Développement préclinique d'une méthode plus rapide de production par
génie tissulaire d'un substitut cutané bilamellaire autologue
Thèse
CHANEL BEAUDOIN CLOUTIER
Doctorat en médecine expérimentale
Philosophiae doctor (Ph.D.)
Québec, Canada
Développement préclinique d'une méthode plus rapide de production par
génie tissulaire d'un substitut cutané bilamellaire autologue
Thèse
Chanel Beaudoin Cloutier
Sous la direction de :
François A. Auger, directeur de recherche
Lucie Germain, codirectrice de recherche
Robert Gauvin, codirecteur de recherche
iii
Résumé
Introduction: Le Laboratoire d’Organogenèse Expérimentale (LOEX) utilise une
technique de production de substituts cutanés bilamellaires autologues auto-assemblés (SASS) unique. Cette méthode permet la génération d’équivalents cutanés permanents avec une structure et une fonction similaire à la peau normale humaine.
Problématique et objectifs: Cette thèse présente d’abord les premiers résultats
d’essais cliniques pour le traitement de plaies chroniques complexes traitées avec SASS. Ces résultats démontrent une efficacité et une sécurité d’utilisation de ces SASS. Toutefois, il y a un intérêt de développer une méthode de production plus rapide de ces substituts cutanés afin d’améliorer l’accessibilité clinique et le pronostic des patients grands brûlés, lors de leur utilisation en phase aiguë. En effet, le délai de couverture cutanée définitive essentielle à la thermorégulation et à l’effet de barrière est directement en lien avec les pronostics vital et morbide de cette population. Le délai actuel de 8 semaines pour la production des greffons aurait avantage à être réduit pour améliorer leur utilité quant aux soins des patients.
Méthode: Dans un premier temps, le développement et la mise au point d’une
méthode de production plus rapide de SASS à partir de matrices dermiques décellularisées (SASS-DM), générant des peaux reconstruites en seulement 4 semaines et demie est présenté. Par la suite, l’équivalence de la méthode de production rapide de ces peaux est d’abord vérifiée in vitro et comparée à la méthode standard quant à ses caractéristiques histologiques, de différenciation cellulaire et la présence d’une membrane basale fonctionnelle. La méthode rapide est finalement comparée in vivo à la méthode standard quant à l’évolution de ces peaux greffées sur les vivants, de façon à compléter le développement préclinique de cette nouvelle méthode innovatrice.
iv
Résultats: La méthode rapide de production des peaux bilamellaires autologues
auto-assemblées s’est montrée équivalente à la méthode de production standard et ce, autant in vitro qu’in vivo.
Conclusion: Ce travail présente d’abord l’utilisation clinique des peaux
reconstruites bilamellaires pour le traitement de plaies variqueuses chronique, qui s’avère efficace et sécuritaire. Puis, le développement préclinique d’une méthode plus rapide de production de peaux reconstruites bilamellaires autologues est présenté, permettant de générer des greffons en 4 semaines et demie plutôt que 8 semaines, et ce avec une qualité équivalente à la méthode standard. Cette innovation représente un ajout majeur aux modes de traitement des grands brûlés puisqu’elle a le potentiel de changer la planification chirurgicale et leur pronostic de survie.
v
Abstract
Introduction: The Laboratoire d’Organogenèse Expérimentale (LOEX) has
developed a unique production technique of self-assembled autologous skin substitute (SASS). This method allows the generation of permanent skin equivalents that display a structure and a function similar to normal human skin.
Problematic and objectives: This thesis presents the first results of SASS clinical
use in the treatment of chronic complex wounds to demonstrate the clinical efficacy and safety. The need to develop a faster production method in order to improve burn patient prognosis is also outlined. Indeed, the delay before definitive skin coverage to insure proper thermoregulation and protection from the external environment is directly associated to the vital and morbid prognosis of this population of severely traumatised patients. The current eight weeks SASS production delay must be reduced in order to further improve burn patients quality of care and survival.
Method: This work describes the development and refinement of a faster
production method for SASS using decellularized dermal matrices (SASS-DM) that generated skin substitutes produced in only 4 weeks and a half. These faster produced skin substitutes where compared in vitro to the standard SASS in regard to the histological characteristics, cellular differentiation and the presence of a functional basement membrane. The faster produced SASS-DM were then compared in vivo to standard SASS by following the evolution of grafted mice in order to complete a preclinical trial of this innovative technique.
Results: The faster production method for the autologous self-assembled bilayered
skin substitutes was shown to be equivalent to the standard production method in
vi
Conclusion: This work presents the clinical use of bilayered skin substitutes for the
treatment of chronic venous ulcers, which was shown to be efficient as well as safe. Afterwards, the preclinical development of a new faster production method of autologous bilayered self-assembled skin substitutes is presented, allowing the culture of skin grafts in four weeks and a half instead of the previous 8 weeks long protocol, with equivalent quality and characteristics as the standard cultured skins. This innovation represents a major adjunct to severely burned patients treatments and could possibly change their surgical planning and their survival.
vii
Table des matières
Résumé...iii
Abstract ... v
Table des matières... vii
Liste des tableaux ...x
Liste des figures ...xi
Liste des abréviations ...xiii
Remerciements... xv
Avant-propos et contexte de recherche... xvi
1. Chapitre 1. Introduction – Étude bibliographique ... 1
1.1 Système cutané humain ... 1
1.1.1 Structure de l’épiderme ... 2
1.1.2 Structure du derme ... 7
1.1.3 Structure de l’hypoderme... 7
1.1.4 Architecture cutanée des peaux reconstruites ... 8
1.2 Reconstruction cutanée par auto-assemblage ... 8
1.3 Fonction épidermique ... 10
1.3.1 Différenciation des cellules épidermiques et formation de l’enveloppe cornifiée ... 10
1.3.2 Différenciation des cellules épidermiques in vitro ... 12
1.4 Marqueurs structurels et de différenciation cutanée... 12
1.4.1 Marqueurs épidermiques ... 12
1.4.2 Marqueurs dermiques ... 13
1.5 Interactions entre les fibroblastes et les kératinocytes... 15
1.6 Reconstructions cutanées bilamellaires ... 16
1.6.1 Substituts cutanés bilamellaires allogéniques... 17
1.6.2 Substituts cutanés bilamellaires autologues ... 19
1.7 Génération de matrices décellularisées et congelées... 21
1.7.1 Principes de décellularisation ... 22
1.7.2 Principes de congélation... 24
1.8 Kystes épidermiques et perles de kératine ... 25
1.8.1 Pathophysiologie des kystes épidermiques... 25
1.8.2 Les perles de kératine ... 27
1.9 Modèles de fibrine ... 29
viii
1.10 Greffes de substituts cutanés ...32
1.10.1 Évolution biologique et macroscopique ...32
1.11 Plaies chroniques et ulcères veineux ...34
1.11.1 Pathophysiologie ...34
1.11.2 Prise en charge clinique ...35
1.12 Objectifs et hypothèses...36
