IDENTIFICATION DES DETERMINANTS MOLECULAIRES DE LA LIAISON ET DE L'ACTIVATION DU RECEPTEUR AT, DE L'ANGIOTENSINE II
par
MARTIN CLEMENT DEPARTEMENT DE PHARMACOLOGIE
These presentee a la Faculte de Medecine et des Sciences de la Sante en vue de l'obtention du grade de
Philosophiae Doctor (Ph.D.) en Pharmacologie
Septembre 2009 Evaluateurs
Dr. Pierrette Gaudreau du Centre de Recherche du CHUM Dr. Marek Rola-Pleszczynski du departement de pediatrie
Dr. Guylain Boulay du departement de pharmacologie Dr. Emanuel Escher du departement de pharmacologie
1*1
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Canada
IDENTIFICATION DES DETERMINANTS MOLECULAIRES DE LA LIAISON ET DE L'ACTIVATION DU RECEPTEUR AT, DE L'ANGIOTENSINE II
Martin Clement Universite de Sherbrooke Departement de Pharmacologic
These presentee a la faculte de Medecine et des sciences de la sante En vue de l'obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)
Les recepteurs couples aux proteines G (GPCR) sont formes de sept domaines transmembranaires. Cette famille de recepteur fait I'objet d'etudes qui visent a comprendre leurs fonctions, leurs interactions avec leurs ligands, les changements de conformations produits suite a cette liaison ainsi que leur mecanisme d'activation.
Notre hypothese est que le recepteur humain de l'angiotensine II de type 1 (hATi) possede des determinants moleculaires responsables de sa liaison a l'angiotensine II (Angll). Nos objectifs sont d'identifier des determinants moleculaires responsables de sa liaison a Angll, ainsi que d'identifier des changements de conformations generes suite a cette liaison. Dans un premier temps, les determinants de la liaison de la position C-terminale de I'Angll ont ete identifies directement grace a des etudes de photomarquage par affinite sur le recepteur hAT). Ces etudes nous ont permis d'observer que l'acide amine photoactivable utilise, le /?ara-benzoyl-Z-phenylalanine (Bpa), presentait une selectivity prononcee pour la methionine. Nous avons exploite cette selectivite du Bpa pour mettre au point une nouvelle approche : l'essai de proximite aux methionines (MPA). Afin de determiner 1'environnement tridimensionnel de la position C-terminale de I'Angll dans le recepteur hATi, nous avons dans un premier temps etudie les domaines transmembranaires (TMD) III, VI et VII en mutant individuellement chacune des positions par une methionine. Cette etude a permis de determiner 1'orientation relative des residus identifies de chaque TMD formant la pochette de liaison. Nous avons fait une etude MP A comparative avec le mutant constitutivement actif NlllG-hATi, afin de pouvoir determiner des changements de hATi qui surviennent lors de 1'activation, sur les TMD III, VI et VII et avons trouve qu'une seule difference. La conclusion de l'etude impliquait un mouvement du TMD VI lors de 1'activation. Dans une autre etude, les 4 derniers TMD (I, II, IV, V) ont ete etudies a la fois a l'etat basal et actif. Cette etude permit d'identifier que les TMD II et V participent a la formation de la pochette de liaison de I'Angll dans la forme active uniquement, impliquant des mouvements dans ces 2 TMD aussi. Suite a 1'identification des residus des TMD participant a la structure de la pochette de liaison, dans la forme active ou inactive, nous avons construit des modeles du recepteur hATi ligande dans la forme inactive et de la forme constitutivement active et les avons compares. L'ultime but de ce projet est de presenter un modele d'activation general des GPCR mais plus concretement une meilleure comprehension des bases moleculaires de la liaison, de l'activation et des changements conformationnels d'un GPCR.
Mots Cles : Recepteurs couples aux proteines G, Recepteur humain de l'angiotensine II de type 1, Activation constitutive, Methionine Proximity Assay, para-benzoy\-L-phenylalanine.
TABLE DES MATIERES
LISTE DES PUBLICATIONS IV
1. PUBLICATIONS PRESENTEES DANS CETTE THESE IV
2. PUBLICATIONS EFFECTUEES DURANT LES ETUDES DE 3E CYCLE V
LISTE DES ILLUSTRATIONS VI
LISTE DES TABLEAUX X
LISTE DES ABREVIATIONS XI
RESUME XIII
INTRODUCTION 1
1.1. L'Angiotensine II 3
1.1.1. Le systeme renine-angiotensine 3
1.1.2. L'angiotensine II 6
1.2 Les recepteurs de l'angiotensine II 8
1.2.1 Le recepteur AT] 9
1.2.1.1 Caracteristiques 9
1.2.1.2 Expression et localisation 11
1.2.1.3 Fonctions et voies de signalisation 12 1.3 Mecanismes moleculaires impliques dans 1'activation des recepteurs
couples auxproteines G 13
1.3.1 Activation constitutive du recepteur AT] 14 1.3.2 Techniques utilisees dans les etudes conformationnelles 17 1.3.3 Marquage par photoaffinite des recepteurs 19
1.3.4 Liaison de l'angiotensine II au recepteur ATi 23 1.3.4.1 Donnees sur la conformation du recepteur ATi... 23 1.4 Changements conformationnels impliques dans l'activation des
recepteurs couples auxproteines G 31
1.5 Justification de l'etude 37
RESULTATS 41
Article 1 : Determining the environment of the ligand binding pocket of the angiotensin II hATi receptor using the methionine proximity assay
42 Article 2 : The Active and the Inactive Form of the hATl Receptor have an
Identical Ligand Binding Environment; an MPA Study on a Constitutively Active Angiotensin II Receptor Mutant
84 Article 3 : Activation induces structural changes in the liganded angiotensin
II type 1 receptor 116 DISCUSSION 163 CONCLUSION 175 REMERCIEMENTS 178 BIBLIOGRAPHIE 180
LISTE DES PUBLICATIONS
1. Publications presentees dans cette these
Martin Clement, Stephane S. Martin, Marie-Eve Beaulieu, Caroline Chamberland, Pierre Lavigne, Richard Leduc, Gaetan Guillemette, and Emanuel Escher (2005) Determining the environment of the ligand binding pocket of the angiotensin II hATi receptor using the methionine proximity assay. Journal of Biological Chemistry: July 22, Vol. 280, Issue 29: p. 27121-27129.
Martin Clement, Caroline Chamberland, Jacqueline Perodin, Richard Leduc, Gaetan Guillemette, and Emanuel Escher (2006) The Active and the Inactive Form of the hATl Receptor have an Identical Ligand Binding Environment; an MPA Study on a Constitutively Active Angiotensin II Receptor Mutant. Journal of Receptors and Signal Transduction: Vol. 26, Numeros (5-6): p.417-433.
Martin Clement, Jerome Cabana, Brian J. Holleran, Richard Leduc, Gaetan Guillemette, Pierre Lavigne, and Emanuel Escher (2009) Activation induces structural changes in the liganded angiotensin II TYPE 1 receptor. Journal of Biological Chemistry, September 25; Vol. 284, Issue39: p.26603-26612.
2. Autres publications effectuees durant les etudes de 3e cycle
Arsenault J., Renaud M.P., Clement M., Fillion D., Guillemette G., Leduc R., Lavigne P., Escher E. (2007) Temperature-dependent variations of ligand-receptor contact points inhATl. JPept Sci. Sep; 13(9): 575-80.
Clement M., and Escher E. (2006) The methionine proximity assay: an approach to glean receptor structures. Med Sci (Paris). Dec;22, (12): 1017-8.
Lanctot P.M., Leclerc P.C, Clement M., Auger-Messier M., Escher E., Leduc R., and Guillemette G. (2005) Importance of N-glycosylation positioning for cell-surface expression, targeting, affinity and quality control of the human ATI receptor. Biochem J. Augl5;390(Ptl):367-76.
Martin S.S., Boucard A.A., Clement M., Escher E., Leduc R., and Guillemette G. (2004) Analysis of the third transmembrane domain of the human type 1 angiotensin II receptor by cysteine scanning mutagenesis. J Biol Chem. Dec 3;279(49):51415-23.
