Développement d'un traitement thérapeutique pour la dystrophie musculaire de Duchenne à l'aide des protéines TALENs ou Cas9

Texte intégral

(1)Développement d’un traitement thérapeutique pour la dystrophie musculaire de Duchenne à l’aide des protéines TALENs ou Cas9. Mémoire. Daniel Agudelo. Maitrise en biologie cellulaire et moléculaire Maitre ès sciences (M. Sc.). Québec, Canada © Daniel Agudelo, 2017.

(2) Développement d’un traitement thérapeutique pour la dystrophie musculaire de Duchenne à l’aide des protéines TALENs ou Cas9.. Mémoire. Daniel Agudelo. Jacques-P. Tremblay, directeur de recherche.

(3) Résumé La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie héréditaire liée au chromosome X. Elle est principalement causée par la délétion d’un ou plusieurs exons du gène DMD, ce qui entraine un changement du cadre de lecture et l’obtention d’une protéine dystrophine tronquée et inactive. L’édition de génome par les systèmes TALEN ou CRISPR/Cas9 est devenue dans les dernières années un grand espoir pour le développement de traitements pour ce type de maladie. Dans ce travail, nous illustrons la faisabilité d’un traitement pour la DMD en utilisant les protéines TALENs ou le complexe CRISPR/Cas9 purifiés. Ces protéines sont donc transduites afin de générer des cassures double brin dans l’ADN génomique. Ainsi, la correction de cette mutation par recombinaison non homologue pourra corriger le cadre de lecture du gène codant pour la protéine dystrophine, produisant ainsi une protéine tronquée, mais active, telle que pour les patients Becker. Bien que les protéines TALENs montrent une bonne activité in vitro, l’efficacité de coupure n’a pas pu être observée dans les cellules, ce qu’indiquerait un défaut lors de la transduction protéique. Toute fois, dans le cas du système CRISPR/Cas9, l’essai surveyor a permis d’observer les produits de coupure attendus lors de la transduction de ce système avec des lipides cationiques. Ceci indique donc que le système CRISPR/Cas9 peut être utilisé de façon efficace sous forme protéique tout en ciblant le gène DMD. Finalement, l’utilisation de ce système a été confirmée in vivo chez la souris hDMD, où il a été possible d’observer la présence des délétions ciblées. La transduction de protéines en utilisant le système CRISPR/Cas9 illustre donc une approche thérapeutique prometteuse dans le but de développer un traitement pour les maladies génétiques.. III.

(4) Abstract Duchenne muscular dystrophy (DMD) is an hereditary disease linked to chromosome X. It is mainly caused by the deletion of one or more exons of the DMD gene, which causes a change in the reading frame, obtaining a truncated and inactive protein. Genome editting by TALEN or CRISPR/cas9 systems has become in the recent years a powerfull tool for developing treatments for this type of disease. However, the use of plasmids encoding these systems leads to a prolonged expression, which may increase the off-target risk. Thus, it is important to note that today, viruses vectors remain the most effective delivery system for these plasmids, which always entails a risk of integration into the genome, increasing the probability of side effects for a treatment. In this work, we illustrate the development of a genome edditing treatment for DMD, but using purified protein TALENs or Cas9. These proteins are transduced in order to generate double strand breaks in the genomic DNA. Thus, the correction of this mutation by non-homologous end joining can correct the reading frame of the gene, producing a functional Dystrophin protein, as for Becker patients. Although TALEN proteins show a good activity in vitro, the cut-effectiveness has not been observed in the cells. It would indicate a defect in the protein transduction. However, in the case of CRISPR/cas9 system, we have obtained the expected cleavage products during the transduction with cationic lipids in both cell lines. These results are similar with those obteined when the plasmids coding for both systems were transfected. This indicates that the CRISPR/cas9 system can be used effectively in protein form while targeting a gene specifically. Protein therapy using the CRISPR/cas9 system can be a promising method in order to develop an alternative treatment for genetic diseases. Finally, in order to confirm that this system can be used in vivo, we will soon test it in the hDMD mouse model, containing the complete human DMD gene.. IV.

(5) Table de matières. Résumé ........................................................................................................................ III Abstract ....................................................................................................................... IV Table de matières .......................................................................................................... V Liste de tableaux ........................................................................................................ VIII Liste de figures ............................................................................................................. IX Liste des abréviations et sigles ....................................................................................... X Remerciements ........................................................................................................... XII Chapitre 1 ..................................................................................................................... 1 Introduction .................................................................................................................. 1 Chapitre 2 ..................................................................................................................... 2 Dystrophie musculaire de Duchenne.............................................................................. 2 2.1 Description de la maladie............................................................................................. 2 2.2 Le tissu musculaire ...................................................................................................... 2 2.3 Protéine dystrophine ................................................................................................... 4 2.4 Gène DMD................................................................................................................... 5 2.5 Mutations du gène DMD .............................................................................................. 6 2.6 Modèles animaux pour la DMD .................................................................................... 7 2.6.1 Souris mdx ..................................................................................................................... 8 2.6.2 Souris hDMD .................................................................................................................. 8. Chapitre 3 ..................................................................................................................... 9 Traitements possibles contre la DMD............................................................................. 9 3.1 Médicaments pharmacologiques.................................................................................. 9 3.2 Saut d’exons .............................................................................................................. 10 3.3 Thérapie génique ....................................................................................................... 11 3.4 Thérapie cellulaire ..................................................................................................... 12 3.5 Édition du génome..................................................................................................... 12 3.5.1 Nucléases à doigts de Zinc .......................................................................................... 13 3.5.2 TALENs ......................................................................................................................... 14 3.5.3 CRISPR/Cas9 ................................................................................................................ 15 3.6 Livraison en thérapie génique et édition du génome ................................................... 17 3.6.1 Vecteurs viraux ............................................................................................................ 19. V.

(6) 3.6.2 3.6.3. Livraison non virale ..................................................................................................... 20 Livraison des protéines. .............................................................................................. 20. Chapitre 4 ................................................................................................................... 21 Réparation de l’ADN suite à une cassure double brin ................................................... 21 4.1 4.2. Recombinaison non homologue ................................................................................. 21 Recombinaison homologue ........................................................................................ 23. Chapitre 5 ................................................................................................................... 25 Edition du génome à l’aide des protéines TALENs ........................................................ 25 5.1 Introduction .............................................................................................................. 25 5.2 Hypothèse et objectifs ............................................................................................... 26 5.3 Matériel et méthodes ................................................................................................ 26 5.3.1 Plasmides codants pour les TALENs. .......................................................................... 26 5.3.2 Vérification de la fonctionnalité des plasmides codant pour les TALENs ................. 28 5.3.3 Production des protéines à partir des bactéries ........................................................ 29 5.3.4 Purification des TALENs .............................................................................................. 29 5.3.5 Dessalage des protéines purifiées .............................................................................. 30 5.3.6 Dosage et analyse de la pureté des protéines. .......................................................... 31 5.3.7 Analyse de l’activité des TALENs in vitro .................................................................... 31 5.3.8 Culture cellulaire ......................................................................................................... 32 5.3.9 Livraison des protéines ............................................................................................... 32 5.3.10 Extraction de l’ADN génomique ............................................................................... 33 5.3.11 Analyse de la coupure génomique à l’aide de l’enzyme Surveyor .......................... 33 5.4 Résultats ................................................................................................................... 35 5.4.1 Analyse de la fonctionnalité des plasmides codants pour les TALENs. ..................... 35 5.4.2 Purification des TALENs .............................................................................................. 37 5.4.3 Analyse de la spécificité des TALENs .......................................................................... 39 5.4.4 Livraison des TALENs dans les cellules ....................................................................... 40. Chapitre 6 ................................................................................................................... 45 Edition du génome à l’aide du système CRISPR/Cas9 purifié ........................................ 45 6.1 Introduction .............................................................................................................. 45 6.2 Hypothèse et objectifs ............................................................................................... 46 6.3 Matériel et méthodes ................................................................................................ 47 6.3.1 Protéine Cas9 utilisée .................................................................................................. 47 6.3.2 Molécules d’ARN utilisés............................................................................................. 47 6.3.3 Analyse de l’activité du système CRISPR/Cas9 in vitro .............................................. 48 6.3.4 Culture cellulaire ......................................................................................................... 49 6.3.5 Livraison des protéines ............................................................................................... 49 6.3.6 Extraction de l’ADN génomique ................................................................................. 50 6.3.7 PCR sur lysat cellulaire ................................................................................................ 50. VI.

