L
a
méthode la plus
.
couramment
utili-sée
pour
conserver
l
es
ressources
génétiques végétales est
l
e stockage
des
semences.
De très nombreuses
espèces, y compris
la plupart des
espèces
cu
lti
vées o
u
apparentées aux espèces
culti-vées, produisent
en effet
des
semences
qui
peuvent
être
déshydratées jusqu
'
à
de
s
teneurs
e
n
eau
réduites
et stockées à
bas
se
rem pérature. Leur
lon
gévité augme
nt
e
dans
ces condit
i
ons
de
conserva
tion.
Les
semences aya
nt
de
ce
ll
es
propriétés
sont
appelées
orthodoxes [l].
Cependant
,
plusieurs
catégories
de
plantes présentent des problèmes pour
l
a
conservation
de leurs
semences
.
Toue
d'
abord
,
un
nombre important d'
espèces,
principalement
tropicales ou su
b-cropi-cales, celles
que
l
e cocotier
,
l
e cacaoyer,
ainsi
que de nombreux
li
gneux
tropicaux
ont
des
semences
qui
n
e s
ubi
ssent
pas
d
e
déshydratation
au cours
de leur
matura-tion
et sont
disséminées
avec
une
teneur
en ea
u
relativement
é
l
evée
[2]
.
Ces
semences
ne
s
upport
ent
pas
une
déshy-dr
atation,
mê
m
e
limit
ée,
et
sont souvent
sensib
l
es a
u
froid. Appelées récalcitrantes
[l],
e
ll
es
doiv
ent être conservées
dan
s
d
es
F. Engelmann : International Plant Genetie Resources lnstitute (IPGRI), Via delle Sette Chiese 142, 00145 Rome, Italie.
S. Dussert: Institut de recherche pour le développement (IRD), BP 5045, 34032 Montpellier cedex 1, France. <d ussert@mpl. i rd.fr>
Tirés à part: F. Engelmann
Ressources génétiques
Développement
de la cryoconservation
pour la conservation des ressources
génétiques végétales
Florent Engelmann, Stéphane Dussert
conditions
de
température et
d
'humidité
relativement é
l
evées et,
même
l
orsqu'e
ll
es
sont stockées
dans les
conditions
opti-males
,
leur
l
ongévité est
limit
ée à
quelques
semaines
ou quelques mois. Les
semences
d'
un
e
troisième catégorie de
plantes
sont
dites
in
termé
di
a
ire
s
[
3].
Ces
semences
peuvent
être
d
és
h
y
draté
es
jusqu'à des teneurs
en eau
relativement
réduites,
mais elles
so
nt
sensib
l
es a
u
x
basses températures. Par
compa
r
aison
avec
des
semences
récalci cran ces
,
l
e
ur
durée de
stockage
peut
être
prolongée,
mais
il est
impossible d
'
obtenir
une
conservat
i
on à
l
ong
terme,
comme avec
l
es semences orthodoxes. Cerce catégorie
de
semences
inclue
des plantes
d
'intérêt
économique telles
que
l
e caféier et
l
e
pal-mier
à
huile
[3
,
4).
Certaines
plantes
ce
ll
es
que
l
es
bananiers
fruits
er
l
es
plantains ne produisent pas
de
semences.
D'autres plantes, celles que
de nombreux fruitiers,
l
a
pomme de
terre, l'igname,
l
e
manioc,
l
a
patate
dou
ce
ou la
canne à sucre
ont à
l
a
fois
des
génotypes
stéri
l
es et
d'autres qui
pro-dui
sen
c
d
es semences
orthodoxes.
Cependant,
ces semences correspo
ndent
généralement à
des
génotypes
forcement
hétérozygotes
et sont
donc d'
un intérêt
limi
té
pour
l
a conservation
de
génotypes
particuliers.
Tou ces ces espèces sont ainsi
eropagées
végécac
i
vemenr.
A
l'
heure
actuelle,
l
a
méthode
classique-ment utilisée
pour
conserver
les
res-sources génétiques
de
ces espèces es
r l
a
conservation en champ
de plantes
ent
i
ères. Ce
mode de
conservat
i
on
pose
cependant
des problèmes
imp
ortants [5].
