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Impact cellulaire de l'expression d'un mutant constitutivement actif du récepteur AT[indice inférieur 1] de l'angiotensine II

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(1)

IMPACT CELLULAIRE DE L'EXPRESSION D'UN MUTANT CONSTITUTIVEMENT ACTIF DU RÉCEPTEUR AT1

DE L'ANGIOTENSINE II

par

MANNIX AUGER-MESSIER Département de Pharmacologie

Thèse présentée à la Faculté de Médecine en vue de l'obtention du grade de

Philosophire Doctor (Ph.D.)

(2)

Tiré de « Le fruit défendu de la connaissance; De Prométhée à la pornographie »par Roger Shattuck

Il ne t'est jamais donné un désir sans que te soit donné le pouvoir de le rendre réalité. Tu peux être obligé néanmoins de peiner pour cela. Tiré de « Le messie récalcitrant »par Richard Bach

(3)

LISTE DES ARTICLES PRÉSENTÉS DANS CETTE THÈSE ... vi

AUTRES ARTICLES ... vi

LISTE DES FIGURES ... viii

LISTE DES TABLEAUX ... X LISTE DES ABRÉVIATIONS ... xi

RÉSUMÉ ... xiii

INTRODUCTION ... 1

1. LE RÉCEPTEUR DE L'ANGIOTENSINE II DE TYPE I (AT1) ... 5

1.1. Système rénine-angiotensine et rôles physio/pathologiques ... 5

1.2. Expression et structure du récepteur AT 1 ... 8

1.3. Voies de signalisation enclenchées par le récepteur AT1 ... 12

2. ACTIVITÉ CONSTITUTIVE DES GPCRs ... 20

2.1. Modèles théoriques d'activation des GPCRs ... 21

2.2. Rôles physiologiques de l'activité constitutitve de GPCRs de type sauvage .... 27

2.3. Pathologies associées à l'activité constitutive de GPCRs mutants ... 28

2.4. Récepteur mutant constitutivement actif Nl 11G-AT1 ... 32

3. PROBLÉMATIQUE ET BUT DE L'ÉTUDE ... 35

RÉSULTATS ... 36

(4)

The constitutively active Nll 1G-AT1 receptor for angiotensin II maintains a high

affinity conformation despite being uncoupled from its cognate G protein Gq111a ... 38

ARTICLE2-AVANT-PROPOS ... 74

Down-regulation of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor in cells stably expressing the constitutively active angiotensin II N 111G-AT1 receptor ... 7 5 ARTICLE 3 - A V ANT-PROPOS ... 123

The Constitutively Active Nll 1G-AT1 Receptor for Angiotensin II Modifies Cellular Morphology and Cytoskeletal Organization ofHEK-293 Cells ... 124

DISCUSSION ... 156

CONCLUSION ... 162

PERSPECTIVES ... 163

REMERCIEMENTS ... 167

(5)

1) Auger-Messier, M., Clement, M., Lanctot, P.M., Leclerc, P.C., Leduc, R., Escher, E., Guillemette, G. (2003) The constitutively active Nll lG-ATl receptor for angiotensin II maintains a high affinity conformation despite being uncoupled from its cognate G protein Gq/1 lalpha. Endocrinology 44(12): 5277-5284

2) Auger-Messier, M., Arguin, G., Chaloux, B., Leduc, R., Escher, E., Guillemette, G. (2004) Down-Regulation of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Receptor in Cells Stahly Expressing the Constitutively Active Angiotensin II N111G-AT1 Receptor. Mol. Endocrinol. 18(12): 2967-2980

3) Auger-Messier, M., Turgeon, E.S., Leduc, R., Escher, E., Guillemette, G. The Constitutively Active N 111G-AT1 Receptor for Angiotensin II Modifies Cellular Morphology and Cytoskeletal Organization of HEK-293 Cells. (Manuscrit accepté à Exp. Cell Res.)

AUTRES ARTICLES

4) Lanctot, P.M., Leclerc, P.C., Clement, M., Auger-Messier, M., Escher, E., Leduc, R., Guillemette, G. (2005) Importance of N-glycosylation positioning for cell-surface expression, targeting, affinity and quality control of the hA T 1 receptor. Biochem J. May 4; doi:10.1042/BJ20050189

(6)

5) Leclerc, P.C., Auger-Messier, M., Lanctot, P.M., Escher, E., Leduc, R., Guillemette, G. (2002) A polyaromatic caveolin-binding-like motif in the cytoplasmic tail of the type 1 receptor for angiotensin II plays an important role in receptor trafficking and signaling. Endocrinology 143(12): 4702-4710

6) Perodin, J., Deraet, M., Auger-Messier, M., Boucard, A.A., Rihakova, L., Beaulieu, M.E., Lavigne, P., Parent, J.L., Guillemette, G., Leduc, R., Escher, E. (2002) Residues 293 and 294 are ligand contact points of the human angiotensin type 1 receptor. Biochemistry 41(48): 14348-14356.

7) Rihakova, L., Deraet, M., Auger-Messier, M., Perodin, J., Boucard, A.A., Guillemette, G., Leduc, R., Lavigne, P., Escher, E. (2002) Methionine proximity assay, a novel method for exploring peptide ligand-receptor interaction. J. Recept. Signal Transduct. Res. 22(1-4): 297-313

8) Gosselin, M.J., Leclerc, P.C., Auger-Messier, M., Guillemette, G., Escher, E., Leduc, R (2000) Molecular cloning of a ferret angiotensin II AT(I) receptor reveals the importance of position 163 for Losartan binding. Biochim. Biophys. Acta. 1497(1): 94-102

(7)

Figure 1. Métabolisme de !'angiotensine II au sein du système rénine-angiotensine ... 6

Figure 2. Représentation schématique du récepteur AT I ··· 10

Figure 3. Couplage du récepteur AT1 aux protéines G hétérotrimériques ... 13

Figure 4. Modèle cubique d'activation du complexe ternaire d'un GPCR ... 22

Article 1: Figure 1. Photoaffinity labeling ofwild-type and mutant AT1 receptors ... 52

Figure 2. Functional properties of the wild-type and mutant AT1 receptors: IP production ... 54

Figure 3. Functional properties of the wild-type and mutant AT1 receptors: Ca2+ mobilization ... 56

Figure 4. Binding properties in the presence of an uncoupling agent ... 57

Figure 5. Coimmunoprecipitation of Gq/I Iu with the different AT 1 receptors ... 60

Article 2: Figure 1. Spontaneous and Ang II-induced Ca2+ oscillations in single cells ... 81

Figure 2. Ang II-induced Ca2+ release and Ca2+ entry ... 83

Figure 3. Dose-response curves for Ang 11-induced Ca2+ release and Ca2+ entry ... 85

Figure 4. Capacitative Ca2+ entry under basal conditions ... 87

Figure 5. Integrity of the intracellular Ca2+ stores ... 89

Figure 6. EXP3174 rescues the Ca2+ release and Ca2+ entry activities ofNl 11 G cells. 91 Figure 7. IP3-induced Ca2+ release activity in permeabilized cells ... 93

(8)

Figure 9. Immunoblot analysis oflP3RIII ... 97

Figure 1 O. Ca2+ responses and IP 3RIII expression in heterogenous populations of G-418-resistant transfected cells ... 99

Figure 11. Mechanism oflP3RIII down-regulation in Nl 1 lG cells ... 101

Article 3: Figure 1. Proliferation rate of clonai cell lines ... 132

Figure 2. Morphological and cytoskeletal reorganization ofNl 1 lG cells ... 133

Figure 3. EXP3174 prevents phenotypic changes in Nl 11 G cells ... 136

Figure 4. Phenotypic modifications of WT cells following Ang II stimulation ... 139

(9)

Article 1 :

Tableau 1. Binding properties ofwild-type and mutant AT1 receptors ... 51 Article 2:

Tableau 1. Binding and Functional Properties of Receptors Expressed in Clonai Cell Lines ... 80

(10)