(7) 6.3.8 Analyse de la coupure génomique à l’aide de l’essai Surveyor ................................. 51 6.3.9 Analyse de l’exon hybride produit lors de la coupure simultanée dans les exons 50 et 54 in vivo............................................................................................................................... 51 6.3.10 Clonage et séquençage des exons hybrides ............................................................. 53 6.4 Résultats ................................................................................................................... 53 6.4.1 Analyse de la coupure in vitro .................................................................................... 53 6.4.2 Livraison du complexe Cas9/ARN ............................................................................... 54 6.4.3 Livraison du complexe Cas9/ARNg in vivo ................................................................. 58. Chapitre 7 ................................................................................................................... 63 Discussion ................................................................................................................... 63 Conclusion................................................................................................................... 68 Bibliographie ............................................................................................................... 69. VII.

(8) Liste de tableaux Tableau 1. Tampons utilisés lors de la purification des TALENs. ................................................................. 30 Tableau 2. Amorces utilisées pour amplifier l'exon 54 du gène DMD. ........................................................ 34 Tableau 3. Amorces utilisées lors de l'amplification de l'exon hybride 50-54............................ 52. VIII.

(9) Liste de figures Figure 1. Complexes protéiques associés à la dystrophine. ........................................................... 3 Figure 2. Types de délétions du gène DMD. ....................................................................................... 7 Figure 3. Exemple d'un traitement par saut d'exon. ........................................................................ 10 Figure 4. Structure et liaison à l'ADN d'une ZFN. ............................................................................ 14 Figure 5. Structure des TALENs. ........................................................................................................ 15 Figure 6. Illustrations du Système CRISPR/Cas9. ........................................................................... 17 Figure 7. Différents types de livraison cellulaire utilisés actuellement. ...................................... 18 Figure 8. Réparation d'une cassure double brin par recombinaison non homologue. ............ 22 Figure 9. Étapes de la recombinaison homologue. ......................................................................... 24 Figure 10. Vecteur plasmidique JDS. ................................................................................................. 27 Figure 11. Vecteur plasmidique Pet16b. ............................................................................................ 28 Figure 12. Fonctionnement de l'analyse par l'essaie Surveyor. ................................................... 35 Figure 13. Analyse avec l'enzyme Surveyor des INDELs produits par la coupure de l'exon 54 par des TALENs. ............................................................................................................................ 37 Figure 14. Purification d'une paire de nucléases TALENs ciblant l'exon 54 du gène DMD. .... 38 Figure 15. Analyse de l'activité nucléase des protéines TALENs purifiées. ............................... 39 Figure 16. Livraison des TALENs dans des cellules HeLa à l'aide du Cys(Npys)-(Arg)9. ........ 40 Figure 17. Livraison des TALENs dans une culture primaire de myoblastes provenant d'un patient DMD. ................................................................................................................................... 41 Figure 18. Transduction des TALENs ciblant l'exon 54 du gène DMD à l'aide du Bioporter. .. 42 Figure 19. Transduction des TALENs à l'aide de la Lipofectamine RNAimax. ........................... 43 Figure 20. Livraison des TALENs dans des cellules HeLa IR8 à l'aide de différents Feldan Shuttles. .......................................................................................................................................... 44 Figure 21. Analyse de la coupure in vitro du complexe Cas9/ARN. ............................................. 54 Figure 22. Livraison du système CRISPR/Cas9 dans des cellules HeLa à l'aide de la Lipofectamine RNAimax. ............................................................................................................. 56 Figure 23 Livraison du système CRISPR/Cas9 avec la Lipofectamien RNAimax dans des myoblastes d'un patient DMD. .................................................................................................... 57 Figure 24. Essai Surveyor sur l'exon 54 du gène DMD, suite à la transduction du système CRISPR/Cas9 avec le Feldan Shuttle. ........................................................................................ 58 Figure 25. Diagramme de l'approche utilisé pour l'analyse de la livraison du complexe Cas9/ARN in vivo........................................................................................................................... 59 Figure 26. Livraison du complexe Cas9/ARN dans la souris hDMD. ........................................... 60 Figure 27. Séquence de l'exon hybride formé suite aux coupures des exons 50 et 54 par les complexes Cas9/ARN livrés avec le Feldan Shuttle B. .......................................................... 61 Figure 28. Analyse de l'homologie entre la séquence attendue (Query) et la séquence obtenue (Sbjct). ............................................................................................................................. 62. IX.

(10) Liste des abréviations et sigles ADN = acide déoxyribonucléique ADNc = ADN complémentaire ADNsb = ADN simple brin ADNdb = ADN double brin ARN = acide ribonucléique ARNm = ARN messager ARNpm = ARN pré-messager cm = centimètre CRISPR = clustered regularly interspaced short palindromic repeats DMB = dystrophie musculaire de Becker DMD = dystrophie musculaire de Duchenne kb = kilo base kDa = kilo Dalton Mdx = dystrophie musculaire liée au chromosome X (muscular dystrophy X-linked) mg = milligramme mm = millimètre ml = millilitre mM = milli molaire pb = paire de base PBS = solution tampon de phosphate PCR = réaction en chaîne par polymérase XI SDS-PAGE = sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TA = Tibialis anterior TALENs = Transcription activator-like effector nucleases Tris-HCl = Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride μl = microlitre μg = microgramme μm = micromètre V = volts ZF = Zinc Finger ZFN = Zinc Finger Nuclease. X.

(11) Je dédie ce mémoire à ma famille.. XI.

(12) Remerciements Je tiens d’abord à remercier mon directeur de recherche, le docteur Jaques P. Tremblay, pour m’avoir donné l’opportunité de réaliser ce projet dans son laboratoire, ainsi que pour ses conseils et commentaires qui me seront très utiles dans mes projets futurs. Je voudrais également remercier les assistantes de recherche, ainsi que les étudiants gradués du laboratoire pour leurs conseils et soutiens au cours de ma maitrise, ainsi que pour m’avoir accueilli avec une ambiance de travail extraordinaire. Je tiens aussi à remercier spécialement Joël Rousseau pour son appui constant dans la théorie et la pratique des différentes techniques utilisées lors de mon projet. J’aimerais. remercier. les. membres. de. l’équipe. de. recherche. et. développement de la compagnie Feldan Therapeutics. Leurs conseils m’ont grandement aidé lors de la réalisation de mon projet. J’aimerais souligner l’apport financier accordé par l’Institut de recherche en santé du Canada (IRSC), ainsi que par les fonds de recherche du Québec en santé ( FRQS) qui m’ont grandement aidé financièrement tout au long de mes études de maitrise. Finalement, je tiens à remercier ma famille et mes amis, spécialement ma mère et ma sœur. Leurs encouragements et leur soutien m’ont aidé énormément pour atteindre mes objectifs académiques et personnels.. XII.

(13) Chapitre 1 Introduction Depuis le décodage du génome humain au début du XXI siècle, on a découvert un lien génétique à plusieurs maladies. On retrouve notamment plusieurs maladies qui sont causées par un dérèglement d’un ou plusieurs gènes important pour notre organisme. À ce jour, il y a plus de 6000 maladies génétiques répertoriées, dont la plupart restent encore orphelines, c’est-à-dire qu’elles n’ont aucun traitement. Elles causent des symptômes très divers et souvent agressifs pour le patient. Dans ce type de maladies, on retrouve les myopathies, soit des maladies neuromusculaires, dont la plus connue, et étudiée est la Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). La DMD est une maladie héréditaire liée au chromosome X qui est causée principalement par la délétion d’un ou plusieurs exons dans le gène de la protéine dystrophine. Cette maladie est récessive et l’incidence est d’un enfant mâle sur 3500 naissances. Chez la femme, cette maladie est très rare, étant donné la présence de deux chromosomes X. La mutation de ce gène implique un changement du cadre de lecture du gène, ce qui conduit à l’apparition d’un codonSTOP prématuré. Ceci cause l’absence complète de la protéine dystrophine, ce qui conduit à l’instabilité du sarcolemme se traduisant par la perte de rigidité des cellules musculaires[1, 2]. Bien que cette maladie soit encore incurable, les recherches sont en cours dans le but de trouver un traitement. Notamment, les recherches en thérapie génique, saut d’exon, ainsi que, dans les dernières années, en édition du génome.. 1.

