCA) in effluent samples at 4 h following various treatments. ... 105

(12)

xii

Liste des figures

Figure 1.1 Composition de la flore bactérienne dans les différentes parties du tractus gastro-intestinal (adapté de [18, 21, 24]). ... 4 Figure 1.2 Représentations schématiques de (1) la région PaLoc (19,6 kb) contenant les gènes codant la toxine A et la toxine B et (2) l’organisation des domaines des toxines A et B de C. difficile. Les toxines A et B sont constituées de 4 domaines : le domaine N-terminal où se situe l’activité biologique (glycosyltransférase) (A), le domaine C-terminal permettant l’adhésion de la toxine (B), le domaine permettant le clivage auto-catalytique (cystéine protéase) (C) et le domaine hydrophobique permettant la translocation de la toxine (D) (adapté de [156, 160]). ... 25 Figure 1.3 Mode d’action des toxines A et B (adapté de Shen [162])... 26 Figure 1.4 Représentations schématiques de (1) la région CdtLoc (6,2 kb) contenant les gènes codant la toxine binaire et (2) l’organisation des domaines des toxines CDTa et CDTb de C. difficile (adapté de [165, 167]). ... 27 Figure 1.5 Mode d’action de la toxine binaire (adapté de [162]). ... 28 Figure 1.6 Critères d’évaluation d’un probiotique (adapté de FAO/WHO [216]). ... 35 Figure 1.7 Principaux mécanismes d’action des microorganismes probiotiques au niveau du tractus gastro-intestinal (adapté de O'Toole and Cooney [15]). ... 38 Figure 1.8 Structure de la nisine A. Les résidus déhydroalanine (Dha) et déhydrobutyrine (Dhb) sont obtenus par la déshydratation engendrée par NisB sur les sérines (Ser) et les thréonines (Thr) sélectionnées, respectivement. Cette déshydratation se fait par le biais d’une phosphorylation des sérines et des thréonines suivie d’une élimination du groupement phosphate, ce qui génère les résidus Dha et Dhb. Il s’en suit une cyclisation (5) entre une cystéine et un résidu Dha ou Dhb formant soit une lanthionine ou une méthyl-lanthionine, respectivement. La nisine mature est obtenue après le clivage protéolytique du prépeptide grâce à NisP (adapté d’Arnison et al., [252]). ... 48 Figure 1.9 Représentation schématique de la biosynthèse et de la régulation de la nisine dans Lactococcus lactis. Le peptide précurseur de la nisine est synthétisé (encodé par NisA), modifié (déshydratation avec NisB, cyclisation avec NisC), puis transloqué (NisT) et finalement après une protéolyse (NisP), la nisine mature est libérée. La nisine agit comme peptide antimicrobien et aussi comme peptide phéromonal qui peut induire une activation de sa propre biosynthèse via les deux composés de régulation NisK et NisR. La cellule

(13)

xiii

productrice possède une protection contre l’action de la nisine grâce au système d’immunité composé de NisI et NisEFG (adapté de Cheigh and Pyun [278]). ... 49 Figure 3.1 Inhibitory activity of bacteriocins nisin A and nisin Z against P. acidilactici UL5 (sensitive strain) and C. difficile ATCC 630, as revealed by zones of clearing in the agar diffusion assay. ... 62 Figure 3.2 Transmission electron micrographs of C. difficile ATCC 630 grown in BHI broth and treated in suspension (106 CFU) for 1 min with (a) no inhibitor; (b) nisin A (16 µg.mL -1); (c) nisin Z (64 µg.mL-1); (d) vancomycin (5 µg.mL-1); (e) nisin A (32 µg.mL-1) and (f)

nisin Z (128 µg.mL-1). Bar = 1 µm. ... 64

Figure 3.3 Viability of C. difficile spores treated with nisin A at different concentrations for 1 h (white) and 24 h (black). Spores were washed, plated on BHI agar containing sodium taurocholate and incubated anaerobically for 24 h at 37 °C. Germinated spores were counted. Values are mean ± SD for four separate experiments. Symbols indicate significant difference between viability in the presence and absence of nisin (P ≤ 0.05). ... 66 Figure 3.4 Inhibition of C. difficile spore germination by nisin A. Spores were plated on BHI agar containing sodium taurocholate and bacteriocin and incubated anaerobically for 24 h at 37 °C. Values are mean ± SD for four separate experiments. Asterisks indicate significant difference between viability in the presence and absence of nisin (P ≤ 0.05). ... 67 Figure 4.1 the multi-compartmental dynamic TIM-1 model of gastrointestinal system. Vessels A, B, C and D constitute the gastric, duodenal, jejunal and ileal compartments, respectively. Modules (E) are semi-permeable hollow fibre membrane dialysis units. (F) Peristaltic valves, (G) ileo-caecal valves, (H) pH electrodes, (I) temperature sensor, (J) stomach secretion inlets, (K) duodenal secretion inlets, (L) and (M) bicarbonate secretion inlet and (N) volume detecting sensors. ... 77 Figure 4.2 Proportion (%) of fermented milk sample distributed in the compartments of TIM-1 model or cumulated in ileal-delivered effluent (a) and survival of Lactococcus lactis UL7TIM-19 (CFU.mL-1 of fermented skim milk) in the compartments of the TIM-1 model during 5h

digestion (b)(stomach (diamond); duodenum (square); jejunum (triangle); ileum (cross); efflux(circle)). Percentages were calculated by Shortcut to Timall 041201 software (TNO Nutrition and Food Research Institute, Zeist, Netherlands) for the slow transit protocol. Data are means of two independent repetitions. ... 82 Figure 4.3 Double-agar assay showing inhibition of Pediococcus acidilactici UL5 by Lactococcus lactis UL719 recovered from different compartments during digestion of an overnight skim milk culture of Lactococcus lactis UL719. Lactococcal colonies were