2 Chapitre 2. Utilisation clinique des peaux bilamellaires pour le traitement d’ulcères chroniques ...40
2.1 Avant-propos ...40
2.2 Présentation de l’article...41
2.2.1 Résumé...42
2.2.2 Abstract ...43
2.2.3 Introduction...44
2.2.4 Patients and Methods ...45
2.2.5 Results ...47
2.2.6 Discussion ...54
2.2.7 Conclusion...55
2.2.8 Acknowledgments ...56
3 Chapitre 3. Développement et optimisation d’une méthode de production plus rapide et comparaison in vitro avec la méthode standard ...57
3.1 Avant propos...57
3.2 Présentation de l’article...59
3.2.1 Résumé...60
3.2.2 Abstract ...61
3.2.3 Introduction...62
3.2.4 Material and Methods ...64
3.2.5 Results ...68
3.2.6 Discussion ...74
3.2.7 Conclusion...77
4 Chapitre 4. Greffe des peaux reconstruites avec le modèle rapide et comparaison in vivo avec le modèle standard ...79
4.1 Avant-propos ...79
4.2 Présentation de l’article...80
4.2.1 Résumé...81
ix
4.2.3 Introduction ... 84
4.2.4 Material and Methods... 86
4.2.5 Results ... 91
4.2.6 Discussion ... 97
4.2.7 Conclusion ...101
4.2.8 Acknowledgments...102
Chapitre 5. Discussion et conclusion ...103
Discussion ...103
Modèles de plaies chroniques veineuses...105
Plaies par brûlures...106
Utilisation de matrices dermiques ...107
Les peaux bilamellaires comme modèle autologue...108
Kystes épidermiques et perles de kératine ...109
Utilisation de fibrine dans un modèle bilamellaire auto-assemblé...110
Comparaison avec les autres modèles bilamellaires autologues...111
Comparaison avec le traitement standard : les autogreffes ...112
Perspectives ...113
Retombées ...115
Conclusion...116
x
Liste des tableaux
Tableau 1: Description des marqueurs épidermiques et dermiques permettant la
caractérisation des peaux reconstruites in vitro ...14
Tableau 2: Critères d’inclusion et d’exclusion des patients ...45
Tableau 3: Caractéristiques des ulcères présents sur les patients ...48
xi
Liste des figures
Figure 1: Structure générale de la peau normale humaine ... 1
Figure 2: Structure de l’épiderme stratifié de la peau normale humaine ... 2
Figure 3: Structure des hémidesmosomes de la membrane basilaire cutanée... 4
Figure 4: Expression continue de collagène IV en immunofluorescence (rouge) à la membrane basale cutanée de peau bilamellaire reconstruite. Noyaux cellulaires (bleu) ... 4
Figure 5: Structure histologique des peaux bilamellaires reconstruites in vitro présentée en A, comparée à la structure histologique d’une peau normale humaine native (B)... 8
Figure 6: Méthode classique de reconstruction cutanée bilamellaire par auto-assemblage 9 Figure 7: Structure des composantes principales de l’enveloppe cornifiée présente dans les kératinocytes différenciés matures ... 12
Figure 8: Substituts cutanés bilamellaires à partir de matrices dermiques humaines décellularisées ... 18
Figure 9: Substituts cutanés Permaderm©... 20
Figure 10: Substituts cutanés MyDerm© ... 20
Figure 11: Représentation de l’histologie anormale de différenciation cellulaire retrouvée dans les kystes épidermiques... 25
Figure 12: Perles de kératine ... 27
Figure 13: Évolution histologique de l’épithélium cutané greffé ... 28
Figure 14: Représentation du processus de coagulation et de formation de caillot de fibrine lors de la guérison de plaies ... 30
Figure 15: Survie initiale d'une greffe de substitut cutané... 33
Figure 16: Apparence macroscopique d'une lyse de greffe ... 34
Figure 17: Macroscopic appearance of SASS... 48
Figure 18: Patient 1 ... 50
Figure 19: Patient 2 ... 50
Figure 20: Patient 3 ... 51
Figure 21: Patient 4 ... 52
Figure 22: Patient 5 ... 53
Figure 23: Representation of the production timeline of standard self-assembled skin substitute (SASS) compared to self-assembled skin substitute reconstructed from a dermal matrix (SASS-DM), from the patient biopsy to clinical availability ... 69
Figure 24: Histological comparison of SASS, SASS-DM and normal human skin... 70
Figure 25: Keratinocyte differentiation immunofluorescence assay... 71
Figure 26: Basement membrane and stem cells immunofluorescence assay ... 71
Figure 27: Transmission electron microscopy analysis of the self-assembled skin substitutes reconstructed from a dermal matrix (SASS-DM) ... 72
Figure 28: Immunofluorescence characterisation of decellularized dermal matrix ... 73
Figure 29: Mechanical properties of SASS-DM and SASS ... 74
Figure 30: Macroscopic appearance of the SASS-DM ... 92
Figure 31: Representative macroscopic results... 94
Figure 32: Histological analysis of SASS produced with adult cells ... 95
xii
xiii
Liste des abréviations
ABI Index tibio-brachial
BP-230 Antigène 1 du pemphigus bulleux CCL2 Chemokine ligand 2 (motif C-C) CCL5 Chemokine ligand 5 (motif C-C) CEA Culture épithéliale autologue CXCL1 Chemokine ligand 1 (motif C-X-C) CXCL8 Synonyme de l’interleukine-8 DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium EDTA Acide éthylène diamine tétraacétique FCS Sérum de veau fétal
GFP Green fluorescent protein
HGF Hepatocyte growth factor (Facteur de croissance hépatocytaire) IgG Immunoglobuline gamma
IL-1α Interleukine 1-alpha IL-6 Interleukine-6
IVIS In vivo imaging system K10 Kératine 10
K19 Kératine 19
LOEX Laboratoire d’Organogenèse Expérimentale mAb Anticorps monoclonal
MEC Matrice extracellulaire MMPs Métalloprotéinases MOI Multiplicity of infection
P Passage
pAb Anticorps polyclonal
PDGF-BB Platelet derived growth factor- BB (Facteur de croissance plaquettaire) PAI-1 Inhibiteur de l’activateur du plasminogène-1
PAI-2 Inhibiteur de l’activateur du plasminogène-2 PGA Acide polyglycolique
PR Peau reconstruite
SASS Substitut cutané auto-assemblé
SASS-DM Substitut cutané auto-assemblé reconstruit à partir d’une matrice dermique décellularisée
TEM Microscopie électronique à transmission TEN Nécrose épidermique toxique
TGF-β1 Transforming growth factor- beta 1 (Facteur de croissance transformant beta 1)
TIMP Tissue inhibitor of metalloproteinases (Facteur d’inhibiteur tissulaire de metalloproteinase)
UV Ultraviolet
VEGF Vascular endothelial growth factor (Facteur de croissance endothelial vasculaire)
TNF-α Tumor necrosis factor- alpha (Facteur de nécrose tumorale alpha) tPA Tissue plasminogen activator (Activateur tissulaire de plasminogène)
xiv
La vie sera ce que tu en feras, la vie t’aime – Mon philosophe préféré
xv
Remerciements
D’abord, je voudrais remercier le Dr. François A. Auger et la Dre Lucie Germain de m’avoir accueillie dans leur laboratoire et pour leur précieux appui dans l’atteinte de mes objectifs professionnels.
Je souligne également l’accompagnement du Dr. Robert Gauvin, par son efficacité remarquable, son soutien et sa motivation aura su m’aider à mener à bien ce projet malgré le double programme de formation.
Merci également à Rina Guignard pour la générosité de ses conseils et son implication inspirante pour la recherche et ce projet. C’est pour moi un modèle d’excellence et de dévouement.
Un remerciement spécial pour le Dr. Dan Lacroix pour ses conseils appréciés et sa disponibilité généreuse ainsi qu’à Dre Véronique Moulin pour son accessibilité et son chaleureux soutien pour la rédaction.
Je tiens également à remercier Todd Galbraith pour son aide indispensable en salle de culture et en atelier ainsi que pour la richesse de nos discussions. Merci à Amélie Lavoie pour son implication avec les analyses en microscopie électronique.