(14) Chapitre 2 Dystrophie musculaire de Duchenne 2.1. Description de la maladie La dystrophie musculaire de Duchenne a été nommée pour la première fois. dans le 19e siècle par le physiologiste Guillaume Benjamin Duchenne [3]. Bien que ce soit une maladie à évolution rapide, les enfants naissants ne montrent aucun symptôme. Cependant, dès l’âge de 2 à 5 ans, les premiers symptômes peuvent être visibles, notamment la difficulté à monter des escaliers ou à se relever lorsqu’ils tombent. Les difficultés physiques causées par une grande faiblesse musculaire augmentent progressivement. À l’âge de 10 à 12 ans, normalement les enfants ont besoin d’un fauteuil roulant. Puis, vers l’adolescence, les problèmes musculaires touchent aussi le diaphragme, ce qui cause un besoin de respirateur chez les patients. Pour la plupart des patients, cette maladie devient mortelle vers la vingtaine. Ceci est causé souvent par des problèmes cardiaques et respiratoires[1, 2].. 2.2. Le tissu musculaire Le tissu musculaire se caractérise par la présence de fibres cellulaires poly-. nucléées. Ces fibres sont formées par la fusion de cellules précurseurs (les myoblastes) [1, 4]. La fonction des fibres musculaires est de créer un travail mécanique, la contraction musculaire, lors de la réception d’un stimulus, soit par exemple, un influx nerveux [5]. Cette contraction est seulement possible grâce à la présence de myofibrilles dans le cytoplasme cellulaire. Ces myofibrilles sont formées par des complexes protéiques pouvant créer une contraction. Elles sont formées par des filaments d’actine qui sont associés aux filaments de. 2.

(15) WURSRP\RVLQHDLQVLTXHGHVILODPHQWVGHP\RVLQH'HSOXVLO\DDXVVLODSUpVHQFH GHILODPHQWVLQWHUPpGLDLUHVIRUPpVSDUOHVGHVPLQHV>@%LHQTXHFHVGLIIpUHQWV W\SHVGHILODPHQWVVRQWUHVSRQVDEOHVGHODIRQFWLRQGHVILEUHVPXVFXODLUHVLOH[LVWH DXVVLG¶DXWUHVFRPSOH[HVSURWpLTXHVTXLFUpHQWXQHLQWHUDFWLRQGHVILODPHQWVDYHF ODPHPEUDQHEDVDOHGHVILEUHVGRQQDQWDLQVLGHODULJLGLWpDX[FHOOXOHV,O\DHQWUH DXWUHVXQFRPSOH[HGHSURWpLQHVTXLV¶DVVRFLHQWjODG\VWURSKLQH'DQVFHFDVOH FRPSOH[H G\VWURSKLQH SHUPHW GH IDLUH OH OLHQ HQWUH OHV ILODPHQWV G¶DFWLQH HW OD ODPLQLQHVHVLWXDQWGDQVODPHPEUDQHEDVDOH ILJXUH

(16) . )LJXUH&RPSOH[HVSURWpLTXHVDVVRFLpVjODG\VWURSKLQH $XQLYHDXGXVDUFROHPPHODG\VWURSKLQHDJLWFRPPHSRLQWG¶DQFUDJHHQWUHGHVILODPHQWV G¶DFWLQH HW OD PHPEUDQH EDVDOH &HFL VH IDLW SDU O¶LQWHUDFWLRQ GH OD G\VWURSKLQH DYHF OHV G\VWURJO\FDQV TXL LQWHUDJLVVHQW DYHF OD ODPLQLQH GH OD PDWULFH H[WUDFHOOXODLUH )LJXUH DGDSWpHGH-RH:0F*UHHY\HWDO. 'DQVOHFDVG¶XQSDWLHQW'0'ORUVGHODQDLVVDQFHOHVFHOOXOHVPXVFXODLUHV VHPEOHQW QRUPDOHV >@ &HSHQGDQW ORUV GH OD FURLVVDQFH GH O¶HQIDQW OHV HIIRUWV SK\VLTXHVH[LJHDQWSOXVLHXUVFRQWUDFWLRQVPXVFXODLUHVJpQqUHQWGHVEULVGDQVOHV ILEUHVPXVFXODLUHV&KH]XQHSHUVRQQHVDLQHOHVILEUHVPXVFXODLUHVVRQWUpSDUpHV UDSLGHPHQW SDU OHV FHOOXOHV VDWHOOLWHV TXL VH GLIIpUHQWLHQW HQ P\REODVWHV HW VH. 3.

(17) fusionnent aux fibres brisées [4, 7]. Ceci est aussi le cas chez les patients DMD toutefois, l’absence de dystrophine dans leurs cellules musculaires provoque des bris massifs de plusieurs fibres musculaires lors de chaque effort physique. Lorsque le patient vieillit, il y a progressivement un épuisement des cellules satellites, provocant ainsi le non-remplacement des fibres musculaires. Ces fibres musculaires non réparées créent donc la dégénérescence musculaire, ce qui provoque la perte de la fonction de contraction musculaire chez les patients DMD [1, 6].. 2.3. Protéine dystrophine Située sous la surface cytoplasmique du sarcolemme, la dystrophine agit. comme point d’ancrage entre les protéines du cytosquelette et la matrice extracellulaire [1, 8]. La dystrophine est une très grande protéine, ayant un poids moléculaire de 427 kDa. Cette protéine appartient à la famille des -spectrines/actinines [9]. Du point de vue structurel, la dystrophine peut être divisée en quatre grands domaines principaux. Tout d’abord, le domaine N-terminal agit comme point d’interaction avec les filaments d’actine présents dans les fibres musculaires. Ensuite, il y a un domaine central en tige (Rod-domain) qui contient 24 unités répétées qui ressemblent structurellement aux répétitions de 3 hélices alpha présentes dans les spectrines. À l’intérieur de ce domaine, il y a aussi quatre points charnières riches en prolines qui interrompent les répétitions d’hélices- (figure 1). Cette interruption des hélices sert à donner une structure flexible à la dystrophine [1, 10]. Il est important aussi de noter que le domaine central ne donne pas seulement de la flexibilité à la dystrophine, celui-ci peut aussi servir de point d’interaction avec différentes protéines. C’est le cas de nNOS (Neuronal Nitric Oxide Synthase) qui se lie les répétitions 16-17 de la dystrophine (figure 1)[8]. À la fin du domaine central, il y a un domaine WW (motif de répétition WWP). 4.

(18) qui agit comme module de liaison des protéines. En fait, ce domaine sert d’intermédiaire. à. la. liaison. entre. la. dystrophine. et. le. -dystroglycan. transmembranaire (figure 1). Ainsi, le domaine central est suivi par un domaine riche en cystéines. Ce domaine possède la capacité d’interagir avec les ions Ca 2+ intracellulaires, ce qui lui permet de lier aussi la calmoduline. Cette dernière liaison est dépendante du Ca2+. Finalement, il y a aussi un domaine C-terminal qui est formé par 2 super-hélices-. Cette structure permet l’interaction avec les dystrobrevines [1, 11, 12].. 2.4. Gène DMD Le gène DMD a été identifié pour la première fois en utilisant le génome d’un. patient DMD ayant une délétion très grande, d’où le nom du gène. Il est le plus grand gène du génome humain, comprenant environ 2,5 millions de bases, ce qui correspond à environ 14 kb d’ADN codant qui se compose de 79 exons. Ce gène se situe dans le chromosome X à la position p21 [13]. Il s’exprime principalement au niveau des muscles squelettiques et cardiaques, ainsi qu’en quantité minime au cerveau. Étant donné que la mutation de ce gène cause des dystrophies, la protéine qui se produit à partir de celui-ci a été nommée dystrophine. L’expression de ce gène est contrôlée principalement par trois promoteurs spécifiques différents. Soit un promoteur pour l’expression de la dystrophine au niveau du cerveau, un autre promoteur pour l’expression dans les muscles squelettiques, puis finalement un promoteur spécifique aux cellules de Purkinje, des neurones du cortex cérébelleux. Ces trois différents promoteurs codent pour la protéine complète, toutefois, à partir de ce gène il est possible aussi de former plusieurs isoformes de la dystrophine. Ces isoformes sont des plus petites protéines qui se différencient de la dystrophine par la présence d’une région Cterminale tronquée. [1, 14, 15].. 5.