(14)

xiv

selected randomly from MRS agar medium from gastric compartment after 105 min of digestion (a), from duodenal compartment after 180 min of digestion (b) and from the exit of ileal compartment after 300 min of digestion (c). ... 84 Figure 4.4 Agar diffusion test showing the biological activity of nisin Z against Pediococcus acidilactici UL5 for samples taken during digestion of skim milk sample fermented for an overnight with Lactococcus lactis UL719. S35-105 are from gastric compartment at 0, 35, 70 and 105 min of digestion. D30-120 are from the duodenal compartment at 30, 60, 90 and 120 min of digestion. J60-300 and I60-300 are from jejunal and ileal compartments at 60, 120, 180, 240 and 300 min of digestion. T0, 24 h skim milk culture of Lactococcus lactis UL719 not subjected to the TIM-1 treatment. ... 85 Figure 4.5 Agar diffusion test showing the biological activity of nisin Z against Pediococcus acidilactici UL5 for samples taken during digestion of purified nisin Z (10 mg per 300 mL of skim milk acidified at pH 5.3). S35-105 are from gastric compartment at 0, 35, 70 and 105 min of digestion. D30-120 are from the duodenal compartment at 30, 60, 90 and 120 min of digestion. J60-300 and I60-300 are from jejunal and ileal compartments at 60, 120, 180, 240 and 300 min of digestion. NZ, purified nisin Z in skim milk not subjected to the TIM-1 treatment. ... 86 Figure 5.1 Time schedule of continuous intestinal fermentation during the different treatment periods. BC, bead colonization. Lactococcus lactis UL719 was added at final concentration of (109 CFU/mL) in the reactor. C. difficile ATCC43255 was added at a final concentration

of 5×106 CFU/mL. ... 99

Figure 5.2 Survival of Lactococcus lactis UL719 after its last addition (day 62) in a human colon model. L. lactis UL719 (circle); theoretical washout (square). ... 106 Figure 5.3 Inhibitory activity of nisin at 5× and 20× the MIC (3.8 µmol/L) and Lactococcus lactis UL719 (109 UFC/mL) against Clostridium difficile ATCC43255 in a human colon

model. C. difficile alone (black diamond); C. difficile plus nisin 5× (white triangle); C. difficile plus nisin 20× (cross); C. difficile plus L. lactis UL719 (white circle); theoretical washout (white square). ... 107 Figure 5.4 Impact of nisin addition at 76 µmol/L (20× the MIC vs Clostridium difficile ATCC43255) on microbiota population enumerated by qPCR. Total bacteria (white diamond); Lachnospiraceae group. (white square); Ruminococcaceae group. (white triangle); Bacteroidetes (cross); Bifidobacteria (black triangle); Enterobacteriaceae (white circle); Lactobacillaceae/Leuconostocaceae group. (black square); Values with asterisk are significantly different (P<0.05). ... 108

(15)

xv

Liste des abréviations

ADN acide désoxyribonucléique ADP adénosine diphosphate AGCC acide gras à courtes chaines ATCC American type culture collection ATP adenosine triphosphate

AU arbitrary units BHI brain heart infusion BL bactérie lactique

CDAD C. difficile associated diarrhea CDT toxine binaire de C. difficile CFU colony forming units

CMI concentration minimale d’inhibition CPM colite pseudomembraneuse

DAA diarrhée associée aux antibiotiques DACD diarrhée associée à C. difficile DNA Deoxyribonucleic Acid

FAO Food and Agriculture Organization FISH Fluorescence In Situ Hybridization FDA Food and Drug Administration GI gastro-intestinal

GIT gastrointestinal tract

GRAS generally recognized as safe HSP heat shock protein

ICD infection à Clostridium difficile IDSA infectious diseases society of America Ig immunoglobuline

IL interleukine

LAB lactic acid bacteria LCT large clostridial toxin

(16)

xvi

MRS de Man, Ragosa, Sharpe OD optical density

PAM peptide antimicrobien PCR polymerase chain reaction PMA propidium monoazide

qPCR PCR quantitave en temps reel SCFA short chain fatty acid

SD standard deviation

SHEA society of healthcare and epidemiology of America Tcd toxine de C. difficile

TGI tractus gastro-intestinal

TMF transplantation de microbiote fécal TNF tumoral necrosis factor

UFC unite formant colonies

VIH virus de l’immunodéficience humaine WHO world health organization

(17)

xvii

Remerciements

Tout d'abord je voudrais remercier mon directeur de recherche, le Dr. Ismaïl Fliss pour m'avoir donné la chance de pouvoir effectuer ce doctorat au sein de son équipe de recherche et de m'avoir accordé sa confiance pour mener ce projet de recherche. J'aimerais également remercier mon codirecteur de recherche, le Dr. Marc Ouellette pour m’avoir accueilli au sein de son laboratoire et mis à ma disposition les ressources nécessaire pour mener à bien ce projet.

Je tiens aussi à remercier les membres du comité examinateur de cette thèse, Dr. Lucie Beaulieu (pré-lectrice), Dr. Gisèle Lapointe et Dr. Christophe Chassard pour le temps que vous avez accordé pour évaluer l’ensemble du document.

Je tiens à remercier Larbi Dridi pour son aide lors de mes manipulations au sein du laboratoire du Dr Ouellette, le Dr. Ehab Kheadr pour son aide avec le modèle in vitro de digestion. Je remercie particulièrement Riadh Hammami pour son soutien pour la rédaction de mes articles et pour les discussions concernant ces derniers. Enfin, un grand merci à Benoit Fernandez avec qui j’ai passé énormément de temps à faire la mise au point du modèle de fermentation colique et de la quantification biomoléculaire.

J’aimerais aussi remercier le personnel du laboratoire qui nous apporte beaucoup d’aide : Diane Gagnon, Marie-Michelle Gagnon, Hélène Gingras, Suzanne Avoine, Céline Paquin, Catherine Viel, Alain Gaudreau, Mélanie Martineau.

Je remercie aussi les organismes subventionnaires sans qui les projets ne pourraient être financés. Merci au Fonds de Recherche du Québec, Nature et Technologies (FRQNT) et au Conseil de Recherches en Sciences Naturelles et en Génie du Canada (CRSNG).

Je tiens aussi à remercier mes collègues présents ainsi que mes amis pour leur soutien et leur aide constante : Allison, Marie-Hélène, Hajer, Alain, Cyril, Jérémie, Amine, Éric, Stéphane, Arnaud, Guillaume, Mélanie, Alice, Anne-Catherine, Gilles et tous ceux que j’oublie. J’aimerais finalement remercier du fond de mon cœur ma famille, que j’aime, et qui m’a soutenue tout au long de cette aventure. Un gros merci à toi maman, Brigitte et mon frère,

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xviii

Julien ainsi qu’à mes merveilleux grands-parents, Gabriel et Jeanine et aussi au reste de la famille Aimée, Gilbert, Didier et Philippe. Je tiens à dédier cette thèse à mon père, Jean-François, toi qui n’as pas pu voir mon accomplissement, tu nous manques beaucoup.