Les
collections
resrenr
exposées aux
aléas
Cahiers Açiricultures
2000
;
9:
237-45
climatiques
,
aux attaq
u
es
des pathogènes
et
ravageurs
et,
de plus, les
coûts en
main-d'
œuvre sont
rrès
é
l
evés
.
Enfin
,
la
distribution
et
l
'
échange
de matériel
à
partir des
collections en champ sont
dif-ficiles, du fait de
l
a
n
a
tur
e végétative
du
matériel
et
des risques inhérents
d
e
transfert de maladies.
Ju
squ'à
présent,
l
a
plupart des
activités
de
conservation
des
ressources génétiq
u
es
se
sont concentrées
sur
l
es
plantes
culti
-vées et
l
es espèces apparentées.
Cepen-dant,
l
a conservation
des
espèces
rares
et
menacées
est aujourd
'
hui devenue
d'
actualité
.
Enfin, le développement des
biotechno-lo
gies a conduit à
l
a
production d'
une
nouvelle
catégorie
de ressources
géné-riques,
qui inclue des clones
obtenus à
partir de
génotypes élites
,
des
li
gnées
cel-lulair
es ayant
des
caracté
ri
stiques
particu-li
ères et
du matériel transgénique [6].
Ces nouvelles
ressources one so
u
vent
un
e
très haute valeur
ajourée et son
t
difficiles
e
t
onéreuses
à
produire. Le
développe-ment de techniques performances
per-mettant d
'
ass
ur
er
leur
conservation
en
route
séc
urit
é est
donc d
'
un
e grande
importance.
La cryoconservation,
c'est-à-dire
l
e
stoc-kage
de matériel biologique
à
une
tem-pérature ultra-basse,
généralement ce
ll
e
de l'azote
liquid
e (-
196
°
C), est
l
a se
ul
e
technique disponible
à
l'heure
actue
ll
e
qui permette d'
assurer
la
conservation à
long
terme
,
en toute sécurité et à coût
réduit, de
ces
différentes ressources
géné-tiqu
es.
Dans
cet article,
nous présentons
l
es
dif-férentes techniques de
cryoconservation
dispo11ibl
es
pour
l
es ti
ssus er
o
rganes
végé
ta
ux, ain
s
i qu
e
l
e
ur
appli
cation
actu
elle, et nous
discuco11s
le
futur de
l
'
utilisation de
l
a CLyoconservation da11s
le cadre
de
la conservation des
ressources
génétiques
végé
tales.
Principes
de la cryoconservation
Certains
organes
végétaux,
tels
que
les
sem
ences orth
odoxes er les
bourgeo
ns
dormants
rés
istants au froid, conti
enn
ent
des
quantités
d
'ea
u très faibles et
peu-ve
nt ainsi
êu
e congelés
directement,
sans
traitement préa
l
abl
e.
Cependant,
la
plu-part des systèm
es employés en
cryocon-servation
(suspensions ce
llul
aires, cals,
apex, embty
ons) sont
culti
vés
in vitro
et
co
nti
ennent des
quantités
d
'ea
u très
éle-vées
.
C'est
égalem
ent le cas
des semences
non orthodoxes et de
leurs embryons
zygotiques
.
Pour cous ces types
de
maté-ri
e
l
qui ne sont pas
intrin
sèquem
ent
to
léran
ts à
la co
ngéla
tion,
l
es
ce
llul
es
doivent
êt
re
déshydratées artifici
e
llement
pour les
protéger des
dommages causés
par
l
a cristallisatio
n de
l
'ea
u intrace
llulai-re [7]. On peut distinguer deux types
de
techniques en
fo
nction des
méca11ismes
physiques sur
lesquels elles
reposent : les
techniques class
iqu
es et
les
no
uve
lles
techniques
de cryoco
nservation
[
8
].
Les
techniques
class
iqu
es compren11ent une
dés
hydratation induire par la congé
l
ation
visant à
réduire
le
nombre et la
rai
lle
des
cristaux de g
l
ace
intracellul
aire,
al
ors que
l
es
nouvelJes techniques sont fondées sur
la vitrifi
ca
tion
,
qui peut être
défini
e
comme
la
transition de
l'ea
u directement
de
la
phase
liquid
e en un
e
phase
vitreuse
amorphe, évitant
a
in
si
l
a
formation de
glace crista
llin
e
dans
l
es cellules [9]
.