L’aide du Dr. Stéphane Chabaud avec son expertise et son enseignement sur les principes et techniques de fluorimétrie et du Dr. Patrick Carrier pour le partage de son expérience avec l’utilisation de fibrine en culture cellulaire est souligné.
Une reconnaissance spéciale à Benjamin Goyer, un collègue hors pair travaillant pour son aide précieuse avec la transfection cellulaire et la microscopie confocale.
Je souligne le support de ma petite sœur Phénix dont je suis si fière et de ma mère Josée qui est une femme si complète. Finalement, un grand merci à mon Étienne pour son précieux support tout au long de ces année.
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Avant-propos et contexte de recherche
La peau est le plus grand organe du corps humain et est responsable de la fonction de barrière et de protection, du contrôle de l’évaporation liquidienne et de la thermorégulation [1]. Une atteinte importante de ces fonctions suite à des brûlures sévères représente une menace à la survie humaine. Le traitement de ces graves traumatismes consiste en un remplacement de la peau atteinte par des autogreffes, des allogreffes, des xénogreffes ou plus récemment par des substituts cutanés reconstruits par génie tissulaire [2].
La prise en charge des patients brûlés s’exerce à plusieurs niveaux et requiert la coordination d’une équipe médicale spécialisée, puisqu’il s’agit d’un groupe de patients tout à fait particulier autant sur le plan médical, chirurgical que de la réadaptation. Ainsi, les standards de traitements actuels impliquent la prise en charge globale de ces patients sur des unités de grands brûlés regroupant l’expertise de multiples professionnels dédiés. On retrouve au Canada 10 unités de grands brûlés reconnues qui offrent des traitements de pointes et à contribuent à l’avancement des connaissances.
La mise au point et l’utilisation clinique de la culture des kératinocytes en laboratoire par Rheinwald et Green [3] en 1975 ont permis l’essor du génie tissulaire, une avancée qui a mené au développement des premiers feuillets cellulaires servant de substituts cutanés [4, 5]. D’abord unilamellaires, soit de nature épidermique seulement et formées à partir de cellules extraites de biopsies de peau, ces cultures épidermiques autologues (CEA) ont révolutionné le traitement des brûlés et offert de nouvelles perspectives pour leur pronostic [6-8]. Bien que ces feuillets épidermiques représentent une stratégie très peu invasive de production à grande échelle de substituts cutanés, ces remplacements cutanés peuvent être fragiles aux contraintes mécaniques, subissent un phénomène physiologique de contraction secondaire et présentent un taux de succès très variable [9]. L’intérêt du développement de substituts cutanés bilamellaires, étant
xvii
composés d’un épiderme et d’un derme joint par une membrane basale vise à améliorer les caractéristiques globales du greffon, ainsi qu’à offrir un remplacement plus proche de la peau native pour permettre le rétablissement plus complet de la physiologie cutanée.
Le traitement de patients avec brûlures étendues (plus de 40-50%) implique une disponibilité d’autogreffes (greffe cutanée prélevée sur une région saine du patient brûlé) restreinte due à une surface disponible de prélèvement sain réduite. La couverture cutanée complète de tels patients peut reposer sur l’utilisation de stratégies de remplacement cutané pouvant être temporaires, par exemple via allogreffes (greffe cutanée provenant de donneurs cadavériques) qui subissent éventuellement un rejet immunologique, ou permanentes. Différentes techniques permettent aujourd’hui la reconstruction bilamellaire permanente en laboratoire à partir de cultures cellulaires autologues.
Les caractéristiques idéales de greffons reconstruits devraient se rapprocher le plus possible d’une peau normale humaine greffée (autogreffe). De tels greffons devraient donc impliquer la formation d’une couverture permanente, être exempts de réaction immunologique avec un niveau élevé de prise sur le lit receveur, avec un risque de transmission infectieuse extrêmement bas [2]. Ces greffons idéaux auraient également une production à grande échelle ainsi qu’une contraction finale minimale permettant des résultats esthétiques et fonctionnels optimaux [2]. Le Centre de recherche en Organogenèse EXpérimentale de l’Université Laval/LOEX (LOEX) utilise une méthode de reconstruction unique permettant de produire des peaux bilamellaires ayant une structure et une fonction très similaires à la peau normale humaine [10] et, donc, visant à se rapprocher des caractéristiques idéales.
La méthode de reconstruction utilisée au LOEX est l’auto-assemblage. Il s’agit d’un procédé au cours duquel le fait de placer les cellules dans le bon environnement avec les facteurs de croissance appropriés permet aux cellules de
xviii
se différencier et d’organiser elles-mêmes leur matrice extracellulaire dans l’espace tridimensionnel pour former des tissus [11-14]. Cette technique permet la reconstruction de tissus à partir de cellules autologues, évitant ainsi le rejet immunologique [15]. Cependant, une telle technique demande 8 semaines de culture [16], ce qui représente un délai important pour les patients considérant que les allogreffes temporaires utilisées durant l’attente doivent être remplacées aux 2 à 3 semaines dû à leur inexorable rejet.
Les étapes de production de ces substituts cutanés auto-assemblés impliquent d’abord la génération et maturation de feuillets fibroblastiques qui sont ensuite superposés et fusionnés pour la formation d’un derme homogène de bonne épaisseur [16, 17]. Après une période de maturation dermique, des kératinocytes sont ensemencés sur les dermes puis cultivés en condition immergée. Le montage est par la suite placé à l’interface air-liquide pour permettre la différenciation épidermique [18]. Parmi ces étapes, la phase de culture dermique est particulièrement longue dans le processus. Son amélioration, quant à son délai intrinsèque, peut s’avérer une stratégie efficace pour réduire le temps de production et améliorer l’impact clinique.
Une approche originale pour se faire, avec utilisation de matrices dermiques décellularisées, déshydratées et congelées permettrait de contourner cette phase de culture afin de réduire les délais de production. En effet, la conservation des matrices sous forme congelées permettrait l’initiation des dernières étapes de reconstruction épidermique plus rapidement, par rapport à la méthode classique, réduisant ainsi le temps de reconstruction. Cette stratégie s’avère une judicieuse hypothèse de développement.
La reconstruction d’un greffon cutané bilamellaire auto-assemblé nécessite une période de culture de 8 semaines [16, 17, 19]. Ce délai important augmente les risques de complications et la mortalité des patients avec brûlures étendues et sévères en attente de greffe, notamment dus aux infections, au rejet d’allogreffes
xix
et à la qualité des cicatrices engendrées [20]. L’objectif de réduire le temps nécessaire à la production des peaux bilamellaires s’inscrit dans une visée d’utilisation et de résultats cliniques optimisés.
Ainsi, l’objectif global de ce projet vise la démonstration de la sécurité et de l’efficacité des peaux reconstruites bilamellaires chez les patients, justifiant le développement d’un substitut cutané bilamellaire autologue auto-assemblé par une méthode plus rapide que la méthode standard. La méthode standard étant déjà utilisée en clinique, l’équivalence autant in vitro qu’in vivo des deux méthodes est souhaitée pour permettre une éventuelle utilisation clinique.
Les travaux présentés dans le cadre de cette thèse ont mené à la production de trois articles:
Le premier (Chapitre 2) a été publié en septembre 2013 dans le journal Advances
in Skin and Wound Care et a pour titre: Prospective study on the treatment of lower extremity chronic venous and mixed ulcers using tissue-engineered skin substitute made by the self-assembly approach.