(19) 2.5. Mutations du gène DMD Jusqu’à présent, des centaines des mutations indépendantes ont pu être. identifiées dans le gène DMD. Cependant, la grande majorité se concentre dans deux régions spécifiques du gène DMD. La première région se trouve au niveau des exons 2 à 20 du gène. Des délétions au niveau de cette région causent l’absence d’une partie du domaine de liaison à l’actine, ainsi que le début du domaine central de la dystrophine. La deuxième région est située entre les exons 45 à 53. Celle-ci se trouve principalement au niveau du domaine central (Roddomain), ce qui fait qu’une délétion enlève une partie de ce domaine [2, 16, 17]. Bien que la plupart des mutations de ce gène entrainent la délétion des parties du gène, il existe deux types de mutations qui correspondent à la sévérité des symptômes chez le patient. D’un côté, si la délétion est à l’intérieur du gène et que cette mutation ne change pas le cadre de lecture du gène, il y aura une production d’une protéine dystrophine plus petite, mais qui sera partiellement fonctionnelle. C’est le cas des patients atteints de la Dystrophie Musculaire de Becker (DMB). De l’autre côté, il est possible d’observer des mutations qui engendrent un changement du cadre de lecture du gène. Celles-ci peuvent être des délétions, des insertions ou une simple mutation ponctuelle. Ces mutations provoquent l’apparition d’un codon-STOP prématuré, ce qui entraine une terminaison prématurée de la traduction et la formation d’une protéine dystrophine tronquée. Dans ce type de mutations, l’ARN messager et la protéine tronquée formée sont instables, ce qui produit l’absence de la dystrophine au niveau du sarcolemme. C’est le cas des patients DMD (figure 2) [17-19].. 6.

(20) )LJXUH7\SHVGHGpOpWLRQVGXJqQH'0' /RUVTXHODPXWDWLRQGXJqQHQHFKDQJHSDVOHFDGUHGHOHFWXUHGXJqQHOHSKpQRW\SHGH OD PDODGLH HVW PRLQV VpYqUH GRQQDQW XQ SKpQRW\SH '0% &HSHQGDQW VL OD PXWDWLRQ FKDQJHOHFDGUHGHOHFWXUHLO\DXQJUDYHDIIDLEOLVVHPHQWGHVPXVFOHVFHTXLGRQQHXQ SKpQRW\SH'0')LJXUHDGDSWpHGH-RH:0F*UHHY\HWDO. . . 0RGqOHVDQLPDX[SRXUOD'0' 'HSXLV OD GpFRXYHUWH GX JqQH '0' SOXVLHXUV PRGqOHV DQLPDX[ RQW pWp GpFRXYHUWV GDQV OD QDWXUH HW G¶DXWUHV RQW pWp GpYHORSSpV HQ ODERUDWRLUH $XMRXUG¶KXLLO\DDSSUR[LPDWLYHPHQWXQHVRL[DQWDLQHGHPRGqOHVDQLPDX[SRXUOD '0',OHQH[LVWHSOXVLHXUVPRGqOHVQRQPDPPLIqUHVFRPPHOH &HOHJDQV>@ PDLVOHVPRGqOHVPDPPLIqUHVVRQWOHVSOXVXWLOLVpVHQUHFKHUFKH/HVSOXVFRQQXV jFHMRXUVRQWOHVGLIIpUHQWVW\SHVGHPRGqOHGHVRXULVGHUDWGHFKLHQDLQVLTXH OHFRFKRQ>@7RXWHIRLVDXFRXUVGHPHVWUDYDX[VHXOHPHQWOHPRGqOHGH VRXULVDpWpXWLOLVp . 7.

(21) 2.6.1. Souris mdx. Ce modèle de souris présente une absence complète de la protéine dystrophine. Ceci est causé par une mutation ponctuelle au niveau de l’exon 23 du gène codant pour la dystrophine de souris, ce qui entraine la formation d’un codonSTOP prématuré[17, 24]. Bien que ces souris puissent montrer des dysfonctions physiques dans les analyses, le phénotype DMD est léger et le temps de vie ne diminue pas énormément. À long terme, cette souris développe des effets physiques semblables aux patients DMD, comme la perte des fibres au niveau du diaphragme et le remplacement de ceux-ci par du collagène. Il est aussi possible d’observer des nécroses musculaires dans certaines périodes de vie de la souris. Cependant, ces symptômes arrivent à un stade relativement plus âgé que chez l’humain[1, 8, 24]. Bien que les symptômes ne sont pas très sévères, la souris mdx est utilisée fréquemment en recherche pour le développement de l’édition du génome pour corriger le gène DMD [17, 25].. 2.6.2. Souris hDMD. Étant donné que les séquences génomiques du gène DMD chez la souris et chez l’humain sont remarquablement différentes, une souris humanisée DMD a été produite par le laboratoire du Dr Johan T. den Dunnen. Cette souris contient une copie du gène DMD humain complet et fonctionnel qui est intégré dans le génome d’une souris mdx. Bien que cette souris n’a aucun phénotype lié au DMD, cette souris présente un modèle très intéressant pour la validation de l’édition du gène DMD dans l’ADN humain[8, 26, 27].. 8.

(22) Chapitre 3 Traitements possibles contre la DMD Depuis la découverte du gène DMD, la thérapie génique a toujours été le plus grand espoir pour le développement de traitements therapeutiques. Toutefois, le manque de résultats positifs a ouvert la porte à la recherche d’autres types de traitements, autant pour soulager des symptômes que pour guérir les patients DMD.. 3.1. Médicaments pharmacologiques Bien que ces médicaments ne visent pas à guérir complètement la DMD, ils. peuvent diminuer les symptômes du patient. Parmis ce type de médicaments, il est possible d’observer des glucocorticoïdes comme la Prednisone ou le Deflazacort. Ces médicaments sont habituellement administrés dès que le diagnostic de la maladie est fait. Les glucocorticoïdes visent à ralentir la perte de la fonction musculaire ce qui peut aussi ralentir les complications respiratoires et cardiaques chez le patient DMD. Il est aussi important de noter que ces médicaments ont des effets secondaires liés à leur administration prolongée. Il est donc possible d’observer des augmentations du poids corporel lié à un déséquilibre hormonal, ainsi qu’une augmentation du risque d’ostéoporose. Il existe aussi d’autres médicaments utilisés pour la DMD qui visent à causer la négligence des codonsSTOPs au niveau de la traduction de l’ARNm en protéine. Dans ce type de médicaments, on y trouve la Gentamycine et l’Ataluren [28-30].. 9.

(23) 6DXWG¶H[RQV &HWWH WHFKQLTXH WKpUDSHXWLTXH YLVH j VDXWHU O¶H[RQ FRQWHQDQW OH FRGRQVWRS SUpPDWXUp HQ PRGLILDQW O¶pSLVVDJH GH O¶$51 SUpPHVVDJHU (Q IDLW GHV ROLJRQXFOpRWLGHVDQWLVHQVVRQWFRQoXVGDQVOHEXWGHFLEOHUGHVVpTXHQFHVVLWXpHV DXGpEXWRXjODILQG¶XQH[RQFKRLVLGHO¶$51SUpPHVVDJHU'HFHWWHIDoRQORUV GH O¶pSLVVDJH FHW H[RQ HVW HQOHYp GH O¶$51 PHVVDJHU UpWDEOLVVDQW OH FDGUH GH OHFWXUH pOLPLQDQW DLQVL OH FRGRQVWRS FDXVDQW OD SHUWH GH OD G\VWURSKLQH &HWWH WHFKQLTXH YLVH GRQF j SURGXLUH XQH G\VWURSKLQH SOXV SHWLWH PDLV TXL HVW IRQFWLRQQHOOHFRPPHF¶HVWOHFDVGHVSDWLHQWV'0% ILJXUH

(24) /HVROLJRQXFOpRWLGHV DQWLVHQVXWLOLVpVVRQWPRGLILpVFKLPLTXHPHQWSRXUUHWDUGHUOHXUGpJUDGDWLRQHWDLQVL DVVXUHUXQSOXVORQJWHPSVG¶DFWLRQ>@. A. B. )LJXUH([HPSOHG XQWUDLWHPHQWSDUVDXWG H[RQ 'DQV FH FDV XQH GpOpWLRQ GH O¶H[RQ FDXVHV XQ FKDQJHPHQW GX FDGUH GH OHFWXUH $

(25) 'DQVOHEXWGHOHWUDLWHUXQROLJRQXFOpRWLGH EDUUHMDXQH

(26) HVWSURGXLWSRXUFLEOHUO¶$51SUp PHVVDJHUDXQLYHDXGHO¶H[RQHWDLQVLUpWDEOLUOHFDGUHGHOHFWXUH %

(27) )LJXUHDGDSWpH GH&OHPHQW%ORHW]HUHWDO. 10.