(19)

xix

Avant-propos

Cette thèse de doctorat est divisée en 7 parties dont 5 chapitres. L’introduction générale du projet de recherche servira de première partie. Le premier chapitre sera une revue de littérature sur le sujet permettant d’exposer les connaissances actuelles sur le microbiote colique, les infections à Clostridium difficile, les probiotiques ainsi que sur les bactériocines. Le chapitre 2 permettra d’amener la problématique, ainsi que l’hypothèse et les objectifs du projet de recherche.

Les trois chapitres suivant sont rédigés en anglais sous la forme d’articles scientifiques. Le chapitre 3 intitulé «Nisin is an effective inhibitor of Clostridium difficile vegetative cells and spore germination» a été réalisé sous la direction du Dr. Ismaïl Fliss et du Dr. Marc Ouellette. Larbi Dridi, stagiaire post-doctoral, m’a aidé lors de la conception et des manipulations. Le Dr. Bergeron a contribué à l’isolation de souches cliniques de Clostridium difficile. La plus grande partie des expériences, le traitement des résultats ainsi que la rédaction de cet article ont été réalisés par moi-même. Cet article a été publié dans «Journal of medical microbiology».

Le chapitre 4 intitulé «Survival of Lactococcus lactis ssp lactis biovar diacetylactis UL719, in the upper gastrointestinal tract conditions using a dynamic in vitro model» a été réalisé sous la direction du Dr. Ismaïl Fliss. J’ai effectué les analyses, le traitement des résultats et la rédaction de cet article. Cet article sera soumis dans «Journal of applied microbiology»

Le chapitre 5 intitulé «On Lactococcus lactis UL719 competitivity and nisin (Nisaplin®) capacity to inhibit Clostridium difficile in a model of human colon» a été réalisé sous la direction du Dr. Ismaïl Fliss et du Dr. Marc Ouellette. Dr. Benoit Fernandez m’a aidé pour les manipulations et le Dr. Riadh Hammami a contribué à la rédaction de l’article. Le traitement et l’analyse des résultats ainsi que la plus grande partie de la rédaction ont été réalisés par moi-même. Cet article a été publié dans «Frontiers in microbiology».

La dernière partie sera une conclusion générale sur le projet de recherche ainsi que la proposition de perspectives générales.

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Introduction

L’infection à Clostridium difficile (ICD) est un problème de santé publique à l’incidence et à la gravité croissantes aux États-Unis, au Canada et dans de nombreux pays européens [1-3]. Entre 2004 et 2005, une épidémie d’ICD s’est déclarée au Québec et a engendré plus d’un millier de décès (Institut national de santé publique du Québec, 2011). Au cours de cette période, le taux moyen d’incidence d’ICD nosocomiale était de 10,5 cas pour 1000 admissions avec un taux de mortalité de 16,2 % par cas recensé. Un taux d’incidence de 15,2 cas pour 1000 admissions a été atteint au plus fort de l’épidémie. Aujourd’hui au Québec, le taux moyen d’incidence d’ICD nosocomiale est de 5,6 cas pour 1000 admissions avec un taux de mortalité de 15,1 % ( http://www.inspq.qc.ca/infectionsnosocomiales/spin-cd/surveillance-2013-2014). Outre l’impact sur la santé publique, les coûts liés à cette problématique sont très importants. Aux États-Unis, ces infections constituent un fardeau considérable sur le système de santé évalué à plus de 3 milliards de dollars par année [4]. Pendant plus de 30 ans, les ICDs ont pu être correctement traitées par du métronidazole ou de la vancomycine avec une fréquence rare de récidives ou de formes sévères et/ou compliquées. Depuis les dernières épidémies au début des années 2000, les échecs cliniques avec la métronidazole et la vancomycine sont devenus plus fréquents et le nombre de récidives a augmenté. Des souches avec une sensibilité réduite au métronidazole ont été isolées [5]. Ce constat préoccupant a entraîné la recherche de nouvelles alternatives pour le traitement des ICDs. Plusieurs alternatives ont été avancées ces dernières années, incluant la recherche de nouvelles molécules antibiotiques comme la fidaxomicin [6], de nouvelles approches biothérapeutiques comme la transplantation du microbiote fécal [7] ou encore l’usage de probiotiques [8].

Les probiotiques sont définis comme des microorganismes qui lorsque administrés à des doses adéquates, ont des effets bénéfiques sur la santé de l’hôte [9]. Plusieurs effets bénéfiques ont été associés aux probiotiques, dont la stimulation du système immunitaire [10], la prévention des diarrhées dues aux virus et aux prises d’antibiotiques [11, 12], la réduction des allergies chez l’enfant [13] et la protection et la lutte contre les infections et pathologies intestinale [14]. Les mécanismes d’action des probiotiques sont nombreux et inclus la production de composés antimicrobiens comme les bactériocines [15].

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2

Les bactériocines sont des peptides antimicrobiens issus de la synthèse ribosomale chez les bactéries. De nombreuses études ont montré que certaines bactériocines avaient une action inhibitrice in vitro sur de nombreuses souches pathogènes. Parmi elles, on retrouve la nisine qui est la seule bactériocine admise dans plus de 50 pays comme additif alimentaire en Europe et approuvé par la FDA (statut GRAS, generally recognized as safe) [16]. La nisine est active contre les bactéries à Gram positifs et principalement les bactéries lactiques, Bacillus et Clostridium [17]. Grâce à son spectre d’activité et son statut GRAS, la nisine semble être une alternative naturelle et intéressante à l’usage d’antibiotiques dans le cadre d’ICD.

L’objectif scientifique de ce projet de doctorat est d’évaluer la capacité du candidat probiotique L. lactis UL719 producteur de nisine à survivre au niveau du tractus gastro-intestinal et à inhiber Clostridium difficile via sa production de bactériocine.

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Chapitre 1 Revue de littérature

1.1 Le microbiote gastro-intestinal

1.1.1 La répartition des microorganismes dans le tractus gastro-intestinal

Du point de vue microbiologique, l’environnement gastro-intestinal comprend trois régions principales qui offrent des conditions très différentes pour la survie des différents microorganismes : l’estomac, le petit intestin et le côlon. Les phylums bactériens retrouvés dans ces différentes régions sont présentés dans la Figure 1.1.