Le deuxième article (Chapitre 3), ayant pour titre: Production of a bilayered
self-assembled skin substitute using a tissue-engineered acellular dermal matrix a été
publié en décembre 2015 dans le journal Tissue Engineering Part C.
Le dernier article (Chapitre 4), a été soumis au Journal of Tissue-Engineering and Regenerative Medicine en novembre 2015 et a pour titre: In vivo evaluation and
imaging of a bilayered self-assembled skin substitute using a decellularized dermal matrix grafted on mice.
xx
Afin de bien saisir les bases du projet, les principes de reconstruction cutanée et le cheminement des expériences du projet de développement des peaux
reconstruites avec la méthode rapide, une vue d’ensemble bibliographique est proposée dans la prochaine section.
1
1. Chapitre 1. Introduction – Étude bibliographique
1.1 Système cutané humain
La peau est le plus grand organe du corps humain et représente jusqu’à 15 % du poids total d’un adulte avec une superficie d’environ 1.7 à 2 mètres carrés selon les caractéristiques physiques des individus [1]. La peau contribue au maintien de l’homéostasie systémique par la thermorégulation, contrôle les pertes liquidiennes par l’évaporation et assure la synthèse de la vitamine D. La peau contribue également à la fonction de barrière protectrice corporelle envers les micro-organismes, les agressions mécaniques et les rayons UV [1]. Elle est constituée de deux couches principales : l’épiderme en surface servant de barrière protectrice imperméable et le derme plus en profondeur (Figure 1). Ces deux couches sont jointes l’une à l’autre par une membrane basale dont l’importance structurelle pour la fonction cutanée sera détaillée plus loin. Chaque couche présente une architecture caractéristique témoignant d’un processus de différenciation cellulaire organisé et complexe, faisant de la reconstruction cutanée un défi biologique de taille.
Figure 1: Structure générale de la peau normale humaine
Afin de bien comprendre les principes clés de la reconstruction cutanée in vitro, il convient de détailler la structure et la physiologie de la peau normale que l’on vise à reproduire le plus fidèlement possible. L’architecture des différentes couches de l’épiderme est abordée dans les prochains paragraphes en mettant une emphase
2
détaillée sur la membrane basilaire et ses composantes pouvant servir de marqueurs lors des analyses de structure. Le derme et l’hypoderme sont par la suite brièvement présentés.
1.1.1 Structure de l’épiderme
L’épiderme, constitué à 95 % de cellules épithéliales squameuses stratifiées ou kératinocytes, est une structure avasculaire dérivée de l’ectoderme embryonnaire [21]. D’autres cellules font partie de l’épiderme comme les cellules de Langerhans impliquées dans le système immunitaire, les cellules de Merkel qui contribuent à la perception cutanée par une action mécanoréceptrice ainsi que les mélanocytes responsables de la pigmentation [1]. Les kératinocytes se détachent de la membrane basale épidermique, se différentient et migrent vers la couche cornée et formant ainsi des couches distinctes de l’épiderme formées de cellules à différents stades de maturation. Ce processus sera expliqué plus en détail dans la section migration et différenciation de cellules épidermiques. Quatre couches forment ainsi l’épiderme : à partir du niveau le plus profond jusqu’au niveau superficiel, on retrouve la couche germinative ou la couche basale, la couche spineuse, la couche granuleuse et la couche cornée (Figure 2). La couche Malpighienne désigne la combinaison de la couche basale et de la couche spineuse. Il existe également une couche claire (stratum lucidum) située entre la granuleuse et la couche cornée constituée de cellules nucléées dites de transition et ce, seulement à la paume des mains et la plante des pieds [21]. Cette dernière couche ne sera pas reconstruite lors de la production de substituts cutanés auto-assemblés.
3 1.1.1.1 Membrane basale
La membrane basale constitue la région de jonction entre le derme et l’épiderme de la peau. Elle est composée d’une région dense aux électrons à la microscopie électronique nommée la lamina densa et d’une région transparente nommée lamina lucida [22] L’adhésion des structures épidermiques au derme s’effectue principalement grâce aux hémidesmosomes qui permettent l’ancrage des cellules épidermiques à la matrice extracellulaire dermique via une organisation complexe incluant en autres du collagène IV et VII, des intégrines et des laminines [23, 24] (Figure 3). Les filaments intermédiaires de kératine de type 5 et 14 intracellulaires s’insérant au cytosquelette des kératinocytes se lient à la protéine du pemphigus bulleux (BP-230) intracellulaire. Les intégrines sont des protéines hétérodimériques transmembranaires qui se lient au BP-230 par sa chaîne β4 en intracellulaire [25] et à la laminine de type V de la matrice extracellulaire pour former des jonctions cellule-matrice assurant sa stabilité à la membrane [24]. Les laminines sont des glycoprotéines hétérotrimériques composées de chaînes α, β et γ incorporées à la matrice extracellulaire dermique. Elles sont sécrétées autant par les cellules dermiques que les cellules épidermiques et leur expression contribue grandement aux signaux entre la matrice extracellulaire et les cellules [23, 26]. La laminine de type V est localisée à la base des hémidesmosomes, sa liaison à la BP-230 permet donc l’ancrage solide du cytosquelette cellulaire des kératinocytes à la matrice extracellulaire même. L’expression de l’isoforme I dans la peau adulte [27] et de l’isoforme VI lié de façon covalente avec la laminine V [28] démontre que la contribution de la laminine V n’est pas unique dans la physiologie de la membrane basilaire. Ainsi, le marquage de multiples types de laminines est pertinent pour la mise en évidence de la présence d’une membrane basale sur un spécimen cutané reconstruit, tel qu’utilisé plus loin dans ce travail. Les hémidesmosomes contiennent également des filaments d’ancrage constitués de filaments de collagène VII qui se projettent de la membrane basilaire vers le derme en forme de U et s’enchevêtrent dans les fibres des collagènes de type I et III matriciel pour solidifier l’ancrage de la membrane basale au derme [29]. Le collagène IV est formé de six chaînes alpha qui peuvent s’assembler selon trois
4
hétérodimères, dont la forme α5α5α6 (IV) se retrouve dans la membrane basale cutanée.
Figure 3: Structure des hémidesmosomes de la membrane basilaire cutanée
Les laminines et le collagène IV, stabilisés par des protéoglycans héparan sulfate, forment des polymères le long de la membrane basale [23], ce qui se traduit par une expression continue de ces protéines tout le long de la membrane basale lors de l’analyse en immunofluorescence (Figure 4). Cette membrane continue est formée d’une série d’hémidesmosomes, dont la présence visible en microscopie électronique confirme la présence d’une membrane basale sur un spécimen cutané natif ou reconstruit.
Figure 4: Expression continue de collagène IV en immunofluorescence (rouge) à la membrane basale cutanée de peau bilamellaire reconstruite. Noyaux cellulaires (bleu)
5
In vitro, la formation d’une membrane basale optimale est assurée par une
différenciation cellulaire adéquate stimulée par la mise à l’interface air-liquide [18], par la présence de vitamine C [30, 31] mais également par l’absence de forces de friction entre l’épiderme et le derme pour permettre la formation des hémidesmosomes responsables de l’ancrage mécanique des deux couches cutanées reconstruites [32, 33].