Les techniques
classiques
de
cryoconser-va
tion
corn prennent un refroidissement
l
em jusqu
'à
u11
e
temp
éra
ture
de
pré-refroidisse
m
ent défini
e, s
uivi
pa
r une
immersion directe
dans
l'azote
liquid
e.
Avec
l'abaisse
ment de
la
tempéra
ture au
cours du
refroidissemem lent
,
les cellules
et le
milieu
ex
terne sont d'abord
en
sur-fusion,
puis
l
e
milie
u
externe
prend
en
g
l
ace
le
premier [
7]
.
La
memb
rane
cellu-laire agir
a.
l
o
rs co
mme
une
barrière
phy-siqu
e et emp
êc
he
la crista
lli
sa
tion du
milieu
interne;
les cellul
es
restent ainsi
en
surfusio11. Leur pression d
e vapeur
aqueuse es
t plus é
l
evée
que ce
ll
e
du
co
mpartiment
externe, ce
qui induit un
flux d
'e
au imracellulaire vers
l
e
compar-tim
ent
ex
rracellulair
e et ainsi
l
a conce
n-tration des
solutés
intrace
llul
air
es. L
'ea
u
intrace
llul
aire
qui
so
re d
es cellules es
t
imm
édiatement
co11verrie en
glace
dans
le co
mpartim
ent extra.ce
llul
aire, ce
qui
accé
l
ère
le
phénom
ène.
En conditions
optimales,
l
a
m
ajeure
parti
e o
u la
totali-té
de
l
'eau
intra
ce
llulair
e crisra
lli
sa.bl
e est
ext
ra
ir
e
des cellules, ce
qui réduit
ou
supprim
e
l
a
form
ation dommageable
de
glace
intrace
llul
aire
lors
de
l'
immersion
des échantillon
s
da
ns l'azo
te
liquid
e.
C
ependant
,
un
e
déshydratation trop
int
ense
p
eur induir
e
différ
ents
dom
-m
ages
li
és à
l
'
au
g
m
e
ntation
d
e
la
concentration des se
l
s
imracellulaires et
à
des changements dans la
conformatio
n
de
l
a
m
e
mbra
ne ce
llul
a
ire [7
]. Le
réchauffem
em doit
être
auss
i rapide
que
possible
pour év
iter
l
e
phénomè
n
e
de
recristallisation
,
au
cours
duque
l l
es
cris-ta
ux
de g
l
ace
form
és
pendant le
refroi-disse
ment fusionn
ent pour d
onner d
es
crista
u
x
de
raille
plus
imporram
e,
rher-modyna
miqu
emem plus
favorable, mais
éga
l
e
m
e
nt plus
domm
agea
bl
e
pour
l
'
imégriré cellulai
re [7].
Dans
les
nouvell
es techniques
de
cryo-conservation
,
fo
ndées sur la vitrifica
tion,
la
dés
hydratation
ce
llul
a
ir
e es
t r
éa
lisée
ava
nt
l
a con
gé
l
ati
o
n
en
exposant les
échantillons à
des
solutions cryo
pro
cec-rri
ces extrêmement
con
centrées et/ou
en
les soumettant
à
une
dessiccation
phy-sique, ce
qui
a
pour
effet d'extrai
re
l
'ea
u
cri
srallisable
des cellules.
Les échantillons
so
nt ensui
te
refroidis rapidement. L
a
for-mation de g
l
ace
intracellulaire esr ainsi
évitée.
Des
transiri
ons viueuses
(change-ments
dans
la co
nfo
rm
ation
structurale
du
verre)
ont été enregistrées au
cours de
l
a con
gé
l
a
tion de
différents
matéri
els
végétaux
en utili
sant la
technique
de
microcalorirnétrie
différentielle à
ba
l
aya-ge [10-13].
Protocoles
de cryoconservation
Pour
chaqu
e
nouvea
u maté
ri
e
l
à
ccyo-conserver,
l
es conditions
de chacune
des
étapes success
iv
es
du protoco
l
e
doivem
être
optimisées.