AC ACE AMPc Angl AngII Ang III AngIV ARNm AT1R AT2R CHAPS DAG DTM ERK FAK

FRAP

FRET GDP GIRK GPCR GRK GTP GTP)'S HEK-293 IP3 IP3R IP3 sponge IRAP JAK MAPK mGluR p130PH PARI

PKA

PKC PIP2 PBK PLA2 PLC PLD PMCA

PS

Adénylyl cyclase Enzyme de conversion de !'angiotensine Adénosine monophosphate cyclique Angiotensine I Angiotensine II Angiotensine III Angiotensine IV Acide ribonucléique messager Récepteur de type 1 de l'angiotensine II Récepteur de type 2 de !'angiotensine II 3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio ]propanesulfonate Diacylglycérol Domaine transmembranaire "Extracellular signal-regulated kinase" "Focal adhesion kinase" "Fluorescence recovery after photobleaching" "Fluorescence resonance energy transfer" Guanosine diphosphate "G protein-linked inwardly rectifying K+ channel" Récepteur couplé aux protéines G "G protein-coupled receptor kinase" Guanosine triphosphate Guanosine-5 '-0-(3-thiotriphosphate) Lignée cellulaire "Human Embryonic Kidney 293" Inositol 1,4,5-trisphophate Récepteur-canal de l'IP3 Domaine de liaison de l'IP3RI de souris "Insulin-regulated membrane aminopeptidase" "Janus-activated kinase" "Mitogen-activated protein kinase" Récepteur métabotropique du glutamate "PH domain of the phospholipase C-like protein p130" "Protease-activated receptor 1" Protéine kinase A Protéine kinase C Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate Phosphoinositide 3-kinase Phospholipase A2 Phospholipase C Phospholipase D "Plasma membrane calcium ATPase" Pentosane sulfate

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PYK2 RE RGS2 Sar SER CA

soc

SRA STAT TRP

"Proline-rich tyrosine kinase 2" Réticulum endoplasmique "Regulator of G protein signaling 2" Sarcosine "Sarcoplasmic and endoplasmic reticulum calcium ATPase" "Store-operated channel" Système rénine-angiotensine "Signal transducer and activator of transcription" "Transient receptor potential"

(12)

Impact cellulaire de l'expression d'un mutant constitutivement actif du

récepteur AT

1

de l 'angiotensine II

Par MANNIX AUGER-MESSIER Université de Sherbrooke Département de Pharmacologie Thèse présentée à la Faculté de Médecine

en vue de l'obtention du grade de Philosophire Doctor (Ph.D.)

Le récepteur mutant constitutivement actif Nl 11G-AT1 a la capacité de stimuler la protéine Gq111 en absence d'angiotensine II (Ang II), l'agoniste endogène du récepteur

AT1. Nous avons montré que le récepteur Nll1G-AT1, bien qu'il couple efficacement à la protéine Gq111, maintient un état de haute affinité pour l' Ang II même en présence d'agents découplants. Afin de déterminer si cette propriété du récepteur Nll 1G-AT1 découle d'un changement de conformation intrinsèque ou plutôt d'une interaction plus stable avec la protéine Gq11 i, nous avons montré par co-immunoprécipitation que le récepteur Nl l1G-AT1 couple de façon réversible à la protéine Gaq111. D'autre part, nous avons montré que l'expression stable du récepteur Nll 1G-AT1 dans les cellules HEK-293 (cellules Nll 1 G) mène à la génération spontanée d'oscillations calciques en absence d' Ang Il. Par contre, en dépit de cette mobilisation calcique constante au repos, les cellules Nll IG présentent une désensibilisation hétérologue de la voie de relâche du Ca2+. Nous avons montré par des essais fonctionnels (relâche de Ca2+ par l'inositol 1,4,5-trisRhosphate (IP3) sur des cellules perméabilisées à la saponine) et biochimiques (liaison d'[ H]-IP3 et immunobuvardage des récepteurs de l'IP3 (IP3Rs)) que le niveau des IP3Rs dans les cellules Nl 11 G est fortement diminué. Le mécanisme par lequel cette désensibilisation survient passe par une dégradation accrue des IP3Rs par la voie du lysosome. Le traitement prolongé (24-48 h) des cellules Nll IG avec l'EXP3174, un agoniste inverse du récepteur ATi, permet de renverser cette désensibilisation de la voie de relâche calcique. La signalisation constante du récepteur Nl 11G-AT1 se traduit aussi par d'importants changements morphologiques des cellules Nl llG lorsqu'elles forment un feuillet de cellules confluentes. Ce phénotype particulier des cellules Nl 11 G se traduit par une réorganisation du cytosquelette d'actine et peut être reproduit en stimulant avec l'Ang II des cellules HEK-293 exprimant le récepteur AT1. Nous avons montré que l'adoption d'un tel phénotype est dépendant de l'activation de la protéine Rho-kinase. Encore une fois, l 'EXP317 4 s'est révélé efficace pour prévenir et renverser l'adoption du phénotype des cellules Nll IG. En somme, ces résultats suggèrent que l'activation constitutive des voies de signalisation sous-jacentes au récepteur Nl 11G-AT1 force la cellule à s'adapter en modifiant son phénotype.

(13)

L'identification des protéines formant la grande famille des récepteurs couplés aux protéines G (G Protein-Coupled Receptor: GPCR) a contribué au progrès fulgurant de la médecine du 20e siècle. En plus de jouer un rôle clé dans une myriade de processus physiologiques et pathologiques, les GPCRs constituent à l'heure actuelle environ 50% des cibles thérapeutiques exploitées par l'industrie pharmaceutique (FLOWER, 1999). L'intérêt commercial et fondamental pour l'étude de cette superfamille de protéines reste d'ailleurs des plus élevé puisqu'il a été possible d'estimer que 2% du génome humain coderait pour des GPCRs (LANDER et al., 2001; FREDRIKSSON et al., 2003).

Les GPCRs sont des protéines intégrales de la membrane plasmique présentant une architecture à sept domaines transmembranaires (DTMs) hydrophobiques reliés consécutivement par des séquences hydrophiliques (boucles intracellulaires et extracellulaires) de longueurs variables. De plus, ces protéines sont dotées de queues N-terminale (côté extracellulaire) et C-N-terminale (côté intracellulaire) de différentes longueurs. Composée de plus de 800 membres distincts, la superfamille des GPCRs parvient à décoder une multitude de différents signaux extracellulaires allant de simples ions jusqu'à de grosses protéines (DOHLMAN et al., 1991; COUGHLIN, 1994; STRADER et al., 1994). En liant spécifiquement leur GPCR, ces ligands en modifient la structure des DTMs et des boucles intracellulaires et permettent ainsi de traduire l'information extracellulaire en signaux intracellulaires via l'activation de différents effecteurs (GILMAN, 1987; BIRNBAUMER et al., 1990; GUDERMANN et al., 1997; BOCKAERT et PIN, 1999). Parmi ces derniers, l'activation classique des protéines G

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hétérotrimériques est d'ailleurs à l'origine du nom des GPCRs. L'identification des protéines impliquées dans ces voies classiques de signalisation des GPCRs est le fruit d'importantes études réalisées au cours des quarante dernières années. Divers groupes de chercheurs tels Sutherland et Rall, Rodbell et Birnbaumer, Ross et Gilman, Clapham et Neer ont mis à jour l'incroyable complexité entourant la signalisation des GPCRs via les sous-unités protéiques Ga et Gpy (VAUGHAN, 1998). Toutefois, la totalité des actions engendrées par les GPCRs ne s'explique pas que par la simple activation des protéines G hétérotrimériques. Au cours de la dernière décennie, la capacité des GPCRs à activer d'autres voies de signalisation traditionnellement reconnues pour découler de l'activation des récepteurs à activité tyrosine kinase (e.g. Jak/STAT, pp60c-sRc, petites protéines G de la famille Rho) et ayant un impact à long terme sur le protéome cellulaire a été mise en évidence (FUKATA et al., 2001; LUTTRELL et LUTTRELL, 2004; PARSONS et PARSONS, 2004; THOMAS et al., 2004). Ainsi, la compréhension approfondie des mécanismes moléculaires d'activation et des voies de signalisation sous-jacentes aux GPCRs (autant ceux connus que les GPCRs orphelins) renferme la promesse d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pouvant améliorer la qualité de vie et la longévité chez l'homme.