Dans l’estomac, la forte acidité, pH variant entre 1 et 5 dépendamment de la prise alimentaire, est responsable de la faible prolifération microbienne (101-104 unités formatrices de colonies

par gramme; UFC/g). Les phylums bactériens retrouvés dans cette partie du tractus gastro-intestinal (TGI) sont les Firmicutes, les Actinobacteria, les Bacteroidetes, les Proteobacteria et les Fusabacteria [18, 19].

Le petit intestin est divisé en trois sous-sections : le duodénum, le jéjunum et l’iléon. Étant donné le transit rapide, les sécrétions biliaires et pancréatiques ainsi que la sécrétion de molécules antimicrobiennes produites par l’hôte (comme les immunoglobulines A (IgA), les défensines, les cathélicidines et les lectines de type C), la croissance bactérienne est limitée [19, 20]. La microflore est constituée essentiellement de Firmicutes, d’Actinobacteria et de Bacteroidetes, à raison d’entre 103 et 108 UFC/g, selon la section du petit intestin [18].

Finalement, le côlon (un environnement dépourvu d’oxygène et ayant un pH compris entre 5 et 7) comporte une flore microbienne plus abondante (1010-12 UFC/g) et très complexe, qui

est dominée par les Firmicutes et les Bacteroidetes. Ces groupes constituent 60-80 % et 15-30 % des bactéries totales, respectivement [19, 21-24]. Le phylum Actinobacteria y est présent dans une proportion de 2-10 % et peut atteindre jusqu’à 25 %. Pour leur part, les Proteobacteria et les Verrumicrobia représentent seulement 1-2 % et moins des bactéries totales [24, 25]. Le microbiote intestinal se trouve dans le côlon sous deux états : l’état sessile, où les bactéries sont fixées à des particules alimentaires ou au mucus intestinal formant ainsi

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un biofilm, ou l’état planctonique, où les populations bactériennes évoluent de façon libre et isolée dans l’environnement colique [26].

Figure 1.1 Composition de la flore bactérienne dans les différentes parties du tractus gastro-intestinal (adapté de [18, 21, 24]).

1.1.2 L’établissement et l’évolution du microbiote colique au cours du temps

Le développement du microbiote est un processus complexe. Le nouveau-né, stérile in utero, se trouve exposé à une flore simple provenant de la flore fécale et vaginale de la mère et de l’environnement proche. Le nourrisson est rapidement colonisé par une succession de bactéries aérobies, de bactéries anaérobies facultatives, puis de bactéries anaérobies strictes [27-30]. Les premiers colonisateurs sont les entérobactéries, les coliformes, les lactobacilles et les streptocoques. Une fois que ces organismes aérobies/anaérobies ont consommé l'oxygène, diminuant ainsi le potentiel d’oxydo-réduction dans la lumière du tube digestif, les bactéries anaérobies strictes telles que les bifidobactéries, les Bacteroïdes et les clostridies s’implantent [29, 31, 32]. À cet instant, le microbiote colique est dominé par un ou plusieurs genres bactériens tels qu’Escherichia, Clostridium, Bacteroïdes et Bifidobacterium.

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Après les six premiers mois de la vie, lorsque l’alimentation solide est introduite au nourrisson, le microbiote colique devient plus diversifié. La succession de Bacteroides, de Clostridium et des bactéries anaérobies augmente rapidement alors que la proportion de bifidobactéries devient plus stable [29, 31].

Une flore diversifiée et stable, proche de celles de l’adulte, ne semble être obtenue qu’entre 2 et 4 ans [33].

1.1.3 Les facteurs qui influencent le développement du microbiote colique

Différents facteurs influencent la composition et l’évolution du microbiote de l’enfant tels que le mode d’accouchement, l’environnement, le mode d’alimentation, le terme à la naissance et l’usage d’antibiotiques.

1.1.3.1 Le mode d’accouchement et le terme à la naissance

Les nourrissons nés par voie naturelle ont une flore différente de celle des nourrissons nés par césarienne [31]. Étant donné que les nourrissons nés par voie naturelle entrent en contact avec la flore vaginale et fécale maternelle, la colonisation de l'intestin s’effectue par des microbes provenant du canal de naissance de la mère, contrairement aux nourrissons nés par césarienne. Il a été montré lors d’un suivi d’une cohorte de nourrissons nés (par voie naturelle et par césarienne) que l’implantation de la flore anaérobie stricte était retardée pour les nourrissons nés par césarienne, ce retard portant principalement sur les genres Bifidobacterium et Bacteroïdes [28].

D’autres auteurs ont suggéré que l’intestin du nourrisson était plutôt colonisé suite à l'ingurgitation de liquide amniotique in utero [29] et par les microorganismes de l'environnement, tels que ceux du personnel de santé, des salles et d’autres nourrissons [34, 35].

Les nouveau-nés prématurés sont rapidement séparés de leur mère pour être mis dans un environnement de soins intensifs très aseptisé. Ils ont un développement semblable aux nouveau-nés issus de césarienne à terme et ont pour principale source de colonisation l’environnement qui les entoure [34].

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1.1.3.2 Les habitudes alimentaires et d’hygiène

La composition du microbiote semble être influencée par la situation géographique, due aux différentes habitudes alimentaires dans une région ou un pays. Une récente étude a montré un "gradient géographique" dans le microbiote infantile à travers l'Europe du Nord [36]. En effet, les nourrissons du Nord ont montré des niveaux élevés de bifidobactéries, Atopobium, Clostridium perfringens, Clostridium difficile alors que les nourrissons du Sud ont présenté une proportion plus élevée de Bacteroides, Eubacteria et Lactobacillus. La dynamique de colonisation est fortement conditionnée par l’hygiène qui entoure la naissance et les premiers moments de la vie. Ceci se démontre par exemple par la colonisation tardive des espèces commensales comme Escherichia coli dans les pays industrialisés par rapport aux pays en voie de développement, où les conditions d’hygiène sont différentes [37].

1.1.3.3 Le mode d’alimentation

Le mode d'alimentation, soit l'allaitement (lait maternel) ou l'alimentation avec du lait artificiel, a un effet important sur le microbiote du nourrisson. Durant l’allaitement, le transfert de microbiote se poursuit par le biais du lait maternel qui est une excellente source de bactéries comme de staphylocoques, de streptocoques, de bactéries lactiques (BL) et de bifidobactéries [38, 39]. De plus, le lait maternel contient une quantité appréciable d’oligosaccharides qui ne sont pas hydrolysés par les enzymes digestives humaines. N’étant donc pas assimilés par l’humain, ces oligosaccharides favorisent le développement des bifidobactéries [40, 41], et permet d’expliquer la colonisation dominante chez le nouveau-né par le genre Bifidobacterium.