1.1.1.2 Couche spineuse
La couche spineuse se retrouve au dessus de la membrane basale et est facilement reconnaissable en microscopie grâce à la forme polyédrique des kératinocytes qui la composent. Les kératinocytes de cette couche sont liés entre eux par des desmosomes, des liaisons intercellulaires qui permettent une augmentation de la résistance aux forces mécaniques et qui contribuent à la stabilité de la membrane basale sous-jacente [1]. En plus des liaisons intercellulaires, la couche spineuse est impliquée dans le processus de différenciation, tel que décrit à la section 1.3. Les kératinocytes y synthétisent de l’involucrine qui constitue un des premiers éléments incorporés à l’enveloppe cornifiée construite durant la différenciation et la migration kératinocytaire [19]. L’involucrine est principalement synthétisée à partir de la couche spineuse, mais elle est jointe à l’enveloppe cornifiée par les transglutaminases à partir de la couche granuleuse [19]. Les cellules de cette couche contiennent également des kératines dont la kératine 1 et la kératine 10 [1].
1.1.1.3 Couche granuleuse
La couche granuleuse est située au-dessus de la couche spineuse cutanée. Cette couche se nomme granuleuse puisque les kératinocytes qui la composent contiennent des granules de kératohyalines composées de kératine, loricrine et profillagrine. La profilagrine des granules kératinocytaires est clivée en filagrine [19] avant d'être à son tour clivée en acides urocanique et pyrrolidone carboxylique permettant entre autres une protection aux rayons UV. La loricrine également contenue dans les granules est jointe à d’autres protéines dont l’involucrine [1].
6 1.1.1.4 Couche lucidum
Cette couche, située directement sous la couche cornée, n’est présente qu’à la plante des pieds et à la paume des mains, mais elle est absente des autres sites anatomiques où la peau est plus mince. Cette couche apparait translucide en microscopie électronique, d’où son nom. Cette couche a pour fonction la dégradation des organelles et du noyau cellulaire par les lysosomes cellulaires avant l’arrivée de la cellule cornifiée dans la couche cornée. Il s’agit donc d’une couche de transition [21].
1.1.1.5 Couche cornée
La couche cornée est la couche la plus superficielle de l’épiderme. Les cellules qui la composent se nomment cornéocytes et sont dépourvues de noyau ainsi que d’organelles intracellulaires. Ces cellules possèdent une enveloppe cornifiée acquise au cours de la différenciation kératinocytaire [21]. Cette enveloppe cornifiée, formée entre autres d’agrégats de macrofilaments de kératine liés, est responsable de la propriété de barrière et d’imperméabilité de la peau [1]. Les cellules de cette couche desquament en raison des faibles liens intercellulaires résiduels et doivent être constamment remplacées par de nouveaux cornéocytes pour assurer la stabilité de la fonction de barrière cutanée. L’épiderme se renouvèle en entier en 45 à 75 jours [34]. Ce relais cellulaire est assuré par une différenciation kératinocytaire accompagnée d’une migration cellulaire depuis la membrane basale au cours de laquelle il y a formation d’une enveloppe cornifiée (section 1.2.1). Le capital cellulaire permettant ce renouvellement rapide est assuré par la présence de niches de cellules souches au sein même de la membrane basale et du renflement des poils cutanés [35-37]. Les cellules souches se divisent de façon asymétrique: elles engendrent d'une part une autre cellule souche et, d'autre part, une cellule d’amplification transitoire qui se divise elle-même à quelques reprises avant d’entamer son propre processus de différenciation [35]. Leur présence est essentielle autant dans une peau native que pour une peau reconstruite visant à être greffée afin d’assurer le caractère permanent et auto-renouvelable de ces deux formes de peau.
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1.1.2 Structure du derme
Le derme est situé sous l’épiderme. Son épaisseur varie selon sa localisation corporelle, soit environ 6 mm à la plante des pieds et 1mm aux paupières [1]. Le derme est composé d’une matrice extracellulaire formée principalement de protéoglycans hydrophiles, de glycoprotéines comme la fibronectine, de divers collagènes puis d’élastine. La décorine est un protéoglycan du derme dont l’association à l’élastine contribue à l’élasticité normale de la peau [38]. La tenascine-C est également retrouvée dans le derme et joue un rôle important dans la déposition ordonnée du collagène de la matrice extracellulaire dermique [39]. Le collagène constitue la plus grande partie de cette matrice, soit environ 75 % du poids sec dermique dont 70 % est du collagène de type I; le collagène de type III est également une composante majeure de cette matrice [21]. Le derme comprend deux régions, le derme papillaire et le derme réticulaire, qui se distinguent par le calibre et l’organisation des fibrilles de collagène qui les composent. La grosseur des fibres de collagène augmentent progressivement en calibre, du derme superficiel au derme plus profond. Le derme papillaire est très mince et accolé à la membrane basale [21]. Le derme papillaire plus en profondeur contient quant à lui les glandes sébacées, des nerfs moteurs et sensitifs, des follicules pileux, des capillaires et artérioles puis des vaisseaux lymphatiques. Répartis dans cette matrice extracellulaire, les fibroblastes sont les cellules majoritaires du derme responsables de la sécrétion de la matrice extracellulaire. Le derme humain natif contient également des macrophages, des histiocytes et des mastocytes [21].
1.1.3 Structure de l’hypoderme
L’hypoderme est une couche adipeuse située sous le derme qui contient le plexus sous-cutané de vaisseaux sanguins d’où émerge le plexus vasculaire dermique. Cette couche procure également une adhésion de la structure dermique aux structures plus profondes dont les fascias. [34]
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1.1.4 Architecture cutanée des peaux reconstruites
Lors de la culture en laboratoire, l’ensemble des composantes cutanées reconstruites incluent un derme et un épiderme complet formé de 4 couches dont une membrane basale, la spineuse, la granuleuse et la couche cornée (Figure 5) et ce, à partir de deux populations cellulaires : les fibroblastes et les kératinocytes. Les peaux reconstruites ne contiennent pas de follicules pileux, d’annexes, ni de capillaires ou de lymphatiques. Le reste de la composition est cependant similaire à la structure cutanée humaine normale décrite dans la présente section [10].
Figure 5: Structure histologique des peaux bilamellaires reconstruites in vitro présentée en A, comparée à la structure histologique d’une peau normale humaine native (B)
1.2 Reconstruction cutanée par auto-assemblage
La méthode de reconstruction cutanée par auto-assemblage utilisée au LOEX implique la mise en culture de kératinocytes et de fibroblastes dans des conditions optimales, permettant à ces derniers de sécréter leur propre matrice extracellulaire et de s’organiser dans l’espace pour former un tissu tridimensionnel. La méthode de production classique [16] est précédée de l’extraction de ces deux types cellulaires d’une biopsie cutanée obtenue d’un patient. L’expansion des populations cellulaires en culture, afin d’obtenir une quantité suffisante pour assurer les étapes subséquentes, est par la suite réalisée. Le délai généralement nécessaire pour cette première étape est de 13-17 jours. Par la suite,
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l’ensemencement des fibroblastes en flacons pour leur permettre de former des feuillets manipulables composés des cellules et de leur matrice extracellulaire est réalisé (Figure 6). La production de ces feuillets, qui seront ensuite superposés trois par trois pour obtenir un derme reconstruit d’épaisseur suffisante, requiert en général 21-28 jours. Les kératinocytes extraits de la biopsie sont quant à eux ensemencés sur le derme reconstruit et maintenus en culture immergée pour une durée de 7 jours (Figure 6). Les substituts cutanés sont par la suite placés à l’interface air-liquide pour une durée de 10 jours, de façon à permettre la différenciation des kératinocytes ensemencés pour former un épiderme stratifié complet (Figure 6). Les cellules sont cultivées en présence d’acide ascorbique durant toute la culture [18]. Au terme de ce processus, la peau reconstruite est composée d’un substitut dermique formé de fibroblastes et de la matrice extracellulaire qu’ils ont sécrétée et d’un épiderme bien différencié [40] (Figure 5). Le derme et l’épiderme reconstruits sont joints un à l’autre par une membrane basale mature et continue [41].