À cette fin, différents modèles d'homologies ont été suggérés afin d'identifier, s'il en existe, les bases communes aux mécanismes moléculaires d'activation des GPCRs (BALDWIN, 1993; GETHER et KOBILKA, 1998; GETHER, 2000; KARNIK et al., 2003). Traditionnellement, les homologies de séquences entre les GPCRs ont permis de définir trois sous-familles de récepteurs (A, B et C) chez les mammifères (ATTWOOD et FINDLAY, 1994; KOLAKOWSKI, 1994). Les récepteurs semblables à la rhodopsine

(15)

constituent la plus importante sous-famille renfermant approximativement 90% des GPCRs (sous-famille A: caractérisée par la présence d'une séquence DRY dans la portion N-terminale de la 2e boucle intracellulaire, d'un pont disulfure reliant les 1 ère et 2e boucles extracellulaires et d'un motifNPxxY dans le 7e DTM). Les GPCRs reliés au récepteur de la calcitonine (sous-famille B: caractérisée par la présence de 20 cystéines bien conservées et l'absence de la séquence DRY) et aux récepteurs métabotropiques (sous-famille C: caractérisée par la présence du pont disulfure reliant les 1 ère et 2e boucles extracellulaires et l'absence de la séquence DRY) constituent les 10% restant des GPCRs (GETHER et KOBILKA, 1998; GETHER, 2000). Il est à noter que la nomenclature plus récente selon le système de classification GRAFS (pour Glutamate, Rhodopsin, Adhesion, ,Erizzled/taste2 et §.ecretin) a été proposée suite au séquençage complet du génome humain (FREDRIKSSON et al., 2003). En soi, l'ensemble de ces caractéristiques permettant la classification en sous-familles des GPCRs suggèrent que la pression évolutive force le maintien de certains déterminants communs nécessaires à l'activation appropriée de ces récepteurs. D'ailleurs, quelques études tendent à prouver l'existence de tels mécanismes moléculaires d'activation communs aux GPCRs (HAN et al., 1997; MIURA et al., 1999; SHEIKH et al., 1999; SCHULZ et al., 2000). La validation de ces mécanismes d'activation bénéficierait grandement de l'élucidation des structures tridimensionnelles des GPCRs en conformations inactives et actives. Toutefois, bien que les structures tridimensionnelles des protéines G soient connues (COLEMAN et al., 1994; MIXON et al., 1995; TESMER et al., 1997), la cristallographie des protéines membranaires tels les GPCRs reste encore aujourd'hui difficile à réaliser. La détermination de l'arrangement spatial des 7 DTMs de la rhodopsine et l'élucidation de

(16)

sa structure cristallographique à haute résolution dans une conformation inactive reste un exemple unique parmi les GPCRs de mammifères (UNGER et al., 1997; PALCZEWSKI et al., 2000). Heureusement, la cristallographie des récepteurs à 7 DTMs n'est pas la seule méthodologie pouvant fournir d'importantes informations sur leur structure. Par exemple, la mutagénèse aléatoire (SPALDING et al., 1998; PARNOT et al., 2000; BEUKERS et al., 2004), la mutagénèse dirigée (COTECCIDA et al., 1990; KJELSBERG et al., 1992; MARIE et al., 1999), l'introduction de sites de liaison pour un ion métallique (SHEIKH et al., 1996; ALTENBACH et al., 1999), le marquage par photoaffinité (KENNEDY et al., 1996; BOUCARD et al., 2000), la réticulation intra- ou inter-moléculaire à l'aide d'agent ponté hi-fonctionnel (ITOH et al., 2001; KLEIN-SEETHARAMAN et al., 2001) et l'identification des pochettes de liaison par la méthode de "Substituted-Cysteine Accessibility Method" (JAVITCH et al., 1994; BOUCARD et al., 2003) sont parmi les méthodes exploitées activement afin de mieux définir la structure des GPCRs.

En somme, la modélisation moléculaire d'un GPCR par homologie de séquence avec la rhodopsine en combinaison avec l'ensemble des données relatives à sa structure-fonction permettront de raffiner notre compréhension de ses propriétés pharmacologiques et fonctionnelles. L'élucidation des différents états conformationnels (inactif et actif) d'un GPCR ainsi que des mouvements dynamiques ensuivis lors de son activation représente un défi de taille pour la communauté scientifique (BARTFAI et al., 2004). Toutefois, l'accumulation de ces connaissances promet de mener au développement de médicaments encore plus efficaces et sécuritaires tels les agonistes inverses et les superagonistes, favorisant respectivement l'adoption d'états conformationnels inactifs ou actifs par le GPCR ciblé (KENAKIN, 2003a).

(17)

1. LE RÉCEPTEUR DEL' ANGIOTENSINE II DE TYPE 1 (AT1)

Au cours des 25 dernières années, la mise en évidence de certaines propriétés fondamentales des GPCRs ( e.g. activité constitutive, dimérisation, allostérisme, couplage à différentes protéines G, influence des protéines auxilliaires et enrichissement d'états conformationnels précis selon le ligand utilisé et le protéome cellulaire étudié) nous a permis d'entrevoir de nouvelles avenues thérapeutiques (BRADY et LIMBIRD, 2002; KENAKIN, 2004a). À cet effet, l'étude du récepteur AT1 a grandement contribué à l'avancement de nos connaissances entourant les propriétés des GPCRs en général.

1.1. Système rénine-angiotensine et rôles physio/pathologiques

L'Ang II (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe) est une hormone octapeptidique qui permet le maintien de ! 'homéostasie cardiovasculaire en régulant la pression sanguine (volume sanguin et résistance vasculaire), l'équilibre hydrique et électrolytique, la sécrétion de certaines hormones ( e.g. aldostérone, vasopressine et adrénocorticotropine) et les fonctions rénales (DE GASP ARO et al., 2000). Ces actions physiologiques de l 'Ang II s'expliquent par la diversité de ses tissus cibles tels les muscles lisses vasculaires, le cerveau, ! 'hypophyse, le système nerveux sympathique, les glandes surrénales et les reins. La formation de l 'Ang II est accomplie par la synthèse du précurseur angiotensinogène (protéine globulaire de 452 acides aminés) qui, sous l'action successive des enzymes protéolytiques rénine (constituant l'étape limitante du processus) et ACE (enzyme de conversion de !'angiotensine régulant aussi le niveau de bradykinine ), est hydrolysé en Ang II (Figure 1 ). En diminuant le taux de sécrétion de la

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Protéases

Angiotensinogène

Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu Leu-Val- ... Rénine

Angl

Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe His-Leu ACE

Ang II

T

Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe

Fragments inactifs /

AT4/IRAP

Aminopeptidases

Milieu

4

Réponses

cellulaires

Ang III

Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe

+

AngIV

Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe

~

,

?

~Reponses

cellulaires

Figure 1. Métabolisme de l'angiotensine II au sein du système rénine-angiotensine. L' angiotensinogène, principalement synthétisé au foie, est hydrolysé en angiotensine 1 (Ang 1) par l'enzyme rénine (synthétisée et sécrétée par les cellules juxtaglomérulaires des reins). L' Ang 1 est rapidement hydrolysée en angiotensine II (Ang II) par l'enzyme de conversion de !'angiotensine (ACE) que l'on retrouve à la surface des cellules endothéliales et conséquemment, en grande quantité aux poumons (NG et VANE, 1967; RYAN et al., 1976). L' Ang II produit diverses réponses cellulaires en liant ses récepteurs AT 1 et AT 2. L' Ang II peut aussi être hydrolysé par des aminopeptidases en fragments actifs (angiotensine III : Ang III et angiotensine IV : Ang IV) liant le récepteur AT 4/IRAP ou par diverses protéases en fragments inactifs.

(19)

rénine, l'Ang II régule son propre niveau sanguin et complète ainsi une boucle de rétro-inhibition au sein du système rénine-angiotensine (SRA). Les malformations engendrées chez des souris déficientes en angiotensinogène, en ACE ou traitées in utero avec le losartan (antagoniste spécifique du récepteur AT1) mettent en évidence l'importance du SRA dans la croissance et le développement normal de ses tissus cibles (TUFRO-MCREDDIE et al., 1995). Depuis déjà 20 ans, il est suggéré que l'existence de SRA localisé à même ces différents tissus cibles serait responsable de l'action paracrine et autocrine de l'Ang II dans les processus d'hypertrophie cellulaire, de prolifération, de migration, d'inflammation et de fibrose (DZAU et GIBBONS, 1987; GRIFFIN et al., 1991; WEBER et al., 1995; FUKUHARA et al., 2000; DANSER, 2003; NERI SERNERI et al., 2004). L'étiologie des pathologies cardiovasculaires telles l'hypertension, l'athérosclérose, l'hypertrophie cardiaque du ventricule gauche et les crises cardiaques reflète aussi l'importance du rôle joué par le récepteur AT1 dans ces maladies (GRIENDLING et al., 1996; SWYNGHEDAUW, 1999; VAUGHAN, 2000; MOLKENTIN et DORN, 2001; HUNYADY et TURU, 2004). L'efficacité équivalente des antagonistes spécifiques du récepteur AT1 et des inhibiteurs de l'ACE dans la lutte contre l'hypertension artérielle a permis de confirmer l'implication du SRA dans cette pathologie (RAMSAY et YEO, 1995). Néanmoins, plusieurs études cliniques à grande échelle ( e.g. LIFE, ELITE, RENAAL) ont montré qu'en bloquant précisément le récepteur AT1, les antagonistes spécifiques s'avèrent plus sécuritaires et mieux tolérés que les inhibiteurs de I' ACE (BALL et WIDTE, 2003). De plus, une nouvelle classe de médicaments non-peptidiques (tel l'aliskiren) inhibant directement la rénine pourrait

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bientôt s'ajouter à la pharmacopée utilisée pour lutter contre diverses pathologies du système cardiovasculaire (STANTON, 2003).