Bien qu’il ait été montré que les nouveau-nés nourris avec du lait artificiel pouvaient avoir une colonisation et une prolifération équivalente en bifidobactéries totales à celle observée chez les nouveau-nés allaités, il semble y avoir une variation dans les espèces dominantes selon le mode d’allaitement privilégié [36, 42, 43].

Il a aussi été observé que le microbiote du nouveau-né nourri au lait artificiel était plus diversifié et similaire au microbiote adulte. Il est caractérisé par la prévalence d’anaérobes facultatifs comme Bacteroïdes et Clostridium suivi par Staphylococcus, Streptococcus et

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Enterobacteriaceae et avec un déficit en bifidobactéries comparé à celui d’un nouveau-né nourri au lait maternel qui est dominé par les bifidobactéries [34, 44].

1.1.3.4 L’usage d’antibiotiques

Les antibiotiques causent des effets délétères sur le microbiote du nouveau-né. Une étude a montré que les enfants ayant reçus de la céfalexine avaient moins de bifidobactéries et une augmentation des entérocoques comparé aux enfants n’ayant pas reçu de traitements antibiotiques [45]. Une autre étude, évaluant l’impact de l’administration d’antibiotiques (Augmentin® (amoxicilline et acide clavulanique) suivi de Bactrimel® (trimethoprime et

sulfamethoxazole)) sur la colonisation du microbiote, a montré que le microbiote des nouveau-nés ayant reçu ce traitement était extrêmement instable jusqu’à l’âge de 1 mois, avec E. coli comme dominant au début de la colonisation. Cependant, la plus grande différence entre les microbiotes des nouveau-nés ayant reçu ou non ce traitement antibiotique est l’apparente absence des bifidobactéries dans le groupe traité. De plus, jusqu’au 5e mois

de l’enfant, aucune bifidobactérie n’est détectée ce qui montre l’effet prolongé des antibiotiques sur le microbiote [46].

1.1.4 Les interactions du microbiote avec l’hôte

Le microbiote intestinal, par sa présence permanente et son immense population, exerce des effets physiologiques dont les répercussions sur l’hôte sont, pour la plupart, bénéfiques. Il joue un rôle essentiel dans le maintien de la santé de l’hôte par le développement et la maturation du système immunitaire intestinal, la protection contre les microorganismes pathogènes, le développement de la structure et des fonctions du TGI et son apport au niveau de la nutrition et du métabolisme.

1.1.4.1 Le développement et la maturation du système immunitaire grâce au microbiote intestinal

La comparaison entre des animaux axéniques (exempts de germes) et des animaux conventionnels a permis de mettre en évidence le rôle du microbiote au niveau du développement et de la maturation du système immunitaire. Il a été montré dans un modèle de souris immunocompétentes que la colonisation intestinale stimulait la production d’IgA,

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la différenciation des lymphocytes TH1 et TH17, et le développement des lymphocytes TReg

[47]. Il a été montré qu’un cocktail comprenant 46 souches murines de Clostridium, essentiellement des groupes IV et XIVa, avait amélioré la branche anti-inflammatoire du système immunitaire en engendrant la différenciation de lymphocytes TReg et en induisant

l’expression d’interleukines 10 (IL-10) anti-inflammatoires [48]. Le polysaccharide A produit par Bacteroïdes fragilis a également démontré une induction de la production IL-10 [49]. La stimulation permanente du système immunitaire par le microbiote intestinal est en fait nécessaire non seulement pour son développement et sa maturation, mais également pour le maintien de l’homéostasie intestinale, de la fonction de barrière de l’épithélium ou encore de l’équilibre entre réponses pro- et anti-inflammatoires [50].

1.1.4.2 La protection de l’hôte par le microbiote intestinal

Le microbiote intestinal fournit à son hôte une protection physique à l’invasion pathogène par une exclusion compétitive. Cette exclusion se fait par l’occupation des sites d’attachement, la consommation des nutriments et la production de substances antimicrobiennes. De plus, le microbiote stimule l’hôte à produire une variété de peptides antimicrobiens (PAM).

De nombreux PAMs sont produits dans le TGI comme des défensines, des cathélicidines et des lectines de type-C. Ce groupe diversifié de molécules a pour rôle principal de réguler la population et la composition du microbiote intestinal [51]. Les interactions entre les PAMs et le microbiote sont bidirectionnelles : les PAMs sont responsables de la perturbation structurelle des surfaces des bactéries pathogènes et commensales [51, 52], tandis que le microbiote et ses métabolites stimulent la production des différents types de PAMs.

Les cellules de Paneth, un type de cellule de l’épithélium de l’intestin grêle que l’on retrouve exclusivement au fond des cryptes, sécrètent de nombreux PAMs. Il a été montré que cette sécrétion est directement liée à la présence du microbiote intestinal. Pour atteindre de haut niveau d’expression de PAMs, il est nécessaire d’avoir la présence de l’ensemble de la population microbienne [53, 54]. La présence de certaines espèces bactériennes comme Bacteroides thetaiotamicron [53, 55] et Listeria innocua [53] ou bien la présence de

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lipopolysaccharides [54, 55] permet l’induction de l’expression de ces peptides antimicrobiens, quand ceux-ci sont faiblement exprimés.

Les métabolites microbiens ont aussi la capacité d’induire l’expression de PAM. Il a été démontré que les acides gras à courtes chaines (AGCCs) et l’acide lithocholique induisaient l’expression de la cathélicidine LL-37 [56, 57].

Certains PAMs (ex : défensine) sont initialement produits sous une forme inactive (ex : prodéfensine) et ont besoin d’un clivage protéolytique pour être activés. Les cellules de Paneth produisent la matrilysine, molécule permettant l’activation de la défensine. Une étude sur des souris sans germe a montré que la colonisation par B. thetaiotaomicron entrainait l’induction de l’expression de la matrilysine [58]. Ceci démontre une autre facette de la médiation entre le microbiote et l’induction des défenses antimicrobiennes de l’hôte. Il apparait clairement que la présence du microbiote ou de métabolites produits a la capacité d’induire l’expression des PAMs et de permettre leur activation afin de contribuer à la protection de l’hôte contre des pathogènes et aussi de maintenir l’homéostasie.