Auger-Messier, M., Clement, M., Lanctot, P.M., Leclerc, P.C., Leduc, R., Escher, E., and Guillemette, G. (2003) The constitutively active N111G-AT1 receptor for angiotensin II maintains a high affinity conformation despite being uncoupled from its cognate G protein Gq/llA. Endocrinology Dec;144(12):5277-84.
LISTE DES ILLUSTRATIONS
Figure 1 : Voies de signalisation dependante et independante des proteines G pour
le recepteur ATi 4
Figure 2 : Le systeme renine-angiotensine (SRA) 5
Figure 3 : Representation bidimensionnelle du recepteur de 1'AngII de type 1
humain (hATj) 10
Figure 4 : Mecanisme reactionnel de la benzophenone 20
Figure 5 : Selectivity du Bpa aux Methionines 24
Figure 6 : Modele du complexe ATi-Angll propose par Inagami etal. (1995) 25 Figure 7 : Modele moleculaire d'interaction Angll et ATi provenant des etudes de
mutagenese SD propose par Paiva et al. (1998) 27
Figure 8 : Modelisation des helices a du recepteur de I'angiotensine de type 1 de rat
(AT1A) propose par Balmforth et al. (1997) 28
Figure 9 : Modelisation moleculaire de la pochette de liaison du recepteur ATi et de
Figures de 1'article 1
Figure 1A : Primary structure of Angll and the photoreactive Angll analogues 47 Figure IB : Photolabelling of wt and Met-mutants of the hATi receptors 58 Figure 2 : Snake plot representation of the hATi receptor 59 Figure 3 A : CNBr cleavage of photolabelled wt and TMD III mutant hATi
receptors 60
Figure 3B : Schematic degradation patterns of photolabelled hATi and TMD III
mutants 61
Figure 4A : CNBr cleavage of photolabelled wt and TMD VI mutant hATi receptors 62 Figure 4B : Schematic degradation patterns of photolabelled hATi and TMD VI
mutants 63
Figure 5A : CNBr cleavage of photolabelled wt and TMD III mutant hATi
receptors 64
Figure 5B : Schematic degradation patterns of photolabelled hATi and TMD VII
mutants 65
Figure 6 : Reaction scheme of photoactivated Bpa with a Met residue and the
ensuring CNBr cleavage products 74
Figure 7A : Molecular model of the [Sar , Bpa ] Angll liganded hATi receptor. Side
view 71
1 8
Figure 7B : Molecular model of the [Sar , Bpa ] Angll liganded hATi receptor. Top
Figures de l'article 2
Figure 1 : Functional properties of the wild-type and NlllG-hATi receptors: IP
production 97
Figure 2 : Snake plot representation of the hATi receptor 98 Figure 3 : CNBr cleavage of photolabelled wt and TMD III mutant NlllG-hATi
receptors 103
Figure 4 : CNBr cleavage of photolabelled wt and TMD VI mutant hATj receptors 104 Figure 5 : CNBr cleavage of photolabelled wt and TMD VII mutant hATi
receptors 105
Figures de l'article 3
Figure 1 : Primary structure of Angll and the photoreactive Angll analogue 122 Figure 2 : Snake plot representation of the hAT] receptor 134 Figure 3 : Photolabeling of wt-hATi, NlllG-hAT,, and the Met-mutants of the
hAT! receptor with 125I-[Sar\ Bpa8]AngII 140
Figure 4A : CNBr cleavage of the photolabeled wt-hATi and TMD I mutant hAT]
receptors 141
Figure 4B : Schematic degradation patterns of photolabeled wt-hAT1? NlllG-hATi,
Figure 5A : CNBr cleavage of the photolabeled wt-hAT,, NlllG-hAT, and TMD II
mutant NlllG-hATi receptors 143
Figure 5B : Schematic degradation patterns of photolabeled wt-hATi, NlllG-hATi
and TMD II mutant-Nil lG-hAT, receptors 144
Figure 6A : CNBr cleavage of the photolabelled wt-hATi, NlllG-hAT, and TMD V
mutant NlllG-hAT, receptors 145
Figure 6B : Schematic degradation patterns of photolabeled wt-hAT,, NlllG-hAT,
and TMD V mutant NlllG-hAT, receptors 146
Figure 7 : Basal levels of IP in COS-7 cells expressing the wt-hAT, and mutant
hAT, receptors 148
Figure 8 A : Molecular model of the [Sar1, Bpa8]AngH liganded wt-hAT, receptor
154 Figure 8B : Molecular model of the [Sar1, Bpa8]AngII liganded NlllG-hAT,
receptor 155
Figure 8C : Overlap of the molecular models of the [Sar1, Bpa8]AngII liganded
LISTE DES TABLEAUX
Tableau de 1'article 1
Tableau I : Binding properties of T25I-[Sar1, Ile8]AngII to methionine-substituted
hATi mutant receptors and the respective KD values of [Sar1, Bpa8]AngII (") and
[Sar'^'-OMe-BpaVngll^) 68
Tableau de 1'article 2
Tableau I : Binding properties of 125I-[Sar\ Ile8]AngII to methionine-substituted
NlllG-hATi mutant receptors and the respective KD value of [Sar1,
Bpa8]AngII 99
Tableaux de l'article 3
1 8
Tableau I : Binding properties of [Sar , Bpa ]AngII to methionine-substituted
hATi mutant receptors 135
Tableau II : Binding properties of [Sar , Bpa ]AngII to methionine-substituted
LISTE DES ABREVIATIONS Abreviation AC AngI AngH AngHI ATi AT2 Bmax BP Bpa BSA CAM CNBr DAG DDT DMEM ECA ECL EPR GPCR GRK Nom complet Adenylate cyclase Angiotensine I Angiotensine II Angiotensine III
Recepteur de 1' angiotensine II de type 1 Recepteur de 1'angiotensine II de type 2 Capacite maximale de liaison
Benzophenone
Benzoylphenylalanine Albumine de serique bovine Mutant constitutivement actif Bromure de cyanogene Diacylglycerol
Dithiothreitol
Dulbecco's modified eagle medium Enzyme de conversion de 1'angiotensine Boucle extracellulaire
Spectroscopic a resonnance paramagnetique a electron Recepteur couple aux proteines G
IC50 IP IPs JAK/STAT JNK KD MAPK MPA PBS PCR PKC PLC SCAM SDS SNC SRA TFA TMD diazol-4-yl) ethylene-diamine)
Concentration inhibant a 50% la liaison specifique du radioligand Inositol phosphate
Inositol 1, 4, 5-trisphosphate
Janus Kinases/Signal Transducer and Activator of Transcription Kinase Jun
Constante de dissociation a l'equilibre MAP kinase
Methionine Proximity Assay (Essai de proximite aux Methionines) Phosphate buffered saline (Tampon phosphate salin)
Reaction de polymerisation en chaine Proteine kinase C
Phospholipase C
Substituted cysteine accessibility method
(Methode d'accessibility aux cysteines substitutes) Sodium dodecyl sulfate
Systeme nerveux central Systeme renine-angiotensine Acide trifluoroacetique
Transmembrane Domain (domaine transmembranaire) Ultra violet
INTRODUCTION
En pharmacologic, l'etude des GPCR est d'une importance capitale. En effet, on estime que 40% des medicaments developpes par l'industrie pharmaceutique ciblent cette famille de proteines membranaires (BRINK et al, 2004), alors qu'elle represente entre 1 et 2% des proteines encodees par le genome des mammiferes (FREDRIKSSON et al, 2003) (LANDER et al, 2001). Les ligands ciblant les GPCR sont tres divers soit: les photons, les ions, les peptides et memes de grosses molecules telles les glycoproteines et les phospholipides (MAUDSLEY et al, 2005). L'acquisition de nouvelles connaissances sur cette classe de proteines est necessaire tant au niveau fondamental, que clinique.
