La voie Fanconi active le promoteur c-Myc pleine longueur

Nous avons précédemment montré que FANCC est un activateur transcriptionnel du promoteur c-Myc. Dans le but d’approfondir ce rôle de régulateur transcriptionnel de FANCC sur c-Myc, nous avons effectué des tests de gènes rapporteur en luciférase de différents fragments du promoteur c-Myc.

Dans un premier temps, nous avons utilisé des constructions de délétions de ce promoteur, en fonction des sites d’enzyme de restriction. Ces constructions sont appelées Del1, Del2, Del3 et Del4. La construction Del1 correspond au promoteur pleine longueur (comprenant une délétion de 4 nucléotides), la construction Del2 débute en -1194 et s’arrête au site majeur de départ de la transcription, la construction Del3 débute en -741 et s’arrête au site majeur de départ de la transcription et la construction Del 4 débute en -484 et s’arrête au site majeur de départ de la transcription. La construction Del1 est celle utilisée précédemment et appelée c-Myc promoteur (dans la partie 2.3.1 Activation transcriptionnelle des cibles de la voie Wnt/β-caténine par la voie Fanconi).

Nos résultats montrent que l’activation des délétions du promoteur c-Myc par FANCD2, dans les lignées mutantes ou complémentées en FANCD2, est du même ordre que l’activation de ces délétions par la β-caténine. En effet, pour la construction Del1, on observe une activation de la construction par FANCD2 de 70 fois, en comparaison aux cellules

67 mutantes. De même, la mesure de l’activité de cette construction dans les cellules mutantes pour FANCD2 transfectées avec une construction constitutivement active de la β-caténine, montre une activation de l’ordre de 70 fois, tout comme dans les cellules complémentées en FANCD2 transfectées avec la β-caténine active. Pour la construction Del2, on observe une activation de l’ordre de 20 fois dans les cellules complémentées en FANCD2 et dans les cellules mutantes transfectées avec la β-caténine active, en comparaison aux cellules mutantes non transfectées à la β-caténine. Pour ce qui est des cellules complémentées et transfectées à la β-caténine active, on observe une activation de l’ordre de 30 fois celle des cellules mutantes non transfectées à la β-caténine. Les constructions Del3 et Del4 ne montrent pas d’activation significative (figure 3.1 A).

Nos résultats montrent également que l’activation des délétions du promoteur c-Myc par FANCC, dans les lignées mutantes ou complémentées en FANCC, est du même ordre que l’activation de ces délétions par la β-caténine. En effet, pour la construction Del1, on observe une activation de la construction par FANCC de 30 fois, en comparaison aux cellules mutantes. L’activation de la construction dans les cellules mutantes par la β-caténine est de l’ordre de 40 fois celle des mêmes cellules sans activation. On observe une activation égale de cette construction dans les cellules complémentée en FANCC et transfectées avec la β- caténine. Pour la construction Del2, on observe une activation de l’ordre de 10 fois dans les cellules complémentées en FANCC et dans les cellules mutantes transfectées avec la β- caténine active, en comparaison aux cellules mutantes non transfectées à la β-caténine. Pour ce qui est des cellules complémentées et transfectées à la β-caténine active, on observe une activation de l’ordre de 20 fois celle des cellules mutantes non transfectées à la β-caténine. La construction Del3 montre une faible activation à la fois par FANCC et la β-caténine. La construction Del4, elle, ne montre pas d’activation significative (figure 3.1 B).

Afin de savoir si cette activation est réellement dépendant de la voie Fanconi, nous avons également tester ces constructions dans des lignées dérivées de patients mutées pour FANCA (PD220) et complémentées avec FANCA sauvage (PD220/A). Les résultats montrent que FANCA est capables d’activer la transcription de la construction Del1, mais dans une proportion deux fois plus faible que la β-caténine, à la fois dans les cellules mutantes

68 et dans les cellules complémentées en FANCA. Au niveau de la construction Del2, on observe une activation équivalente de FANCA et de la β-caténine et une activation un peu plus importante dans les cellules complémentées en FANCA et transfectées à la β-caténine active. On observe également une activation de la construction Del3 semblable dans les cellules complémentées en FANCA et dans les cellules mutantes et complémentées en FANCA transfectées à la β-caténine. La construction Del4 ne montre pas d’activation significative (figure 3.1 C).

69 Figure 3.1 : Les protéines Fanconi ne régulent que le promoteur de c-Myc pleine longueur.

Test luciférase de différents fragments du promoteur c-Myc dans cellules dérivées de patients mutés pour (A) FANCD2 (PD20) et complémentées en FANCD2 (PD20/D2) transfectées ou non avec β-caténine S33Y. (B) FANCC (PD331) et complémentées en FANCC (PD331/C) transfectées ou non avec β-caténine S33Y. (C) FANCA (PD220) et complémentées en FANCA (PD220/A) transfectées ou non avec β-caténine S33Y. La construction Del1 est activée par FANCA et la β-caténine S33Y. (D) Représentation des différentes délétions du promoteur c-Myc. L’ensemble de ces expériences ont été faites 3 fois et mesurées en duplicata, les analyses statistiques sont faites en utilisant le logiciel GraphPad Prism version 6.0, et des t-test sont effectués pour comparer les moyennes.

70 Ces résultats nous indiquent que les protéines FANCC et FANCD2 semblent importantes dans l’activation de la transcription de c-Myc. Sachant que FANCD2 se trouve en aval de FANCC, dans la voie de signalisation Fanconi, nous nous sommes interrogés sur la possibilité de rétablissement de l’activation du promoteur par la surexpression de FANCD2 dans des lignées dérivées de patients mutants pour FANCC.

3.3.2 La restauration de la voie Fanconi dans les cellules mutantes pour