(28) Bien que les essais cliniques ont pu montrer des fibres positives en dystrophine chez certains patients traités avec cette méthode, les résultats n’ont pas été convaincants dû à une grande variation entre les patients. Ainsi, l’absence d’améliorations physiques significatives a justifié l’arrêt d’un essai clinique de phase 3 utilisant cette méthode. Il est important de noter que même si ce type de traitements peut être prometteur, il ne vise pas à guérir le patient de façon permanente. Le patient serait dont obligé de prendre constamment le médicament, avec tous les désavantages que cela implique [28, 29].. 3.3. Thérapie génique Dès la décodification du génome humain, il y a eu des associations entre des. gènes et des maladies sévères, comme c’est le cas pour la DMD. De ce fait, il y a maintenant plus de 6000 maladies génétiques répertoriées et le plus grand espoir pour trouver un traitement repose sur le remplacement du gène muté par un gène sain ou la correction du gène défectueux. Bien que les essais cliniques avec ce type de traitement n’aient pas été toujours un succès, le développement de cette technologie au cours des dernières années a permis l’apparition de médicaments basés sur la thérapie génique. Un de ces médicament, le Glybera, est un traitement par thérapie génique visant à livrer le gène sain d’une lipoprotéine lipase avec un vecteur viral adénoassocié (AAV) [33, 34]. Ce médicament a même déjà été commercialisé. Dans le cas de la DMD, l’utilisation de la thérapie génique est limitée, car le gène DMD a une taille de 2,4 Mb, ce qui dépasse les limites physiques acceptables pour les vecteurs utilisés.[1, 35] Bien que la taille du gène complet limite l’avancement en thérapie génique contre la DMD, il y a des développements qui se font en utilisant des mini ou micro-dystrophines [35, 36]. En fait, il est connu que lorsque la mutation du gène DMD ne change pas le cadre de lecture, les symptômes dystrophiques sont beaucoup plus faibles, tel est le cas des patients Becker [19]. Il a même déjà été répertorié la présence d’un patient Becker ayant une protéine dystrophine qui avait. 11.

(29) une délétion des exons 17 à 48, ce qui représente 46% du gène codant pour la dystrophine. Même avec cette grande délétion, ce patient présentait des symptômes peu sévères de la DMB [37]. Ceci a permis la construction des gènes thérapeutiques pour la DMD en éliminant une grande partie du domaine centrale en tige (Rod domain), tout en gardant intactes les extrémités en N-terminale et Cterminale de la protéine [35, 38].. 3.4. Thérapie cellulaire. La thérapie cellulaire vise à traiter un patient par la greffe de cellules saines. Lorsque les cellules proviennent d’un donneur sain, on parle d’une greffe allogénique. D’un autre côté, la greffe peut être aussi autologue, ce qui veut dire que ce sont les cellules, du même patient, qui sont greffées. Dans ce dernier type de greffe, les cellules sont préalablement corrigées en laboratoire, ce qui peut se faire par thérapie génique ou par édition du génome. Bien que la thérapie cellulaire pour certaines maladies génétiques semble prometteuse, au niveau de la DMD, elle est limitée par le grand nombre des muscles qui doivent être greffés. De plus, dans les années 90, des essais cliniques en thérapie cellulaire contre la DMD ont illustré des problèmes de mortalité des cellules greffées, un bas taux de migration dans le tissu injecté, ainsi qu’un rejet immunitaire. Certains de ces problèmes ont pu être améliorés lors des essais cliniques suivants, par exemple avec l’utilisation du tacrolimus pour immunosupprimer les patients ou par l’augmentation du nombre de cellules greffées. Cependant, les résultats des greffes restent aujourd’hui très faibles, limitant le développement de thérapies contre la DMD [39-41].. 3.5. Édition du génome Avec les nouveaux outils développés dans les dernières années en biologie. moléculaire, il est possible maintenant d’envisager la modification du génome humain de façon spécifique. En fait, l’édition du génome utilise des endonucléases capables d’induire des cassures double brin dans une région d’ADN choisie. Ces cassures sont ensuite réparées par les mécanismes cellulaires, la recombinaison. 12.

(30) non homologue dans la plupart des cas, introduisant des petites insertions ou délétions (INDELs) au site de coupure. De cette façon, il est possible d’envisager de corriger le cadre de lecture d’un gène muté, ou même faire l’inhibition d’un ou plusieurs gènes. De plus, si lors de l’induction de la cassure double brin, il y a présence d’un ADN donneur, ayant des séquences homologues aux extrémités de la cassure, il est possible aussi d’induire son introduction dans ce site spécifique, ce qui est fait par recombinaison homologue. La recombinaison homologue permet d’insérer les parties manquantes des gènes mutés. Dans l’évolution de l’ingénierie des génomes, plusieurs outils ont été développés et il est maintenant possible de mentionner les Nucléases à Doigts de Zinc (Zinc Finger Nucleases, ZFNs), les TALENs, ainsi que les CRISPR/Cas9. Ceux-ci seront discutés davantage dans les sous-sections suivantes. 3.5.1 Nucléases à doigts de Zinc Les Nucléases à Doigts de Zinc (ZFN) se composent principalement de 2 domaines, un domaine de liaison à l’ADN et un domaine nucléase. En ce qui concerne le domaine liant l’ADN, il se compose de répétitions de Doigts de Zinc (Zinc fingers, ZF), habituellement 3 à 6, qui possèdent des répétitions en tandem Cys2-His2. Chaque ZF est capable de lier 3 pb d’ADN. Pour le domaine nucléase, il est formé principalement par l’endonucléase FokI. Celle-ci est une enzyme de 587 résidus ayant un domaine N-terminal, liant l’ADN, et un domaine catalytique en C-terminal. Il est important de noter que la FokI se trouve en C-terminal des répétitions ZF. Le clavage de la nucléase se fait par dimérisation de 2 FokI, ce qui fait que l’induction d’une cassure double brin a besoin de 2 ZFN. Chaque ZFN lie une séquence cible adjacente, mais séparée par 5 à 7 pb. Cette séparation permet la formation du dimère (figure 4) [2, 42, 43].. 13.

(31) )LJXUH6WUXFWXUHHWOLDLVRQjO $'1G XQH=)1 'HX[=)1VVRQWQpFHVVDLUHVSRXULQGXLUHXQHFDVVXUHGRXEOHEULQFDUO¶HQ]\PH)RN,HVW DFWLYHORUVGHVDGLPpULVDWLRQ/DVpTXHQFHHVWFKRLVLHHQXWLOLVDQWGHV=)FKDFXQOLDQW QXFOpRWLGHV)LJXUHDGDSWpHGH0DUN,VDODQHWDO. 7$/(1V . 8QH SURWpLQH7$/(1HVW XQH SURWpLQH GHIXVLRQ HQWUH XQHSURWpLQH7$/(HW XQH QXFOpDVH VRLW OD )RN, /HV 7$/(V RQW pWp LVROpHV FKH] OHV EDFWpULHV ;DQWKRPRQDV 63 (Q IDLW FHV EDFWpULHV XWLOLVHQW OHV 7$/(V ORUV GH O¶LQIHFWLRQ GHV SODQWHV SRXU LQGXLUH O¶H[SUHVVLRQ GHV JqQHV FKH] OD SODQWH TXL IDYRULVHQW FHWWH LQIHFWLRQ 8Q 7$/( VH FRPSRVH SULQFLSDOHPHQW SDU GHV GRPDLQHV UpSpWpV FRQWHQDQWFKDFXQHQWUHHWDFLGHVDPLQpV7RXWHIRLVHQWUHFKDTXHGRPDLQH LO \ D XQH YDULDWLRQ GHV DFLGHV DPLQpV HW &HV GHUQLHUV DFLGHV DPLQpV GpFLGHQW OD OLDLVRQ j XQ QXFOpRWLGH VSpFLILTXH &HV UpVLGXV HW VRQW FRXUDPPHQWDSSHOpV59'V 5HSHDW9DULDEOHGLUHVLGXHV

(32) (QpWXGLDQWOHV7$/(V 59'VGLIIpUHQWVRQWpWpLGHQWLILpV6LOH59'HVW11 $VSDUDJLQH$VSDUDJLQH

(33) LO\ DDXUDUHFRQQDLVVDQFHG¶XQHJXDQLQH'DQVOHFDVGH1, $VSDUDJLQH,VROHXFLQH

(34) XQH DGpQLQH HVW UHFRQQXH 8Q 59' +' +LVWLGLQH$FLGH DVSDUWLTXH

(35) UHFRQQDLW OD F\WRVLQH SXLV ILQDOHPHQW XQ 1* $VSDUDJLQH*O\FLQH

(36) UHFRQQDLW XQH WK\PLQH /RUVTX¶XQ7$/(HVWIXVLRQQpjODQXFOpDVH)RN,FHODFRQVWLWXWXQ7$/(1HWFHOXL. 14.