La reconstruction débute par la mise en culture des fibroblastes en flacons pour permettre la production de feuillets dermiques (21-28 jours) qui sont par la suite superposés trois par trois. Les kératinocytes sont ensuite ensemencés sur l’équivalent dermique et maintenus en culture immergée pour 7 jours avant de placer le substitut cutané en culture à l’interface air-liquide pour 10 jours supplémentaires.
Figure 6: Méthode classique de reconstruction cutanée bilamellaire par auto-assemblage
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Ainsi, au cours de cette reconstruction par auto-assemblage, aucun échafaudage exogène, biomatériau ou matrice extracellulaire synthétique n’est nécessaire pour la production des peaux bilamellaires, ce qui représente un avantage immunologique et permet d’éviter les réactions de corps étrangers. La présence d’une membrane basale continue représente également un atout mécanique et structurel important [42]. De plus, la production à partir des propres cellules du patient sans élément xénogène est une caractéristique intéressante du point de vue immunologique. En contrepartie, la méthode par auto-assemblage possède le désavantage d’avoir un délai de production supérieur à d’autres méthodes dû au temps nécessaire à la culture cellulaire elle-même.
1.3 Fonction épidermique
Tel que décrit, la méthode de reconstruction tissulaire par auto-assemblage utilisée au LOEX repose sur la mise en place de conditions de culture adéquates permettant aux cellules de produire leur propre matrice extracellulaire et de se différencier pour former le tissu d’intérêt [12, 13, 16]. La différenciation cellulaire organisée joue un rôle crucial dans la formation des différentes couches de l’épiderme et dans la fonction barrière de la peau. En effet, les kératinocytes se différencient pour former graduellement une enveloppe cornifiée mature au niveau de la couche cornée de l’épiderme, rendant la peau sélectivement imperméable [1]. Lors de l’analyse en immunofluorescence des peaux reconstruites, les marqueurs sont utilisés pour valider non seulement la structure cutanée, mais également la différenciation adéquate des cellules qui compose ces peaux. Les étapes sommaires de cette différenciation sont présentées dans les prochains paragraphes et permettront de mieux saisir la raison du choix des marqueurs utilisés pour la caractérisation in vitro des peaux reconstruites.
1.3.1 Différenciation des cellules épidermiques et formation de l’enveloppe cornifiée
La prolifération cellulaire qui se produit dans la couche épidermique en contact avec la membrane basale, accompagnée d’une migration cellulaire, est en
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équilibre avec la desquamation de la couche cornée; il s’agit de l’homéostasie épidermique. Les cellules souches basilaires se divisent et assurent le maintien d’un capital cellulaire suffisant [35]. Ces cellules souches expriment la kératine 19 et leur présence varie en fonction de l’âge du donneur et du site anatomique prélevé [36, 37]. Afin de conférer un caractère permanent aux greffes de culture, la présence de ces cellules souches est donc essentielle et mérite une attention spéciale lors de la caractérisation ultérieure des greffons.
Au cours de ce processus de migration cellulaire, les cellules basilaires destinées à se différencier formeront une enveloppe cornifiée sous la membrane plasmique [43]. Cette enveloppe est formée d’une organisation protéique dont les composantes sont liées par des transglutaminases [44]. Des lipides sont également intégrés à cette structure pour former une enveloppe hydrophobe [45].
Au début de ce processus, les kératinocytes modifient leur contenu en kératine. En effet, la kératine 5 et la kératine 14 des cellules basales sont remplacées par la kératine 1 et la kératine 10 [43]. L’involucrine et d’autres protéines comme l’envoplakine et la périplakine sont rapidement liées en couche sous la membrane plasmique, formant un échafaudage pour la fixation de composantes de soutien [44]. Notamment, la loricrine et des petites protéines riches en proline, liées en homodimères ou en hétérodimères, sont incorporées à la nouvelle charpente protéique pour la solidifier [44]. Au niveau de la couche granuleuse, la profilagrine contenue dans les granules kératohyalines est déphosphorylée et clivée pour libérer la filagrine [43]. Cette protéine permet la liaison des filaments de kératine 1 et de kératine 10 en faisceaux serrés, ce qui s’accompagne d’un changement majeur de la conformation cellulaire vers une forme plane caractéristique des couches supérieures de l’épiderme [43]. Ainsi, les principales composantes de l’enveloppe cornifiée mature des kératinocytes qui seront utilisées subséquemment pour la caractérisation des peaux reconstruites sont représentées dans la Figure 7.
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Figure 7: Structure des composantes principales de l’enveloppe cornifiée présente dans les kératinocytes différenciés matures
1.3.2 Différenciation des cellules épidermiques in vitro
En culture in vitro, cette différenciation kératinocytaire est induite par le contact des cellules avec l’air [18], ce qui mime de façon très intéressante le contexte physiologique de la peau normale humaine. De plus, l’ajout d’acide ascorbique (vitamine C) au milieu de culture joue un rôle adjuvant pour la différenciation des kératinocytes [30, 46] en plus de favoriser la formation d’une enveloppe cornifiée plus dense [31].
1.4 Marqueurs structurels et de différenciation cutanée
Suivant la description de l’architecture et de la composition de la peau normale humaine, l’utilité des marqueurs des composantes spécifiques servant à la caractérisation des peaux reconstruites est facilement mise en perspective. Cette section représente un regroupement des marqueurs évoqués dans les sections précédentes et pourra servir de référence dans la section traitant de l’analyse en immunofluorescence des substituts cutanés.
1.4.1 Marqueurs épidermiques
La mise en évidence de composantes spécifiques de l’épiderme s’intéresse particulièrement à la démonstration de la présence d’une membrane basale continue (confirmée en microscopie électronique) ainsi qu’à la différenciation adéquate des kératinocytes.
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1.4.1.1 Marqueurs épidermiques de la membrane basale
Tel que vu à la section 1.1.1.1, la membrane basale est formée de plusieurs composantes organisées en hémidesmosomes de manière à former un système d’ancrage entre le cytosquelette cellulaire des kératinocytes épidermiques et la matrice extracellulaire dermique. Les laminines, le collagène IV, la protéine du pemphigoide bulleux (BP-230) sont des constituants principaux de ces hémidesmosomes. Les kératines 5 et 14 sont retrouvées dans les kératinocytes de la couche basale. De plus, le collagène VII est retrouvé dans les filaments d’ancrage de la matrice extracellulaire dermique. Les cellules souches épidermiques expriment la kératine 19 et les cellules en prolifération expriment quant à elles le Ki-67. Ces marqueurs sont résumés dans le tableau 1.
1.4.1.2 Marqueurs épidermiques de différenciation cellulaire
Tel que décrit à la section 1.3.1, la différenciation kératinocytaire adéquate est nécessaire à la fonction cutanée normale. L’involucrine est retrouvée à un stade précoce dans le processus de différenciation auquel sont soumis les kératinocytes. De plus, la loricrine s’incorpore à l’échafaudage pour former l’enveloppe cornifiée, via l’action des transglutaminases. Les kératines 5 et 14 présentes dans les kératinocytes de la couche basale sont remplacées par les kératines 1 et 10 dès la couche épineuse puis ces filaments de kératine sont liés par la filagrine pour former des faisceaux solides. Ces marqueurs sont résumés dans le tableau 1.