1.1.4.3 Le développement de la structure et des fonctions normales du tractus gastro-intestinal grâce au microbiote

Le nouveau-né vient au monde avec un système gastro-intestinal structurellement et fonctionnellement immature [59]. Le développement post-natal du TGI est influencé par de nombreux facteurs incluant le développement de la communauté microbienne intestinale [59, 60].

Il a été montré que les souris axéniques présentaient un système immunitaire immature. En effet, il a été observé une hypoplasie des plaques de Peyer, une réduction du nombre de lymphocytes intra-épithéliaux ainsi qu’une limitation dans les concentrations d’immunoglobulines sériques et dans la production de cytokines [50]. De plus, en absence de microbiote, il apparait que la physiologie du tube digestif n’atteint pas sa maturité. Il en résulte une réduction de l’épaisseur de la muqueuse, de la taille des villosités et des bordures en brosse et aussi par une réduction du renouvellement de l’épithélium colique et la vitesse de production de cellules par crypte [61]. Il a aussi été démontré que les animaux axéniques

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avaient une vascularisation de l’intestin plus faible, une couche de mucus plus importante et une réduction des activités enzymatiques digestives [62].

1.1.4.4 La nutrition et le métabolisme

L’étude de modèles animaux axéniques a permis de mettre en évidence le rôle du microbiote au niveau de la nutrition et du métabolisme de l’hôte. Les animaux n’ayant pas de microbiote avaient besoin d’un apport calorique de 20 à 30 % supérieur à celui d’animaux conventionnels, afin de maintenir leur masse corporelle [62]. Ceci s’explique par la capacité du microbiote colique à métaboliser les glucides, les protéines et lipides d’origine alimentaire (fibres alimentaires) non-digérés dans la partie supérieure du TGI ainsi que les sécrétions endogènes (mucopolysaccharides, débris cellulaires, stérols, enzymes) [63].

1.1.4.4.1 Le métabolisme des glucides

Les glucides arrivant au niveau du côlon sont sous la forme de glucides complexes résistants aux α-amylases de l’hôte. Le microbiote est particulièrement bien adapté pour l’utilisation de ces glucides complexes grâce à la contribution de différents groupes bactériens ayant des activités métaboliques complémentaires [64].

La première étape consiste à dégrader les glucides complexes en métabolites fermentaires (AGCCs et gaz principalement), et est réalisée par l’action enzymatique (polysaccharidases, glucosidases) des bactéries hydrolytiques [64]. Les genres Bacteroides, Bifidobacterium, Ruminococcus et Roseburia ainsi que quelques espèces des genres Enterococcus, Clostridium et Eubacterium ont démontré une activité hydrolytique à l’égard des polymères glucidiques [65]. Les métabolites fermentaires, issus de l’hydrolyse des glucides complexes, peuvent être ensuite utilisés par des espèces dépourvues d’activité hydrolytique. Les substrats glucidiques simples sont catabolisés par le microbiote selon un nombre restreint de voies métaboliques.

La plupart des espèces bactériennes utilisent la glycolyse pour convertir les glucides en pyruvate. Le pyruvate, molécule centrale dans ces processus fermentaires, est ensuite transformé selon différentes voies métaboliques en produits finaux de fermentation (acétate, propionate et butyrate), qui sont rapidement utilisés par le microbiote ainsi qu’absorbés par

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les cellules épithéliales de l’intestin et sont métabolisés dans différents organes (épithélium colique, foie, muscle, cœur). Un certain nombre d’espèces produit également d’autres métabolites secondaires (lactate, succinate, formate et éthanol) qui ne s’accumulent pas dans l’écosystème car ils sont ensuite métabolisés par d’autres espèces en produits finaux de fermentation [66].

1.1.4.4.2 Le métabolisme des protéines

Les protéines et les peptides sont les principales sources d’azote dans le côlon. Le microbiote doit hydrolyser ces molécules par le biais de nombreuses enzymes telles que des protéases, des désaminases et des transaminases pour disposer des carbones et de l’azote qui les composent [63]. Cette dégradation engendre des molécules potentiellement toxiques pour l’hôte (phénols, indoles, ammoniac, amines) [63].

Suite à la protéolyse des protéines par des espèces ayant une activité protéasique (Bacteroides, Clostridium, Propionibacterium, Fusobacterium, Streptococcus et Lactobacillus), les peptides générés peuvent être assimilés par plusieurs espèces bactériennes. Suite à cette utilisation, il en résulte souvent une excrétion d’acides aminés libres non nécessaires à la croissance de ces bactéries. Ces acides aminés libres peuvent être utilisés par des espèces n’ayant pas la capacité d’assimiler les peptides [63]. La désamination des acides aminés conduit généralement à la formation d’AGCCs (acétate, propionate et butyrate) et d’ammoniac. D’autres composés sont aussi produits lors de la métabolisation des acides aminés comme des composés phénoliques et indoliques, des acides gras ramifiés (isobutyrate, isovalérate) et des acides dicarboxyliques [67]. Les composés phénoliques et indoliques sont absorbés par la muqueuse colique, détoxifiés puis excrétés dans les urines [67]. L’ammoniac est aussi l’une des principales sources d’azote pour le microbiote. Ainsi le microbiote utilise l’ammoniac pour sa protéosynthèse, et par conséquence, diminue la concentration en ammoniac dans la lumière intestinale, le surplus étant absorbé par les muqueuses intestinales et envoyé au foie pour être converti en urée et être éliminé dans les urines [67].

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1.1.4.4.3 Le métabolisme des lipides

Les lipides présents au niveau du côlon, sont issus de l’alimentation, des lipides bactériens et de la desquamation de coloncytes [68]. Le microbiote transforme les acides gras via différentes réactions d’hydrolyse, d’oxydation et de réduction [69]. De nombreuses espèces du microbiote possèdent des lipases permettant l’hydrolyse de triglycérides à longues chaines [69]. Cependant, une étude a montré que le microbiote n’était pas capable de métaboliser toutes les longueurs de chaines d’acides gras (particulièrement celles de 20 à 22 carbones) [70]. Il a été montré que le microbiote était capable de convertir le cholestérol en coprostanol, une molécule qui n’était pas absorbée par l’hôte et qui était éliminé dans les fèces, ce qui permet de diminuer le taux de cholestérol dans le sang de l’hôte [71].