Un protocole
de
cryo-conse
rvation
comprend
l
es étapes
sui-vantes
:
sélectio
n du matériel
végétal,
préculture,
traitement
cryopr
otecteut,
congé
l
a.rion,
réchauffemem et post-
traice-ment.
Cahiers Açiricultures 2000
;
9
:
237-45
Protocoles classiques
Au
cours
d'un
proto
col
e
classiqu
e
de
cryoconse
rvation,
l
es échan
tillons
subis-sent d
'a
bord une
préculture
de
quelques
he
ur
es o
u jours en présence
d'osm
oti-cum
s
tels
que
l
e
mannitol ou
l
e sorbitol
pour provoquer un
e
l
égère
dés
h
y
drat
a-tion
[1
4].
Ils
sont
ens
uite
soumis à
un
rraice
menc
ccyoprocecceur
avec
des
sub-stances variées
(sucres,
pol
yols,
dim
éth
yl-s
ulfo
xyde, etc.)
. La congé
l
ation
es
t
réali-sée en deux
étapes
: un refroidi
ssem
ent
l
e
nt
jusqu
'à
un
e
température
do
nn
ée,
dite
de
pré-refroidissement, suivi d'
une
imm
ersion rapide
des échantillons
dans
l
'azote
liquide
.
Les
vi
tesses de
refroidisse-m
ent
généralem
ent
employées va
ri
ent
encre
0
,
5 er qu
e
lqu
es °C/min jusqu'à
des
températures de
pré-
refroidissemem
aux
ale
ntours
de -
40
°C
[1
4]. Les
tech-niques
classique
nécessitem
l
'
utilisation
de co
ngélateurs
prog
rammables
sophisti-qués et
coûteux.
D
ans certains cas,
l
e
ur
emploi peur
être évité e
n
utilisant un
co
ngé
l
ate
ur
m
énager ou de
l
aboratoire
pour réa
li
ser
l
e
pré-refroidissem
ent [
15].
Après
l
e
réchauff
em
ent,
l
es agem
s
ccyo-protecteurs som
éliminés en tran
sféra.nt
les échamillons sur des
milieux neuf
s à
interva
lles
rapprochés
. Pour
stimul
er
l
a
reprise
de croissance, les conditions
stan-dard de culture sont parfois
trans
itoir
e-ment modifiées,
par
exempl
e en
dimi-nu
a
nt
l'
inte
ns
ité
lumin
e
use o
u
e
n
chan
geam
l
a composition hormonale ou
minérale
du milieu de culture
[14,
1
5].
Les techniques
classiques
de
cryoconserva-tion
sont depuis
lon
gtemps
utilisées
avec
succès
pow- la congé
l
ation de s
u
spensions
cellulai
res et
de cals,
qui
sont
co
mposés
de
peti
tes
unités
relativem
em uniform
es
au nivea
u
histologique
[16,
17]. Ell
es sonr
égal
emem appli
cabl
es
pour la congé
l
ation
d
'a
pex
de certai
nes espèces
coléram
es au
froid
,
mais
non pour ce
lle
d'espèces
tropi-cales ou
sub-cropi
cales
[18].
Nouvelles techniques
Les
nouve
ll
es
techniqu
es
de CLyoco
nserva-rion présentent des avantages
par rapport
aux
techniques
classiques. En
évitant
l
a
fo
rm
ation d
e g
l
ace crista
llin
e
dans
l
es
échan
tillons, e
ll
es
sont plus
appropri
ées
pour
l
a congé
l
ation d
'
organes complexes
reis que
l
es
apex et
l
es embryon
,
compo-sés
de
types cellulaires
d iffére
n rs
qui
nécessite
raiem cl1acun des conditions
par-ti
culières
de
déshydratation induire
par la
congélation. E
ll
es
ne
requièrent pas
l'
utili-s
ation de congélateur
s
pro
g
ramm
a
bl
es e
t
ont w1
e
larg
e
applic
a
bilit
é,
n
e
n
éces
sitant
qu
e
d
es
modific
a
tion
s
min
e
ur
es
pour leur
a
d
a
pt
a
ti
o
n
à
des
m
a
t
é
riel
s e
t type
s
ceUu-l
ai
r
es
diff
é
r
e
nt
s
[15]
.