1.4.2 Marqueurs dermiques
La matrice extracellulaire dermique contient plusieurs éléments pour assurer les fonctions de support mécanique et d’élasticité du derme. Les collagènes de type I et III sont des protéines structurelles majeures de cette composition dermique. La décorine, la tenascine-C et la fibronectine sont respectivement des protéoglycans et des glycoprotéines présents dans la matrice qui contribuent à l’enchevêtrement adéquat des éléments la matrice. Ces marqueurs sont résumés au tableau 1.
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Tableau 1: Description des marqueurs épidermiques et dermiques permettant la caractérisation des peaux reconstruites in vitro
Marqueur Localisation Intérêt de marquage
Laminine jonction dermo-épidermique Membrane basale épidermique Collagène IV
Protéine pemphigus bulleux Intégrine α6β4 Kératine 5 Kératine 14 Collagène VII Kératine 19 jonction dermo-épidermique jonction dermo-épidermique jonction dermo-épidermique Kératinocytes basaux Kératinocytes basaux MEC dermique supérieure Couche basale
Membrane basale épidermique Membrane basale épidermique Membrane basale épidermique Kératine intracellulaire basale Kératine intracellulaire basale Filaments ancrage basaux Cellules souches épidermiques
Ki67 Couche basale Cellules prolifératives
Involucrine Couches suprabasales Différenciation épidermique Loricrine Couches suprabasales Différenciation épidermique Transglutaminases Kératine 1 Kératine 10 Filagrine Collagène I Collagène III Décorine Tenascine-C Fibronectine À partir de la spineuse À partir de la spineuse À partir de la spineuse Couche granuleuse MEC dermique MEC dermique MEC dermique MEC dermique MEC dermique Différenciation épidermique Différenciation épidermique Différenciation épidermique Différenciation épidermique Composante de la MEC Composante de la MEC Composante de la MEC Composante de la MEC Composante de la MEC
MEC : Matrice extracellulaire
Au cours des sections précédentes, la structure, la composition et la fonction de la peau normale humaine et des peaux reconstruites ont été discutées. Ces éléments sont issus d’une interaction mutuelle finement régulée entre les différents types cellulaires, leur matrice extracellulaire et leur environnement. Ces interactions ont aussi un rôle central dans le mode d’action des substituts cutanés produits in vitro en tant que greffes cutanées. Ces implications biologiques dans le mode d’action des greffons cultivés justifient bien le choix des praticiens dans le recours aux
15
peaux uni- ou bilamellaires comme thérapie. Dans la prochaine section, l’utilité clinique de ces interactions cellulaires est présentée afin de saisir la motivation concrète menant à la décision de se concentrer sur le développement fondamental d’un modèle bilamellaire.
1.5 Interactions entre les fibroblastes et les kératinocytes
Les kératinocytes et les fibroblastes, les principales cellules constituant respectivement l’épiderme et le derme, communiquent constamment entre elles pour réguler autant leur prolifération, leur sécrétion de facteurs de croissance que leur phénotype cellulaire [42, 47, 48]. Ces interactions jouent un rôle central dans la reconstruction même du tissu par auto-assemblage, mais participent également au mécanisme de guérison impliqué lors de la greffe de ces peaux. En effet, les substituts cutanés stimulent la guérison en servant de couverture, à la manière d’un pansement biologique, mais également en livrant des cytokines, des chemokines et des facteurs de croissance dans la plaie [42].
De façon très intéressante, le patron de sécrétion de ces médiateurs de guérison issu de substituts reconstruits de kératinocytes ou de fibroblastes seuls diffère du patron de sécrétion de ces deux types cellulaires en co-culture [49, 50]. Les kératinocytes seuls produisent une prédominance de médiateurs pro-inflammatoires (IL-1α, TNF- α et CCL5) et angiogéniques (VEGF) alors que les fibroblastes seuls en culture produisent un patron de médiateurs visant le remodelage tissulaire et de ré épithélialisation (HGF, TIMP-2) [49]. Par contre, la culture de kératinocytes et de fibroblastes combinée engendre la production de facteurs pro-inflammatoires, angiogéniques mais également de facteurs stimulant la granulation tissulaire (CCL2, CXCL1, CXCL8, IL-6) [49]. Ces facteurs sont sécrétés par les fibroblastes en réponse à l’action synergique d’IL-1α et de TNF-α produits par les kératinocytes et, donc, cette variation de patron d’expression de médiateurs de guérison est due à des interactions paracrines entre les deux types cellulaires [49, 50].
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Ces observations fondamentales ont des implications cliniques importantes. En effet, l’utilisation de cultures épithéliales autologues (CEA) requiert la présence d’une base dermique suffisante pour son application. En ne secrétant pas de facteurs de stimulation de granulation ou de remodelage tissulaire, ces substituts unilamellaires de kératinocytes ne sont pas appropriés pour le traitement de plaies profondes, inertes, sans base de granulation. Par contre, ces cultures peuvent être très utiles pour favoriser l’épithélialisation de plaies avec base dermique active présente en épaisseur suffisante [51, 52]. Ainsi, leur utilisation clinique originale pour la couverture des sites donneurs chez les grands brûlés trouve son explication.
En ce qui concerne les cultures cutanées bilamellaires impliquant une co-culture de kératinocytes et de fibroblastes, leurs caractéristiques biologiques leur permettent une utilisation grandement élargie par rapport aux CEA. En effet, les peaux bilamellaires peuvent être utilisées sur des plaies profondes avec ou sans présence de support dermique résiduel de même que sur des plaies inertes chroniques [15, 53, 54] en raison de leurs propriétés pro-angiogéniques, de stimulation de la granulation et de remodelage tissulaire. Ainsi, l’intérêt du développement d’un modèle de peau bilamellaire pour une utilisation clinique polyvalente, due à ces raisons biologiques intrinsèques, apparait justifié.
1.6 Reconstructions cutanées bilamellaires
Afin de développer un modèle de reconstruction cutanée bilamellaire de façon plus rapide, l’utilisation de matrices dermiques décellularisées se présente comme une stratégie intéressante. Quelques modèles de reconstruction bilamellaire à partir de matrices dermiques ont été proposés par différentes équipes [15, 55]. Ces modèles utilisent différents types de matrices qui peuvent être regroupés dans les catégories suivantes : matrices synthétiques, matrices humaines décellularisées et matrices xénogènes décellularisées. Cette section résume les principaux modèles bilamellaires utilisant des matrices dermiques appartenant à ces différentes catégories.
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1.6.1 Substituts cutanés bilamellaires allogéniques
1.6.1.1 Substituts cutanés bilamellaires acellulaires à partir de matrices synthétiques
L’Integra© est le premier prototype des substituts cutanés bilamellaires incluant une matrice dermique exogène. Ces équivalents cutanés sont composés d’une partie dermique formée de collagène bovin et de chondroitin-6-sulfate et d’une partie épidermique composée d’un polymère synthétique de polysiloxane [55]. Après quelques semaines, la membrane épidermique de silicone doit être remplacée par une autogreffe d’épaisseur partielle [9, 54], soit une étape additionnelle invasive pour le patient. L’Intégra© est actuellement utilisé pour le traitement des brûlés [56, 57] et des ulcères chroniques [54, 58].
Le Biobrane est un équivalent cutané temporaire acellulaire, utilisé fréquemment pour le traitement des nécroses épidermiques toxiques (TEN) [59] ou des brûlures superficielles [60]. Il est composé d’une membrane de nylon liée de façon covalente à du collagène bovin de type I. Une mince couche de silicone sert de composante épidermique pour limiter les pertes liquidiennes [55].