1.2. Expression et structure du récepteur AT1

Chez l'homme, l'Ang II lie deux récepteurs ayant 30% d'homologie entre eux, soient les récepteurs hA T 1 et hA T 2. Le clônage des récepteurs AT 1 et AT 2 a suivi leur identification pharmacologique préalablement basée sur leur différence de liaison aux antagonistes non-peptidiques sélectifs tels le losartan (aussi nommé DuP753 et développé par Du Pont Pharmaceuticals; AT 1 sélectif) et le PD 1231 77 (un dérivé de la spinacine; AT2 sélectif) (CHIU et al., 1989; WHITEBREAD et al., 1989; MURPHY et al., 1991; SASAKI et al., 1991; KAMBAYASHI et al., 1993; NAKAilMA et al., 1993). Plus précisément, le récepteur hA T 1 est codé par un seul gène composé de 5 exons et situé sur la bande q24 du chromosome 3 (CURNOW et al., 1992; GUO et al., 1994). Chez le rat, deux gènes distincts codant pour les sous-types de récepteur AT JA et AT rn ont été clonés (SASAMURA et al., 1992; YE et HEALY, 1992; MURASAWA et al., 1993; GUO et INAGAMI, 1994). Suite au clonage du récepteur ATr, certains groupes de recherche ont entrepris d'identifier les mécanismes régulant son expression. Il a été suggéré que l'effet protecteur des estrogènes sur les maladies cardiovasculaires découlerait de leur capacité à moduler le niveau d'expression du récepteur AT1A chez le rat par les 5'LS BPs (protéines liant des ARN cytosoliques et reconnaissant, dans le cas présent, la séquence promotrice en position 5' de l'ARNm du récepteur AT1A) (KRISHNAMURTHI et al., 1999). L'interféron-y inhibe l'expression du récepteur AT1A dans les cellules vasculaires de muscles lisses de rat en modulant le niveau transcriptionnel du gène par des voies

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dépendantes de l'activation des protéines MAPK (Mitogen-activated protein kinase) et Jak2 (Janus-activated kinase) (IKEDA et al., 1999). Toutefois, l'accumulation de connaissances entourant la régulation de l'expression du récepteur AT1 chez l'homme est ralentie par le manque de lignées cellulaires humaines exprimant de façon endogène ce GPCR. Ce n'est que tout récemment que l'étude d'une lignée de trophoblaste humain immortalisé a permis de montrer que l'expression du récepteur hAT1 y est régulée en partie par les facteurs de transcription ubiquitaires Spi et Sp3 (DUFFY et al., 2004).

En dépit du manque d'informations entourant la régulation de l'expression du récepteur AT1, plusieurs de ses déterminants structuraux et fonctionnels sont toutefois connus. L'analyse d'hydropathie du récepteur AT1 suggère que cette protéine de 359 acides aminés contient 7 DTMs hydrophobes formant des hélices

a

dans la bicouche lipidique des membranes cellulaires. De plus, l'existence d'une 8e hélice

a

au caractère amphipathique, située à la suite du 7e DTM et interagissant avec les lipides anioniques a été proposée comme pouvant influencer la fonctionnalité du récepteur AT 1 (MOZSOLITS et al., 2002; THOMAS et QIAN, 2003). La structure secondaire du récepteur AT 1 est représentée à la figure 2. La structure tertiaire de ce GPCR est maintenue grâce à la présence de deux ponts disulfures reliant la région N-terminale à la 3e boucle extracellulaire et la 1 ère boucle extracellulaire à la 2e boucle extracellulaire. L'intégrité de ces ponts disulfures est nécessaire à la liaison de l'Ang II au récepteur AT 1 et lui confère une sensibilité aux agents réducteurs tels le dithiothréitol et le 2-mercaptoéthanol (GUNTHER, 1984; WlllTEBREAD et al., 1989; OHYAMA et al.,

1995). La présence de trois sites consensus de N-glycosylation (NxSff) retrouvés sur la queue N-terminale (N4) et la 2e boucle extracellulaire (NI 76 et N188) du récepteur AT1

(22)

Figure 2. Représentation schématique du récepteur AT1• Les sept DTMs et la ge hélice a composant le récepteur AT 1 sont numérotés (I-VIII). Le récepteur AT 1

comprend trois sites de N-glycosylation (Asn4, Asn176 et Asn188) essentiels à son ciblage membranaire. Sa structure tertiaire est maintenue grâce à deux ponts disulfures reliant la Cys18 à la Cys274 et la Cys101 à la Cys180• Le résidu Asn111 (milieu du 3e DTM) et les motifs DRY et NPxxY (portion C-terminale des 3e et 7e DTMs respectivement) sont intimement liés aux mécanismes d'activation du récepteur AT 1• Les sites potentiels de phosphorylation (sérines/thréonines et tyrosines) présents aux boucles intracellulaires et à la queue C-terrninale sont aussi mis en évidence (losanges et triangles rouges, respectivement).

(23)

est nécessaire à son ciblage membranaire lors de la synthèse protéique (DESLAURIERS et al., 1999; JAYADEV et al., 1999; LANCTOT et al., 1999). Le processus de glycosylation est toutefois complexe et peut varier énormément d'un type cellulaire à l'autre (ROTH, 2002). C'est d'ailleurs probablement pourquoi la masse apparente du récepteur AT1, comme celle mesurée pour d'autres GPCRs (e.g récepteur AT2, récepteur

~-adrénergique, récepteur du glucagon), diffère souvent entre différents tissus et systèmes

d'expression (CARSON et al., 1987; ARBABIAN et al., 1989; SERVANT et al., 1994; IWANIJ, 1995). Comme pour plusieurs GPCRs, la présence des séquences DRY (résidus 125-127) et NPxxY (résidus 298-302) à la portion C-terminale des 3e et 7e DTMs, respectivement, est intimement liée à la fonctionnalité du récepteur AT 1 (LAPORTE et al., 1996; MIURA et al., 2000; KARNIK et al., 2003). L'ensemble de ces déterminants structuraux du récepteur AT1 permet de classer cette glycoprotéine dans la sous-famille A des GPCRs. D'autre part, les trois boucles intracellulaires et la queue cytoplasmique du récepteur AT1 renferment plusieurs sites potentiels de phosphorylation pour certaines Ser/Thr kinases ( e.g. protéine kinase C et "G protein receptor kinases") et Tyr kinases (e.g. Jak2, pp60c-sRc et p125FAK) (BERK et CORSON, 1997; FERGUSON, 2001). Suite

à la phosphorylation du récepteur AT1, les mécanismes de désensibilisation tels le recrutement des ~-arrestines et l'internalisation au niveau des puits tapissés de clathrine

sont enclenchés (OAK.LEY et al., 2000; PIERCE et al., 2001; THOMAS et QIAN, 2003). Bien que la phosphorylation des Ser335 et Thr336 favorise l'internalisation rapide et maximale du récepteur AT1 lors de la liaison de l'Ang II, cette modification post-traductionnelle n'est toutefois pas essentielle à son internalisation (THOMAS et al., 1996; THOMAS et al., 1998). De plus, il est intéressant de noter que les motifs d'internalisation

(24)

du récepteur AT1 (contenus au mveau de la partie N-terminale de sa 3e boucle intracellulaire et de sa queue C-terminale) ne recoupent pas entièrement les déterminants structuraux permettant la stimulation de la phospholipase C (CHAKI et al., 1994; HUNYADY et al., 1994b; HUNYADY et al., 1995; THOMAS et al., 1995; LAPORTE et al., 1996). En ce sens, l'Ang II provoque l'internalisation robuste des récepteurs mutants D74N-AT1 et D74N/~21-226-AT1 sans que ces derniers ne parviennent à activer la protéine Gqtll (HUNY ADY et al., 1994a). La capacité de différents analogues de l'Ang II (e.g. [Sar1,Ile8]Ang II et [Sar1,Ile4,Ile8]Ang II) à diriger le récepteur AT1 vers les vésicules d'endocytose sans préalablement activer la protéine Gq111 suggère aussi fortement que ce GPCR adopte des conformations distinctes lors de son couplage aux protéines G hétérotrimériques et de son internalisation (THOMAS et al., 2000).