(37) FLSRXUUDFLEOHUXQHVpTXHQFHG¶$'1FKRLVLH&HSHQGDQWODVpTXHQFHFKRLVLHSRXU OD OLDLVRQ GX 7$/( GRLW rWUH VXLYLH G¶XQH 7K\PLGLQH DX QLYHDX GH OD UpJLRQ FLEOH 7RXWFRPPHSRXUOHV=)1OHV7$/(1VRQWDXVVLEHVRLQGHIRUPHUXQGLPqUHSRXU LQGXLUH XQH FDVVXUH GRXEOH EULQ &HFL IDLW TXH SRXU FKDTXH FDVVXUH GRXEOH EULQ FLEOpH LO HVW QpFHVVDLUH G¶XWLOLVHU 7$/(1V 'H SOXV OHV VpTXHQFHV FLEOpHV SDU FHV GHX[ 7$/(1V GRLYHQW rWUH DXVVL VpSDUpHV GH j SE SRXU SHUPHWWUH OD IRUPDWLRQGXGLPqUH ILJXUH

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(40) FRGDQW SRXU GHV HQGRQXFOpDVHV > @ /HV pWXGHV IRQGDPHQWDOHV GH FH V\VWqPH RQW SHUPLV G¶LOOXVWUHU OD SUpVHQFH GH W\SHV GH &DV /HV W\SHV , HW ,,, QpFHVVLWHQW O¶LQWHUDFWLRQ GH SOXVLHXUV SURWpLQHV &DV SRXU LQGXLUH OD GpJUDGDWLRQ GH O¶$'1 H[RJqQH7DQGLVTXHOHW\SH,,XWLOLVHXQHVHXOHSURWpLQH&DVOD&DVTXLDpWp 15.

(41) montrée comme étant la seule Cas à induire une cassure double brin. Au niveau du type II, un tracrRNA (Trans-activating CRISPR RNA) s’hybride aux répétitions qui se retrouvent dans l’ARN prémature produit à partir du cluster (figure 6). L’ARN produit par le protospacer et la séquence de répétition est appelé crRNA (Short CRISPR RNA). Ce complexe est ensuite maturé par l’ARNase III endogène, ce qui permet au complexe crRNA/tracrRNA d’interagir avec la Cas9, formant le complexe CRISPR/Cas9 [44]. Ce complexe est capable de reconnaitre la séquence définie par le protospacer seulement s’il est suivi par un PAM ou Protospacer Adjacent Motif [50, 51]. En ce qui concerne la protéine Cas9, c’est une endonucléase d’environs 160 kDa, capable de générer des cassures double brin. Ceci est possible grâce aux domaines RuvC et HNH. Chacun de ces domaines cause la cassure d’un brin d’ADN (figure 6) [44, 52, 53]. Étant donné le grand potentiel de cette technique en biologie moléculaire, les études approfondies dans ce système au niveau des bactéries ont permis de trouver des enzymes Cas9 capables de générer des bris dans le génome des mammifères. Ces Cas9 sont présentes dans Streptococcus thermophilus et Streptococcus pyogenes. Cette dernière étant celle généralement utilisée en recherche. De plus, dans le but d’alléger le système, le crRNA et le tracrRNA ont été fusionnés dans le but de former un unique ARN guide (sgRNA) (figure 6). Ces améliorations du système ont permis de créer une méthode simple et rapide pour faire éditer le génome. Cependant, il a été répertorié que ce système pourrait avoir plus de coupures hors cible que d’autres systèmes d’édition génomique, comme les TALENs. Les modifications de la protéine Cas9 pour produire les protéines eSpCas9 et la SpCas9-HF1, ont permis de limiter ce problème. Ces modifications sont basées sur le remplacement d’acides aminés polaires par des acides aminés neutres diminuant ainsi les interactions non spécifiques avec l’ADN. Des modifications de l’ARN guide ont aussi amélioré la spécificité du système CRISPR/Cas9 [44, 49, 54, 55].. 16.

(42) A. B. )LJXUH,OOXVWUDWLRQVGX6\VWqPH&5,635&DV (Q$LOHVWSRVVLEOHG¶REVHUYHUOHV\VWqPHXWLOLVDQWOHFRPSOH[HFU51$7UDFU51$(Q% OH V\VWqPH XWLOLVH O¶$51 JXLGH IXVLRQp SDU XQH ERXFOH HQWUH OH FU51$ HW OH 7UDFU51$ )LJXUH DGDSWpH GH KWWSGKDUPDFRQJHOLIHVFLHQFHVFRPDSSOLFDWLRQVJHQHHGLWLQJ FRQVXOWpOHDRW. /LYUDLVRQHQWKpUDSLHJpQLTXHHWpGLWLRQGXJpQRPH 'HSXLVOHVSUHPLHUVGpYHORSSHPHQWVHQWKpUDSLHJpQLTXHOHSOXVJUDQGGpIL D WRXMRXUV pWp OD OLYUDLVRQ GX PDWpULHO JpQpWLTXH TXL VHUYLUD DX WUDLWHPHQW $XMRXUG¶KXL SOXVLHXUV RXWLOV RQW pWp GpYHORSSpV XWLOLVDQW GHV WHFKQLTXHV GH OLYUDLVRQ GHV SODVPLGHV FRPPH GHV WUDQVIHFWLRQV GH FHOOXOHV RX PrPH GHV YHFWHXUV YLUDX[ SRXYDQW rWUH XWLOLVpV LQ YLWUR RX LQ YLYR 7RXWHIRLV OH FKRL[ GX PR\HQGHYHFWRULVDWLRQGXPDWpULHOJpQpWLTXHLPSRVHWRXMRXUVGHVFRQWUDLQWHVFH. 17.

(43) TXL OLPLWH JUDQGHPHQW O¶DYDQFHPHQW GHV WKpUDSLHV HQ HVVDLV FOLQLTXHV 8QH QRXYHOOH DSSURFKH HQ GpYHORSSHPHQW HVW OD OLYUDLVRQ GHV SURWpLQHV FH TXL OLPLWHUDLHQW FHUWDLQHV FRQWUDLQWHV pWKLTXHV HW GH VDQWp FDXVpHV SDU O¶XWLOLVDWLRQ GH PDWpULHO JpQpWLTXH /HV SULQFLSDOHV WHFKQLTXHV GH YHFWRULVDWLRQ VHURQW H[SOLTXpHV EULqYHPHQWGDQVOHVSURFKDLQHVVRXVVHFWLRQV ILJXUH

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(45) HWGHVOHQWLYLUXVQRQLQWpJUDWLIV 1,/9V

(46) (Q%OHVPpWKRGHVGHOLYUDLVRQQRQYLUDOH XWLOLVHQW VRXYHQW GHV SRO\PqUHV RX GHV OLSLGHV FDWLRQLTXHV (Q & LO HVW SRVVLEOH GH YRLU GHVWHFKQLTXHVSK\VLTXHVFRPPHO¶pOHFWURSRUDWLRQTXLXWLOLVHODFKDUJHQHWWHQpJDWLYHGH O¶$'1SRXUOHOLYUHUjO¶LQWpULHXUGHVFHOOXOHV)LJXUHDGDSWpHGH4XUUDW8O$LQHWDO. . . 18.