U
n
e ca
r
ac
t
é
ristiqu
e c
ommun
e
d
es
nou-v
ea
ux pro
toc
ol
es es
t qu
e
l
'é
t
a
p
e c
ritiqu
e
pour ob
te
nir l
a s
urvi
e es
t
l
a
d
és
h
y
dratation
e
t
n
o
n
l
a co
ng
é
lation
, c
omm
e
d
a
n
s
l
es
prot
oc
ol
es
classiqu
es
. Ain
s
i
, s
i l
e
s
éc
han-till
o
n
s à
congel
e
r p
e
u
ve
nt
ê
tr
e
r
e
ndu
s
tol
é
-rant
s à
un
e
dessiccation ju
s
qu
'à
d
es
teneurs
e
n
e
au
s
uffi
s
amm
e
nt ba
sses, s
an
s
diminu-tion ou
ave
c
une
diminution
limit
é
e d
e
la
s
ur
v
i
e
par
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apport
a
ux t
é
m
o
in
s
non d
és
h
y
-dr
a
t
és,
d
es
pour
ce
nt
a
g
es
d
e s
u
r
vi
e s
imi-l
ai
r
es so
nt
gé
n
é
ral
e
m
e
nt
o
b
servés [
1
5].
On di
s
tin
g
u
e s
ept pro
cé
dur
es
diff
é
r
e
nt
e
s :
l'
e
n
ca
p
s
ul
a
tion-d
és
h
y
dr
a
t
a
ti
o
n
,
la
v
itrifi-ca
tion,
l'
e
n
c
apsul
a
tion
-
vitrifi
ca
tion
,
la
d
ess
ic
ca
ti
o
n
,
la
pr
é
cultur
e,
l
a
pr
é
culture-d
ess
i
cca
tion
, e
t la
c
on
gé
l
a
tion
e
n goutte
s.
•
L
'e
n
c
ap
s
ul
a
tion-d
és
h
y
dr
a
t
a
rio
n es
t
fo
nd
ée
s
ur
l
a te
chnologi
e
d
éve
lopp
ée
p
o
ur
l
a
pro-du
c
ti
o
n d
es se
m
e
n
ces a
rtifi
c
i
e
ll
es.
L
es
ex
pl
a
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s s
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ca
p
s
ul
és
d
a
n
s
d
es
bill
es
d
'
al
g
in
ate
d
e
calcium
,
pr
éc
ulti
vés e
n mili
e
u
liquid
e e
nri
c
hi
e
n
s
u
c
r
e
p
e
nd
a
nt
1
à 7
-10 jour
s,
parti
e
ll
e
m
e
nt d
és
h
y
d
ra
t
és s
ou
s
l
a
h
o
tt
e à
flux
laminair
e
ou
avec
du
s
ilicagel
ju
s
qu
'à
un
e
ten
e
ur
e
n
ea
u d
'e
n
v
iton
2
0
%
p
ar
r
a
pp
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de congélation d'accessions (%} de régénération congelées Dioscorea spp. E 4 54 (26-71} D (2 espèces} [39] 1 (2 espèces) D. bu/bitera E 2 Jusqu'à 100 D [40] et D. alata Musa spp. E 8 D [28]
p
15 30 (7-67) D [41] V 2 60-70 D [42] Pyrus spp. V 8 60 (40-73) D [15] E 3 69 (67-70) D [43] E 11 50 (23-80) D [44] CP 1 60 D [44] So/anum spp. CP 19 48 (0-100) 1 + D [45] V 5 56 (37-94) D [46] E 6 40 (9-59) D [47] G 219 40 (4-100) D [48]Techniques de congélation employées: V: vitrification; E: encapsulation-déshydratation; CP:
congélation programmée ; P : préculture ; G : congélation en gouttes. Les résultats de survie indi-quent le pourcentage moyen de survie obtenu et entre parenthèses les valeurs minimales et max i-males. D : reprise directe de la croissance ; 1 : reprise indirecte de la croissance.