Les GPCR possedent sept domaines transmembranaires (TMD) hydrophobes, relies entre eux par trois boucles intracellulaires et trois boucles extracellulaires hydrophiles. L'extremite N-terminale du recepteur se trouve du cote extracellulaire alors que l'extremite C-terminale est du cote intracellulaire. II existe une methode de classification des GPCR selon leur homologie avec des recepteurs prototypiques (ATTWOOD et FINDLAY, 1994; GETHER, 2000; KOLAKOWSKI, 1994). Ces diverses classes de GPCR presentent des differences de localisation de leurs sites de liaison. Les GPCR de la famille de la rhodopsine, la classe A, represente environ 90% des GPCR connus. La pochette de liaison du ligand est formee a la fois par des residus des TMD et des residus des domaines extracellulaires. Chez les recepteurs de la classe B (famille des recepteurs de la secretine), les sites de liaisons se retrouvent dans les domaines extracellulaires et au niveau du long domaine N-terminal. Quant aux sites de liaison des recepteurs de la classe C (famille des recepteurs du glutamate), ils sont
exclusivement dans les domaines extracellulaires et principalement dans lew colossal domaine N-terminal.
La transmission du signal du cote intracellulaire se produit principalement suite a la liaison specifique du ligand sur son recepteur. Le ligand agoniste provoque un changement conformationnel permettant au recepteur d'activer ses effecteurs. Les GPCR activent principalement les proteines G heterotrimeriques (VAUGHAN, 1998). L'activation de ces proteines G module l'activite de plusieurs voies de signalisation telles que la phospholipase C (PLC) via la proteine Gq et l'adenylate cyclase via les proteines Gs et Gi (GILMAN, 1987; SIMON et al, 1991). Bien que principalement associes aux proteines G, les GPCR peuvent activer d'autres voies de signalisation. Par exemple, I'activation de la voie des kinases mitogenes (MAPK), traditionnellement associee a I'activation de recepteur de type tyrosine kinase, peut aussi etre activee par les GPCR (MAUDSLEY et al, 2000; SHAH et al, 2006). Certaines voies sont meme activees independamment des proteines G (RAJAGOPAL et al, 2005).
Historiquement, la premiere voie independante des proteines G a etre identified fut la voie JAK/STAT (Janus Kinases/Signal Transducer and Activator of Transcription). JAK2 est une tyrosine kinase recrutee a la queue cytoplasmique du recepteur ATi d'une facon agoniste dependante, menant a I'activation de STAT1/2 (MARRERO et al, 1995). De plus, le recepteur AT] peut mener a une activation independante des proteines G via Src qui active Ras et ultimement ERK (SETA et al, 2002). Les regulateurs de la transduction du signal des GPCR, les kinases des GPCR (GRK) et les P-arrestines, sont des candidats intrigants. Les GRK catalysent la phosphorylation des serines/threonines a plusieurs endroits sur la queue cytoplasmique des GPCR, ce qui recrute les p-arrestines
(KOHOUT et LEFKOWITZ, 2003). Ce recrutement desensibilise les GPCR, le resultat est une diminution du signal de la proteine G dependante (Fig. 1) (KOHOUT et LEFKOWITZ, 2003). De plus, les GRK et les P-arrestines effectuent une fonction de transduction du signal independante (KOHOUT et LEFKOWITZ, 2003). Ainsi, le systeme GRK/p-arrestine est bifonctionnel, il initialise des voies de signalisation independantes des proteines G de meme qu'il inactive la signalisation dependante des proteines G.
1.1. L'ANGIOTENSINE
1.1.1 Le systeme renine-angiotensine
Meme si les fonctions de certaines composantes du systeme renine-angiotensine (SRA) restent encore a elucider, les effets biologiques de ce systeme sont le centre d'interet d'un grand nombre d'etudes depuis plusieurs annees, notamment a cause de son role dans la regulation de l'homeostasie cardio-vasculaire ainsi que de son implication dans la pathophysiologie de l'hypertension et dans les alterations des structures vasculaires du coeur et des reins. Le SRA comprend plusieurs composantes dont la principale hormone active est l'angiotensine II (Angll) possedant de nombreux roles physiologiques. Plusieurs agents therapeutiques agissent directement sur le SRA permettant le controle de la pression sanguine.
La cascade d'evenements conduisant a la synthese d'Angll implique la liberation de renine et la presence de precurseurs et d'enzymes (Fig. 2). La renine (EC 3.4.23.15) est une aspartyl protease, provenant de la maturation de la pro-renine qui est secretee dans la circulation en reponse a la stimulation du recepteur Pi-adrenergique au niveau de
l'appareil juxtaglomerular du rein ou encore suite a une baisse de la pression sanguine (HOBART et al, 1984). Le substrat de la renine, l'angiotensinogene, est une glycoprotein de 57 kDa synthetisee en majorite par le foie (TEWKSBURY, 1983). L'angiotensinogene est clive au niveau de sa partie N-terminal par la renine pour liberer un decapeptide de courte demi-vie, I'angiotensine I (AngI). Ce dernier est rapidement clive en C-terminal par une metalloprotease membranaire localisee a la surface des cellules endothelials et epitheliales, appelee enzyme de conversion de I'angiotensine (ECA) (EC 3.4.15.1) pour produire l'octapeptide actif, I'angiotensine II (Angll, Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe) ainsi qu'un dipeptide His-Leu. Le poumon est le principal organe implique dans la formation de 1'AngII etant donne une presence importante d'ECA au niveau de 1'endothelium vasculaire pulmonaire. L'ECA est egalement connue sous le nom de kininase II car elle inactive la bradykinine (STEWART et al, 1981). La synthese d'Angll peut se faire par une voie alternative, celle des chymases qui ont ete detectees au niveau des poumons, des vaisseaux sanguins et du coeur (DZAU et al, 1993). En plus du SRA plasmatique, plusieurs SRA locaux existent egalement dans des organes tels que le rein, le cerveau et les vaisseaux sanguins (TIMMERMANS et al, 1993).
1.1.2 L'angiotensine II
L'angiotensine II (Angll) est un octapeptide pouvant agir comme un neurotransmetteur ou encore comme une hormone paracrine et autocrine. II represente un mediateur important des fonctions du SRA et est responsable d'une grande variete d'effets physiologiques sur les systemes cardio-vasculaire, neuronal et endocrinien. L'inhibition pharmacologique de la production et des actions de 1'AngII sont des
de cette hormone dans I'hypertension ainsi que dans certaines maladies cardio-vasculaires.
L'Angll peut produire differents effets biologiques en se liant a ses recepteurs tel que decrit par De Gasparo et collaborateurs :
• Element regulateur cle dans l'homeostasie cardio-vasculaire : controle du tonus vasculaire (vasoconstriction), de la pression arterielle (myocarde), du rythme cardiaque et de la force de contraction.
• Stimulation de la proliferation cellulaire.
• Augmentation de la biosynthese et de la secretion d'aldosterone via la glande cortico-surrenale entrainant une reabsorption des ions Na+ au niveau
du rein et, par consequent, une retention hydrique. • Augmentation de la glycogenolyse au niveau du foie.
• Relache de la corticotropine par la medulla de la glande surrenale et relache de la vasopressine au niveau de l'hypophyse posterieure (SNC).
• Activites neuronales (SAAVEDRA, 1992). • Inflammation et l'apoptose.
• Facteur de croissance, dont son role dans I'hypertension et l'arteriosclerose. (De Gasparo et al, 2000)
L'Angll a une demi-vie de 3 min et est rapidement degradee par des carboxy- et des aminopeptidases, ainsi que des endopeptidases mettant fin a son activite biologique. En effet, I'Angll peut etre convertie en Anglll par I'aminopeptidase A (EC 3.4.11.7) suivi d'une degradation par I'aminopeptidase B (EC 3.4.11.6) ou I'aminopeptidase M (EC 3.4.11.2) afin de produire I'AnglV. D'un autre cote, I'Angll peut etre directement convertie en AnglV par la dipeptidylaminopeptidase III (EC 3.4.14.4). Une degradation de I'Angll par la carboxypeptidase P ainsi que la degradation de l'Angl par une endopeptidase neutre et la propylendopeptidase menent a la formation de l'Ang(l-7) (SANTOS et al, 1992) (Fig.2). Certains des produits de degradation de I'Angll comme 1'Anglll, I'AnglV (3-8) et l'Ang (1-7) ont egalement des effets biologiques (FERRARIO
etal, 1991; HARDING et al, 1992).