1.1.5 Techniques d’étude de la diversité bactérienne du microbiote intestinal

Plusieurs méthodes sont aujourd’hui disponibles pour l’évaluation de la diversité bactérienne au sein du microbiote intestinal. Traditionnellement, des méthodes de culture étaient utilisées. Avec cet outil, il a été possible de faire des progrès dans le phénotypage des isolats sur la base de leurs profils de fermentation et sur leurs exigences de croissance in vitro. Bien que l’identification bactérienne par culture soit peu coûteuse, elle demande beaucoup de temps et de main d’œuvre et ne prend en compte qu’une partie du microbiote intestinal car seulement 30 % du microbiote sont cultivables [21, 72].

Depuis les années 1990, des méthodes indépendantes de la culture bactérienne ont été développées et utilisées tant pour évaluer la diversité du microbiote que pour quantifier les espèces composant le microbiote. Elles ont ainsi permis de révéler une plus grande complexité du microbiote intestinal. La majorité de ces techniques est basée sur les gènes codant l’ARN ribosomique 16S (ARNr 16S), des gènes hautement conservés au sein des espèces bactériennes et présentant des régions suffisamment variables pour permettre une identification au niveau de l’espèce [73]. Ces méthodes incluent la réaction en chaine de la polymérase en temps réel (qPCR), l’électrophorèse sur gel en présence d’un gradient d’agent dénaturant (DGGE) ou d’un gradient de température (TGGE), l’analyse du polymorphisme de longueur des fragments terminaux (T-RFLP), l’hybridation in situ en fluorescence (FISH), les puces ADN, et les méthodes de séquençage (Tableau 1.1)

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Tableau 1.1 : Techniques utilisées pour l’étude du microbiote intestinal.

Technique Description Avantages Inconvénients Méthode culturale Isolation de bactéries sur milieux

sélectifs Peu coûteux Semi-quantitative Fastidieux 30% du microbiote cultivable qPCR Amplification et quantification de l’ARNr 16s Identification phylogénétique, Quantitative Rapide

Biais d’extraction et d’amplification d’ADN Ne permet pas d’identifier des espèces inconnues

DGGE/TGGE Séparation sur gel d’amplicons d’ARNr 16s par dénaturation ou avec la température

Rapide

Semi-quantitative,

Bandes peuvent être excisées pour des analyses complémentaires

Biais d’extraction et d’amplification d’ADN Identification phylogénétique impossible

T-RFLP Digestion d’amplicons d’ARNr 16S marqué par un fluorochrome et séparation sur gel

Rapide peu coûteux Semi-quantitative

Biais d’extraction et d’amplification d’ADN Identification phylogénétique impossible Basse résolution

FISH Hybridation d’amorces fluorescentes avec l’ARNr 16S

Identification phylogénétique Semi-quantitative

Pas de biais d’extraction et d’amplification d’ADN

Ne permet pas d’identifier des espèces inconnues

Puce à ADN Hybridation entre des sondes d’oligonucléotides et un échantillon marqué par un fluorochrome, la fluorescence est détectée par laser

Identification phylogénétique Rapide

Semi-quantitative

Biais d’extraction et d’amplification d’ADN Limite de détection

Séquençage de clone d’amplicon d’ARNr 16S

Clonage de l’ARN 16S, méthode Sanger, électrophorèse capillaire

Identification phylogénétique Biais d’extraction et d’amplification d’ADN Laborieuse

Biais de clonage Séquençage direct

d’amplicons d’ARNr 16S

Séquençage haut débit d’amplicons d’ARNr 16S (454, SOLiD, Illumina)

Identification phylogénétique Rapide

Semi-quantitative (abondance) Identification de bactéries inconnues

Biais d’extraction et d’amplification d’ADN Laborieuse

Coûteuse

Séquençage shotgun du microbiome

Séquençage haut débit du génome entier

Identification phylogénétique Semi-quantitative (abondance)

Coûteuse

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1.1.5.1 La PCR en temps réel (qPCR)

La PCR quantitative, ou PCR en temps réel, permet la quantification de différents phylums ou différentes espèces du microbiote [74, 75]. Bien que cette méthode soit rapide et relativement peu coûteuse, elle ne permet pas de quantifier l’intégralité du microbiote car seuls les phylums/espèces ciblés par les amorces le seront. De plus, elle ne distingue pas les cellules viables des non viables, à moins qu’un agent intercalant inhibiteur de PCR tel que le propidium monoazide ne soit utilisé. Ce dernier étant capable d’atteindre et de se fixer au matériel génétique des cellules endommagées empêche leur amplification par qPCR et donc leur quantification [76].

1.1.5.2 Les techniques d’empreintes moléculaires

Les techniques d’empreintes moléculaires (DGGE, TGGE et T-RFLP) offrent une vision globale sur le profil des populations microbiennes par comparaison du polymorphisme des amplicons d'ADN issus d’un échantillon.

La DGGE est une technique d’électrophorèse en condition dénaturante (généralement, urée) qui permet de séparer les multiples amplicons issus d’un échantillon en fonction de leur poids moléculaire et de leur séquence. Ces amplicons peuvent ensuite être extraits du gel pour être séquencés [77]. La TGGE est une méthode similaire mais basée sur un gradient de température [78, 79]. Ces deux méthodes ne permettent pas ou difficilement l’identification phylogénétique des échantillons.

La T-RFLP est une méthode basée sur la digestion des amplicons par des endonucléases de restriction [80]. Un profil de l’échantillon est obtenu après séparation par électrophorèse en condition non dénaturante. Cette méthode est principalement utilisée pour évaluer la diversité et comparer la variabilité du microbiote [80, 81]. Bien que cette méthode soit rapide et relativement peu coûteuse, sa limite de détection est relativement haute.

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1.1.5.3 Les techniques d’hybridation

Les techniques d'hybridation (FISH et puces à ADN) sont basées sur la complémentarité entre des sondes oligonucléotidiques spécifiques et des séquences cibles de l'ADN bactérien. Les sondes utilisées pour le FISH sont marquées avec un fluorochrome. Une fois l’hybridation effectuée, les espèces ciblées par les sondes peuvent être énumérées manuellement à l’aide d’un microscope optique ou par cytométrie de flux [82, 83]. Au même titre que la qPCR, le FISH ne permet pas de quantifier les espèces inconnues et ne distingue pas les cellules viables des non viables.