1.3. Voies de signalisation enclenchées par le récepteur AT 1

L'action rapide de l'Ang II sur le système cardiovasculaire est majoritairement due à sa liaison au récepteur AT1. En premier lieu, l'activation de la phospholipase C de type~

par la sous-unité protéique Gaq111 liant le guanosine triphosphate permet l'hydrolyse du phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate en inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) et diacylglycérol (Figure 3). Tandis que l'IP3 favorise l'ouverture de ses récepteurs-canaux tétramériques (IP3Rs) et provoque la mobilisation intracellulaire rapide du Ca2+ contenu dans le réticulum endoplasmique (RE), le diacylglycérol active directement certaines isoformes de protéine kinase C (NEWTON, 2001; PATTERSON et al., 2004). Le Ca2+ ainsi relâché peut provoquer une multitude d'effets cellulaires (via l'activation de différents effecteurs) allant de réponses rapides telles la sécrétion d'hormones et la

(25)

Figure 3. Couplage du récepteur AT1 aux protéines G hétérotrimériques. La liaison de l'Ang II au récepteur AT1 (AT1R) provoque l'activation des protéines Gq111 et Gilo en favorisant l'échange de guanosine diphosphate (GDP) pour le guanosine triphosphate (GTP). La sous-unité G<Xq111 liant le GTP active la phospholipase C de type ~ (PLC-~)

qui hydrolysera le phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) en diacylglycérol (DAG)

et lP3. Le DAG est un activateur direct de la protéine kinase C (PKC) tandis que l'IP3, en liant son récepteur-canal (IP3R), mène à l'activation de plusieurs effecteurs (e.g. calmoduline kinase, protéine kinase C) via la relâche du Ca2+ @t) contenu au réticulum

endoplasmique (RE). Cette élévation de la concentration de Ca2+ au cytoplasme est

contrebalancée par les pompes SERCA et PMCA. L'entrée de Ca2+ extracellulaire par les

canaux calciques situés à la membrane plasmique tels les "transient receptor potential" (TRP) et les "store-operated channel" (SOC) permettent d'éviter la vidange à long terme des réserves de Ca2+ intracellulaire. Pour sa part, la sous-unité Gailo liant le GTP inhibe

l'adénylyl cyclase (AC), réduisant ainsi le niveau d'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) et l'activité de la protéine kinase A (PKA). Les sous-unités G~y peuvent aussi

(26)

AngII

, ',

--+

-:---• Calmodulinc

~ .

Calmodulme PKA Kinase oyau

• •

(27)

contraction jusqu'aux régulations à long terme telles l'hyperplasie et l'hypertrophie cellulaire, les processus d'inflammation et l'apoptose (BERRIDGE et al., 2000). La cellule doit d'ailleurs se protéger contre l'exposition prolongée à de fortes concentrations de Ca2+ intracellulaire en l'expulsant à l'aide des pompes SERCA (Sarcoplamic and Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase: pompage au RE) et PMCA (Plasma Membrane

Ca2+ ATPase: pompage au milieu extracellulaire ). Afin d'éviter la déplétion sévère des réserves intracellulaires de Ca2

+,

divers canaux calciques situés à la membrane plasmique (e.g. "transient receptor potential", "store-operated channel") sont ensuite ouverts afin de permettre le remplissage du RE (SPASSOVA et al., 2004).

L'activation de la protéine G110 permet aussi d'expliquer certaines des actions hémodynamiques du récepteur AT1 (Figure 3). Par exemple, c'est en activant la protéine Gi/o que le récepteur AT1 stimule la synthèse d'angiotensinogène dans le foie (POBINER et al., 1991; KLETT et al., 1993). Plus précisément, l'inhibition de l'adénylyl cyclase par la sous-unité

Gavo

chez les hépatocytes de rat mène à la stabilisation de l'ARNm de l'angiotensinogène et conséquemment, à l'augmentation de sa synthèse protéique (KLETT et al., 1993). L'atténuation du transport au travers l'épithélium rénal des tubules proximaux (réabsorption d'eau, de sel et de composés organiques endogènes VS sécrétion de déchets organiques) par le récepteur AT1 est aussi due à l'activation de la protéine G110 (DOUGLAS et al., 1990). Enfin, l'utilisation de la toxine de pertussis (inhibant la protéine G,;o par un mécanisme d'ADP-ribosylation) a permis de montrer que le récepteur AT1 diminue la sécrétion de rénine en partie grâce à l'inhibition de l'adénylyl cyclase (HACKENTHAL et al., 1985). Toutefois, les effets cellulaires découlant de l'activation de la protéine Gi/o peuvent aussi provenir de l'action de la sous-unité G~y sur ses

(28)

différents effecteurs tels la PBK (phosphoinositide 3-kinase ), certaines GRK (G protein-coupled receptor kinases) ainsi que différentes isoformes d'adénylyl cyclase et de PLC-~

(CLAPHAM et NEER, 1997).

Plusieurs études ont montré que les protéines G hétérotrimériques interagissent directement avec différentes portions des boucles intracellulaires et de la queue C-terminale des GPCRs (KONIG et al., 1989; DOHLMAN et al., 1991; BLUML et al.,

1994; BOURNE, 1997; WESS, 1998; WU et al., 1998; WELSBY et al., 2002; CHAN et al., 2003; AUGER et al., 2004; ROGINSKA YA et al., 2004). Par exemple, la Ser240 de la rhodopsine (située à la portion C-terminale de sa 3e boucle intracellulaire) est nécessaire pour l'interaction de ce GPCR en conformation active avec les portions N- (résidus 19-28) et C-terminales (résidus 310-314 et 342-345) de la transducine (protéine G hétérotrimérique présente dans la rétine) (FRANKE et al., 1992; CAi et al., 2001; ITOH et al., 2001). L'activation des protéines G hétérotrimériques par le récepteur AT1 repose en partie sur l'intégrité de la séquence DRY (2e boucle intracellulaire), des résidus 219-225 (3e boucle intracellulaire) et des résidus 312-314 (queue C-terminale) (OHY AMA et al., 1992; SHIRAI et al., 1995; WANG et al., 1995; SHIBATA et al., 1996; SANO et al., 1997; KA1 et al., 1998; MIURA et al., 2000). Toutefois, peu de distinction entre le couplage des protéines Gq111 et Gi/o au récepteur AT 1 n'a été porté au cours de ces études. De telles différences semblent pourtant exister puisque l'orientation et la rigidité du 4e DTM du récepteur AT1 influence sa spécificité de couplage avec les protéines Gq111 et Gi/o (FENG et KARNIK, 1999). D'autre part, la sélectivité de couplage des GPCRs ( e.g. récepteur D2 de la dopamine, récepteur CBl des cannabinoides) à différentes protéines G hétérotrimériques varie selon le ligand utilisé (GLASS et NORTHUP, 1999; GAZI et al.,

(29)

2003). Le groupe de Lefkowitz a aussi montré que l'état de phosphorylation des récepteurs ~-adrénergiques (type 1 et 2) et V2 de la vasopressine gouverne la nature des voies de signalisation pouvant être enclenchées suite à l'activation de ces GPCRs (ZAMAH et al., 2002; MARTIN et al., 2004a; REN et al., 2005). On peut ainsi suggérer que l'ensemble des déterminants moléculaires permettant au récepteur AT 1 d'activer la protéine Gq111 ne correspond pas entièrement à ceux permettant son couplage fonctionnel à la protéine Gi10.

L'action du récepteur AT1 s'étend toutefois bien au-delà des quelques effecteurs classiques des protéines Gq;11 et Gi/o mentionnés ci-haut. En fait, l'activation du récepteur AT 1 enclenche un vaste réseau de voies de signalisation faisant appel à la phospholipase A2 (génération d'acide arachidonique), la phospholipase D (production d'acide phosphatidique ), différents canaux ioniques ( e.g. canaux calciques voltage-dépendant de type L et T) ainsi qu'une grande variété de sérine/thréonine kinases ( e.g. MAPK, PKC, Akt/PKB) et de tyrosine kinases (e.g. Jak2, Pyk2, pp60c-sRc, p125FAK' p130CAS) (SA YESKI et al., 1998; DE GASPARO et al., 2000; TOUYZ et BERRY, 2002). Par exemple, le récepteur AT 1 exprimé dans les cellules vasculaires de muscles lisses active la voie de signalisation des PBK-Akt/PKB grâce à la production d'espèces réactives en oxygène par la NADH/NADPH oxidase (USHIO-FUKAI et al., 1999). Le récepteur AT1 provoque aussi la translocation rapide des STAT ("signal transducers and activators of transcription") au noyau de divers types de cellules (e.g. cardiomyocytes, cellules vasculaires de muscles lisses, cellules "Chinese Hamster Ovary") en activant directement la tyrosine kinase Jak2 (BHAT et al., 1995; MARRERO et al., 1995; MCWHINNEY et al., 1997). Plus précisément, la protéine Jak2 s'associe au récepteur AT1 en interagissant