1.2. Les recepteurs de Pangiotensine II
L'Angll agit sur au moins deux sous-types distincts de recepteurs (AT] et AT2) qui ont pu etre identifies par la decouverte d'antagonistes non-peptidiques selectifs. Ces recepteurs ont ete caracterises et clones chez plusieurs especes (SANDBERG, 1994; TIMMERMANS et al, 1993) et lient le peptide vaso-actif Angll avec des affinites similaires (2-3nM). La plupart des effets physiologiques connus de I'Angll chez l'adulte, sont attribuables au recepteur ATi. La fonction du recepteur AT2 est quant a elle moins bien definie.
1.2.1 Le recepteur ATi
1.2.1.1 Caracteristiques
Le recepteur ATi est une proteine de 359 acides amines a 7 TMD (MURPHY et
al, 1991; SASAKI et al, 1991). Deux isoformes, ATia et ATib avec une similarity
saisissante dans leur sequence d'acides amines (95%), leur specificite pharmacologique et leurs mecanismes de signalisation, mais different dans leur distribution, leur localisation sur les chromosomes, leur structure genomique et la regulation de leur transcription. Les 2 sous types sont presents chez le rat et la souris, alors que seulement un sous type, nomme ATi, est trouve chez le bceuf, le pore, le lapin et l'humain (PULAKAT, 1999). Le recepteur AT] montre une haute affinite pour le DuP753 (Losartan) et le L-158,809, deux antagonistes specifiques a ATi, et est insensible au PD 123,177 et au PD 123,319, deux antagonistes specifiques a AT2. La sensibilite du
recepteur AT] au DTT suggere la presence de ponts disulfures permettant de maintenir la conformation tridimensionnelle « optimale » du recepteur (GUNTHER, 1984; OHYAMA
et al, 1995). Ces derniers sont les residus cysteines situes dans la partie N-terminale et les
trois boucles extracellulaires qui forment ces deux ponts disulfures (Cysl8-Cys274 et Cysl01-Cysl80) (Fig.3) (OHYAMA et al, 1995). La masse moleculaire apparente du recepteur glycosyle est de 60-110 kDa et de 40 kDa apres deglycosylation (DESARNAUD et al, 1993; SERVANT et al, 1996). Par gel SDS-PAGE, il a ete demontre que le recepteur ATi bovin migre a 60 kDa alors que le recepteur ATi humain migre a 110 kDa. Les variations de poids moleculaire pour le recepteur glycosyle seraient dues a differents degres de N-glycosylation (CARSON et al, 1987; LANCTOT et al,
N-glycosylation (Asn-X-Ser/Thr), soit un dans la partie N-terminale du recepteur (Asn4) et les deux autres dans la 2eme boucle extracellulaire (Asnl76 et Asnl88). La region
intracytoplasmique du recepteur ATi est composee de trois boucles intracellulaires et d'une queue C-terminale qui contient des sites de phosphorylation pour plusieurs serines/threonines kinases, incluant la proteine kinase C (PKC) et les kinases des GPCR (GRK).
1.2.1.2 Expression et localisation
Le gene codant pour le recepteur ATi humain est localise sur la bande q22 du chromosome 3, il contient 3 introns et 4 exons. L'expression du recepteur ATi peut etre stimulee par les glucocorticoi'des qui agissent via les trois elements de reponse aux glucocorticoi'des situes dans la region promoteur (GUO et al, 1995). La regulation de l'expression du recepteur ATi depend de differents types de stimuli tels que les gluco- et mineralocorticoides (DELLA et al, 1995), l'insuline (NICKENIG et al, 1998), Vinsulin
like growth factor I (WYSE et al, 1997), l'oxyde nitrique (ICHIKI et al, 1998),
1'epidermal growth factor (GUO et al, 1994). De nombreuses etudes ont montre que le recepteur ATi present sur les cellules musculaires lisses vasculaires est regule negativement par tous les acides trans-retinoi'ques (TAKEDA et al, 2000) et les oestrogenes, et est regule positivement par la progesterone (NICKENIG et al, 2000). L'expression vasculaire du recepteur AT] est regule par les taux locaux de noradrenaline; cette derniere regule negativement le recepteur ATj, au niveau de l'expression de l'ARNm et de la synthese de la proteine, au moins en partie par 1'activation du recepteur adrenergique type alpha-1 (DU et al, 1997).
Les recepteurs ATi et AT2 ont une distribution differente, ATi est largement exprime chez l'adulte, particulierement dans les organes impliques dans le controle cardio-vasculaire. Le recepteur ATi est present au niveau du systeme vasculaire, du cortex renal et surrenalien, du myocarde, du parenchyme pulmonaire, du foie, des fibroblastes matures et du cerveau.
1.2.1.3 Fonctions et voies de signalisation
Le recepteur ATi peut se coupler a une variete de proteines intracellulaires telles que Gq, Gj, les proteines JAK/STAT et les proteines activees par les mitogenes (MAP).
Dans les mecanismes d'action d'ATi, les phospholipases C, D, A2 ainsi que les canaux calciques dependants du voltage peuvent etre actives. Lorsque le recepteur ATi est stimule et se couple a la proteine Gj, il inhibe l'AC reduisant le niveau d'adenosine monophosphate cyclique (AMPc) et stimule l'ouverture des canaux calciques sensibles aux dihydropyridines (LASSEGUE et al, 1994). Parallelement aux sous unites as et OCJ
de la proteine G qui sont responsables de la regulation de l'AC, la sous unite aq active la
PLC de type p-1 induisant une hydrolyse du phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate pour generer le diacylglycerol (DAG) et l'inositol 1, 4, 5-trisphosphate (IP3). Le DAG stimule la PKC qui a son tour peut activer la voie des MAP kinases (MAPK) en phosphorylant une autre serine/threonine kinase, la proteine raf-1 (NISHIZUKA, 1988). D'autres recherches ont montre que le recepteur ATi pouvait induire 1'activation les tyrosine kinases JAK2, TYK2 et PYK2 (MARRERO et al, 1995) et 1'activation de la kinase Jun (JNK) (BLUME et al, 1999).
L'IP3 quant a lui se lie a son recepteur situe au niveau du reticulum endoplasmique, conduisant a une augmentation des niveaux de calcium intracellulaire (BERRIDGE et IRVINE, 1984). L'augmentation de Ca active la calmoduline qui a son tour active les proteines kinases dependantes de la calmoduline, ces dernieres phosphorylent les proteines telles que, c-fos, c-myc, c-jun afin de produire la reponse cellulaire (KLEE, 1988).
L'activation du recepteur AT] induit une variete d'actions dependamment du tissu. La plupart des effets physiologiques attribues a l'Ang II, tels que la regulation de la pression arterielle, la vasoconstriction, la reabsorption du sodium et de l'eau, la production d'aldosterone, la relache des catecholamines la proliferation cellulaire et 1'hypertrophic cardiaque se produisent via le recepteur ATV Le controle de la filtration glomerulaire, la resistance vasculaire renale et le transport epithelial tubulaire sont des actions renales de 1'AngII via les recepteurs ATi, qui predominent dans les glomerules, l'appareil juxtaglomerular et les tubes proximaux du rein humain adulte (CHUNG et UNGER, 1998).
1.3 Mecanismes moleculaires impliques dans l'activation des GPCR
La famille des GPCR possede des modes de liaison aussi varies que la nature chimique de ses ligands. Certains agonistes agissant sur le meme recepteur se lient dans des pochettes de liaison distinctes. II est done evident qu'il existe plusieurs facons de propager le signal et qu'il n'y a done pas de serrures communes pour tous les agonistes (SCHWARTZ et ROSENKILDE, 1996). II est cependant probable que les mecanismes
structuraux sous-jacents menant a l'activation des GPCR aient ete conserves au cours de revolution, puisqu'ils activent des voies de signalisation communes par la meme classe de proteine G.
1.3.1 Activation constitutive du recepteur ATi
La decouverte d'une activite basale chez certains GPCR permettant d'activer leur proteine G en absence d'agoniste (CHIDIAC et al, 1994; COSTA et HERZ, 1989; SAMAMA et al, 1994) fut une avancee importante. Certaines mutations permettent d'augmenter cette activite constitutive en absence d'agoniste de facon significative (ALLEN et al, 1991; KJELSBERG et al, 1992; LEFKOWITZ et al, 1993; SAMAMA et
al, 1993; SCHEERetal, 1996).