(47) 3.6.1 Vecteurs viraux La faible efficacité naturelle de livraison cellulaire de l’ADN nu exogène est la cause du développement des vecteurs pouvant transporter ce matériel génétique. Les virus, étant déjà présents dans la nature, ont des capsides leur permettant de transporter leur génome. La sélection des virus a permis de développer des vecteurs viraux recombinants où les gènes essentiels à la réplication virale sont délétés et remplacés par le transgène d’intérêt. Ceux-ci ont trouvé leur utilisation en thérapie génique depuis les années 90. Plusieurs types de vecteurs ont été produits. Toutefois, aujourd’hui, le choix est plus restreint dû aux effets immunitaires des vecteurs comme les adénovirus et au risque d’intégration aléatoire de certains virus comme les rétrovirus. Aujourd’hui, le choix de vecteur se base principalement sur l’absence d’intégration au génome. Les vecteurs issus de lentivirus, adénovirus et virus adénoassociés (AAV) restent les vecteurs de choix pour le transport du transgène d’intérêt [44] Dans le cas des vecteurs lentivirus non intégratifs, ils ont l’avantage d’infecter les cellules même lorsqu’elles ne sont pas en division. De plus, ils ont une capacité de transport relativement bonne, ayant une limite de 8 kb de transgène. Ces vecteurs sont capables d’infecter plusieurs types cellulaires avec une bonne efficacité, et ce, en induisant très peu de réactions immunitaires [44, 56]. Du côté des vecteurs d’adénovirus, ils ont l’avantage d’avoir une grande capacité de livraison, pouvant transporter plus de 30 kb de transgène. Ces vecteurs peuvent infecter des cellules très efficacement et sans intégration au génome [57]. Toutefois, les adénovirus ont le désavantage de causer des réactions immunes chez le patient, ce qui peut causer le décès des cellules infectées et même du patient[58]. En ce qui concerne les vecteurs AAV, ils ont le bénéfice d’être très peu immunogènes. De plus étant donné la grande quantité de sérotypes différents, ils peuvent infecter une grande variété de types cellulaires. Cependant, leur capacité de charge est très faible, étant de seulement 4,5 kb, ce qui limite leur utilisation pour certains gros transgènes [44, 59].. 19.

(48) 3.6.2 Livraison non virale La propriété d’être chargé négativement peut être utilisée pour la livraison des molécules d’ADN. En fait, en utilisant des polymères cationiques ou des lipides cationiques, il est possible d’encapsider l’ADN et ainsi le transporter à travers la membrane cellulaire (figure 7). Cette encapsidation est réalisable, car autant les polymères que les lipides contiennent une tête polaire chargée positivement et un corps hydrophobe. De cette façon, la molécule d’ADN, étant chargée négativement, interagit par des échanges électrostatiques avec la tête polaire, ce qui crée une capsule et entraine la molécule d’ADN vers son intérieur. Le corps de l’agent de livraison, étant lipophilique, peut traverser ou se fusionner à la membrane cellulaire et ainsi livrer le transgène d’intérêt. Ces techniques peuvent facilement être utilisées in vitro, toutefois, son utilisation in vivo est restreinte à cause du manque de sélectivité des cellules à transfecter[44, 60, 61]. Ainsi, il est possible d’utiliser des techniques plus physiques, comme des injections directes dans les cellules, ou des électroporations. L’électroporation est une technique qui utilise des impulsions électriques dans le but de causer des micropores dans la membrane cellulaire, où l’ADN passe à l’intérieur de la cellule grâce à sa charge (figure 7). Bien que ces techniques soient peu ou pas utilisés in vivo, elles ont l’avantage d’être très simples et reproductibles in vitro[44, 61]. 3.6.3 Livraison des protéines. Une alternative aux problèmes générés par l’utilisation de matériel génétique en thérapie génique ou en édition du génome est l’utilisation directe des endonucléases recombinantes. En fait, la livraison des protéines a comme avantage de diminuer les effets hors cible en diminuant le temps d’exposition des endonucléases. Il a été rapporté qu’il est possible de livrer des protéines en utilisant différents peptides de livraison, ainsi que des lipides formant des vésicules par interactions électrostatiques [44, 46, 62].. 20.

(49) Chapitre 4 Réparation de l’ADN suite à une cassure double brin Lorsqu’on utilise un outil d’édition de génome, on vise normalement à causer une cassure double brin dans la molécule d’ADN, et ce, en ciblant un gène de façon spécifique. Suite à cette cassure, les mécanismes de réparation de l’ADN cellulaires s’activent et cherchent à corriger la mutation que notre système d’édition a causée. Dans le but de corriger une cassure double brin, la cellule utilise principalement deux voies de réparation, soit la recombinaison non homologue ou la recombinaison homologue.. 4.1 Recombinaison non homologue Comme technique de réparation cellulaire, la recombinaison non homologue a l’avantage d’être active tout au long du cycle cellulaire. Ainsi, cette technique n’a pas besoin d’un brin donneur ou de chromatides sœurs, ce qui fait que la réparation se fait rapidement et permet la continuité du cycle cellulaire. La recombinaison non homologue se fait principalement en 3 étapes, soit la liaison et recrutement au niveau des brins cassés, la terminaison des brins et leur ligation (figure 8). Tout d’abord, les protéines Ku 70 et 80 reconnaissent les brins cassés. Les protéines Ku agissent comme support pour l’alignement des brins, ainsi que pour la protection à la dégradation par les exonucléases. De plus,. Ku recrute la. protéine Kinase DNA-PK. Cette dernière phosphoryle l’ADN ligase IV et la protéine XRCC4. Cette phosphorylation permet l’interaction des ligases avec les protéines Ku. Ensuite, les brins doivent être traités dans le but de former des bouts francs,. 21.

(50) FHTXLHVWQpFHVVDLUHSRXUHIIHFWXHUODOLJDWLRQ&HFLHVWIDLWSULQFLSDPHQWSDUXQH $'1 SRO\PpUDVH RX OD QXFOpDVH $UWHPLVH (Q IDLW DX FRXUV GH FHWWH pWDSH GHV SHWLWHV LQVHUWLRQV RX GpOpWLRQV ,1'(/V

(51) VH IRQW GDQV OH EXW GH IRUPHU OHV ERXWV IUDQFV)LQDOHPHQWXQHOLJDWLRQHVWIDLWHDXQLYHDXGHVERXWVIUDQFVIRUPpV&HWWH OLJDWLRQ HVW PpGLpH SDU OH FRPSOH[H IRUPp HQWUH O¶$'1 OLJDVH ,9 HW OD SURWpLQH ;5&& 'DQV FH FDV OD SURWpLQH ;5&& DJLW FRPPH UpJXODWHXUGH O¶$'1 OLJDVH ,9HWHOOHJXLGHODOLJDVHDXGRXEOHEULQG¶$'1FHTXLSHUPHWODOLJDWLRQGHVERXWV HW DLQVL OD UpSDUDWLRQ GH OD FDVVXUH ,O HVW LPSRUWDQW GH QRWHU TX¶HQ LQJpQLHULH GX JpQRPH OHV ,1'(/V TXL VH IRUPHQW ORUV GH FHWWH UpSDUDWLRQ VRQW WUqV XWLOHV VRLW SRXU LQGXLUH OD UpSUHVVLRQ G¶XQ JqQH RX FRUULJHU XQ FDGUH GH OHFWXUH PRGLILp FRPPHF¶HVWOHFDVGDQVODSOXSDUWGHV'0'>@. )LJXUH 5pSDUDWLRQ G XQH FDVVXUH GRXEOH EULQ SDU UHFRPELQDLVRQ QRQ KRPRORJXH /D UpSDUDWLRQ G¶XQH WHOOH PXWDWLRQ VH IDLW SULQFLSDOHPHQW HQ pWDSHV OD UHFRQQDLVVDQFH GHV EULQV OD WHUPLQDLVRQ GHV EULQV LPSOLTXDQW GHV ,1'(/V HW OD OLJDWLRQ GHV ERXWV GH OD FDVVXUH )LJXUH DGDSWpH GH KWWSZZZJHQRPHMSNHJJ ELQVKRZBSDWKZD\"PDS NR VKRZBGHVFULSWLRQ VKRZ&RQVXOWpOHDRW. 22.