Les puces à ADN sont constituées de sondes d’oligonucléotides immobilisées sur une matrice solide telles qu’une lame de verre. L’hybridation entre l’échantillon préalablement marqué par un fluorochrome et les sondes induit une fluorescence détectable par un laser. Cette technologie fournie une identification phylogénétique du microbiote intestinal [84] qui est principalement utilisée pour comparer différents microbiotes [85, 86]. La principale limite de cette méthode réside dans sa limite de détection relativement haute.

1.1.5.4 Les méthodes de séquençage

Les méthodes de séquençage (séquençage à partir de banques de clones d’ARNr 16S, d’amplicons d’ARNr 16S et d’ADN génomique) ont pour but de déterminer, à l’aide de la séquence d’acides nucléique, l’identité des membres d’un écosystème d’intérêt.

Le séquençage de banques de clones d’ARNr 16S nécessite d’abord la production de clones. Le séquençage des inserts permet d’identifier et de déterminer l’abondance du microbiote intestinal [87], mais, compte tenu de la possibilité de ne séquencer qu’un seul insert à la fois, la profondeur de séquençage reste la limitation majeure de cette méthode [88, 89].

Les méthodes de séquençage à haut débit développées depuis les années 2000 permettent d’éliminer l’étape de clonage de la précédente méthode et sont effectuées à partir d’amplicons (séquençage direct d’amplicons d’ARNr 16S) ou directement d’ADN génomique total (aussi appelé métagénomique du microbiome). Ces méthodes se résument en trois étapes : la

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préparation et l'amplification des échantillons à analyser (amplicons d’ARNr 16S ou ADN), ensuite l'incorporation des bases complémentaires du brin à séquencer enfin la lecture de la séquence.

Les principales technologies de séquençage à haut débit (next-generation sequencing, NGS) utilisées actuellement sont les systèmes Life Sciences 454, Life Technologies avec son système ABI SOLiD, et Illumina (Solexa). Ces différentes technologies permettent l’identification phylogénétique, l’abondance microbienne (semi-quantitative) mais elles sont très laborieuses, coûteuses et demandent beaucoup de travail de traitements de données. La technologie Roche 454 est basée sur le pyroséquençage. Le matériel génétique est fragmenté puis un seul fragment est fixé sur une bille. Il s’en suit une étape d'amplification par PCR en émulsion. Le mélange obtenu est ensuite déposé sur une plaque. La réaction de séquençage par synthèse est alors initiée base par base. La lecture de chaque base incorporée est révélée à l'aide d'une réaction chemoluminescente et détectée par une caméra [90, 91]. Cette méthode a été utilisée par exemple dans l’évaluation de l’impact d’antibiotique sur le microbiote intestinal [92] et dans le projet du microbiome humain [93]. C’est une méthode rapide et une longueur de lecture de 700 bp mais qui comporte certains inconvénients comme un haut taux d’erreurs de lecture lorsqu’il y a présence d’homopolymères (nt ≥ 6) et un faible débit comparé aux autres technologies (NGS).

La technologie Applied Biosystems SOLiD est basée sur le séquençage par ligation. L’étape d'amplification est identique à celle du pyroséquençage. Par contre, les séquences amplifiées sont fixées sur un support solide au lieu d'une plaque. La réaction de séquençage s'effectue ensuite par un système assez complexe de cycles de ligation et de clivage [90, 91]. Cette méthode a été utilisée pour l’étude du microbiote intestinal [94]. Son principal avantage est la précision du séquençage mais a pour inconvénient la longueur des lectures (75 bp). La technologie Illumina est basée sur le séquençage à l’aide de terminateurs réversibles. L'amplification de l'échantillon s'effectue sur un support solide. La réaction de séquençage se déroule position après position en ajoutant un mélange contenant toutes les bases associées

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chacune à un fluorophore différent. L'extrémité de ces bases est protégée pour empêcher l’addition de bases supplémentaires à chaque cycle d’incorporation. Le clivage des fluorophores permet ensuite l'incorporation de la base suivante. La lecture est effectuée ainsi cycle après cycle [90, 91]. Cette méthode a été utilisée pour l’étude comparative de microbiote [95] et dans le projet du microbiome humain [93]. Cette méthode a comme principal inconvénient la longueur des lectures (150 bp).

1.1.6 Modèles in vitro de fermentation pour étudier le microbiote colique

De nombreux modèles de fermentation in vitro ont été proposés afin de simuler le microbiote colique humain. Ces modèles présentent une opportunité inégalée pour la réalisation d’études souvent contestées chez les humains et les animaux en raison des préoccupations éthiques. La conception et la complexité de ces systèmes in vitro de fermentation ont engendré une multitude de modèles allant de simples modèles en «batch» à des modèles en continu avec plusieurs niveaux avec une multitude de technique d’inoculation fécale [96-100]. L’usage de ces modèles permet d’étudier un microbiote intestinal complet et stable pendant une période de temps définie et spécifique au modèle utilisé. La sélection du modèle approprié nécessite une évaluation minutieuse des objectifs de l’étude étant donné les avantages et les limites exposés par chacun des types de système (tableau 1.3)

1.1.6.1 Les systèmes de fermentation en «batch»

Les fermentations en «batch» sont des modèles statiques et décrivent la croissance d’une suspension bactérienne dans un milieu sélectionné. Ces modèles sont généralement constitués de bouteilles refermant une suspension de matières fécales et du milieu étudié dans des conditions anaérobes. Ces modèles sont utilisés pour l’évaluation de l’utilisation de certains composants alimentaires tels que des polysaccharides ou des fibres comme potentiels prébiotiques [101, 102]. Ils sont aussi utilisés pour l’étude des profils métaboliques des AGCCs résultant de la métabolisation des composés alimentaires par le microbiote intestinal [98, 103]. Ces systèmes sont faciles d’utilisation, peu coûteux ce qui permet de tester rapidement un grand nombre de substrats et/ou d’échantillons fécaux. Par contre, certains

Figure

Figure 1.1 Composition de la flore bactérienne dans les différentes parties du tractus gastro- gastro-intestinal (adapté de [18, 21, 24])
Tableau 1.2 : Avantages et limites des modèles in vitro de fermentation [118].
Figure  1.2  Représentations  schématiques  de  (1)  la  région  PaLoc  (19,6 kb)  contenant  les  gènes codant la toxine A et la toxine B et (2) l’organisation des domaines des toxines A et B  de C
Figure 1.3 Mode d’action des toxines A et B (adapté de Shen [162]).
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