Les TMD du recepteur AT] portent elles aussi des contraintes intramoleculaires favorisant I'etat inactif. Cependant, les etudes effectuees sur le recepteur ATi identifierent d'abord des residus impliques dans la formation de I'etat actif. Les TMD II et VII furent cibles en premier lieu puisqu'ils possedent des residus cles responsables de l'efficacite de couplage du recepteur a la proteine G. La mutation de ces residus, la Tyr292 et l'Asp74, diminue la capacite du recepteur a activer la PLC (BIHOREAU et al, 1993; MARIE et al, 1994). Etant donne que la mutation individuelle ou double de la Tyr292 et de 1'Asp74 diminue la capacite du recepteur a activer la PLC de facon similaire, il fut alors suggere dans un premier modele que l'etablissement d'un lien hydrogene entre ces residus pouvait etre un element conduisant a I'etat actif (BIHOREAU et al, 1993). Par ailleurs, dans un effort de modelisation des formes actives et inactives du recepteur ATi, Joseph et collaborateurs ont propose qu'un residu puisse
jouer un role d'intermediate pour soutenir I'etat inactif et faciliter la transition vers I'etat actif (JOSEPH et al, 1995). Dans la forme inactive du recepteur, l'Asnl 11 se trouvant a etablir un lien hydrogene avec la Tyr292, cette interaction fut la premiere suspectee pour decrire un mecanisme d'activation du recepteur ATi. En considerant l'importance relative de l'Asp74 et de la Tyr292 dans I'activation du recepteur, les auteurs avaient propose le mecanisme suivant: suite a la liaison de 1'AngII dans la pochette de liaison, le lien hydrogene entre l'Asnl 11 et la Tyr292 serait brise. Ce bris provoquait la formation de nouveaux liens entre l'Asp74 et la Tyr292 de meme qu'une interaction entre la Tyr4 de 1'AngII et Asnl 11, ciblant alors le role central de l'Asnl 11 dans le processus d'activation. Le role bivalent de ce residu qui intervient autant dans le maintient de la forme inactive que dans la stabilisation de la forme active s'inscrit dans un schema d'une interaction importante entre le TMD III et le TMD VII, qui semble etre conservee au sein de la famille A des GPCR (BARANSKI et al, 1999; PAUWELS et WURCH, 1998; ROBINSON et al, 1992; SPALDING et BURSTEIN, 2001; STROSBERG, 1993). Cette hypothese fut par la suite supportee par des etudes de mutagenese dirigee qui ont apporte des elements solides au modele d'activation propose. En effet, la substitution de l'Asnl 11 par differents residus (Ala ou Gly) resulte en des recepteurs possedant une activite constitutive (GROBLEWSKI et al, 1997; NODA et al, 1996). II fut alors propose que la perte d'interaction entre la position Asnl 11 et la Tyr292, due a l'absence de formation de liens hydrogene dans ces recepteurs mutants, resultait en une diminution des contraintes intramoleculaires permettant ainsi de favoriser l'isomerisation du recepteur en son etat actif. II fut ensuite suggere que la taille de l'acide amine en position Asnl 11 serait tres importante pour stabiliser la forme inactive. En effet, la substitution de l'Asnl 11 par de
plus petits residus (Ala, Gly, Ser ou Cys) cause une activation constitutive alors que des residus plus volumineux (Asn, lie, Gin, His, Lys, Phe et Tyr) empechent celle-ci, allant meme jusqu'a diminuer I'activation du recepteur (FENG et al, 1998). Cependant, il fut aussi propose que l'environnement local autour du residu Asnl 11 puisse etre determinant. La construction d'une chimere comprenant le recepteur ATi avec le TMD III du recepteur AT2, a montre une activite constitutive identique, au mutant Asnl 11 sur le recepteur ATi, puisqu'un residu Asn ou Gly se trouvait a la position 111 (FENG et al, 1998). La sensibilite de cette position (3.35) a des mutations qui relachent des contraintes intramoleculaires semble repandue dans la famille A selon des etudes effectuees sur les recepteurs pi-adrenergiques, 02 adrenergiques, le recepteur B2 de la bradykinine et le recepteur CXCR4 des chemokines (MARIE et al, 1999; PEREZ et al, 1996; ZHANG et
al, 2002; ZUSCIK et al, 1998). Ces donnees viennent done souligner le role majeur
d'interaction entre le TMD III et le TMD VII du recepteur AT] et des GPCR en general dans le processus d'activation.
Les mutations conferant une activite constitutive au recepteur ATi etaient restreintes aux TMD, jusqu'a ce qu'une etude realisee par mutagenese aleatoire permette de decouvrir des domaines receptoriels qui font partie des boucles intracellulaires et qui sont sensibles a des mutations conferant de 1'activite constitutive (PARNOT et al, 2000). Ainsi, les recepteurs mutants Ile245Thr et Leu305Gln ont pu etre identifies dans la boucle intracellulaire 3 et la queue C-terminale respectivement. L'hypo these mise de l'avant pour expliquer le phenotype de ces recepteurs propose que le domaine de liaison avec la proteine G soit altere par de telles mutations, ce qui irait provoquer son decouplage fonctionnel du recepteur et I'activation de la PLC (PARNOT et al, 2000). Les
donnees provenant des recepteurs mutants a activite constitutive du recepteur AT| permettent d'assigner un role, a plusieurs domaines receptoriels, dans l'activation.
1.3.2 Techniques utilisees dans les etudes conformationnelles
II est important d'elucider la stereochimie des interactions existant entre un ligand et son recepteur pour comprendre le mecanisme d'activation de ce dernier. Afin de determiner les structures primaires de nombreux GPCR, beaucoup d'efforts ont ete fournis pour essayer de trouver les domaines des recepteurs impliques directement dans la liaison du ligand. Des approches pharmacologiques, biochimiques et biophysiques ont ete combinees pour identifier les regions et les residus d'interaction entre un ligand et son recepteur. La construction de recepteurs mutes par mutagenese dirigee ainsi que de recepteurs chimeriques ou encore de recepteurs avec des deletions, couplees a des approches de modelisation moleculaire permettent de determiner comment les interactions entre un ligand et les TMD de son recepteur peuvent resulter dans la formation d'une pochette de liaison et dans la reconnaissance bimoleculaire entre le recepteur et le ligand. Malheureusement, ces methodes plutot indirectes peuvent aussi modifier de facon plus ou moins importante la conformation generale du recepteur, en affectant les interactions intrinseques de la proteine, done ne refletant pas ainsi le comportement naturel du ligand dans sa pochette de liaison. Malgre cette eventualite de modification de 1'architecture du recepteur, la mutagenese dirigee reste un des outils frequemment utilises pour les etudes conformationnelles des recepteurs peptidergiques, notamment les recepteurs de 1'AngII.
Au cours des annees 90, des approches plus directes ont permis d'etudier la pochette de liaison de ces recepteurs. Ces methodes consistent a realiser un marquage par photoaffinite permettant de lier de facon covalente un ligand selectif radioactif a son recepteur et, par digestion chimique et/ou enzymatique du complexe en utilisant les sites de clivage endogenes, d'identifier les domaines ou residus impliques dans la liaison du photomarqueur. Les sites de liaison pour les recepteurs a 7 TMD des bioamines et des polypeptides ont ete identifies par cette aproche, notamment le recepteur adenosine A] (KENNEDY et al, 1996), recepteur p2 adrenergique (DOHLMAN et al, 1988;
STRADER et al, 1994), ATi et AT2 (LAPORTE et al, 1999; SERVANT et al, 1997), le
recepteur NK-1 de la substance P (LI et al, 1995), etc. Meme si le marquage par photoaffinite est un des outils biochimiques directs les plus utilises, peu de structures comprehensibles de GPCR emergent de ces efforts etant donne que la plupart des etudes determinent seulement un point de contact dans un recepteur donne, introduisant des restrictions insuffisantes pour realiser des modeles moleculaires representatifs de la realite. Pour une analyse approfondie, plusieurs points de contact sont necessaires, e.g. aux extremites du ligand et/ou avec leurs contacts a chaque extremite du recepteur.