(30)

avec le motif YIPP (région 319-322) situé sur la queue C-terminale de ce GPCR (ALI et al., 1997). Il est intéressant de noter que deux mutants du récepteur AT1 ("M5-AT1" et D74E-AT1) n'activant pas les protéines Gqtll et Gito parviennent tout de même à enclencher la voie de signalisation Jak2-STAT (DOAN et al., 2001 ). En interagissant directement avec le récepteur AT 1, la protéine A TRAP ("AT 1 receptor-associated protein") diminue le niveau d'activation de la voie de signalisation calcineurin-NFAT ("nuclear factor of activated T cells") (DA VIET et al., 1999; GUO et al., 2005). D'autre part, une gamme entière de fonctions physio/pathologiques de l 'Ang II sur le système cardiovasculaire repose sur ses effets typiquement associés aux facteurs de croissance tels l'EGF ("epidermal growth factor") et le PDGF ("platelet-derived growth factor") (SHAH et CATT, 2003; SMITH et al., 2004). En fait, la transactivation du récepteur de l'EGF (EGFR) par le récepteur AT 1 semble jouer un rôle important dans la progression de l'hypertrophie pathologique du muscle cardiaque (KAGIY AMA et al., 2002; THOMAS et al., 2002). Ce processus de transactivation des EGFR par différents GPCRs requiert l'activation de métalloprotéases de la matrice extracellulaire tel ADAM12 ("a disintegrin and metalloprotease 12") (DAUB et al., 1996; GSCHWIND et al., 2001; ASAKURA et al., 2002; SHAH et CATI, 2004). Bien que le mécanisme par lequel les GPCRs activent les métalloprotéases reste à éclaircir, deux études provenant du groupe de Sadoshima ont suggéré que le récepteur AT 1 peut transactiver les EGFR sans l'aide des protéines G hétérotrimériques (SETA et al., 2002; SETA et SADOSHIMA, 2003). En effet, même en ne couplant pas à la protéine Gq111 , le récepteur mutant D125G/R126GN127 A/M134A-AT1 parvient toujours à intemaliser, à activer les voies de signalisation des tyrosine kinases et des MAPK en plus de transactiver les EGFR (SET A et al., 2002). De plus,

(31)

cette équipe de recherche a rapporté l'interaction directe (et controversée) du récepteur AT 1 avec l'EGFR suite à la phosphorylation de la Tyr319 située sur la queue C-terminale de ce GPCR (SETA et SADOSHIMA, 2003; THOMAS et al., 2004). Ainsi, penser que les protéines G hétérotrimériques soient exclusivement responsables de l'activation de l'ensemble des voies de signalisation sous-jacentes au récepteur AT1 serait de banaliser la capacité de ce GPCR à interagir avec d'autres protéines régulatrices. Bien que les protéines G hétérotrimériques jouent un rôle majeur au niveau de la fonctionnalité des GPCRs, elles ne sont toutefois pas les seules protéines à interagir avec ces récepteurs à 7 DTMs (BOCKAERT et PIN, 1999; HALL et al., 1999; MARINISSEN et GUTKIND, 2001; KREIENKAMP, 2002; PIERCE et al., 2002; REBOIS et HEBERT, 2003). Par exemple, la famille des protéines ~-arrestines est reconnue depuis plus d'une décennie

pour diriger l'internalisation de plusieurs GPCRs vers les puits tapissés de clathrine en interagissant directement avec les portions intracellulaires de ces récepteurs (FERGUSON, 2001; LUTTRELL et LEFKOWITZ, 2002). Le recrutement stable des protéines ~-arrestines par certains GPCRs ( e.g. récepteur AT i, récepteur V2 de la

vasopressine, récepteur de la substance P) au niveau des vésicules d'endocytose permet d'ailleurs d'activer les voies de signalisation des MAPK et JNK indépendamment des protéines G hétérotrimériques (MCDONALD et al., 2000; OAKLEY et al., 2000; WEI et al., 2003; WEI et al., 2004). L'interaction de l'une des deux types de "Receptor-Activity-Modifying Protein" avec le "Calcitonine Receptor-Like Receptor" permet le repliement adéquat et le ciblage membranaire de ce GPCR tout en déterminant ses propriétés pharmacologiques (MCLATCHIE et al., 1998). La liaison des protéines d'échafaudage Homer (types la-c, 2 et 3) aux récepteurs métabotropiques du glutamate (via un domaine

(32)

riche en proline (PPxxFr) situé au niveau de leur queue cytoplasmique) permet la dimérisation et le couplage fonctionnel de ces GPCRs aux IP3Rs (BRAKEMAN et al., 1997; TU et al., 1998; XIAO et al., 1998). En fait, l'identification croissante de protéines interagissant directement avec les récepteurs à 7 DTMs (e.g. calmodulin, "Na+/W ex changer regulatory factor", tubulin, "A kinase-anchoring protein", etc ... ) suggère que le réseau de voies de signalisation pouvant être enclenché et régulé par les GPCRs est complexe et diversifié (MINAKAMI et al., 1997; HALL et al., 1998; CIRUELA et al., 1999; WANG et al., 1999; FRASER et al., 2000). À la lumière de ces données récentes, il est clair que le contexte cellulaire (ou protéome) dans lequel un GPCR est exprimé peut influencer drastiquement sa réponse face aux ligands endogènes et aux médicaments dirigés contre ce dernier (KENAKIN, 2003b ).

2. ACTIVITÉ CONSTITUTIVE DES GPCRs

L'action des GPCRs sur leurs systèmes biologiques ne repose pas uniquement sur la liaison préalable d'un ligand agoniste. En fait, ces récepteurs ont la capacité intrinsèque d'adopter une conformation active en absence d'agoniste (activité constitutive). Cette activité constitutive des GPCRs joue un rôle fondamental dans le maintien de différentes fonctions physiologiques et l'évolution de certains processus pathologiques (SPIEGEL, 1996; LEURS et al., 2000; PARNOT et al., 2002; SEIFERT et WENZEL-SEIFERT, 2002; MILLIGAN, 2003). À ce jour, plus de 60 GPCRs de type sauvage ont montré une activité constitutive dans différents systèmes d'expression et ce, sans égard au type de protéine G hétérotrimérique auquel ils couplent ou à leur sous-famille d'origine (SEIFERT et WENZEL-SEIFERT, 2002). Les premières évidences de l'activité

(33)

constitutive d'un GPCR ont été rapportées pour les récepteurs

8

opioïde et ~z­

adrénergique (KOSKI et al., 1982; CERIONE et al., 1984; COSTA et HERZ, 1989). Rapidement, plusieurs études de mutagenèse dirigée et de mutagenèse aléatoire ont montré qu'il est possible d'accentuer l'activité constitutive chez différents GPCRs ( e.g. rhodopsine, récepteur AT i, récepteur M5 muscarinique, récepteur a 1-adrénergique,

récepteur

8

opioïde) (COTECCIIlA et al., 1990; KJELSBERG et al., 1992; COHEN et al., 1993; BURSTEIN et al., 1995; SPALDING et al., 1998; PARNOT et al., 2000; DECAILLOT et al., 2003). Ces GPCRs mutants constitutivement actifs sont caractérisés par l'augmentation de leur activité basale relativement à celle de leur récepteur homologue de type sauvage (PARNOT et al., 2002). Depuis plus d'une décennie, l'étude de l'activation constitutive des GPCRs a grandement enrichi notre connaissance de leur structure et notre compréhension de leurs mécanismes d'activation et de désensibilisation (LEFKOWITZ et al., 1993; SCHEER et COTECCIIlA, 1997; LEURS et al., 2000; BARAK et al., 2003; MILLIGAN, 2003; GOULDSON et al., 2004; PRATHER, 2004).

2.1. Modèle théorique d'activation des GPCRs

Suite aux premières observations d'activité constitutive chez les GPCRs, le modèle d'activation du complexe ternaire d'un GPCR (en vogue dans les années 1980) a été raffiné et complété par le modèle cubique d'activation du complexe ternaire d'un GPCR (DE LEAN et al., 1980; LEFKOWITZ et al., 1993; SAMAMA et al., 1993; LEFF, 1995; WEISS et al., 1996) (Figure 4). L'innovation de ce modèle cubique réside dans le fait qu'il tient compte de toutes les combinaisons d'interactions possibles entre le

(34)

LR1G

R1

·

1 1 T ~

,

R

1

G

,' 1( , , , , , , , , , , , , , , , , , "',''

R1 ,

LR

G

LR/

(Tirée et modifiée de WEISS et al., 1996)

Figure 4: Modèle cubique d'activation du complexe ternaire d'un GPCR. La réaction

d'isomérisation déterminant la proportion de récepteurs existant dans une conformation inactive (R1) ou active

(R.,)

est régie par un équilibre thermodynamique. Le récepteur peut, dans l'une ou l'autre de ces conformations, lier le ligand (L) et/ou la protéine G hétérotrimérique (G). L'activité constitutive d'un GPCR s'explique par la formation d'un complexe fonctionnel entre le

R.,

et la G.