1.6.1.2 Substituts cutanés bilamellaires à partir de matrices dermiques humaines décellularisées
Plusieurs équipes ont développé des substituts bilamellaires composites, formés de cultures épidermiques autologues apposées sur des matrices dermiques cadavériques humaines décellularisées. Ces peaux étaient reconstruites à partir d’Alloderm© [52] ou de peaux décellularisées par différents procédés chimiques dont l’oxyde d'éthylène [61] ou le glycérol [62-64]. Ce concept d’utilisation de CEA combinée à des matrices dermiques cadavériques a d’abord été utilisé sans décellularisation dermique préalable [7, 65] dans les années 80. La problématique de ce dernier concept réside dans l’application de kératinocytes déjà différenciés sur la base dermique, empêchant ainsi la reconstruction in situ de la membrane basale par contact avec la matrice extracellulaire sous-jacente. L’absence d’une membrane basale fonctionnelle représente un désavantage histologique
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s’accompagnant d’une faiblesse mécanique considérable [66] (Figure 8) et peut même mener à une perte complète de l’épiderme.
Figure 8: Substituts cutanés bilamellaires à partir de matrices dermiques humaines décellularisées
Figure adaptée de El Ghabzouri et al. (2004) dans laquelle une couche de fibroblastes a été ensemencée au-dessus de la matrice dermique, empêchant le contact direct de l’épiderme avec la matrice extracellulaire sous-jacente, résultant en une absence de membrane basale en A. et en une dégénérescence de l’épiderme après une semaine de culture commune en B.
1.6.1.3 Substituts cutanés bilamellaires allogéniques à partir de matrices dermiques xénogéniques
L’Apligraf© est un substitut bilamellaire formé d’un gel de collagène bovin ensemencé de fibroblastes néonataux allogéniques sur lequel on retrouve un épithélium stratifié de kératinocytes néonataux allogéniques [9, 55]. Ce substitut cutané est surtout utilisé pour le traitement des ulcères veineux chroniques [67-69].
Le substitut Orcel© est similaire à l’Apligraf© dans la mesure où il est également composé de fibroblastes néonataux dans une éponge de collagène bovin surmonté d’un épiderme de kératinocytes néonataux [15]. Cet équivalent est quant à lui utilisé davantage pour le traitement des sites donneurs pour les brûlés [70].
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1.6.2 Substituts cutanés bilamellaires autologues
Il existe très peu de modèles de substituts cutanés bilamellaires autologues. Les principaux actuellement disponibles sont les suivants :
Le Tissue-Tech Autograft System© nécessite l’application de deux produits séparément à une semaine d’intervalle, soient la matrice dermique Hyalograft 3D© et le substitut épidermique Laserskin© tous deux composés de cellules autologues ensemencées dans une matrice d’acide hyaluronique synthétique. La préparation initiale de la matrice dermique requiert environ 1 semaine [71], puis celle-ci sera appliquée sur le patient pendant la préparation du composé épidermique disponible la semaine suivante [72]. Ainsi, le délai de production de ce substitut est estimé à deux semaines.
Le Permaderm© est un substitut cutané bilamellaire autologue dans lequel des fibroblastes autologues sont ensemencés dans une matrice dermique de collagène bovin et de glycoaminoglycans disposés en polymères synthétiques, puis des kératinocytes autologues sont cultivés à la surface pour former un épiderme stratifié [15, 73] (Figure 9). Ce modèle n’est pas utilisé de façon courante jusqu’à présent, mais réapparait actuellement sous la bannière Novaderm (Regenicin). Selon la monographie sommaire du produit, les peaux sont disponibles pour la greffe en 30 jours (4 semaines).
Le MyDerm©, fabriqué en Malaisie est un substitut cutané bilamellaire autologue dans lequel les fibroblastes du patient sont ensemencés dans de la fibrine produite à partir du plasma provenant également du patient. Les kératinocytes sont ensuite ensemencés dans cette même fibrine et les deux couches sont superposées de façon à obtenir les deux composantes de la peau reconstruite (Figure 10). Les cellules sont ensemencées à confluence (14 jours pour les kératinocytes) et un temps de maturation d’une semaine avant la greffe est nécessaire [74]. Ainsi, le délai de production estimé pour la fabrication de ces peaux est de 3 semaines.
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Figure 9: Substituts cutanés Permaderm©
Figure adaptée de Boyce et al. (1995), en A. les substituts cutanés Permaderm constitués d’un équivalent dermique synthétique (b) comprenant des fibroblastes autologues et un épiderme stratifié (a). Comparé en B. à l’histologie d’une autogreffe d’épaisseur partielle (étalon d’or) comprenant une couche cornée beaucoup plus développée.
Figure 10: Substituts cutanés MyDerm©
Figure adaptée de Mazlyzam et al. (2007). Démonstration histologique des substituts cutanés bilamellaires autologues MyDerm©. En A. l’apparence histologique de ces peaux 4 semaines suivant la greffe sur souris athymiques. Sur cette planche, on note la présence d’une couche cornée en a. un épiderme différencié en b. et une composante dermique en c. Sur la planche B, on observe l’apparence histologique de ces substituts cutanés avant la greffe. On ne voit pas la présence d’une couche cornée à ce moment. On note cependant la présence d’un épiderme d’allure indifférencié en a, et une composante dermique en b. Quelques perles de kératine (keratin pearls) ont été observées dans les couches épidermiques (flèche blanche), mais sans persistance au-delà de la greffe.
A
B
a b
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Le Polyactive© est un substitut cutané bilamellaire autologue fabriqué en Hollande dans lequel des fibroblastes autologues sont ensemencés dans un copolymère biodégradable de polyéthylène oxide teraphtalate et polybutylène teraphtalate (PEGT/PBT). Les fibroblastes sont cultivés dans ce treillis synthétique pour 3 semaines, puis des kératinocytes autologues sont ensemencés sur le néo-derme, cultivés en immergé pour 1 semaine suivi d’une semaine en interface air-liquide [75]. Ainsi, le délai de production de ce composé est estimé à 5 semaines [75]. Plusieurs modifications ont été proposées pour la mise au point de ce modèle aux résultats et attachements derme-épiderme variables [66]. Le copolymère a été démontré comme étant dégradable en 4 semaines chez le porc, s’accompagnant d’une réaction de corps étranger caractérisé par la présence de nombreux macrophages et cellules géantes multinucléées [76].
Ainsi, les autres modèles de substituts bilamellaires autologues possèdent des délais de production entre 2 et 5 semaines. Aucun modèle auto-assemblé exempt de matrice synthétique n’a jamais été développé auparavant. Le modèle MyDerm© est celui se rapprochant le plus de la physiologie normale jusqu’à présent. Parmi les modèles présentés, seulement les suivants sont utilisés sur les humains : Integra© [57, 58], Biobrane© [59, 60], Apligraf© [67, 68], Orcel© [70] et le Tissue-Tech Autograft System© [71, 77]. Le substitut Permaderm© est présentement en étude clinique aux États-Unis [78]. Parmi ceux-ci, seulement l’Integra© et l’Orcel© sont approuvés par la Food and Drug Administration (FDA) américaine pour leur utilisation chez les brûlés. L’Apligraft est approuvé pour son utilisation sur les ulcères variqueux et diabétiques réfractaires. Le Biobrane et l’Orcel sont approuvés pour leur utilisation dans les cas d’épidermolyse bulleuse ou de nécrose épidermique toxique (TEN).
1.7 Génération de matrices décellularisées et congelées
Suivant la description des méthodes existantes de reconstruction cutanée in vitro à partir de matrices dermiques, les caractéristiques idéales recherchées de ces matrices se précisent. La génération de matrices sans matériel exogène et dont la