Certaines etudes precedentes ont montre que le site de liaison des ligands de petite taille est plus souvent localise entre les TMD du recepteur (SCHWARTZ, 1994; STRADER et al, 1994). A l'oppose, les larges proteines telles que les hormones glycoproteiniques interagiraient a cause de leur encombrement avec les boucles extracellulaires et le segment terminal amine de leurs recepteurs respectifs (BALDWIN, 1994). Les caracteristiques de liaison des peptides les plus petits pourraient etre un intermediate entre les caracteristiques des bioamines et des glycoproteins, impliquant a
la fois les boucles extracellulaires et les TMD (SCHWARTZ et ROSENKILDE, 1996). Comme les peptides sont des ligands de plus grandes tailles et plus flexibles que les neurotransmetteurs classiques, ils ne possedent pas en general de structure secondaire ou tertiaire bien definie en solution. Done aucune generalisation n'est possible en ce qui concerne 1'organisation de ces peptides pour leurs recepteurs respectifs. Ils interagissent vraisemblablement avec un plus grand nombre de residus des recepteurs, rendant les etudes conformationnelles encore plus complexes que pour les ligands de petite taille.
1.3.3 Marquage par photoaffinite des recepteurs
Le principal objectif des approches de marquage par photoaffinite est d'immortaliser l'interaction reversible existant entre le ligand et le recepteur. En effet, avant 1'irradiation un equilibre est etabli entre le ligand et le site de liaison, qui maintient ces deux composes en proximite etroite et bien situes pour la formation d'un lien covalent. La plupart des etudes conformationnelles des GPCR peptidergiques ont ete realisees avec des analogues peptidiques contenant des groupements photosensibles tels que la benzophenone, I'aryl azide, les diazo esters et les diaziridines aromatiques, dont les insertions a certaines positions sont plus ou moins acceptees par le recepteur. Durant la photolyse, des intermediaires radicalaires hautement reactifs sont capables de s'incorporer dans la structure de la proteine en formant un lien covalent avec un acide amine situe dans leur environnement immediat (Fig. 4). Une benzophenone (Bp), le p-benzoyl-L-phenylalanine (Bpa) est tres rapidement devenu le groupement photoactivable le plus utilise car il possede plusieurs avantages compares aux autres groupements. En effet, il est beaucoup plus stable et disponible commercialement, il peut etre manipule a
la lumiere ambiante et il est active a une longueur d'onde de 350-360 nm qui n'endommage pas la proteine. De plus, I'etat excite du triplet biradicalaire est inerte envers l'eau, a l'oppose des groupements nitrenes et carbenes. Le Bpa reagit avec des liens C-H non reactifs, meme en presence d'eau et de larges nucleophiles. D'autres caracteristiques importantes du Bpa incluent sa capacite d'etre active de facon repetee (DORMAN et PRESTWICH, 1994) et son tres haut taux d'incorporation avec des liens C-H Gusqu'a 80%).
La formation de l'intermediaire reactif des derives BP via 1'irradiation UV est un phenomene dynamique et repetitif. La benzophenone absorbe un photon a une longueur d'onde de 350 nm, qui conduit au passage d'un electron de l'orbital de type sp2 non liante
de I'oxygene a I'orbitale 7i* anti-liante du groupement carbonyle. Dans I'etat triplet biradicalaire, I'orbitale n de I'oxygene deficiente en electron est electrophile et done, interagit avec les liens C-H a faibles, resultant en une abstraction d'hydrogene pour completer I'orbitale n a demie remplie. L'etat triplet relaxe vraiment jusqu'a I'etat basal s'il ne trouve pas de donneur d'hydrogene. Ce schema d'activation - inactivation par un photon est particulier a ce genre de groupements photosensibles. Le radical cetone hautement reactif produit durant la photolyse fait que Bpa retourne a son etat initial et peut reagir avec un second photon. Aussi longtemps que le radical cetone active ne se lie pas de facon covalente a un residu approprie du recepteur ou d'une autre molecule (e.g le ligand lui-meme), il reste a son etat d'origine et maintient ses proprietes de liaison et de photoactivation (TURRO, 1978).
Les precurseurs de la benzophenone de type carbene et nitrene, quant a eux subissent une seule et irreversible dissociation du groupement azote sous photolyse,
conduisant a des intermediates biradicalaires avec des demi-vie tres courtes. Les carbenes et nitrenes sont des composes fortement electrophiles qui peuvent exister sous la forme d'etat singulet ou d'etat triplet. Meme si les carbenes sont beaucoup plus reactifs que les nitrenes, leur chimie est relativement semblable. A Poppose de la benzophenone, les photoligands produisant les nitrenes et les carbenes ont en general des taux d'incorporation plus faibles, probablement a cause de leur photochimie irreversible a excitation unique.
Le Bpa est un groupement photoreactif repute jusqu'a maintenant pour etre non selectif, capable de reagir avec des residus aliphatiques dans un rayon de 3.1 A (DORMAN et PRESTWICH, 1994; LAPORTE et al, 1999; MACDONALD et al, 2001). Outre les facteurs geometriques, la reactivite et l'efficacite du lien covalent dependent fortement de l'environnement chimique et electronique du photophore et du groupement donneur d'hydrogene. La force du lien brise dans le groupement donneur et les stabilites relatives des radicaux alkyles resultant sont des facteurs determinants majeurs. Les sites particulierement reactifs incluent les centres tertiaires riches en electrons tels que les liens C-H des leucines et des valines et les groupes CH2 des heteroatomes dans les Lys, Arg et Met (DORMAN et PRESTWICH, 1994; SERVANT et al, 1997).
Dans plusieurs cas, la localisation exacte de l'acide amine en tant que point de contact a ete determinee pour des ligands peptidergiques contenant le Bpa. De maniere assez surprenante, une forte proportion des points de contact s'est revelee etre des residus methionines alors que ces dernieres sont assez rares dans les proteines. Cependant, des resultats recents ont montre que le Bpa possede une certaine selectivity pour les residus methionines, reduisant done la precision de la methode de marquage par photoaffinite
etant donne le transfert de charge uniquement possible avec cet acide amine (Fig 5.) (PERODIN et al, 2002). Afm de tourner ce probleme en avantage, cette propriete unique nous a permis de proposer et d'utiliter une nouvelle methode pour determiner les regions de contact des GPCR peptidergiques : « Methionine Proximity Assay (MPA)». Les residus de contact hypothetiques sont remplaces par des methionines via la mutagenese dirigee et sont ensuite photomarques avec les ligands contenant le groupement Bpa. Une incorporation reussie indique une proximite physique de ces residus et done la possibility que ces acides amines soient reellement les sites de contact entre le ligand et le recepteur ou encore que le site de contact se trouve a une distance tres proche de cette methionine. Dans notre etude, cette strategie est applique aux analogues de 1'AngII contenant la benzophenone se liant au recepteur ATi ainsi que certains mutants Phe293Met et Asn294Met et nous a permis de determiner plusieurs points de contact.
1.3.4 Liaison de 1'AngII aux recepteurs ATt
1.3.4.1 Donnees sur la conformation du recepteur ATi
La plupart des modeles tridimensionnels des complexes formes entre 1'AngII et le recepteur ATi, resultant d'etudes de mutagenese, ont place les domaines de liaison de 1'AngII sur l'interface membranaire extracellulaire du recepteur A1Y Plusieurs de ces modeles ont utilise aussi des approches de modelisation par ordinateur basees sur la conformation du ligand et des interactions electrostatiques satisfaisantes entre 1'AngII et AT] notamment Inagami et collaborateurs (Fig.6), Joseph et collaborateurs et Inoue et collaborateurs (INAGAMI, 1995; JOSEPH et al, 1995; INOUE et al, 1997). Les emplacements extracellulaires les plus extremes ont ete proposes par Paiva et
collaborateurs (Fig.7) ou par Balmforth et collaborateurs (Fig.8) (Paiva et al, 1998; BALMFORTH et al, 1997).
Dans les premiers modeles proposes, nombreux ont ete construits en se basant sur la structure de la bacteriorhodopsine. II est maintenant accepte que la bacteriorhodopsine n'est pas un bon modele pour les GPCR, etant donne le tres faible homologie avec cette famille et que 1'orientation relative des segments transmembranaires est differente (NIKIFOROVICH et MARSHALL, 2001). Cependant, pour comprendre la topographie d'interaction entre le ligand et son recepteur, 1'identification directe des residus impliques dans les points de contact, est une necessite pour des structures reflechies.