(35)

récepteur en conformation inactive ou active, le ligand et la protéine G hétérotrimérique. Bien que ces modèles théoriques représentent la simplification d'une réalité beaucoup plus complexe, ils ont tout de même permis de comprendre et prédire plusieurs comportements des GPCRs (MILLIGAN et IJZERMAN, 2000; STRANGE, 2002). Par exemple, l'expression stable du récepteur a20-adrénergique dans les cellules PC-12 (phéochromocytome de rat) a permis de confirmer l'existence de ce GPCR (en absence de ligand) dans une conformation active pouvant interagir et activer la protéine Gi/o CRA G) (TIAN et al., 1994 ). La forte activité constitutive du récepteur Mel IA de la mélatonine exprimé à un niveau physiologique dans les cellules HEK-293 s'explique par l'intense précouplage de la protéine Gai à ce GPCR (R1G et/ou RAG décelés par co-immunoprécipitation) (ROKA et al., 1999). D'autre part, le modèle cubique d'activation du complexe ternaire d'un GPCR permet de comprendre le caractère agoniste, antagoniste neutre ou agoniste inverse des ligands face à leurs GPCRs. Ainsi, un ligand agoniste stabilisera une quantité plus importante de récepteurs en conformation active couplant et activant les protéines G hétérotrimériques (LRA G en équilibre avec RA 0) que celle retrouvée initialement en absence de ligand (RAO seulement). C'est pourquoi la quantité de protéines G hétérotrimériques entraînées par l'immunoprécipitation de certains GPCRs (e.g. récepteur CCK-B de la cholecystokinine, récepteur ô opioïde, récepteur Mel1A de la mélatonine) est augmentée de façon importante suivant la liaison d'agonistes (LAW et REISINE, 1997; BRYDON et al., 1999; ROKA et al., 1999; GALES et al., 2000). Par contre, un agoniste inverse appauvrira la quantité totale de complexes fonctionnels (LRAO et RAO) en déplaçant l'équilibre thermodynamique vers des complexes n'activant pas les protéines G hétérotrimériques (LR1G et LR1). L'existence d'un complexe ternaire

(36)

du type LR1G a récemment été confirmée dans le cas des récepteurs CB2 des endocannabinoides, H1 et H2 de l'histamine liant les agonistes inverses SR 144528, mepyramine et tiotidine, respectivement (BOUABOULA et al., 1999; MONCZOR et al., 2003; FITZSIMONS et al., 2004). Remarquablement, ces agonistes inverses ont la propriété inattendue de provoquer la désensibilisation hétérologue des voies de signalisation régulées par les protéines G hétérotrimériques maintenues en complexe avec ces GPCRs en appauvrissant leur disponibilité pour d'autres types de GPCRs. La conséquence physiologique de l'utilisation de tels ligands reste toutefois à définir. Enfin, les antagonistes neutres lient leurs GPCRs sans en diminuer la quantité de complexe RAG à l'équilibre. Toutefois, ils bloquent ainsi l'accès de la pochette de liaison du GPCR aux agonistes inverses et aux agonistes.

Il est intéressant de noter que la plupart des agonistes inverses ont initialement été perçus comme étant des antagonistes neutres (MILLIGAN et al., 1995; KENAKIN, 2004b ). Ensemble, le clonage des GPCRs, la possibilité d'exprimer ces récepteurs dans des systèmes plus sensibles et l'identification de mutations augmentant leur activité constitutive ont permis de démasquer le caractère agoniste inverse de ces "pseudo-antagonistes neutres". Par exemple, la surexpression du récepteur ~2-adrénergique

(montrant ainsi une activité constitutive) chez les souris a permis de confirmer la nature agoniste inverse du ligand ICI-118,551 (BOND et al., 1995). Bien que les agonistes inverses offrent un potentiel thérapeutique certain, l'utilisation d'antagonistes neutres pourrait s'avérer plus judicieuse dans certains cas (MILLIGAN et al., 1995; MILLIGAN et BOND, 1997). Par exemple, l'antagoniste neutre 6~-naltrexol dirigé contre le récepteur

(37)

mu opioïde semble plus sécuritaire que les agonistes inverses naloxone et naltrexone afin de calmer la dépendance physique à la morphine (SADEE et al., 2005).

Le modèle cubique d'activation du complexe ternaire d'un GPCR permet aussi de comprendre pourquoi les niveaux d'expression du récepteur et de la protéine G hétérotrimérique influencent la détection de l'activité constitutive (KENAKIN, 1997). En fait, la surexpression d'une de ces deux composantes résultera, d'après la loi d'action de masse, en une augmentation de la quantité totale de complexes RAG. De nombreuses études ont observé une augmentation de l'activité constitutive d'un GPCR ( e.g. récepteur D1 de la dopamine, récepteur M3 muscarinique) suite à la surexpression de la protéine G hétérotrimérique lui étant couplée (SENOGLES et al., 1990; BURSTEIN et al., 1997). De même, la surexpression de plusieurs GPCRs ( e.g. récepteur ~2-adrénergique,

récepteur de la thyrotropine, récepteur D 18 de la dopamine, récepteur de la calcitonine) dans divers types cellulaires mène aussi à l'augmentation de la production de seconds messagers en absence de ligand agoniste (CHIDIAC et al., 1994; TIBERI et CARON, 1994; V AN SANDE et al., 1995; POZVEK et al., 1997). Outre les niveaux d'expression du GPCR et de la protéine G hétérotrimérique, plusieurs autres facteurs peuvent augmenter l'activité constitutive des GPCRs ( e.g. polymorphismes, épissage alternatif, édition d' ARN, variances entre espèces, mutations ponctuelles et protéome cellulaire). En somme, n'importe quelle modification poussant l'équilibre d'isomérisation du récepteur vers une conformation active ou favorisant la formation d'un complexe avec la protéine G hétérotrimérique est susceptible d'augmenter le niveau d'activité constitutive du GPCR.

Évidemment, le modèle cubique ne couvre pas tous les aspects du comportement des GPCRs. Comme mentionné précédemment, ces récepteurs sont maintenant reconnus

(38)

pour interagir avec une vaste gamme de protéines ne se limitant pas uniquement aux protéines G hétérotrimériques. Toutefois, il serait futile de tenter d'inclure ces différentes interactions aux modèles théoriques puisqu'elles ne sont souvent pas généralisées à l'ensemble des GPCRs. Par contre, en décrivant l'interaction d'un GPCR avec une protéine G hétérotrimérique dans un ratio de 1: 1, le modèle cubique ne tient évidemment pas compte de la dimérisation possible de ces récepteurs. Le processus de dimérisation est pourtant essentiel au transport (ciblage membranaire et internalisation) et à la signalisation de plusieurs GPCRs (HEBERT et BOUVIER, 1998; DEVI, 2001; RIOS et al., 2001 ). Par exemple, il a récemment été montré que l'homodimérisation du récepteur P2-adrénergique au niveau du réticulum endoplasmique est nécessaire à son ciblage adéquat à la membrane plasmique (SALAHPOUR et al., 2004). En utilisant un peptide dérivé du 6e DTM de ce même GPCR, il a été possible d'empêcher l'homodimérisation du récepteur P2-adrénergique et ainsi, de prévenir l'activation de l'adénylyl cyclase suite à l'ajout de l'agoniste isoprotérénol (HEBERT et al., 1996). Fait intéressant, ce peptide inhibe aussi l'activité constitutive du récepteur P2-adrénergique, suggérant ainsi que le processus de dimérisation puisse jouer une rôle important dans l'activation constitutive d'un GPCR (HEBERT et al., 1996). Bien que plusieurs autres GPCRs constitutivement actifs soient capables de former des homodimères (e.g. récepteurs 5-HTrn et 5-HTrn de la sérotonine, récepteurs D2 et D3 de la dopamine, récepteur CB 1 des endocannabinoides ), il reste à prouver que leur activation constitutive dépend de leur dimérisation (NG et al., 1993; NIMCHINSKY et al., 1997; ZAW ARYNSKI et al., 1998; XIE et al., 1999; LEE et al., 2000; MUKHOP ADHY A Y et al., 2000). Nul doute que l'ensemble de ces résultats

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influencera, au même titre que la découverte de l'activité constitutive par le passé, les modèles théoriques d'activation des GPCRs.