(52) 4.2 Recombinaison homologue Bien que ce mécanisme de réparation de l’ADN soit le deuxième plus courant, il est en fait beaucoup moins fréquent que la recombinaison non homologue. Ceci est dû au fait que la recombinaison homologue est seulement possible lors de la fin de la phase S et pendant la phase G2 du cycle cellulaire [65]. Lors d’une cassure double brin (CDB), les extrémités formées sont traitées dans le but de former des extrémités 3’ protubérantes. Ceci est commencé par les enzymes MRE11 et CtiP, puis suivi par l’exonucléase I et le complexe BRT [66, 67]. Les extrémités ainsi formées sont ensuite protégées par les protéines RPA. Le complexe ADNsb/RPA ainsi formé active le complexe ATR qui interagit avec ATM et provoquent l’arrêt du cycle cellulaire et l’initiation de la réparation de l’ADN par la recombinaison homologue [68]. De plus, ATM initie aussi le recrutement de Rad51, protéine clé lors de ce mécanisme de réparation. La présence de cette dernière protéine provoque aussi l’incorporation de BRCA II et PALB2 [69]. Ces derniers étant des médiateurs de l’activation de Rad51. Son activation provoque la formation de filaments lors de la formation d’un complex avec les extrémités 3’ protubérantes. Rad51 catalyse l’invasion de cet ADN simple brin vers l’ADN double brin de la chromatide sœur formé lors de la réplication de l’ADN. L’invasion provoque la dissociation de l’ADNdb de la chromatide sœur et permet l’hybridation de l’extrémité 3’ protubérante de la CDB avec sa séquence complémentaire (figure 9). Ceci forme ce qui est appelé une boucle de déplacement (D-loop) [66, 70]. La formation de cette boucle provoque le recrutement de RAD54 et RAD51AP1. Ces dernières stabilisent la boucle et permettent que les ADN polymérases puissent récupérer la séquence perdue lors de la CDB [71, 72]. Lorsque l’autre extrémité 3’ protubérante de la CDB s’hybride avec l’autre brin de la chromatide sœur, cela provoque la formation des jonctions de Holliday (figure 9) [70]. Ces jonctions en forme de croix sont ensuite clivées par l’activité nucléase des résolvases. Les produits de ce clivage peuvent ainsi être directement rattachés, ce qui peut. 23.

(53) RFFDVLRQQHU O¶pFKDQJH GH PDWpULHO JpQpWLTXH HQWUH OHV FKURPDWLGHV FH TXL HVW FRQQXVXUOHQRPGHFURVVRYHU ILJXUH

(54) >@ (Q pGLWLRQ GX JpQRPH O¶XWLOLVDWLRQ G¶XQ $'1 GRQQHXU SHXW UHPSODFHU OD FKURPDWLGHV°XUFHTXLSHUPHWO¶DMRXWGHVQRXYHOOHVVpTXHQFHVjO¶LQWpULHXUGHOD FDVVXUHGRXEOHEULQ&HFLHVWWUqVXWLOHSRXUODFRUUHFWLRQGHVVHFWLRQVSHUGXHVORUV GHODPXWDWLRQG¶XQJqQHWHOHVWOHFDVGHOD'0'>@. )LJXUHeWDSHVGHODUHFRPELQDLVRQKRPRORJXH /D SUpVHQFH G¶XQH FKURPDWLGH V°XU RX G¶XQ $'1 GRQQHXU SHUPHW OD UpFXSpUDWLRQ GHV VpTXHQFHVSHUGXHVORUVG¶XQHPXWDWLRQ)LJXUHDGDSWpHGH0D]LQHWDO. . . 24.

(55) Chapitre 5 Edition du génome à l’aide des protéines TALENs 5.1. Introduction. La dystrophie musculaire de Duchenne est une maladie génétique causée principalement par la délétion d’un ou plusieurs exons au niveau du gène de la dystrophine [1]. Cette mutation cause un dérèglement du cadre de lecture du gène et entraine la formation d’un codon-stop prématuré [1, 2]. Aujourd’hui, les outils d’édition de génome offrent la possibilité de causer une cassure double brin avant ou après la mutation du patient. Cette cassure sera ensuite corrigée par la cellule par recombinaison non homologue, ce qui pourrait restaurer le bon cadre de lecture par les INDELs qui se forment lors de la réparation [44, 54]. Les protéines TALENs offrent la possibilité d’être utilisées pour générer une cassure double brin. Celles-ci sont des protéines de fusion capable de cibler une séquence d’ADN et causer une cassure double-brin à cet endroit. Pour se faire, deux TALEN sont nécessaires, puisque la nucléase fokI, qui cause la cassure double brin, a besoin de former un dimère pour être active [44, 47]. Les méthodes d’édition du génome, bien qu’efficaces, ont besoin d’être livrées au niveau des cellules. Toutefois, les méthodes courantes utilisant des virus ont montré que la surexpression d’un plasmide peut augmenter les risques de cassures non spécifiques. De ce fait, l’utilisation des protéines purifiées semble être une façon prometteuse qui permettra de diminuer ces risques [44, 62].. 25.

(56) 5.2. Hypothèse et objectifs Notre hypothèse est qu’une paire des protéines TALENs ciblant l’exon 54 du. gène DMD auraient la possibilité corriger le cadre de lecture du gène chez un patient ayant une délétion des exons 51 à 53. Cette correction sera possible par l’apparition d’INDELs au niveau de la cassure du gène lorsque la cellule répare l’ADN par recombinaison non homologue. Dans le but de prouver notre hypothèse, plusieurs objectifs ont besoin d’être atteints. Tout d’abord, il sera nécessaire de vérifier la fonctionnalité des TALENs clonés chez un plasmide capable d’être transfecté au niveau des cellules. Ensuite, il sera nécessaire de produire et purifier des protéines TALENs à partir des bactéries. Ces protéines seront ensuite transduites à l’intérieur des cellules et son activité sera analysée par l’essai Surveyor.. 5.3. Matériel et méthodes. 5.3.1 Plasmides codants pour les TALENs. Les plasmides JDS-TALEN R2 et L3 ont été synthétisés précédemment dans le laboratoire par un professionnel de recherche en utilisant la technique Golden Gate (Voytas et al. 2011). Ces deux plasmides codent pour la paire de TALENs ciblant l’éxon 54 du gène DMD. L’expression de ces TALENs se fait à l’aide du promotteur CMV du plasmide JDS (figure 10). Les séquences ainsi obtenues ont été par la suite clonées dans des vecteurs Pet16B (figure 11). Ce dernier vecteur permet la production des TALENs dans les bactéries. De plus, il contient aussi une séquence codant pour 6 histidines qui se trouvent avant le site de clonage, ainsi qu’un gène de résistance à l’Ampiciline. Les 6 histidines sont placées en Nterminal du TALEN lors de la transcription, ce qui permet de purifier les protéines TALENs par affinité avec une résine chargée de nickel.. 26.

(57) )LJXUH9HFWHXUSODVPLGLTXH-'6 ,O SHUPHW O¶H[SUHVVLRQ GHV 7$/(1V GDQV OHV FHOOXOHV HXFDU\RWHV )LJXUH DGDSWpH GH KWWSVZZZDGGJHQHRUJ&RQVXOWpOHDRW. . 27.

(58) )LJXUH9HFWHXUSODVPLGLTXH3HWE 9HFWHXU XWLOLVp SRXU OD SURGXFWLRQ GH SURWpLQHV UHFRPELQDQWHV GDQV XQ V\VWqPH SURFDU\RWH)LJXUHDGDSWpHGHKWWSELRFKHPZHEXWDKHGXKLOOOLQNVS(7ESGI&RQVXOWp OHDRW. . . 9pULILFDWLRQGHODIRQFWLRQQDOLWpGHVSODVPLGHVFRGDQWSRXUOHV 7$/(1V /HV SODVPLGHV -'6 FRGDQWV SRXU OD SDLUH GH 7$/(1V RQW pWp WUDQVIHFWpV GDQV GHV FHOOXOHV +(.7 DYHF OD /LSRIHFWDPLQH 7KHUPR 6FLHQWLILF

(59) HQ VXLYDQW OH SURWRFROH GX IDEULFDQW /D WUDQVIHFWLRQ D pWp IDLWH HQ XWLOLVDQW XQ UDWLR $'1OLSRIHFWDPLQHGH&HOOHFLDpWpVXLYLHSDUKG¶LQFXEDWLRQj&/HV FHOOXOHV RQW pWp HQVXLWH UpFROWpHV HW O\VpHV HQ XWLOLVDQW XQ WDPSRQ FRQWHQDQW GH O¶('7$P0HWGXVDUFRV\O/¶$'1DpWpH[WUDLWHQXWLOLVDQWODWHFKQLTXHDX SKpQROFKORURIRUPHjSDUWLUGX O\VDW/¶$'1DLQVL REWHQX D pWpGRVp DX QDQRGURS 7KHUPR6FLHQWLILF

(60) /¶DQDO\VHGHODIRQFWLRQDOLWpDpWpIDLWHSDUO¶DQDO\VHVXUYH\RU . 28.