II a ete montre que 1'AngII pouvait adopter une structure tertiaire definie : les huit acides amines seraient maintenus sous la forme d'une epingle due a la formation d'un lien ionique entre le groupe amine terminale et le groupe carboxyle terminale. Trois residus de 1'Angll, Arg2, Tyr4, His6 ainsi que la partie carboxyle terminale libre seraient essentiels pour une haute affinite de liaison des recepteurs ATi alors que l'activite biologique serait conferee aux residus Tyr4 et Phe8. Par contre, les residus aliphatiques en positions 3, 5, 7 (Val3, Ile5 et Pro7) ne semblent pas etre impliques dans des interactions specifiques avec le recepteur etant donne que la substitution par une alanine n'affecte presque pas les activites biologiques. Recemment, il a ete montre que la position 3 de 1'Angll interagit directement avec l'Ilel72 dans le second domaine extracellulaire du recepteur ATi (Fig. 9)(BOUCARD et al, 2000).
Durant ces dernieres annees, une variete de mutants du recepteur ATi ont ete exprimees et testees pour la liaison des ligands et la production d'inositol phosphate. Plus
de 40 residus dans le recepteur ATi ont ete montres comme etant sensibles soit pour la liaison du ligand ou pour la transduction du signal. II y a un commun accord entre les etudes sur les recepteurs ATi que la lysine dans le TMD V (Lysl99) interagirait avec l'acide carboxylique libre de Phe8. Deux residus dans le TMD VI (Phe259 et Asp263) sont proposes pour ancrer His6 de I'Angll, de meme, la Lysl02 et la Serl05 dans la seconde helice sont aussi impliquees dans la liaison de I'Angll. Les regions extracellulaires du recepteur AT) interagissent avec le cote N-terminale charge de I'Angll. En effet, il a ete propose que l'Hisl83 interagisse avec l'Aspl, de meme que le residu Arg2 interagisse avec Asp281, dans la 3eme boucle extracellulaire (FENG et al,
1995).
Dans l'un des derniers modeles du recepteur ATi propose avant le debut de mes etudes graduees, ou des considerations steriques et energetiques ont ete prises en compte, Marshall a montre que le recepteur ATi et son ligand formaient une structure tres compacte avec une penetration significative du residu crucial Phe8 de I'Angll a l'interieur de la pochette de liaison (MARSHALL, 2001). L'environnement le plus proche des residus fonctionnellement importants Tyr4, His6 et Phe8 comprend 7 residus d'ATi, qui sont connus pour etre impliques dans la voie de signalisation ou l'activite constitutive, c'est a dire Phe77, Asnlll, Leull2, Trp253, His256, Tyr292 et Asn294. Une des principales differences de ce modele avec les precedents et que Phe8, mais par Tyr4 se trouve tres proche des residus extremement importants Asnl 11, His256, Tyr292, Asn294 et Asn295, profondement positionnes entre les helices des domaines transmembranaires. Ceci semble plus consistant avec les donnees experimentales montrant que I'analogue [Sar1,Bpa8]AngII se lie dans la region 285-295 du recepteur
AT]. Une autre difference significative apportee dans ce modele est que la transition conformationnelle de l'etat non occupe a l'etat occupe d'ATi n'est pas limitee a n'importe quelle interaction inter-residu specifique telle que Tyr292-Asp74. Au lieu de cela, le modele montre que le processus de transduction signaletique via les domaines transmembranaires du recepteur ATi est une chaine de plusieurs perturbations conformationnelles de chaines secondaires, qui est initiee par les residus directement affectes par la liaison de 1'AngII. Ceci signifie que la sensibilite d'un residu du recepteur a la liaison du ligand ou a la transduction signaletique, ne signifie pas que celui ci devrait necessairement etre en contact direct avec le ligand, il peut y avoir plusieurs voies impliquant ces residus dans des transitions conformationnelles (MARSHALL, 2001).
1.4 Changements conformationnels impliques dans l'activation des GPCR
La comprehension des mecanismes structuraux decrivant l'activation des recepteurs requiert le developpement de techniques permettant de fournir des informations sur la nature des changements physiques accompagnant la transition du recepteur de l'etat inactif a l'etat actif. Sheikh et collaborateurs ont utilise une approche dans laquelle des paires d'histidines ont servi comme sites de chelation de metaux tels que le zinc, aux extremites cytoplasmique des TMD III et VI chez la rhodopsine (SHEIKH et al, 1996). Celle-ci leur a permis de prevenir l'activation de la transducine par la rhodopsine suite a la reticulation d'une paire d'histidine via chelation du zinc. De facon indirecte, les auteurs demontraient que des mouvements entre ces deux domaines (TMD III et VI) pouvaient s'averer importants pour l'activation du recepteur. Ce meme schema a pu etre decrit par la suite autant pour le P2-adrenergique que pour le recepteur
de la parathormone qui est un membre de la famille B (SHEIKH et al, 1999). Ceci venait suggerer que les mecanismes d'activation pourraient etre conserves entre les membres de la famille A et B. De leur cote, Javitch et ses collaborateurs ont mis a profit la technique de (substituted cysteine accessibility method) pour supporter le schema d'activation du recepteur P2-adrenergique en se servant d'un recepteur constitutivement actif (JAVITCH
et al, 1997). Leur principale observation fut la decouverte d'une cysteine dans le TMD VI
du recepteur constitutivement actif, qui devenait accessible a un reactif charge specifique aux groupes sulfhydryles. Cette observation suggerait que le TMD VI subirait un rearrangement conformationnel decrivant une rotation dans le sens anti-horaire ou une inclinaison de l'helice. Si on assume que la conformation du recepteur CAM correspond a celle du recepteur natif par l'agoniste, ces donnees indiquent que le mouvement du TMD VI est un element important du mecanisme d'activation du recepteur.
Des techniques biophysiques permettant 1'analyse en temps reel des changements structuraux dans le recepteur ont aussi fourni une quantite precieuse de renseignements. II n'est pas surprenant que la majorite des etudes ont d'abord ete effectuees sur la rhodopsine etant donne l'abondance naturelle de ce recepteur et de sa stabilite inherente permettant ainsi la production et la purification de grandes quantites de proteines recombinantes. Les techniques biophysiques ainsi appliquees regroupent la spectroscopic infrarouge par transformee de Fournier, la spectroscopie a resonnance du plasmon de surface, la spectroscopie par absorbance d'UV sur residus tryptophane et la spectroscopie a resonnance paramagnetique a electron (EPR) (ALTENBACH et al, 1999a; ALTENBACH et al, 1999b; ALTENBACH et al, 1996; FARAHBAKHSH et al, 1995; GARCIA-QUINTANA et al, 1995; LIN et SAKMAR, 1996; ROTHSCHILD et al, 1983;
SALAMON et al, 1994). Ces approches ont toutes decrit que des mouvements significatifs survenaient lors de la transition de la rhodopsine vers la forme metarhodopsine II, qui constitue la forme du recepteur couplant la proteine G. En utilisant la spectroscopic par absorbance d'UV sur residus tryptophane, Lin et Sakmar purent obtenir les premieres evidences directes d'un mouvement relatif des TMD III et TMD VI suite a la photoactivation (LIN et SAKMAR, 1996). Ainsi, la mutation de residus tryptophane des TMD III et VI eliminait la difference spectrale dans le spectre d'absorbance UV qui distinguait la rhodopsine de la metarhodopsine II.