2.2. Rôles physiologiques de l'activité constitutive de GPCRs de type sauvage

Bien que l'activité constitutive soit une propriété intrinsèque des GPCRs, son rôle au niveau du fonctionnement normal des systèmes biologiques demeure difficile à prouver (MILLIGAN, 2003). La présence d'agonistes endogènes peut constituer un problème majeur dans l'étude in vivo de l'activité constitutive des GPCRs, particulièrement pour des systèmes complexes comme les neurones où la relâche de vésicules de neurotransmetteurs vient brouiller les cartes. Pour une analyse juste de l'activité constitutive des GPCRs dans un système natif, il est crucial d'avoir en sa possession une gamme d'agonistes, d'antagonistes neutres et d'agonistes inverses afin d'exclure la contribution d'agonistes endogènes à l'activité détectée (MORISSET et al., 2000; WIELAND et al., 2001). C'est d'ailleurs en utilisant l'antagoniste neutre Proxyfan que l'implication de l'activité constitutive du récepteur H3 de l'histamine au niveau du contrôle de l'activité des neurones histaminergiques chez le rat (important pour l'éveil, l'attention et les mécanismes d'apprentissage) a pu être révélée (MORISSET et al., 2000). Bien que cet exemple reste unique à l'heure actuelle, plusieurs autres GPCRs connus pour jouer un rôle central dans le maintien de réponses toniques ( e.g. récepteur de l'oxytocine pour la contraction utérine, récepteurs des endocannabinoides pour le contrôle du seuil de nociception thermique) sont soupçonnés d'y contribuer par l'activation constitutive de leurs voies de signalisation sous-jacentes (DE LIGT et al., 2000). De plus, l'intense activité neuronale qui anime notre cerveau en tout temps pourrait bien reposer sur

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l'activité constitutive de plusieurs autres GPCRs ( e.g. récepteurs a2- et Bz-adrénergiques liant la noradrénaline, récepteur MehA de la mélatonine, récepteur S1P5 du sphingosine 1-phosphate, récepteurs CBl et CB2 des endocannabinoides, récepteur HT2A de la 5-hydroxytryptamine, récepteur MC4 de la mélanocortine) (TIAN et al., 1994; SMIT et al.,

1996; ROKA et al., 1999; HOPKINSON et al., 2000; ROULEAU et al., 2002; HARVEY, 2003; NIEDERNBERG et al., 2003; SRINIV ASAN et al., 2004; PERTWEE, 2005). L'identification récente d'agonistes inverses endogènes supporte aussi l'implication possible de l'activité constitutive des GPCRs dans certains processus physiologiques. En effet, le contrôle du poids corporel repose en partie sur l'action agoniste inverse du ligand endogène "Agouti-related protein" au niveau des récepteurs MC3 et MC4 de la

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mélanocortine (OLLMANN et al., 1997; HASKELL-LUEV ANO et MONCK, 2001; NIJENHUIS et al., 2001; ADAN et KAS, 2003). D'autre part, les chemokines "interferon-y-inducible protein 10" et "stromal cell-derived factor-la" empêchent le développement du sarcome de Kaposi en renversant l'activité constitutive du GPCR viral ORF74 ("open reading frame 74") (ROSENKILDE et al., 1999). Clairement, l'identification d'autres réponses physiologiques dépendantes de l'activation constitutive des GPCRs et de l'action d'agonistes inverses endogènes modifiera notre perception du maintien de l'homéostasie chez les organismes en général.

2.3. Pathologies associées à l'activité constitutive de GPCRs mutants

L'avènement de la génétique moléculaire a permis de déceler une multitude de mutations ponctuelles impliquées dans le développment de plusieurs maladies graves. Les protéines en cause sont autant des enzymes, des canaux ioniques que des GPCRs. Les

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maladies provoquées par la mutation d'un GPCR résultent souvent d'une substitution inactivant le récepteur (SPIEGEL et WEINSTEIN, 2004; ULLOA-AGUIRRE et al., 2004). Par exemple, la substitution del' Arg137 du récepteur V

2 de la vasopressine par une His rend ce GPCR incapable de stimuler la protéine Gs et mène au diabète insipide (ROSENTHAL et al., 1993). Le nanisme peut découler de l'incapacité du récepteur du facteur de relâche de l'hormone de croissance à activer la protéine Gs suite à la substitution de l' Asp60 par une Gly (LIN et al., 1993). Toutefois, diverses pathologies humaines héréditaires ou acquises résultent de mutations germinales ou somatiques augmentant l'activité constitutive de GPCRs (SPIEGEL, 1996; PARNOT et al., 2002; SEIFERT et WENZEL-SEIFERT, 2002). Par exemple, plusieurs mutations différentes augmentant l'activité constitutive du récepteur de l'hormone lutéinisante (e.g. M5711, T5771 et D578G) menent à la puberté masculine précoce familiale (désordre métabolique hériditaire, indépendant des gonadotropines et provoquant de graves problèmes développementaux) (SHENKER et al., 1993; SHENKER, 2002; THEMMEN et VERHOEF-POST, 2002). La rhodopsine, impliquée dans la phototransduction, est aussi sujette à de telles mutations (JIN et al., 2003). Ce récepteur est normalement activé par l'absorption d'un photon qui provoque l'isomérisation du rétinal lié de façon covalente grâce à une base de Schiff formée par les acides aminés Glu113 et Lys296 (situés au 3e et 7e DTM, respectivement) (HUBBELL et al., 2003). L'activation constitutive de la rhodopsine lors de la substitution de la Lys296 par une Glu a été retrouvée chez une famille souffrant de rétinite pigmentaire, une maladie caractérisée par la dégénération du tissu photosensible de la rétine (ROBINSON et al., 1992). Il est intéressant de noter que l'augmentation d'expression ou la dégradation inappropriée du récepteur P ARl

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("protease-activated receptor 1 "; irréversiblement activé par l'action protéolytique de la thrombine et agissant ainsi comme un récepteur pleinement constitutivement actif) contribuent à l'apparition du caractère métastatique des cellules de cancer du sein (EVEN-RAM et al., 1998; O'BRIEN et al., 2001; BOODEN et al., 2004). La responsabilité de l'activation constitutive de certains GPCRs dans le développement de diverses tumeurs souligne d'ailleurs le potentiel oncogénique des récepteurs à 7 DTMs (initialement suggéré par l'étude du récepteur mutant R288K/K290H/A293L-arn-adrénergique) (ALLEN et al., 1991). En effet, plusieurs cas d'adénomes thyroïdiens présentant une hyperplasie de la glande thyroïde et provoquant un hyperthyroïdisme sont causés par différentes mutations somatiques (~ 50 ayant été identifiées) augmentant drastiquement l'activité constitutive du récepteur de l'hormone hypophysaire thyrotropine (PARMA et al., 1993). Récemment, une nouvelle isoforme du récepteur de la cholecystokinine B/gastrine résultant d'un épissage alternatif et montrant une activité constitutive accrue a été découverte spécifiquement chez les cellules humaines du cancer colorectal (HELLMICH et al., 2000). De plus, certains cas rares de cancer (e.g. sarcome de Kaposi, lymphome de Burkitt, leucémie chez l'adulte, carcinome hépatique) découlent de l'expression de GPCRs mutants constitutivement actifs codés par différents virus ( e.g. virus de l'herpès, rétrovirus et virus de l'hépatite B; ces derniers ont piraté le génome humain pour ensuite muter ces récepteurs) (SMIT et al., 2000; ROSENKILDE et al., 2001; SMIT et al., 2003). Vraisemblablement, l'activation continue des voies de signalisation en aval de ces GPCRs constitutivement actifs est à l'origine des désordres cellulaires et métaboliques produits. Ainsi, nul doute que le développement d'agonistes

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mverses offrira un fort potentiel thérapeutique dans la lutte contre les diverses pathologies dues à l'activation constitutive de GPCRs (PRATHER, 2004).

À ce jour, l'existence d'un lien entre le polymorphisme du gène du récepteur AT1 et l'incidence des maladies cardiovasculaires demeure controversé (MILLER et SCHOLEY, 2004; BAUDIN, 2005). Par exemple, certaines études rapportent que la substitution de l'adénosine située à la position 1166 du gène codant le récepteur hA T 1 (portion 3' non traduite du gène) pour une cytidine constitue un polymorphisme fréquemment observé chez des patients hypertendus (BONNARDEAUX et al., 1994; SZOMBATHY et al., 1998; KOBASHI et al., 2004; RUBATTU et al., 2004). À l'inverse, d'autres équipes de recherche n'ont pu établir de lien entre le polymorphisme A1166C du récepteur AT1 et l'évolution de différentes pathologies du système cardiovasculaire telles l'hypertension essentielle et l'hypertrophie du myocarde (SCHMIDT et al., 1997; ONO et al., 2003; ARAUJO et al., 2004; KUZNETSOVA et al., 2004; SUGIMOTO et al., 2004). Étant donné la divergence des nombreuses études ayant exploré l'implication du polymorphisme A1166C du récepteur ATi, il est surprenant de constater que la conséquence même de ce polymorphisme au niveau de l'expression et de l'activité du récepteur AT1 n'est toujours pas connue (DANSER et SCHUNKERT, 2000). D'autre part, le développement d'adénomes (tumeurs bénignes) des glandes surrénales provoquant l 'hyperaldostéronisme ne semble pas résulter d'une mutation augmentant l'activité constitutive du récepteur AT1 (DA VIES et al., 1997; SACHSE et al., 1997). Par contre, la mise en évidence récente du rôle déterminant joué par l'activation du récepteur AT1 dans les processus d'angiogenèse associés à la croissance de certaines tumeurs laisse entrevoir le potentiel thérapeutique des agonistes inverses ( e.g. losartan, irbesartan et

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