Dans une serie d'etudes tres elegantes par Farrens et collaborateurs, l'utilisation de la spectroscopic EPR couplee a de multiples substitutions par residus cysteines a pu fournir davantage d'indices sur la nature des changements conformationnels qui accompagnent la photoactivation de la rhodopsine (ALTENBACH et al, 1999a; ALTENBACH et al, 1999b; ALTENBACH et al, 1996; FARAHBAKHSH et al, 1995; FARRENS et al, 1996; KIM et al, 1997). Ainsi le marquage specifique de residus cysteines individuels, inseres dans les portions cytoplasmiques des domaine transmembranaires, a l'aide de marqueurs de spin nitroxide specifiques aux groupes sulfhydryles, a fourni des preuves des mouvements, particulierement des portions cytoplasmiques du TMD VI suite a 1'activation par la lumiere de la rhodopsine (ALTENBACH et al, 1999a; ALTENBACH et al, 1999b; ALTENBACH et al, 1996; FARAHBAKHSH et al, 1995; FARRENS et al, 1996; LANGEN et al, 1999). Dans le but d'identifier la nature des changements conformationnels, Farrens et collaborateurs ont pris avantage de 1'interaction entre les dipoles magnetiques de deux marqueurs de rotation nitroxide s'ils sont situes a moins de 25 A, resultant ainsi en un elargissement de
la ligne spectrale caracteristique (FARRENS et al, 1996). Ainsi, des paires de marqueurs de spin reagissant avec les groupes sulfhydryles furent incorpores dans une serie de doubles-mutants portant des substitutions par des residus cysteine permettant alors la mesure de changements relatifs de distances entre les TMD III et VI (FARRENS et al, 1996). Alors que le mouvement du TMD III fut interprete comme etant relativement minime, celui du TMD VI fut decrit comme un mouvement rigide de rotation dans le sens anti-horaire (vue extracellulaire) de meme qu'un eloignement de sa portion cytoplasmique par rapport au TMD III (FARRENS et al, 1996). Des donnees supplementaires concernant le mouvement du TMD VI suite a la photoactivation de la rhodopsine furent rapportees a l'aide de marquage fluorescent specifique aux residus cysteines inseres a l'extremite cytoplasmique de cette helice (DUNHAM et FARRENS, 1999). Les analyses spectroscopiques ont aussi permis d'observer de plus petits mouvements de la boucle intracellulaire 1 de meme que pour les portions cytoplasmiques des TMD III et VII (ALTENBACH et al, 1999a; FARAHBAKHSH et al, 1995; KLEIN-SEETHARAMAN et al, 1999). Altenbach et collaborateurs, ont pu demontrer un mouvement direct d'eloignement de la portion cytoplasmique du TMD VII par rapport au TMD I (ALTENBACH et al, 2001). Des changements mineurs ou inexistants ont ete observes concernant le mouvement des portions cytoplasmiques des TMD IV et V (ALTENBACH et al, 1996; FARAHBAKHSH et al, 1995).
Par ailleurs, la premiere analyse structurale directe des changements conformationnels encourus par un GPCR active par un ligand diffusible a ete effectuee a l'aide de techniques spectroscopiques de fluorescence (GETHER et KOBILKA, 1998; GETHER et al, 1997; GETHER et al, 1995). La technique de spectroscopic initialement
appliquee prenait avantage de la sensibilite qu'ont plusieurs molecules fluorescentes de reagir differemment selon la polarite de leur environnement local (GETHER et al, 1995). Le IANBD (N,N' dimethyl-N (iodoacetatyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-l, 3-diazol-4-yl) ethylene-diamine), un fluorophore reagissant avec les groupes sulfhydryles, a ete utilise dans le but de marquer les residus cysteine libres du recepteur p2-adrenergique purifie et solubilise dans un detergent (GETHER et al, 1995). La magnitude de remission spectrale de meme que I'accessibilite reduite de masqueurs hydrophiles suggeraient fortement qu'un ou plusieurs des cysteines transmembranaires endogenes etaient marquees (GETHER et al, 1995). Le recepteur marque au IANBD une fois stimule avec l'agoniste mena a une diminution reversible et dose-dependante de remission de fluorescence, corroborant ainsi un mouvement du fluorophore vers un environnement hydrophile suite a la liaison de 1'isoproterenol. L'exposition du recepteur marque au IANBD a des agonistes inverses menait de facon interessante a une augmentation apparente de la fluorescence suggerant que non seulement les agonistes, mais aussi les agonistes inverses peuvent provoquer des changements structuraux des GPCR (GETHER et al, 1995). Les cysteines responsables de la variation de fluorescence furent identifiees et localisees dans le TMD III et VI (Cysl25 et Cys285) suggerant que ces domaines pourraient subir un rearrangement suite a l'activation du recepteur (GETHER et al, 1997). Ainsi, a l'aide de simulations par ordinateurs, 1'orientation spatiale du IANBD lie aux deux cysteines en question, fut investiguee pour identifier la nature du changement conformationnel. En se basant sur un recepteur p2-adrenergique modelise par homologie de sequence avec la rhodopsine, la conformation la plus probable du IANBD lie a la Cysl25 se trouve a la jonction de la bicouche lipidique et de I'interface des TMD III et IV alors que la
conformation du IANBD lie a la Cys285 se trouve a l'interface du TMD VI et VII dans une zone frontaliere entre la bicouche lipidique et l'interieur plus polaire de la molecule de recepteur. Dans ce modele, la variation de fluorescence du recepteur p2-adrenergique lie au IANBD fut interpretee comme etant due a un mouvement de rotation anti-horaire des TMD III et VI qui deplacerait les molecules de IANBD d'un environnement lipidique non polaire jusqu'a l'interieur plus polaire de la molecule de recepteur (GETHER et al, 1997). Ce mouvement serait facilite par la presence d'un residu proline conserve dans le TMD VI (Pro288(6'50)) qui agirait a titre de charniere moleculaire reliant ainsi le domaine
de liaison des agonistes au domaine d'activation de la proteine G (GETHER et al, 1997). En resume, les etudes spectroscopiques effectuees avec la rhodopsine et le recepteur p2-adrenergique fournissent un solide support au role primordial joue par les TMD III et VI dans la transition des GPCR vers leur etat actif. De plus, la similitude des mecanismes structuraux observes pour la rhodopsine et le recepteur |32-adrenergique porte a croire que plusieurs aspects de l'activation des GPCR ont ete conserves a tout le moins pour les membres de la famille A. Cependant, meme si ce mouvement semble important pour decrire l'activation des GPCR, les mouvements des autres TMD dans le processus d'activation ne peuvent etre exclus. En effet, des mouvements du TMD VII de la rhodopsine ont ete suggeres en se basant sur des etudes de spectroscopie EPR (ALTENBACH et al, 1999a). De plus, l'importance probable du TMD VII dans le processus d'activation est aussi supportee de facon indirecte par la creation d'un site de chelation de metal entre les TMD III et VII qui provoque l'activation du recepteur (32-adrenergique (ELLING et al, 1999).
1.5 Justification de Petude
L'implication des GPCR dans de nombreux processus physiologiques en font des cibles de choix pour le traitement de maladies diverses. Etant donne que l'une des strategies adoptee dans le developpement de medicaments consiste a trouver des composes possedant une certaine affinite pour un GPCR donne lui conferant ainsi les proprietes de specificite voulues, l'etude des mecanismes de reconnaissance ligand-recepteur prend done tout son sens. Cette reconnaissance repose sur les interactions fournies par la pochette de liaison des GPCR. Nous avons choisi d'etudier la pochette de liaison d'un GPCR a ligand peptidique dans le contexte du systeme cardiovasculaire. Ainsi, nous nous somme attardes au recepteur AT], liant une hormone peptidique l'Ang II et exercant un role au niveau du systeme cardiovasculaire. Notre hypothese est que le recepteur hATi possede des determinants moleculaires responsables de sa liaison a 1'AngII. Nos objectifs sont d'identifier des determinants moleculaires responsables de sa liaison a Angll, ainsi que d'identifier des changements de conformations generes suite a cette liaison. Pour repondre a ces objectifs, les buts suivants sont proposes : dans un premier temps, les determinants de la liaison de la position C-terminale de 1'Angll ont ete identifies directement grace a des etudes de photomarquage par affinite sur le recepteur hATi. Ces etudes de photomarquage nous menerent a observer que l'acide amine photoactivable utilise, le Bpa, presentait une selectivite prononcee pour la methionine. Nous avons exploite cette selectivite du Bpa pour mettre au point une nouvelle approche : l'essai de proximite aux methionines (MPA). Afin de determiner l'environnement tridimensionnel de la position C-terminale de I'angiotensine II (Angll) dans le recepteur hATi, nous avons dans un premier temps etudie les TMD III, VI et VII en mutant
